Summary
هنا، نقدم بروتوكولا للزرع الجراحي لنافذة بصرية مذهولة بشكل دائم لصدر مورين، والتي تمكن من التصوير عالي الدقة داخل الرئة. إن ديمومة النافذة تجعلها مناسبة تماما لدراسة العمليات الخلوية الديناميكية في الرئة ، خاصة تلك التي تتطور ببطء ، مثل التقدم النقيلي للخلايا السرطانية المنشورة.
Abstract
الانبثاث، الذي يمثل حوالي 90٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان، ينطوي على الانتشار الجهازي للخلايا السرطانية من الأورام الأولية إلى المواقع الثانوية مثل العظام والدماغ والرئة. وعلى الرغم من الدراسة المكثفة، لا تزال التفاصيل الآلية لهذه العملية غير مفهومة بشكل جيد. في حين أن طرائق التصوير الشائعة، بما في ذلك التصوير المقطعي المحوسب (CT)، والتصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية (PET)، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، توفر درجات متفاوتة من التصور الإجمالي، يفتقر كل منها إلى الدقة الزمنية والمكانية اللازمة للكشف عن ديناميكيات الخلايا السرطانية الفردية. ولمعالجة ذلك، تم وصف العديد من التقنيات للتصوير داخل الحتمية للمواقع النقيلية الشائعة. من بين هذه المواقع، أثبتت الرئة أنها تواجه تحديا خاصا في الوصول إلى التصوير داخل الفيتي بسبب رقتها ودورها الحاسم في الحفاظ على الحياة. على الرغم من أن العديد من النهج قد وصفت سابقا للتصوير داخل الخلية الواحدة للرئة سليمة، وكلها تنطوي على إجراءات الغازية للغاية ونهاية، والحد من الحد الأقصى لمدة التصوير ممكن إلى 6-12 ساعة. وصف هنا هو تقنية محسنة لزرع دائم من نافذة بصرية صدرية طفيفة التوغل لتصوير عالية الدقة للرئة (WHRIL). وإلى جانب النهج المكيف للتصوير الدقيق، تسهل النافذة البصرية المبتكرة التصوير المتسلسل داخل الفيتية للرئة السليمة بدقة خلية واحدة عبر جلسات تصوير متعددة وتمتد لعدة أسابيع. وبالنظر إلى المدة غير المسبوقة للوقت الذي يمكن جمع بيانات التصوير خلاله، يمكن أن تسهل WHRIL الاكتشاف المتسارع للآليات الديناميكية الكامنة وراء التقدم النقيلي والعديد من العمليات البيولوجية الإضافية داخل الرئة.
Introduction
المسؤولة عن ~ 90٪ من الوفيات، الانبثاث هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان1. من بين المواقع الرئيسية للنقائل لوحظ سريريا (العظام والكبد والرئة والدماغ)2، وقد ثبت الرئة تحديا خاصا للتصوير في الجسم الحي عن طريق المجهر داخل الجسم. وذلك لأن الرئة هي جهاز حساس في حركة دائمة. تمثل الحركة المستمرة للرئتين، التي تتفاقم أكثر بسبب حركة القلب داخل الصدر، حاجزا كبيرا أمام التصوير الدقيق. لذلك ، نظرا لعدم إمكانية الوصول النسبي إلى طرائق التصوير البصري داخل الفيتالي عالي الدقة ، غالبا ما يعتبر نمو السرطان داخل الرئة عملية غامضة3.
في الإعداد السريري، تتيح تقنيات التصوير مثل التصوير المقطعي المحوسب (CT) والتصوير المقطعي لانبعاثات البوزيترون (PET) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) التصور العميق داخل الأعضاء الحيوية السليمة مثل الرئة4. ومع ذلك ، في حين أن هذه الطرائق توفر وجهات نظر ممتازة للعضو الإجمالي (غالبا ما تكشف عن علم الأمراض قبل ظهور الأعراض السريرية) ، إلا أنها غير كافية للكشف عن الخلايا السرطانية المنشورة الفردية أثناء تقدمها خلال المراحل المبكرة من الانبثاث. وبالتالي ، بحلول الوقت الذي توفر فيه الطرائق المذكورة أعلاه أي مؤشر على الانبثاث في الرئة ، تكون البؤر النقيلية راسخة بالفعل وتتكاثر. منذ البيئة الدقيقة الورم يلعب دورا محوريا في تطور السرطان وتشكيل الانبثاث5،6، هناك اهتمام كبير في التحقيق في الخطوات الأولى من البذر النقيلي في الجسم الحي. ومما يزيد من هذا الاهتمام زيادة التقدير أن الخلايا السرطانية نشر حتى قبل الكشف عن الورم الأساسي7,8 والأدلة المتزايدة على أنها البقاء على قيد الحياة كخلايا واحدة وفي حالة نائمة لسنوات إلى عقود قبل أن يتم النمو إلى الانبثاث الكلي9.
