Summary
여기에서, 우리는 폐의 고해상도, 인트라비티 이미징을 가능하게 하는 뮤린 흉부에 대한 영구적으로 깃드는 광학 창의 외과 이식을 위한 프로토콜을 제시합니다. 창의 영속성은 폐에 있는 동적 세포 프로세스의 연구 결과, 특히 보급된 종양 세포의 전이성 진행과 같이 천천히 진화하는 그들에 적합합니다.
Abstract
암 관련 사망률의 ~90%를 차지하는 전이는 1차 종양에서 뼈, 뇌 및 폐와 같은 이차 부위에 암세포의 전신 확산을 수반합니다. 광범위하게 연구되었지만,이 과정의 기계학적 세부 사항은 제대로 이해되지 않습니다. 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI)을 포함한 일반적인 이미징 양식은 다양한 정도의 총 시각화를 제공하지만, 각 단계는 개별 종양 세포의 역학을 감지하는 데 필요한 시간적 및 공간 적 해상도가 부족합니다. 이 문제를 해결하기 위해 일반적인 전이성 부위의 인트라비티 이미징에 대해 수많은 기술이 설명되어 왔습니다. 이 사이트의, 폐는 생활을 지탱에 있는 그것의 섬세하고 중요한 역할 때문에 인트라생명 화상 진찰을 위해 접근하는 특히 도전적인 입증되었습니다. 몇몇 접근은 이전에 그대로 폐의 단하나 세포 인트라바이탈 화상 진찰을 위해 기술되었더라도, 모두는 6-12 시간으로 가능한 최대 화상 진찰 기간을 제한하는 고도로 침습적이고 말단 절차를 관련시킵니다. 여기에 설명된 폐(WHRIL)의 고분해능 이미징을 위한 최소 침습성 흉부 광학 창의 영구 이식을 위한 향상된 기술이다. 마이크로 카르타포그래피에 적응된 접근법과 결합된 혁신적인 광학 창은 여러 이미징 세션과 여러 주에 걸쳐 단일 세포 해상도에서 그대로 폐의 직렬 적인 인내 이미징을 용이하게 합니다. 화상 진찰 데이터를 수집할 수 있는 전례없는 시간 기간을 감안할 때, WHRIL는 전이성 진행의 근본적인 동적 기계장치 및 폐 내의 수많은 추가 생물학 프로세스의 가속된 발견을 용이하게 할 수 있습니다.
Introduction
사망의 ~90%를 담당하는 전이는 암 관련 사망률1의주요 원인이다. 임상관찰된 전이(뼈, 간, 폐, 뇌)2의주요 부위 중, 폐는 생체 내 현미경 검사를 통해 생체 내 이미징에 특히 도전적임을 입증하였다. 이것은 폐가 영구적 인 움직임에 섬세한 기관이기 때문이다. 폐의 지속적인 움직임은 내구 심장 운동에 의해 더 복합, 정확한 이미징에 상당한 장벽을 나타냅니다. 따라서, 고해상도 인트라비티 광학 이미징을 위한 양상에 대한 상대적 접근성으로 인해 폐 내의 암 성장은 종종 신비한 과정3으로간주되었다.
임상 환경에서는, 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI)과 같은 이미징 기술은 폐4와같은 온전한 생명 기관 내에서 깊은 시각화를 가능하게 한다. 그러나, 이 양식은 총 기관의 우수한 전망을 제공하지만 (종종 임상 증상의 발병 전에 병리학을 드러내는 것), 그들은 전이의 초기 단계를 통해 진행으로 개별 보급 종양 세포를 검출하는 부적절한 해상도입니다. 따라서 앞서 언급한 양식이 폐에 전이의 징후를 제공할 때, 전이성 포시는 이미 잘 확립되고 확산되고 있다. 종양 미세환경은 암 진행및 전이형성에중추적인 역할을 하기 때문에5,6,생체 내에서 전이성 파종의 초기 단계를 조사하는 데 큰 관심이 있다. 이러한 관심은 1차 종양이 검출되기 전에암세포가 보급된다는 인식이 높아짐에 따라 더욱 높아지고있으며,1차 종양이 검출되기전에도 7,8, 그리고 매크로 전이9로 나아지기 전에 1세포와 휴면 상태에서 수십 년 동안 생존한다는 증거가 증가하고있다.
