Summary
Her præsenterer vi en protokol for kirurgisk implantation af et permanent iboende optisk vindue til murin thorax, som muliggør høj opløsning, intravital billeddannelse af lungen. Permanens af vinduet gør det velegnet til studiet af dynamiske cellulære processer i lungen, især dem, der langsomt udvikler sig, såsom metastatisk progression af formidlede tumorceller.
Abstract
Metastaser, tegner sig for ~ 90% af kræft-relaterede dødelighed, indebærer systemisk spredning af kræftceller fra primære tumorer til sekundære steder såsom knogle, hjerne og lunge. Selvom de er grundigt undersøgt, er de mekanistiske detaljer i denne proces stadig dårligt forstået. Mens almindelige billeddannelsesmetoder, herunder computertomografi (CT), positron emission tomografi (PET) og magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), tilbyder varierende grader af grov visualisering, mangler hver især den tidsmæssige og rumlige opløsning, der er nødvendig for at opdage dynamikken i de enkelte tumorceller. For at løse dette, talrige teknikker er blevet beskrevet for intravital billeddannelse af fælles metastatiske steder. Af disse steder har lungen vist sig særligt udfordrende at få adgang til intravital billeddannelse på grund af sin delikatesse og kritiske rolle i at opretholde livet. Selv om flere tilgange tidligere er blevet beskrevet for encellet intravital billeddannelse af den intakte lunge, alle indebærer meget invasive og terminale procedurer, begrænse den maksimale mulige billeddannelse varighed til 6-12 h. Beskrevet her er en forbedret teknik til permanent implantation af en minimalt invasiv thorax optisk Vindue for Høj opløsning Imaging af Lungen (WHRIL). Kombineret med en tilpasset tilgang til mikrokartografi letter det innovative optiske vindue seriel intravital billeddannelse af den intakte lunge ved encellet opløsning på tværs af flere billedbehandlingssessioner og spænder over flere uger. I betragtning af den hidtil usete varighed af tid, hvor billeddata kan indsamles, whril kan lette den accelererede opdagelse af de dynamiske mekanismer, der ligger til grund for metastatisk progression og mange yderligere biologiske processer i lungen.
Introduction
Ansvarlig for ~ 90% af dødsfald, metastaser er den vigtigste årsag til kræft-relaterededødelighed 1. Blandt de store steder for klinisk observeret metastaser (knogle, lever, lunge, hjerne)2, lungen har vist sig særligt udfordrende for in vivo imaging via intravital mikroskopi. Dette skyldes, at lungen er et delikat organ i evig bevægelse. Lungernes kontinuerlige bevægelse, yderligere forværret af intrathoracic hjertebevægelse, repræsenterer en betydelig barriere for præcis billeddannelse. Derfor, på grund af sin relative utilgængelighed til modaliteter for høj opløsning intravital optisk billeddannelse, kræft vækst i lungen er ofte blevet anset for en okkult proces3.
I den kliniske indstilling muliggør billedbehandlingsteknologier som computertomografi (CT), positronemissionstomografi (PET) og magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) visualisering dybt inde i intakte vitale organer som lungen4. Men mens disse modaliteter giver fremragende udsigt over bruttoorganet (ofte endda afslørende patologi forud for begyndelsen af kliniske symptomer), er de af utilstrækkelig opløsning til at opdage individuelle formidlede tumorceller, når de går gennem de tidlige stadier af metastaser. Derfor, på det tidspunkt, de ovennævnte modaliteter giver nogen indikation af metastaser til lungen, metastatisk foci er allerede veletableret og breder sig. Da tumor mikromiljø spiller en afgørende rolle i kræft progression og metastaser dannelse5,6, der er stor interesse i at undersøge de tidligste trin i metastatisk såning in vivo. Denne interesse er yderligere næret af den øgede påskønnelse, at kræftceller formidle, selv før den primære tumor er opdaget7,8 og den stigende dokumentation for, at de overlever som enkeltceller og i en sovende tilstand i årevis til årtier før udvækst i makro-metastaser9.
