여기에서, 우리는 폐의 고해상도, 인트라비티 이미징을 가능하게 하는 뮤린 흉부에 대한 영구적으로 깃드는 광학 창의 외과 이식을 위한 프로토콜을 제시합니다. 창의 영속성은 폐에 있는 동적 세포 프로세스의 연구 결과, 특히 보급된 종양 세포의 전이성 진행과 같이 천천히 진화하는 그들에 적합합니다.
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방법 논문
폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
암 관련 사망률의 ~90%를 차지하는 전이는 1차 종양에서 뼈, 뇌 및 폐와 같은 이차 부위에 암세포의 전신 확산을 수반합니다. 광범위하게 연구되었지만,이 과정의 기계학적 세부 사항은 제대로 이해되지 않습니다. 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI)을 포함한 일반적인 이미징 양식은 다양한 정도의 총 시각화를 제공하지만, 각 단계는 개별 종양 세포의 역학을 감지하는 데 필요한 시간적 및 공간 적 해상도가 부족합니다. 이 문제를 해결하기 위해 일반적인 전이성 부위의 인트라비티 이미징에 대해 수많은 기술이 설명되어 왔습니다. 이 사이트의, 폐는 생활을 지탱에 있는 그것의 섬세하고 중요한 역할 때문에 인트라생명 화상 진찰을 위해 접근하는 특히 도전적인 입증되었습니다. 몇몇 접근은 이전에 그대로 폐의 단하나 세포 인트라바이탈 화상 진찰을 위해 기술되었더라도, 모두는 6-12 시간으로 가능한 최대 화상 진찰 기간을 제한하는 고도로 침습적이고 말단 절차를 관련시킵니다. 여기에 설명된 폐(WHRIL)의 고분해능 이미징을 위한 최소 침습성 흉부 광학 창의 영구 이식을 위한 향상된 기술이다. 마이크로 카르타포그래피에 적응된 접근법과 결합된 혁신적인 광학 창은 여러 이미징 세션과 여러 주에 걸쳐 단일 세포 해상도에서 그대로 폐의 직렬 적인 인내 이미징을 용이하게 합니다. 화상 진찰 데이터를 수집할 수 있는 전례없는 시간 기간을 감안할 때, WHRIL는 전이성 진행의 근본적인 동적 기계장치 및 폐 내의 수많은 추가 생물학 프로세스의 가속된 발견을 용이하게 할 수 있습니다.
서론
사망의 ~90%를 담당하는 전이는 암 관련 사망률1의주요 원인이다. 임상관찰된 전이(뼈, 간, 폐, 뇌)2의주요 부위 중, 폐는 생체 내 현미경 검사를 통해 생체 내 이미징에 특히 도전적임을 입증하였다. 이것은 폐가 영구적 인 움직임에 섬세한 기관이기 때문이다. 폐의 지속적인 움직임은 내구 심장 운동에 의해 더 복합, 정확한 이미징에 상당한 장벽을 나타냅니다. 따라서, 고해상도 인트라비티 광학 이미징을 위한 양상에 대한 상대적 접근성으로 인해 폐 내의 암 성장은 종종 신비한 과정3으로간주되었다.
임상 환경에서는, 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI)과 같은 이미징 기술은 폐4와같은 온전한 생명 기관 내에서 깊은 시각화를 가능하게 한다. 그러나, 이 양식은 총 기관의 우수한 전망을 제공하지만 (종종 임상 증상의 발병 전에 병리학을 드러내는 것), 그들은 전이의 초기 단계를 통해 진행으로 개별 보급 종양 세포를 검출하는 부적절한 해상도입니다. 따라서 앞서 언급한 양식이 폐에 전이의 징후를 제공할 때, 전이성 포시는....
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프로토콜
이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 알버트 아인슈타인 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 사전 승인을 포함하여 척추 동물 의 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 창의 패시비션
- 광학 창프레임(보충 도 2)을효소 활성 세제의 1%(w/v) 용액으로 헹구는 다.
- 유리 항아리 내부에는 광학 창 프레임을 70°C에서 30분 동안 수산화 나트륨 용액을 5%(w/v)로 담급니다.
- 제거 하고 탈화 된 물로 창 틀을 씻어.
- 새로운 유리 항아리 안에는 광학 창 프레임을 7% (w/v) 구연산 용액을 55°C에서 10분 동안 담급니다.
- 다시, 제거하고 탈이온 물로 창 프레임을 씻어.
- 반복 단계 1.2; 그런 다음, 제거하고 탈온 된 물로 창 틀을 세척합니다.
2. 수술 준비
- 후드 또는 라미나르 플로우 캐비닛에서 수술을 수행합니다. 수술 장의 오염을 피하려면 각각 준비, 수술 및 회복을 위해 뚜렷하고 분리 된 영역을 보장하십시오.
- 수술에 앞서, 자동 클라브에 있는 모든 수술 기구를 살균하십시오. 후속 절차가....