이전에는 단일 세포 해상도에서 폐의 이미징은 반드시 전 생체 내 또는 각성제제(10,11,12,13)를포함하여 단일 시점으로 분석을 제한하고 있다. 이 준비는 유용한 정보를 제공하는 동안, 그들은 그대로 순환 시스템에 연결된 기관 내의 종양 세포의 역학에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다.
이미징의 최근 기술 발전은 최대 12h14,15,16의기간 동안 단세포 해상도에서 그대로 폐의 생명 내 시각화를 가능하게했다. 이것은 기계 환기, 흉곽의 절제술 및 진공 보조 폐 고정을 포함하는 프로토콜을 사용하여 뮤린 모델에서 달성되었습니다. 그러나, 생리학적으로 전형적인 폐의 첫 번째 단일 세포 분해성 영상을 제공했음에도 불구하고, 이 기술은 매우 침습적이고 말단이며, 따라서 인덱스 절차를 넘어 추가 이미징 세션을 배제한다. 따라서 이러한 제한은14,15,16의휴면 및 재개시와 같이 12h 이상 걸리는 전이성 단계의 연구에 적용되지 않습니다. 또한, 이 화상 진찰 접근을 사용하여 관찰된 세포 행동의 패턴은 진공 유도된 압력 차동이 혈류량에 있는 우회를 일으키는 원인이 되기 위하여 확률이 높다는 것을 감안할 때, 신중하게 해석되어야 합니다.
이러한 한계를 극복하기 위해, 폐의 고해상도 이미징을 위한 최소 침습창(WHRIL)이 최근에 개발되어 기계적환기(17)를필요로 하지 않고 며칠에서 몇 주 동안 연쇄 이미징을 용이하게 한다. 이 기술은 정상적인 폐 기능의 보존을 위해 밀봉 된 흉부 구멍이있는 '투명 흉곽'의 생성을 수반합니다. 절차는 잘 용납되어 마우스가 기준 활동 및 함수를 의미있게 변경하지 않고 복구할 수 있도록 합니다. 각 각 이미징 세션에서 정확히 동일한 폐 영역을 안정적으로 지역화하기 위해, 마이크로카르타포그래피로 알려진 기술이 이창(18)에적용되었다. 이 창을 통해 폐의 혈관 침대에 도착하여 내피를 건너 세포 분열을 겪고 미세 전이로 성장함에 따라 세포의 이미지를 캡처 할 수있었습니다.
여기서, 연구 결과는 그것의 재현성과 질을 증가하는 동시에 수술을 단순화하는 WHRIL의 이식을 위한 향상된 수술 프로토콜의 상세한 설명을 제시합니다. 이 프로토콜은 전이의 근본적인 동적 프로세스의 조사를 가능하게 하기 위하여 디자인된 동안, 기술은 폐 생물학과 병리학의 수많은 프로세스의 조사에 대안적으로 적용될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 알버트 아인슈타인 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 사전 승인을 포함하여 척추 동물 의 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 창의 패시비션
- 광학 창프레임(보충 도 2)을효소 활성 세제의 1%(w/v) 용액으로 헹구는 다.
- 유리 항아리 내부에는 광학 창 프레임을 70°C에서 30분 동안 수산화 나트륨 용액을 5%(w/v)로 담급니다.
- 제거 하고 탈화 된 물로 창 틀을 씻어.
- 새로운 유리 항아리 안에는 광학 창 프레임을 7% (w/v) 구연산 용액을 55°C에서 10분 동안 담급니다.
- 다시, 제거하고 탈이온 물로 창 프레임을 씻어.
- 반복 단계 1.2; 그런 다음, 제거하고 탈온 된 물로 창 틀을 세척합니다.
2. 수술 준비
- 후드 또는 라미나르 플로우 캐비닛에서 수술을 수행합니다. 수술 장의 오염을 피하려면 각각 준비, 수술 및 회복을 위해 뚜렷하고 분리 된 영역을 보장하십시오.
- 수술에 앞서, 자동 클라브에 있는 모든 수술 기구를 살균하십시오. 후속 절차가 계획되면 뜨거운 비드 멸균기를 사용하여 기기를 다시 멸균하십시오. 이 외과 적 수술에 대 한 팁 전용 기술이 사용 됩니다.
- 가열 된 수술 비드 및 비드 살균기에 전원.