في السابق ، كان تصوير الرئة بدقة خلية واحدة ينطوي بالضرورة على تحضيرات الجسم الحي السابق أو explant10،11،12،13، مما يحد من التحليلات إلى نقاط زمنية واحدة. في حين أن هذه الاستعدادات لا توفر معلومات مفيدة، فإنها لا توفر أي نظرة ثاقبة في ديناميات الخلايا السرطانية داخل الجهاز متصلة بنظام الدورة الدموية سليمة.
وقد مكنت التطورات التكنولوجية الأخيرة في التصوير التصور داخلvital من الرئة سليمة في قرار خلية واحدة على مدى فترات تصل إلى 12 ساعة14،15،16. وقد تم تحقيق ذلك في نموذج مورين باستخدام بروتوكول ينطوي على التهوية الميكانيكية، وإعادة استئصال القفص الصدري، وشل الرئة بمساعدة الفراغ. ومع ذلك ، على الرغم من تقديم أول صور خلية واحدة دقة الرئة سليمة من الناحية الفسيولوجية ، وتقنية الغازية للغاية ونهاية ، وبالتالي منع المزيد من جلسات التصوير وراء الإجراء مؤشر. هذا القيد، لذلك، يمنع تطبيقه على دراسة الخطوات النقيلية التي تستغرق وقتا أطول من 12 ساعة، مثل السكون وإعادة بدء النمو14،15،16. وعلاوة على ذلك، يجب تفسير أنماط السلوك الخلوي التي لوحظت باستخدام هذا النهج التصوير بحذر، بالنظر إلى أن فروق الضغط الناجمة عن الفراغ من المرجح أن تسبب تسريبات في تدفق الدم.
للتغلب على هذه القيود، تم مؤخرا تطوير نافذة طفيفة التوغل للتصوير عالي الدقة للرئة (WHRIL)، مما يسهل التصوير التسلسلي على مدى فترة ممتدة من أيام إلى أسابيع، دون الحاجة إلى التهوية الميكانيكية17. وتنطوي هذه التقنية على إنشاء "قفص الصدري شفاف" مع تجويف صدري مختوم للحفاظ على وظيفة الرئة الطبيعية. هذا الإجراء جيد التحمل ، مما يسمح للفأر بالتعافي دون تغيير ذي مغزى في نشاط خط الأساس ووظيفته. لتعريب موثوق بالضبط نفس منطقة الرئة في كل جلسة تصوير ذات الصلة، تم تطبيق تقنية تعرف باسم التصوير الدقيق لهذه النافذة18. من خلال هذه النافذة ، كان من الممكن التقاط صور للخلايا عند وصولها إلى سرير الأوعية الدموية في الرئة ، وعبور البطانة ، والخضوع لتقسيم الخلايا ، والنمو إلى الانبثاث الدقيق.
هنا ، تقدم الدراسة وصفا مفصلا لبروتوكول جراحي محسن لزرع WHRIL ، والذي يبسط الجراحة مع زيادة إمكانية إعادة إنتاجها وجودتها في الوقت نفسه. في حين تم تصميم هذا البروتوكول لتمكين التحقيق في العمليات الديناميكية الكامنة وراء الانبثاث ، يمكن تطبيق هذه التقنية بدلا من ذلك على التحقيقات في العديد من عمليات بيولوجيا الرئة وعلم الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة باستخدام الحيوانات الفقارية، بما في ذلك الموافقة المسبقة من قبل كلية ألبرت أينشتاين للطب المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1. يزيف من نوافذ
- شطف إطارات النوافذ البصرية (الشكل التكميلي 2) مع محلول 1٪ (ث / v) من المنظفات النشطة أنزيميا.
- داخل جرة زجاجية، غمر إطارات النوافذ البصرية في محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 5٪ (ث/v) لمدة 30 دقيقة عند 70 درجة مئوية.
- إزالة وغسل إطارات النوافذ مع الماء deionized.
- داخل جرة زجاجية جديدة، غمر إطارات النوافذ البصرية في محلول حمض الستريك 7٪ (ث / v) لمدة 10 دقائق عند 55 درجة مئوية.
- مرة أخرى، قم بإزالة إطارات النوافذ وغسلها بالماء المتأين.
- كرر الخطوة 1.2; ثم، وإزالة وغسل إطارات النوافذ مع الماء deionized.
2. التحضير للجراحة
- إجراء الجراحة في غطاء محرك السيارة أو خزانة تدفق صفح. لتجنب تلوث المجال الجراحي، تأكد من مناطق منفصلة ومتميزة للتحضير والجراحة والتعافي على التوالي.
- قبل الجراحة، قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف. إذا تم التخطيط لإجراءات لاحقة، إعادة تعقيم الأدوات باستخدام معقم حبة ساخنة. لهذا الإجراء الجراحي، يتم استخدام تقنية نصائح فقط.
- السلطة على حبة الجراحية ساخنة والخرز معقم.
- تخدير الماوس مع 5٪ isoflurane في غرفة التخدير.