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결과
이 프로토콜에 설명된 외과 적 수술의 단계는 그림 1에요약되고 도시된다. 간단히, 수술 전에, 마우스는 마취되고 왼쪽 흉부 위에 머리는 제거됩니다. 마우스는 흉부 구멍의 침범 시 생존을 가능하게 하기 위하여 삽관되고 기계적으로 환기됩니다. 갈비뼈를 덮어 놓인 연조직은 절제되고,6번째와 7번째 갈비뼈에 걸쳐 작은 원형 결함이 생성됩니다. 광학 창 프레임은 결함에 삽입되고 그 아래쪽(투명 조리개 외부)은 폐 조직에 부착된다. 그런 다음 창 프레임은 봉합사와 접착제의 조합으로 고정되어 흉부 구멍을 다시 밀봉하고 박리 후 정상적인 호흡을 재개할 수 있습니다. 성공적으로 이식되면 폐는 광학 창(가슴 벽의 일부로 통합됨)을 준수하며, 내구 내 압력 그라데이션이 보존됩니다. 이렇게 하면 마우스의 편안한 생존을 허용하여 프로토콜 허용 량(2주)까지 매일 이미징할 수 있습니다. 그런 다음 다른Windows
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토론
폐와 같은 먼 전이의 사이트에서 고해상도 광학 이미징은 종양 세포 전이의 정교한 역학에 대한 통찰력을 제공합니다. 단일 암 세포의 생체 내 시각화와 숙주 조직과의 상호 작용을 가능하게 함으로써 고해상도 인트라바이탈 이미징은 전이의 근본적인 메커니즘을 이해하는 데 중요한 역할을 입증했습니다.
여기에 설명된 고해상도 다광자 현미경 검사를 통해 뮤린 폐의 직렬 이미징을 가능하게 하도록 설계된 광학 창의 영구 흉부 이식을 위한 향상된 외과 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 창은 잘 용인되고, 흉부 구멍을 성공적으로 재밀봉할 수 있는 능력을 감안할 때, 자발적인 환기에 필요한 내측 압력 그라데이션을 유지할 수 있습니다(뮤린 폐14,15,16,
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공개 사항
저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다: CA216248, CA01330, 몬테피오레의 루스 L. Kirschstein T32 교육 보조금 CA200561, 메타비보 초기 경력 상, 그루스 - 리퍼 바이오 포토닉스 센터와 통합 이미징 프로그램, 제인 A. 아인슈타인 의과 대학의 분석 영상 시설(AIF)에 이미징 지원을 부탁드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 효소 활성 세제 1% (w/v) 용액 | Alconox Inc | N/A | 수동 및 초음파 세척을 위한 프로테아제 효소가 함유된 농축된 음이온 세제 |
| 2 µ m 형광 마이크로스피어 | Invitrogen | F8827 | |
| 5mm 커버슬립 | 전자 현미경 과학 | 72296-05 | |
| 수산화나트륨 5%(w/v) 용액 | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| RB-1 절단 바늘이 있는 5-0 꼰 실크 | Ethicon, Inc. | 774B | |
| Sigma-Aldrich | 7%(w/v) 용액 | 251275 | |
| 8mm 스테인리스 스틸 창틀 | N/A | N/A | 주문제작, <강한>보충 그림 2 |
| 9cm 2-0 실크 넥타이 | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5mm 일회용 생검 펀치 | Integra | 33-35-SH | |
| 둔기 마이크로 해부 가위 | Roboz | RS-5980 | |
| 황동 창문 도구 홀더 | N/A | N/A | 맞춤 제작, 보충 그림 3 |
| 부프레노르핀 | 호스피라 | 0409-2012-32 | |
| 카테리 펜 | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| 클로르헥시딘 글루코네이트 | ; Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep 단일 스왑스틱 1.75 mL |
| 압축 공기 캔니스터 | Falcon | DPSJB-12 | |
| 시아노아크릴레이트 접착제 | Henkel 접착제 | LOC1363589 | |
| 광섬유 조명기 | O.C. White Company | FL3000 | |
| 비드 살균기 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe 집게 | Roboz | RS-5135 | |
| 적외선 열 램프 | Braintree Scientific | HL-1 | |
| 인슐린 주사기 | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane 기화기 | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson 바늘 홀더 잠금 장치 | Kalson Surgical | T1-140 | |
| 긴 면 팁 어플리케이터 | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & 드와이트 주식회사 | ||
| 네오마이신/폴리믹신 B/바시트라신 | 존슨 & Johnson | 501373005 | 항생제 연 |
| 연고 | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 종이 테이프 | Fisher Scientific | S68702 | |
| 쥐 인공 호흡기 | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| 직사각형 커버 유리 | Corning | 2980-225 | |
| 설치류 삽관 스탠드 | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| 소동물 폐 팽창 전구 | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| 스테인레스 스틸 절삭 공구 | N/A | N/A | 주문제작, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral | antibiotic Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| 생쥐용 SurgiSuite 다기능 수술 플랫폼, 온난화 | Kent Scientific | SURGI-M02 | 가열식 수술 플랫폼 |
| 기관 카테터 | Exelint International | 26746 | 22 G 카테터 |
| 진공 픽업 시스템 금속 프로브 | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
참고문헌
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., ....
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