- 마취 챔버에서 5 % 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
- 모발을 제거하려면 왼쪽 가슴 절개 부위에 탈모 크림을 넉넉하게 발라주세요. 20s 이상 후, 촉촉한 티슈 페이퍼를 사용하여 모발과 탈모 크림을 단단히 닦아냅니다. 수술 부위에서 모든 머리카락을 제거하기 위해 필요에 따라 반복하십시오.
- 2-0 실크 봉합사를 사용하여 22 G 카테터의 베이스에 매듭을 묶어 2 인치 긴 꼬리를 남깁니다 (그림 1A참조).
3. 폐 창 수술
- 방부제 비누를 사용하여 손을 씻으시면 됩니다.
- 새로운 수술에 앞서 새로운 멸균 장갑을 착용하십시오.
- 각막 건조와 마우스의 눈에 손상을 방지하기 위해, 양쪽 눈에 안연고를 적용합니다.
- 멸균 PBS의 90 μL에 부프레노르핀 10 μL (0.1 mg/kg)을 희석한 다음 수술 전 진통을 보장하기 위해 피하 주입합니다.
- 실크 봉합사 묶인 22 G 카테터15로마우스를 삽관한다. 인플레이션 전구를 사용하여 전구 압착 시 양측 가슴이 상승하는 것을 지적하여 성공적인 삽관을 확인하십시오.
- 마우스 주물 주위에 2-0 실크 봉합사를 묶어 삽관 카테터를 보호하십시오(그림 1B참조).
- 가열 된 수술 스탠드에 마우스를 놓고 왼쪽 흉부를 노출오른쪽 측면 decubitus에 배치합니다.
- 인공호흡기를 삽관 카테터에 연결합니다.
- 인공호흡기에서 제어되고 안정적인 환기를 보장한 다음 이소플루오란을 3%로 낮춥춥시다. 절차의 개시및 절차의 기간 내내 주기적으로, 발가락 핀치 테스트를 수행하여 마취의 적정성을 평가합니다.
- 종이 테이프를 사용하여, 앞팔과 뒷다리를 각각 가열 수술 단계로 고정시합니다. 수술장에 대한 노출을 최대화하기 위해 마우스 등 길이에 테이프를 다른 조각으로 놓습니다(그림 1C참조).
- 멸균의 보존을 위해 후드 아래에 있는 모든 수술 기구를 엽니다.
- 마우스의 피부에 살균제를 넉넉하게 적용하여 수술 부위를 살균합니다.
- 집게를 사용하여 피부를 들어 올리고 ~ 10mm 원형 절개를 하고, 흉골 왼쪽에 ~7mm, 서브코스트 마진보다 ~7mm 우수합니다(도1D).
- 주요 선박을 신중하게 식별합니다. 혈관의 분할이 필요한 경우, 배혈을 유지하기 위해 전기 카우터리 펜으로 양쪽 끝에서 소작.
- 갈비뼈를 덮어 연조직을 절제합니다.
- 집게를 사용하여 6th 또는 7th 립을 상승시킵니다. 무딘 미세 해부 가위의 단일 블레이드를 사용하여, 둥근 측은 폐를 향해, 조심스럽게 내구 공간(도 1E)에들어가기 위해 6th와 7th 갈비뼈 사이의 늑간 근육을 관통한다.
- 폐를 붕괴시키고 가슴 벽에서 분리하기 위해 결함에서 압축 공기 통을 섬세하게 배출합니다. iatrogenic 폐 손상을 방지하기 위해 짧은 버스트에 압축 공기를 발사.
- 생검 펀치를 절삭 공구 위에놓고(보조 도 1)를배치하고 늑간 절개를 통해 절삭 공구의 베이스를 신중하게 조작한다(도1F).
- 흉벽과 평행하게 절단 공구의 베이스를 지향한다. 리브케이지(그림 1G)를통해 5mm 원형 구멍을 뚫습니다.
참고: 노출된 폐 조직이 손상의 흔적없이 분홍색인지 확인하십시오. - 5-0 실크 봉합사를 사용하여, 구멍에서 지갑 문자열 스티치 ~1mm를 만들고, 둘레, 갈비뼈와 인터레이스(그림1H).
- 원형 결함의 가장자리가 창의 홈 내에 정렬되는 것을 창 프레임을 배치합니다(그림 1I참조).
- 5-0 실크 봉합사를 단단히 묶어 이식된 창을 단단히 잠급구합니다.
- 1 mL 주사기에 청약된 시아노아크레이트 젤 접착제 100 μL을 적재합니다.
- ~10-20s(도1J)에압축 공기의 꾸준한 부드러운 스트림을 적용하여 폐를 건조.