- لإزالة الشعر، ضعي كريم إزالة الشعر بسخاء على موقع شق الصدر العلوي الأيسر. بعد ما لا يزيد عن 20 ثانية، مسح بحزم الشعر وكريم إزالة الشعر باستخدام ورق الأنسجة الرطبة. كرر حسب الضرورة لإزالة الشعر من موقع الجراحة.
- باستخدام خياطة حرير 2-0، ربط عقدة في قاعدة القسطرة 22 G، وترك ذيول طويلة 2 بوصة (انظر الشكل 1A).
3. جراحة نافذة الرئة
- غسل اليدين باستخدام الصابون المطهر.
- قبل كل عملية جراحية جديدة، دون قفازات معقمة جديدة.
- لمنع جفاف القرنية وتلف عيون الماوس، وتطبيق مرهم العيون على كلتا العينين.
- تمييع 10 ميكرولتر (0.1 ملغم/كغ) من البوبرينورفين في 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم، ثم حقن تحت الجلد لضمان المسكنات قبل الجراحة.
- Intubate الماوس مع خياطة الحرير مربوطة 22 G القسطرة15. باستخدام لمبة التضخم، تأكد من التنبيب الناجح من خلال ونلحظ ارتفاع الصدر الثنائية عند ضغط لمبة.
- تأمين القسطرة التنبيب عن طريق ربط خياطة الحرير 2-0 حول خطم الماوس (انظر الشكل 1B).
- ضع الماوس على الحامل الجراحي الساخن وضعية في التداعي الجانبي الأيمن لكشف الصدر الأيسر.
- توصيل جهاز التنفس الصناعي إلى القسطرة التنبيب.
- ضمان التحكم، والتهوية مستقرة على جهاز التنفس الصناعي ومن ثم خفض الايزوفلوران إلى 3٪. في بداية الإجراء ودوريا طوال مدة الإجراء، قم بتقييم كفاية التخدير من خلال إجراء اختبار قرصة إصبع القدم.
- باستخدام الشريط الورقي، بشكل قحفي وcaudally تأمين الأطراف الأمامية والهندية، على التوالي، إلى المرحلة الجراحية ساخنة. ضع شريطا آخر بطول ظهر الفأرة لزيادة التعرض إلى أقصى حد للمجال الجراحي (انظر الشكل 1C).
- فتح جميع الأدوات الجراحية تحت غطاء محرك السيارة للحفاظ على العقم.
- تعقيم الموقع الجراحي من خلال تطبيق سخية من المطهر على جلد الفأر.
- باستخدام ملقط، ورفع الجلد وجعل شق دائري ~ 10 ملم، ~ 7 ملم إلى يسار القص و ~ 7 مم متفوقة على الهامش الفرعي(الشكل 1D).
- تحديد بعناية أي السفن الرئيسية. إذا كان تقسيم الأوعية ضروريا، الكي في كلا الطرفين مع القلم الكهربائي للحفاظ على hemostasis.
- استئصال الأنسجة الرخوة overlying الأضلاع.
- رفع الضلع6 أو7 باستخدام ملقط. باستخدام شفرة واحدة من مقص تشريح صغيرة حادة، والجانب مدورة نحو الرئة، واخترق بعناية العضلات الوربي بين الأضلاع6 و7 th لدخول الفضاء داخل الصدر (الشكل 1E).
- تصريف دقيق علبة الهواء المضغوط في عيب لانهيار الرئة وفصلها عن جدار الصدر. أطلق الهواء المضغوط في رشقات نارية قصيرة لمنع إصابة الرئة المسببة للياتوجينيك.
- ضع لكمة الخزعة على أداة القطع(الشكل التكميلي 1)ومناورة بعناية قاعدة أداة القطع من خلال شق الوربي(الشكل 1F).
- توجيه قاعدة أداة القطع بحيث أنها موازية مع جدار الصدر. لكمة ثقب دائري 5 ملم من خلال القفص الصدري (الشكل 1G).
ملاحظة: تأكد من أن أنسجة الرئة المكشوفة وردية اللون، دون ظهور علامات على حدوث تلف. - باستخدام خياطة الحرير 5-0، وخلق غرزة محفظة سلسلة ~ 1 ملم من الحفرة، محيط، متشابكة مع الأضلاع (الشكل 1H).
- ضع إطار النافذة بحيث تتم محاذاة حواف العيب الدائري داخل أخدود النافذة (انظر الشكل 1I).
- قفل آمن النافذة المزروعة عن طريق ربط بإحكام أسفل خياطة الحرير 5-0.
- تحميل 100 ميكرولتر من مادة لاصقة هلام سيانواكريلات في حقنة 1 مل.
- جفف الرئة عن طريق تطبيق تيار لطيف ثابت من الهواء المضغوط ل ~ 10-20 ق (الشكل 1J).
- باستخدام ملقط لقبضة إطار النافذة من قبل الحافة الخارجية، ورفع بلطف لضمان فصل الرئة من تحت سطح الأمواج من إطار النافذة.
- الاستغناء عن طبقة رقيقة من مادة لاصقة سيانواكريلات على طول تحت سطح الأمواج من إطار النافذة البصرية(الشكل 1K).
- زيادة الضغط الإيجابي للانتهاء من الزمام (PEEP) على جهاز التنفس الصناعي لتضخيم الرئة.
- عقد لمدة 10-20 ق، وتطبيق ضغط لطيف ولكن شركة لإرفاق إطار النافذة البصرية على أنسجة الرئة(الشكل 1L).
- الاستغناء عن قطرة 5 ملم من مادة لاصقة هلام سيانواكريلات المتبقية على غطاء مستطيل.
- التقط غطاء 5 مم باستخدام التقاطات الفراغ. تراجع تحت السطح من coverlip في لاصقة ، ثم كشط قبالة لاصقة الزائدة ثلاث مرات ضد الجانب من غطاء مستطيل ، بحيث لا يبقى سوى طبقة رقيقة جدا(الشكل 1M).
- وضع بعناية coverlip لتناسب داخل العطلة في وسط إطار النافذة البصرية ويقام فوق أنسجة الرئة في زاوية. لفترة وجيزة المشبك جهاز التنفس الصناعي لتوليد ضغط إيجابي، فرط تضخيم الرئة. باستخدام حركة دوارة، قم بتوجيه الغطاء الموازي لأنسجة الرئة لإنشاء تباعد مباشر بين سطح الرئة وتحت سطح السطح للزلزلة. الحفاظ على ضغط لطيف، مما يسمح لاصقة سيانواكريلات لتعيين (~ 25 ق).
- استخدام ملقط لفصل coverlip من التقاطات فراغ (الشكل 1N).
- باستخدام خياطة الحرير 5-0، مرة أخرى إنشاء غرزة سلسلة محفظة، وهذه المرة <1 ملم محيط من الحافة القطعية لشق الجلد. دس أي جلد زائد تحت الحافة الخارجية للإطار النافذة قبل ربط عليه بإحكام مع عقدة قفل.
- لضمان وجود ختم محكم الهواء بين غطاء الغطاء وإطار النافذة، قم بتوزيع كمية صغيرة من السيانواكريل السائل في واجهة الزجاج المعدني (انظر الشكل 1O).
- قم بإرفاق إبرة معقمة بحقنة الأنسولين 1 مل. أدخل الإبرة أسفل عملية xiphoid ، وتقدم نحو الكتف الأيسر ، وأدخل تجويف الصدر من خلال الحجاب الحاجز. سحب بلطف مرة أخرى على حقنة لإزالة أي الهواء المتبقي من تجويف الصدر (انظر الشكل 1P).
- إزالة الشريط من الماوس.
- إيقاف ايزوفلوران.
- استمر في التهوية باستخدام الأكسجين بنسبة 100٪ حتى يظهر الماوس جاهزا للاستيقاظ.
- قطع بعناية خياطة الحرير 2-0 حول خطم الماوس وتقشير الماوس.
- نقل الماوس إلى قفص نظيف ورصد حتى تعافى تماما. قتل الفأرة إذا كانت علامات صعوبة في التنفس موجودة.
- توفير مسكن بعد العملية الجراحية عن طريق حقن تحت الجلد 10 ميكرولتر (0.1 ملغم / كجم) من البوبرينورفين المخفف في 90 ميكرولتر من محلول الفوسفات المعقم العازل (PBS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تلخيص خطوات العملية الجراحية الموصوفة في هذا البروتوكول وتوضيحها في الشكل 1. لفترة وجيزة، قبل الجراحة، يتم تخدير الفئران ويتم إزالة الشعر فوق الصدر الأيسر. يتم تنبيب الفئران وتهوية ميكانيكيا لتمكين البقاء على قيد الحياة عند اختراق تجويف الصدر. يتم استئصال الأنسجة الرخوة التي تفرط في الأضلاع ، ويتم إنشاء عيب دائري صغير ، يمتد علىالأضلاع 6 و 7. يتم إدخال إطار النافذة البصرية في العيب ويتم الالتزام بجانبها السفلي (خارج الفتحة الواضحة) إلى أنسجة الرئة. ثم يتم تأمين إطار النافذة مع مزيج من الغرز ولصق، وإعادة ختم تجويف الصدر والسماح باستئناف التنفس الطبيعي بعد التنبيب. عند زرعها بنجاح ، ستلتزم الرئة بالنافذة البصرية (التي يتم دمجها كجزء من جدار الصدر) ، مع الحفاظ على تدرجات الضغط داخل الصدر. وهذا يسمح بقاء مريحة من الماوس، وتمكين التصوير اليومي تصل إلى بدل البروتوكول (2 أسابيع). ويمكن بعد ذلك التصوير Intravital يمكن أن يتم من خلال النافذة، كما هو موضح سابقا لنوافذ أخرى15،19،20.