- 집게를 사용하여 외부 가장자리로 창 프레임을 잡고 부드럽게 들어 올려 창 프레임의 밑면에서 폐를 분리합니다.
- 광학 창 프레임의 밑면을 따라 청약 접착제의 얇은 층을 분배(도 1K).
- 폐를 팽창시키기 위해 인공호흡기의 양양성 최종 만료 압력(PEEP)을 증가시다.
- 10-20s를 보관하고, 광학 창프레임을 폐 조직에 부착하기 위해 부드럽지만 단단한 압력을 가한다(도1L).
- 남은 시아노아크라일트 젤 접착제를 직사각형 커버슬립에 5mm 방울을 분배합니다.
- 진공 픽업을 사용하여 5mm 커버슬립을 선택합니다. 커버슬립의 밑면을 접착제에 담근 다음, 직사각형 커버슬립의 측면에 대해 3회 과도한 접착제를 긁어 내어 매우 얇은 층만 남아있다(도 1M).
- 조심스럽게 광학 창 프레임의 중심에 오목 내부에 맞게 커버 슬립을 배치하고 각도로 폐 조직 위에 개최됩니다. 인공호흡기를 잠깐 고정하여 양압을 생성하고 폐를 하이퍼 팽창시다. 회전 운동을 사용하여 폐 조직과 평행하게 커버슬립을 지향하여 폐 표면과 커버슬립의 지하표면 사이에 직접 적인 예착을 생성합니다. 부드러운 압력을 유지하여 시아노아크레이트 접착제를 설정할 수 있습니다(~25s).
- 진공픽업(도 1N)에서커버슬립을 분리하기 위해 집게를 사용합니다.
- 5-0 실크 봉합사를 사용하여 지갑 끈 스티치를 다시 만들고, 이번에는 피부 절개의 컷 엣지에서 1mm <. 고정 매듭으로 단단히 묶기 전에 창 프레임의 외부 테두리 아래에 여분의 피부를 넣습니다.
- 커버슬립과 윈도우 프레임 사이의 밀착 씰을 보장하려면 금속 유리 인터페이스에서 소량의 액체 시아노아크라이레이트(그림 1O참조)를 분배합니다.
- 멸균 바늘을 1 mL 인슐린 주사기에 부착합니다. 시포이드 프로세스 아래에 바늘을 삽입하고, 왼쪽 어깨쪽으로 전진하고, 횡격막을 통해 흉부 구멍에 들어갑니다. 흉부 구멍에서 잔류 공기를 제거하기 위해 주사기에 부드럽게 다시 그립니다 (그림 1P참조).
- 마우스에서 테이프를 제거합니다.
- 이소플루란을 끕니다.
- 마우스가 깨어날 준비가 될 때까지 100 % 산소로 환기를 계속합니다.
- 마우스 주위에 2-0 실크 봉합사를 조심스럽게 자르고 마우스를 추방합니다.
- 마우스를 깨끗한 케이지로 옮기고 완전히 복구될 때까지 모니터합니다. 호흡에 있는 어려움의 표시가 존재하는 경우에 마우스를 안락사합니다.
- 멸균 인산염 완충액(PBS)의 90 μL에서 희석된 부프레노르핀 10μL(0.1 mg/kg)를 피하하여 수술 후 진통을 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜에 설명된 외과 적 수술의 단계는 그림 1에요약되고 도시된다. 간단히, 수술 전에, 마우스는 마취되고 왼쪽 흉부 위에 머리는 제거됩니다. 마우스는 흉부 구멍의 침범 시 생존을 가능하게 하기 위하여 삽관되고 기계적으로 환기됩니다. 갈비뼈를 덮어 놓인 연조직은 절제되고,6번째와 7번째 갈비뼈에 걸쳐 작은 원형 결함이 생성됩니다. 광학 창 프레임은 결함에 삽입되고 그 아래쪽(투명 조리개 외부)은 폐 조직에 부착된다. 그런 다음 창 프레임은 봉합사와 접착제의 조합으로 고정되어 흉부 구멍을 다시 밀봉하고 박리 후 정상적인 호흡을 재개할 수 있습니다. 성공적으로 이식되면 폐는 광학 창(가슴 벽의 일부로 통합됨)을 준수하며, 내구 내 압력 그라데이션이 보존됩니다. 이렇게 하면 마우스의 편안한 생존을 허용하여 프로토콜 허용 량(2주)까지 매일 이미징할 수 있습니다. 그런 다음 다른Windows15,19,20에대해 이전에 설명한 대로 창을 통해 수행할 수 있다.