لتصور أنواع الخلايا المختلفة، والهياكل البيولوجية، أو الدول الوظيفية الخلوية، يمكن إجراء الإجراء المعروض هنا على مجموعة واسعة من الفئران التي إما تم التلاعب بها وراثيا للتعبير عن البروتينات الفلورية21 أو حقنها مع الأصباغ22. الطبيعة الدائمة للنافذة يجعلها متوافقة مع تقنيات لإعادة توطين مجالات الرؤية مثل التكوير الضوئي23أو24 أو ميكروكارتوغرافيا17و18. التصوير الدقيق هو تقنية التثليث القائمة على استخدام التحولات المحسوبة لإحداثيات العلامات الثقيلية الثابتة بين جلسات التصوير من أجل التنبؤ وإعادة توطين منطقة الاهتمام. في النافذة التي تم إنشاؤها كما هو موضح أعلاه ، هذه العلامات الفقارية هي خدوش خفيفة محفورة في إطار النافذة(الشكل التكميلي 2)التي يمكن التعرف عليها بسهولة تحت المجهر. وهذا يجعل من الممكن العثور على نفس مجال الرؤية عدة مرات، حتى في الأنسجة التي لا تحمل علامات. يوضح الشكل 2 نتيجة هذه التقنيات في الماوس حيث تم تسمية الأوعية الدموية الرئوية عن طريق حقن ديكتران عالي الوزن المسمى صبغة (tetramethylrhodamine 155 kD dextran) ونفس الأوعية الدقيقة التي أعيد توطينها على مدى 3 أيام.
تم العثور على هذا الدكستران لتكون مفيدة للغاية في تقييم فتحات الأوعية الدموية العابرة التي يتم استحثاثها خلال فترات الخلايا السرطانية داخل25,26,27. في الواقع ، فقد ثبت أنه في أورام الثدي الأولية ، يتم عزل هذا الدكستران عالي الوزن بشكل فعال إلى الأوعية الدموية ولا يتسرب إلى إنترستيتيوم25. هذا على النقيض من dextrans من انخفاض الوزن الجزيئي (مثل 10 دينار كويتي أو 70 دينار كويتي) ، والتي ثبت أن تسرب من الأوعية neoangiogenic سلبي28،29. وفي الوقت نفسه ، لوحظ أن الأوعية الدموية السليمة في الرئة أكثر مقاومة للتسرب ، مع هروب dextrans >10 كيلو دي فقط إلى الإنترستيتيوم عند إهانة العضو ، مثل التعرض للاكسوسومات30 أو الفيروسات31. وهناك أيضا مجموعة متنوعة من عوامل التباين لقياس المعلمات الأخرى في الرئة (مثل العلامات النووية، والمؤشرات الحية / الميتة، ومراسلي الإجهاد التأكسدي، وتعقب سرعة تدفق الدم) بالإضافة إلى نفاذية الأوعية الدموية. ويمكن الاطلاع على الموارد ممتازة فهرستها في البروتوكول من قبل Uekiوآخرون.
وWHRIL هو الأسلوب الذي هو مناسب جدا للتحقيق في ديناميات تدفق الدم في الرئة. ويمكن تحقيق ذلك بعدة طرق. أولا، عندما يتم تصويرها باستخدام معدلات الإطار بطيئة نسبيا (~ 1-10 إطارات في الثانية الواحدة، FPS) يمكن تحديد سرعات تدفق الدم من خلال الظلال التي تجعل كريات الدم الحمراء غير المصنفة عند التدفق في الأوعية الكبيرة. في إطار في الثانية منخفضة، هذه الظلال تشكل خطوط الزاوية التي بالنسبة للوعاء يمكن استخدامها لحساب معدلات تدفق كريات الدم الحمراء32 (الشكل 2، خطوط صفراء). ثانيا، يمكن أيضا تتبع الظلال على مجاهر FPS منخفضة عن طريق محاذاة الأوعية مع محور المسح السريع للمجهر والحصول على kymographs باستخدام خط المسح السريع33،34،35. وأخيرا، عند التصوير بمعدلات إطار عالية (>10 إطارا في الثانية) على مجهر قادر على دمج الإشارة مع مرور الوقت (على سبيل المثال، كونفوجال قرص الغزل مجهز بجهاز مقترن بالشحن (CCD) كاشف)، يمكن تتبع الجسيمات الفردية مباشرة16،17. في هذه الحالة، تظهر الكائنات الثابتة كنقاط ساطعة، وتتعقب الكائنات المتدفقة المسارات من خلال الدورة الدموية. يمكن قياس سرعات الخلية من خلال قياس طول المسارات وتقسيمها على وقت اكتساب الإطار. مثال على ذلك في الشكل 3 والفيلم التكميلي 1، حيث تم حقن ميكروسفيرات فلورية 2 ميكرومتر داخل الأوعية الدموية في الماوس قبل التصوير.
مع القدرة على العودة مرارا وتكرارا وباستمرارا إلى نفس مجال الرؤية ، وتصور العمليات التي تتطور على مدى أيام متعددة هو ممكن الآن. كدليل على هذا التطبيق، تم استخدام WHRIL لتصور التقدم النقيلي للخلايا سرطان الثدي داخل الرئتين17،21: وهذا هو، لتتبع مع مرور الوقت مصير الخلايا السرطانية الفردية التي تصل إلى الأوعية الدموية الرئة. يصور هذا المفهوم في الشكل 4A، حيث يتم تصور خلية ورم واحدة تم نشرها بعد وقت قصير من السكن في جزء من الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة. العودة إلى نفس الموقع في الأيام اللاحقة يكشف مصير الخلية السرطانية (على سبيل المثال، إعادة التدوير، البذخ، الخ). تطبيقها على التحقيق في الخطوات التي بلغت ذروتها من التقدم النقيلي في الرئة، كان من الممكن أن يؤرخ بصريا العمليات الديناميكية، بما في ذلك وصول الخلايا السرطانية (الشكل 4B)،البذخ (الشكل 4C)،والانتشار لتشكيل الانبثاث الكلي (الشكل 4D).
الشكل 1:ملخص الجراحة لزرع نافذة التصوير عالي الدقة للرئة (WHRIL). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:يتيح التصوير الدقيق إعادة تخصيص المواضع الثابتة داخل النافذة البصرية. يظهر التصوير متعدد الفوتونت داخل الرحم لمنطقة واحدة من الرئة تحت غطاء شفاف بصريا أن الخلايا المجهرية انتقلت على مدى 3 أيام متتالية باستخدام التصوير الدقيق. تشير الأسهم الصفراء إلى نقطة فرع محددة بوضوح من سفينة واحدة يتم تحديدها كل يوم متتالي. تسلط الخطوط الصفراء الضوء على الظلال التي تصنعها الخلايا الحمراء غير المصنفة عند تدفقها في أوعية أكبر. ويمكن استخدام زاوية هذه الخطوط بالنسبة للوعاء لحساب معدلات تدفق كريات الدم الحمراء. الأحمر = tdTomato المسمى الخلايا البطانية و 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran المسمى مصل الدم، الأخضر = GFP المسمى الخلايا السرطانية، الأزرق = الجيل التوافقي الثاني. شريط المقياس = 15 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:تصور معدل تدفق الدم. يمكن تصور معدلات تدفق الدم عن طريق حقن ميكروسفيرات فلورية قطرها 2 ميكرومتر الرجعية المداري وتصوير مرورها من خلال الأوعية الدموية. عندما صورت على المجهر قادرة على دمج إشارة مع مرور الوقت (على سبيل المثال، كونفوجال القرص الغزل مجهزة كاشف CCD)، تظهر المجهريات الثابتة كنقاط ساطعة (السهام)، والمجالات المتدفقة تتبع المسارات من خلال مع الدورة الدموية (خطوط بين قوسين). مقياس الشريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. يمكن للWHRIL التقاط كل خطوة من سلسلة النقيلي داخل الرئة من خلال تصور مباشرة مصير الخلايا السرطانية المنشورة. (أ)تتبع مصير الخلايا السرطانية المنتشرة (الأخضر) يمكن تحقيقه مع التصوير التسلسلي، على مدى عدة أيام، من خلال WHRIL. في اليوم الأول، لوحظ أن خلية الورم قد وصلت إلى الأوعية الدموية في الرئة واستقرت فيها. في اليوم الثاني واليوم الثالث لم تعد الخلية موجودة في الأوعية الدموية في الرئة، بعد أن أعيد تدويرها أو ماتت. مقياس شريط = 15 ميكرومتر. (ب-D) التصور من كل من مراحل الانبثاث الخلايا السرطانية في الرئة. (ب) خلية ورم داخل الأوعية الدموية (خضراء) استقرت في الأوعية الدموية الرئوية بعد الوصول. (ج) نشر الخلايا السرطانية (الخضراء) بعد البذخ في الرئة parenchyma. (د) الخلايا السرطانية التي انتشرت ونمت لتصبح الانبثاث الدقيق. الأحمر = tdTomato المسمى الخلايا البطانية و 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran المسمى مصل الدم، الأخضر = GFP المسمى الخلايا السرطانية، الأزرق = الجيل التوافقي الثاني. مقياس الشريط = 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم تكميلي 1: فيديو المقابلة لل الشكل 3 تظهر الأوعية الدموية الرئة مع تعميم 2 ميكروسفيرات ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
الشكل التكميلي 1: رسومات التصميم الميكانيكي لأداةالقطع الفولاذية الخالية من الصدأ المستخدمة لتوجيه لكمة الخزعة مقاس 5 ملم.
الشكل التكميلي 2: رسومات التصميم الميكانيكية لإطار النافذة الفولاذ المقاوم للصدأ. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: رسومات التصميم الميكانيكية لأداة حامل النافذة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في مواقع الانبثاث البعيد مثل الرئة ، يوفر التصوير البصري عالي الدقة نظرة ثاقبة على الديناميكيات المتقنة لنبثبث الخلايا السرطانية. من خلال تمكين التصور في الجسم الحي للخلايا السرطانية الفردية وتفاعلاتها مع الأنسجة المضيفة ، أثبت التصوير داخل الجسم عالي الدقة أنه مفيد لفهم الآليات الكامنة وراء الانبثاث.