다양한 세포 유형, 생물학적 구조 또는 세포 기능 상태의 시각화를 위해, 여기에 제시된 절차는 형광단백질(21)을 발현하도록 유전적으로 조작되거나염료(22)로주입된 광범위한 마우스에서 수행될 수 있다. 창의 영구적 특성은광변환(23,24) 또는 마이크로카르토그래피(17,18)와같은 시야 의 재지역화를 위한 기술과 호환된다. 마이크로 카르태그래피는 관심 영역을 예측하고 다시 지역화하기 위해 이미징 세션 간의 고정 된 fiducial 마크 좌표의 계산 된 변환을 사용하여 삼각 측량 기술입니다. 전술한 바와 같이 생성된 창에서, 이러한 필적 마크는 현미경으로 쉽게 식별할 수 있는창프레임(보충도 2)에새겨진 가벼운 스크래치이다. 이것은 그렇지 않으면 표시가없는 조직에서도 동일한 시야를 여러 번 찾을 수 있게합니다. 도 2는 폐 혈관이 염료 표지 된 고분자 량 dextran (테트라메틸lrhodamine 155 kD dextran) 및 동일한 마이크로 혈관 절제술의 주사에 의해 표시 된 마우스에서 이러한 기술의 결과를 보여줍니다 3 일 동안 다시 국화.
이러한 덱은 종양 세포내막25,26,27의기간 동안 유도되는 과도 혈관 개구부를 평가하는 데 매우 유용한 것으로 나타났다. 실제로, 1차 유방 종양에서, 이 높은 분자량 dextran은 그렇지 않으면 효과적으로 혈관에 격리되고교막(25)으로누출되지 않는 것으로 나타났습니다. 이는 신혈관형성 혈관으로부터 수동적으로누출되는것으로 나타난 저분자량(예: 10kD 또는 70kD)의 덱스트랜스와 는 대조적이다. 한편, 건강한 폐 혈관은 덱스트랜스 >10 kD가엑소좀(30) 또는바이러스(31)에노출되는 경우와 같이 장기에 대한 모욕시 간질로만 빠져나가는 등 누출에 더 강한 것으로 관찰되고 있다. 다양한 조영제는 또한 혈관 투과성 이외에 폐내의 다른 매개변수(예를 들어, 핵 마커, 라이브/데드 지표, 산화 스트레스 리포터, 혈류 속도 추적기)에 있는 그밖 매개변수를 측정하기 위하여 존재합니다. 우수한 자원 카탈로그는 Ueki 외22에의해 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.
WHRIL은 폐의 혈류의 역학을 조사하는 데 매우 적합한 기술입니다. 이것은 여러 가지 방법으로 달성 될 수있다. 첫째, 상대적으로 느린 프레임 속도(초당 1~10프레임, fps)를 사용하여 이미지화될 경우, 라벨이 없는 적혈구가 큰 혈관에서 흐를 때 만드는 그림자에 의해 혈액 흐름 속도를 결정할 수 있다. 낮은 fps에서, 이러한 그림자는 혈관에 상대적 각도가 적혈구 유량32 (그림 2,노란색 선)를 계산하는 데 사용할 수있는 라인을 형성한다. 둘째, 그림자는 또한 현미경의 빠른 스캔 축으로 혈관을 정렬하고 급속 선스캐닝33,34,35를사용하여 kymographs를 획득하여 낮은 fps 현미경에 추적될 수 있다. 마지막으로, 시간이 지남에 따라 신호를 통합할 수 있는 현미경상에서 높은 프레임 속도(>10fps)로 이미징할 때(예를 들어, 충전 결합 장치(CCD) 검출기를 장착한 회전 디스크 공초점), 개별 입자는16,17로직접 추적될 수 있다. 이 경우 고정 된 객체가 밝은 점으로 나타나고 흐르는 물체는 순환을 통해 트랙을 추적합니다. 셀 속도는 트랙의 길이를 측정하고 프레임 획득 시간으로 나누어 정량화될 수 있다. 이것의 예는 도 3 및 보충 영화 1에서주어지며, 여기서 2 μm 형광 마이크로 스피어는 이미징 전에 마우스에 침입하여 주입되었습니다.
반복적으로 일관되게 동일한 시야로 돌아갈 수 있는 기능을 통해 며칠 동안 진화하는 프로세스의 시각화가 가능합니다. 이 적용의 데모로서, WHRIL은 폐 내 유방암 세포의 전이성 진행을 시각화하는 데 사용되었다17,21: 즉, 시간이 지남에 따라 폐 혈관에 도착하는 개별 종양 세포의 운명을 추적하였다. 이 개념은 단일 보급 종양 세포가 폐 미세 혈관의 세그먼트에 숙박 한 직후 시각화되는 도 4A에묘사됩니다. 후속 일에 같은 위치로 돌아 종양 세포의 운명을 밝혀 (예를 들어, 재순환, 사치, 등). 폐내 전이성 진행의 절정 단계에 대한 조사에 적용, 종양 세포 도착(도 4B),사치(도 4C)및 거시 전이를 형성하기 위해 증식을 포함하여 동적 과정을 시각적으로 연대기수(도 4D).
그림 1: 폐의 고해상도 이미징을위한 창의 이식을위한 수술 요약 (WHRIL). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마이크로 카트로그래피를 사용하면 광학 창 내에서 고정 된 위치의 재지역화를 가능하게합니다. 광학적으로 투명한 커버슬립 하에서 폐의 단일 부위의 다광인 내배동 이미징은 마이크로카르타포그래피를 사용하여 3일 연속 으로 재배치된 미세 혈관궤수를 나타낸다. 노란색 화살표는 매일 연속으로 식별되는 단일 선박에서 명확하게 정의 할 수있는 분기 점을 나타냅니다. 노란색 선은 라벨이 없는 적혈구가 큰 용기에서 흐를 때 만드는 그림자를 강조 표시합니다. 선박에 대한 이러한 선의 각도는 적혈구 유량을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 빨간색 = tdTomato 라벨 내피 세포 와 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran 라벨 혈액 혈청, 녹색 = GFP 표지 종양 세포, 블루 = 제 2 고조파 생성. 스케일 바 = 15 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 혈류율의 시각화. 혈류량은 2 μm 직경형 마이크로스피어를 복고풍 궤도로 주입하고 혈관을 통과하는 경로를 이미징하여 시각화될 수 있다. 시간이 지남에 따라 신호를 통합할 수 있는 현미경(예: CCD 검출기가 장착된 회전 디스크 공초점)에서 이미지화되면 고정된 미세구가 밝은 점(화살표)으로 나타나고 흐르는 구체는 순환(브래킷 선)을 통해 트랙을 추적합니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. WHRIL은 전파된 종양 세포의 운명을 직접 시각화하여 폐 내의 전이성 폭포의 각 단계를 포착할 수 있다. (A)전파된 종양 세포(green)의 운명을 추적하는 것은 WHRIL을 통해 며칠 동안 직렬 이미징으로 달성할 수 있다. 1일째에, 종양 세포는 폐 혈관에 도착하고 박혀 있는 것을 관찰됩니다. 2일과 3일에 세포는 더 이상 폐 혈관에 존재하지 않으며, 재순환되거나 죽는다. 스케일 바 = 15 μm.(B-D) 폐내 종양 세포 전이의 각 단계의 시각화. (B)도착 후 폐 혈관에 박혀 있는 내분비종양 세포(green). (C)폐 완두엽종으로 사치화 한 후 종양 세포 (녹색)를 전파한다. (D)증식및 마이크로 전이로 성장한 종양 세포. 빨간색 = tdTomato 라벨 내피 세포 와 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran 라벨 혈액 혈청, 녹색 = GFP 표지 종양 세포, 블루 = 제 2 고조파 생성. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 동영상 1: 도 3에 대응하는 비디오는 순환2 μm 마이크로스피어를 순환하는 폐 혈관을 보여주는 것입니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 5mm 생검 펀치를 안내하는 데 사용되는 틴리스 스틸 절삭 공구용 기계적 설계 도면.
보조 도 2: 스테인레스 스틸 창 프레임에 대한 기계적 디자인 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: 창 홀더 도구용 기계적 설계 도면입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
폐와 같은 먼 전이의 사이트에서 고해상도 광학 이미징은 종양 세포 전이의 정교한 역학에 대한 통찰력을 제공합니다. 단일 암 세포의 생체 내 시각화와 숙주 조직과의 상호 작용을 가능하게 함으로써 고해상도 인트라바이탈 이미징은 전이의 근본적인 메커니즘을 이해하는 데 중요한 역할을 입증했습니다.