الموصوفة هنا هو بروتوكول جراحي محسن لزرع الصدر الدائم من نافذة بصرية مصممة لتمكين التصوير التسلسلي للرئة مورين عن طريق المجهر متعدد الفوتون عالية الدقة. النافذة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول هي جيد التحمل، ونظرا لقدرتها على إعادة ختم بنجاح تجويف الصدر، قادرة على الحفاظ على تدرجات الضغط داخل الصدر اللازمة للتهوية العفوية (على عكس أي نافذة أخرى وصفت سابقا لتصوير الرئة مورين14،15،16،36،37 ). وهذا يسمح للفأر بالاستيقاظ من التخدير والتنفس بشكل مستقل والبقاء على قيد الحياة بشكل مريح مع القفص الصدري الشفاف لفترة طويلة من الزمن تمتد لعدة أسابيع.
باستخدام هذه النافذة، كان من الممكن تصور، مع قرار خلية واحدة، كل من خطوات الانبثاث، بما في ذلك الوصول، والبذخ، والنمو في ميكروميتاستاسيس.
على الرغم من أن البروتوكول يتطلب بعض الكفاءة التقنية ، مع الممارسة والاهتمام الدقيق بعدة خطوات رئيسية ، يمكن تنفيذ الإجراء بمعدل نجاح مرتفع. أولا، عند إزالة الشعر قبل الجراحة، من المهم حماية جلد الفأر عن طريق إزالة كريم إزالة الشعر باستخدام نسيج رطب بعد ما لا يزيد عن 20 ثانية من الاتصال. أثناء الجراحة ، يجب توخي الحذر الشديد لتجنب قطع الأوعية. النزيف المفرط، الأكثر شيوعا واجه بسبب تقسيم إما الشرايين الثديية العضدية أو الداخلية أثناء إزالة وسادة الدهون الثديية، يمكن أن تحجب التصور في المجال الجراحي أو يؤدي إلى الموت من خلال exsanguination. وصف حديثا في هذا البروتوكول هو استخدام لكمة خزعة وأداة القطع (الشكل التكميلي 1)، والتي عجلت إلى حد كبير وتبسيط إنشاء عيب دائري من خلال القفص الصدري، وأداة حامل النافذة مما يجعل زرع أسهل. تنفيذ هذه التطورات يحسن بشكل كبير من معدل نجاح الإجراء ويقلل من المستوى المطلوب من المهارات الجراحية السابقة. يمكن للمختبرات الفردية استخدام الرسومات في الأرقام التكميلية لتصنيع هذه الأدوات إما مع المحلات التجارية أو الداخلية. البحث على الانترنت عن "مواقع المناقصات متجر آلة" سوف تسفر عن العديد من التطبيقات عبر الإنترنت التي من شأنها أن تساعد في العثور على محلات الآلات التجارية المحلية.
وأخيرا، من المهم التأكد من أن أنسجة الرئة لا تزال جافة قبل تطبيق لاصق. العثرة الأكثر شيوعا مما أدى إلى مرفق coverlip غير ناجحة هو الفشل في ضمان إزالة كاملة للرطوبة من سطح الرئة قبل apposition مع الإطار أو غطاء الزجاج. وعلاوة على ذلك، لضمان جودة الصور، ينبغي تطبيق طبقة رقيقة للغاية من الغراء (<10 ميكرومتر). يجب كشط الغراء الزائد قبل وضع زجاج الغطاء.
القيد الرئيسي للIVI من خلال WHRIL هو عمق محدود نسبيا من الاختراق يمكن تحقيقه. لذلك ، لا يمكن الوصول إلى علم الأمراض الذي يحدث في عمق الرئة. على الرغم من هذا القيد ، لا تزال هذه التقنية قادرة على إنتاج وفرة من المعلومات ذات الصلة سريريا ، خاصة في التحقيقات الأورام ، نظرا للميل الموصوف لأنبثاث الرئة المترجمة محيطيا38،39،40،41. في نهاية المطاف ، يوفر هذا النهج التصوير ميزة كبيرة على المقايسات القياسية ex vivo وغيرها من الطرق للتصوير في الجسم الحي ، والتي إما فصل الأنسجة عن العمليات الفسيولوجية الحيوية10،11،12،13، أو الحد من التحليل الطولي لمدة أقصاها 12 ساعة14،15،16،37،42، على التوالي.