여기에 설명된 고해상도 다광자 현미경 검사를 통해 뮤린 폐의 직렬 이미징을 가능하게 하도록 설계된 광학 창의 영구 흉부 이식을 위한 향상된 외과 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 창은 잘 용인되고, 흉부 구멍을 성공적으로 재밀봉할 수 있는 능력을 감안할 때, 자발적인 환기에 필요한 내측 압력 그라데이션을 유지할 수 있습니다(뮤린 폐14,15,16,36,37의 이미징을 위한 다른 이전에 설명된 창과는 달리 ). 이것은 마우스가 마취에서 깨어나고, 독립적으로 호흡하고, 여러 주에 걸친 오랜 시간 동안 투명한 흉곽으로 편안하게 살아남을 수 있게 합니다.
이 창을 사용하여, 단일 세포 해상도, 도착, 사치, 미세 메타타스로의 성장을 포함한 전이의 모든 단계를 시각화 할 수 있었습니다.
프로토콜에는 몇 가지 기술적 숙련도가 필요하지만 몇 가지 주요 단계에 대한 연습과 주의 깊은 주의를 기울여 높은 성공률로 절차를 수행할 수 있습니다. 첫째, 수술 전에 모발을 제거할 때, 20s 이하의 접촉 후 촉촉한 조직으로 탈모 크림을 제거하여 마우스의 피부를 보호하는 것이 중요합니다. 수술 중, 혈관절단을 피하기 위해 극도의주의를 기울여야 합니다. 유방 지방 패드를 제거하는 동안 상반신 또는 내부 유방 동맥의 분열로 인해 가장 일반적으로 발생하는 과도한 출혈은 수술 장에서 시각화를 모호하게하거나 exsanguination을 통해 사망으로 이어질 수 있습니다. 본 프로토콜에 새로 기재된 생검 펀치 및 절삭공구(보충 도 1)의활용은 흉곽을 통해 원형 결함의 생성을 상당히 서두르고 단순화하고 이식할 수 있는 창 홀더 도구이다. 이러한 발전의 구현은 절차의 성공률을 크게 향상시키고 이전 수술 기술의 필요한 수준을 감소시킵니다. 개별 실험실은 보충 수치의 도면을 사용하여 사내 또는 상업용 기계 상점으로 이러한 도구를 제조할 수 있습니다. "기계 가게 입찰 사이트"에 대한 인터넷 검색은 지역 상업 용 기계 상점을 찾는 데 도움이 될 여러 온라인 응용 프로그램을 얻을 것이다.
마지막으로, 폐 조직이 접착제 적용 전에 건조하게 유지되도록하는 것이 중요합니다. 커버슬립 부착에 실패한 가장 흔한 함정은 프레임 이나 커버 글래스로 정점하기 전에 폐 표면에서 수분을 완전히 제거하지 못하는 것입니다. 또한, 품질의 이미지를 보장하기 위해 접착제 (<10 μm)의 매우 얇은 층을 적용해야합니다. 커버 글래스를 배치하기 전에 과잉 접착제를 긁어 내보내야 합니다.
WHRIL을 통해 IVI의 주요 제한은 달성 가능한 침투의 상대적으로 제한된 깊이입니다. 따라서 폐 내에서 발생하는 병리학은 접근 할 수 없습니다. 이러한 한계에도 불구하고, 기술은 여전히 임상적으로 관련된 정보의 풍부를 산출할 수 있고, 특히 종양학 조사에서, 주변국화 폐전이38,39,40,41에대한 기술된 성향을 감안할 때. 궁극적으로, 이러한 이미징 접근법은 생체 내 영상에 대한 표준 전 생체 분석 및 기타 방법에 비해 상당한 이점을 제공하며, 이는 중요한 생리적 과정으로부터 조직을분리하여 10,11,12,13,또는 세로 분석을 최대 지속시간 12시간14,15,16,37,42로제한한다. 각각.
이 기간 동안 반복적인 이미징의 경우 몇 가지 어려움을 극복해야 합니다. 첫째, 이식된 창 주위의 피부 건강을 유지하는 것이 중요하며, 상처입은 조직이 노출되지 않는 동안 주변피부가 여전히 염증이 있거나 감염될 수 있습니다. 항생제 연고의 일상적인 응용 프로그램은이 방지 하는 데 도움이 됩니다. 둘째, 시간이 지남에 따라, 절단 된 피부에서 추방은 창 프레임 아래에 동구될 수 있으며 현미경 단계에서 마우스를 고정하는 데 사용되는 고정 플레이트의 배치를 방지 할 수 있습니다. 10-15 분 동안 WHRIL 위에 젖은 조직을 배치하면이 exudate를 부드럽게하고 창 프레임의 배치를 허용합니다. 셋째, 과도한 물을 배설하고 항상성을 유지하기 위한 신체의 메커니즘 중 하나는 증기의 호기를 통해서입니다. 따라서, 너무 많은 유체 섭취 (주로 조영제 또는 종양 세포 현탁액의 주입의 결과로) 폐 표면이 이 과잉 물을 배설하게 하고 WHRIL에서 폐 조직이 분리될 것입니다. 이것은 주사의 양을 한 번에 최대 50 μL로 제한하여 피할 수 있습니다. 마지막으로, 가장 좋은 치료에도 불구하고, 폐 조직은 때때로 마우스가 대량의 물을 섭취하거나 마우스가 과로로 인해 WHRIL에서 분리 될 수 있습니다. 이 발생 하는 경우, WHRIL에서 폐 조직의 분리는 일반적으로 천천히 발생, 외부 가장자리에서 시작. 따라서, 창의 전체 기간 동안 이미징의 첫 날에 위치한 보기의 일부 필드를 따르는 것은 불가능할 수 있습니다. 그것은 최고의 이미징 결과 처음 몇 일 이내에 얻을 것 이다 발견 하 고 이전에 발표 된 대용량 대해상도 인트라 베이직 이미징 등 모자이킹 기술을 채택 하는 것으로 나타났습니다21 이러한 제한의 영향을 최소화할 수 있습니다.
WHRIL이 마우스의 가슴 벽에 통합되어 있다는 것을 감안할 때, 화상 진찰 도중 드리프트는 일반적으로 중요한 문제가 아닙니다, 창과 현미경 사이 부착이 확고하다는 것을 확인하기 위하여 주의가 지불하는 한. 여전히, 현미경 단계에서 마우스의 배치 직후 시간 동안 일부 소량의 드리프트가 관찰될 수 있다. 이는 마우스 본체의 이완 또는 환경 챔버로 인해 현미경 성분(stage plate, XY 단계, 객관적렌즈)의 열 팽창으로부터 발생할 수 있다. 이 드리프트는 이미징 절차를 시작하기 전에 평형에 대해 ~30분을 할당하여 피할 수 있습니다. 이 기간 동안 마우스의 생리학은 마취 하에 안정화되고 모든 구성 요소가 열 평형에 올 수 있게 합니다. 스택Reg43 또는 하이퍼StackReg44와같은 계산 알고리즘에 의해 소량의 잔류 드리프트를 쉽게 처리할 수 있습니다.
마지막으로 이 프로토콜은 두 가지 이유로 이전 작성된 버전에 비해 개선된 것입니다. 첫째, 시각적 형식은 수술 프로토콜의 더 나은 개념화를 허용합니다. 이는 1) 폐가 압축 공기의 꾸준한 부드러운 스트림을 적용하여 건조되는 중요한 단계에 특히 유용합니다 (단계 3.24, 도 1J)커버슬립은 창프레임의 중앙 보어에 부착되어 기포(3.31단계) 및 3) 소량의 액체 시아노아크라이레이트가 금속 유리 인터페이스에 첨가되어 커버글래스와 윈도우 프레임(steps) 사이의 밀착 씰을 보장한다. 3.34, 그림 1O).
결론적으로, WHRIL의 출현과 함께, 연장된 기간에 걸쳐 동일 폐 조직의 세포 전 가시화에 그것의 편의성을 감안할 때, 조사자는 많은 대답되지 않는 질문을 해결하기 위하여 새로 힘을 실어줍니다. 구체적으로, 본 원에 명시된 프로토콜은 암 전이의 진행을 포함하여 수많은 병리학의 근본적인 탐구를 가능하게 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다: CA216248, CA01330, 몬테피오레의 루스 L. Kirschstein T32 교육 보조금 CA200561, 메타비보 초기 경력 상, 그루스 - 리퍼 바이오 포토닉스 센터와 통합 이미징 프로그램, 제인 A. 아인슈타인 의과 대학의 분석 영상 시설(AIF)에 이미징 지원을 부탁드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D.
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E.
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D.
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P.