للتصوير المتكرر خلال هذه الفترة الزمنية ، لا يزال يتعين التغلب على العديد من التحديات. أولا، من المهم الحفاظ على صحة الجلد حول النافذة المزروعة، لأنه في حين أن الأنسجة الجريحة غير مكشوفة، فإن الجلد حولها قد لا يزال ملتهبا أو مصابا. التطبيق الروتيني لمرهم المضادات الحيوية سيساعد على منع هذا. ثانيا، مع مرور الوقت، قد تنضح من الجلد قطع احتقان تحت إطار النافذة ومنع وضع لوحة التثبيت المستخدمة لشل الماوس في مرحلة المجهر. وضع الأنسجة الرطبة على WHRIL لمدة 10-15 دقيقة سوف تليين هذا نضح والسماح بوضع إطار النافذة. ثالثا، إحدى آليات الجسم لإفراز المياه الزائدة والحفاظ على التوازن هي عن طريق زفير البخار. وهكذا، فإن الكثير من تناول السوائل (في الغالب نتيجة لحقن عوامل التباين أو تعليق الخلايا السرطانية) سوف يسبب سطح الرئة لإفراز هذا الماء الزائد، وسوف يؤدي إلى فصل أنسجة الرئة من WHRIL. ويمكن تجنب ذلك عن طريق الحد من حجم الحقن إلى حد أقصى قدره 50 ميكرولتر في وقت واحد. وأخيرا، حتى مع أفضل رعاية، قد تنفصل أنسجة الرئة أحيانا عن WHRIL بسبب تناول الماوس لحجم كبير من الماء أو بسبب إفراط الماوس في صياغة نفسه. عندما يحدث هذا، يحدث انفصال أنسجة الرئة عن WHRIL عادة ببطء، بدءا من الحافة الخارجية. وبالتالي، قد يكون من المستحيل متابعة بعض مجالات الرؤية الموجودة في اليوم الأول من التصوير طوال مدة النافذة. ووجد أنه سيتم الحصول على أفضل نتائج التصوير في غضون الأيام القليلة الأولى وأن استخدام تقنيات الفسيفساء مثل التصوير داخل الفيتوريال عالي الدقة21 المنشور سابقا يمكن أن يقلل من تأثير هذا القيد.
وبالنظر إلى أن يتم دمج WHRIL في جدار الصدر من الماوس، والانجراف أثناء التصوير عموما ليست قضية هامة، طالما يتم دفع الرعاية لضمان أن المرفق بين النافذة والمجهر هو ثابت. ومع ذلك ، يمكن ملاحظة بعض كمية صغيرة من الانجراف خلال الوقت التالي مباشرة لوضع الماوس في مرحلة المجهر. قد يأتي هذا من استرخاء جسم الفأر أو من التمدد الحراري لمكونات المجهر (لوحة المرحلة ، مرحلة XY ، العدسة الموضوعية) بسبب الغرفة البيئية. ويمكن تجنب هذا الانجراف عن طريق تخصيص ~ 30 دقيقة للتوازن قبل بدء إجراء التصوير. هذه الفترة الزمنية تسمح لعلم وظائف الأعضاء الماوس لتحقيق الاستقرار تحت التخدير ويسمح لجميع المكونات للتوصل إلى التوازن الحراري. يمكن بسهولة التعامل مع أي كمية صغيرة من الانجراف المتبقي بواسطة خوارزميات حسابية مثل StackReg43 أو HyperStackReg44.
وأخيرا، هذا البروتوكول هو تحسين على الإصدار المكتوب مسبقا لسببين. أولا، يسمح الشكل البصري بتصور أفضل للبروتوكول الجراحي. وهذا مفيد بشكل خاص للخطوات الحاسمة حيث 1) يتم تجفيف الرئة عن طريق تطبيق تيار لطيف ثابت من الهواء المضغوط (الخطوة 3.24، الشكل 1J، 2) يتم إرفاق غطاء إلى الإطار نافذة تتحمل المركزية بطريقة تمنع الفخ من فقاعات (الخطوة 3.31) ، و 3) يتم إضافة كمية صغيرة من السيانواكريلات السائل في واجهة الزجاج المعدني لضمان ختم محكم بين غطاء الزجاج وإطار النافذة (خطوة 3.34، الشكل 1O).
في الختام ، مع ظهور WHRIL ، نظرا لقدرته على التصور دون الخلوي لنفس أنسجة الرئة عبر فترة طويلة ، تم تمكين المحققين حديثا لمعالجة العديد من الأسئلة التي لم تتم الإجابة عليها. على وجه التحديد ، يمكن البروتوكول المبين هنا من الاستكشاف الأساسي للعمليات الديناميكية الكامنة وراء العديد من الأمراض ، بما في ذلك تطور الانبثاث السرطاني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يكشف صاحبا البلاغ عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: CA216248 ، CA013330 ، وجائزة مونتيفيوري روث ل. كيرششتاين T32 للتدريب CA200561 ، وجائزة METAvivor المهنية المبكرة ، ومركز Gruss-Lipper Biophotonics وبرنامج التصوير المتكامل ، وجين أ. ومايلز ديمبسي. نود أن نشكر مرفق التصوير التحليلي (AIF) في كلية آينشتاين للطب على دعم التصوير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D.
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E.
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D.
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P.