Tidligere har billeddannelse af lungen ved encellet opløsning nødvendigvis involveret ex vivo eller explant præparater10,11,12,13, der begrænser analyser til enkelte tidspunkter. Mens disse præparater giver nyttige oplysninger, de giver ikke nogen indsigt i dynamikken i tumorceller i organet forbundet til en intakt kredsløbssystem.
Nylige teknologiske fremskridt inden for billeddannelse har muliggjort intravital visualisering af den intakte lunge ved encellet opløsning over perioder på op til 12 timer14,15,16. Dette blev opnået i en murine model ved hjælp af en protokol, der involverede mekanisk ventilation, resektion af brystkassen, og vakuum-assisteret lunge immobilisering. Men på trods af at tilbyde de første enkelt celle-opløsning billeder af fysiologisk intakt lunge, teknikken er meget invasiv og terminal, og dermed udelukke yderligere billeddannelse sessioner ud over indekset procedure. Denne begrænsning forhindrer derfor dens anvendelse på studiet af metastatiske trin, der tager længere tid end 12 timer, såsom dvale og re-indledning af vækst14,15,16. Yderligere endnu, mønstre af cellulære adfærd observeret ved hjælp af denne billeddannelse tilgang skal fortolkes forsigtigt, da vakuum-induceret trykforskelle sandsynligvis vil forårsage omdirigeringer i blodgennemstrømningen.
For at overvinde disse begrænsninger blev der for nylig udviklet et minimalt invasivt vindue til højopløsnings imaging af lungen (WHRIL), hvilket lettede seriel billeddannelse over en længere periode på dage til uger uden behov for mekanisk ventilation17. Teknikken indebærer oprettelsen af en 'gennemsigtig brystkasse' med et forseglet brysthulrum til bevarelse af normal lungefunktion. Proceduren tolereres godt, så musen kan komme sig uden meningsfuld ændring af baseline aktivitet og funktion. For pålideligt at lokalisere nøjagtig den samme lungeregion ved hver respektive billedbehandlingssession blev der anvendt en teknik kaldet mikrokartografi på dette vindue18. Gennem dette vindue var det muligt at fange billeder af celler, da de ankommer til lungens vaskulære seng, krydse endothelium, gennemgå celledeling og vokse til mikrometastaser.
Her præsenterer undersøgelsen en detaljeret beskrivelse af en forbedret kirurgisk protokol til implantation af WHRIL, som forenkler operationen, samtidig med at dens reproducerbarhed og kvalitet øges. Mens denne protokol var designet til at muliggøre undersøgelse af de dynamiske processer, der ligger til grund for metastaser, kan teknikken alternativt anvendes til undersøgelser af mange processer af lungebiologi og patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol, er blevet udført i overensstemmelse med retningslinjer og bestemmelser for brug af hvirveldyr, herunder forudgående godkendelse fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Passivering af vinduer
- Skyl de optiske vinduesrammer (supplerende figur 2) med en 1% (w/v) opløsning af enzymatisk aktivt vaskemiddel.
- Inde i en glaskrukke nedsænkes de optiske vinduesrammer i 5% (w/v) natriumhydroxidopløsning i 30 min ved 70 °C.
- Fjern og vask vinduesrammerne med deioniseret vand.
- Inde i en ny glaskrukke nedsænkes de optiske vinduesrammer i 7% (w/v) citronsyreopløsning i 10 min ved 55 °C.
- Igen skal du fjerne og vaske vinduesrammerne med deioniseret vand.
- Gentag trin 1.2. derefter fjernes og vaskes vinduesrammer med deioniseret vand.
2. Forberedelse til operation
- Udfør operationen i en hætte eller laminar flow kabinet. For at undgå forurening af det operative felt skal du sikre særskilte, adskilte områder til henholdsvis forberedelse, kirurgi og nyttiggørelse.
- Forud for operationen steriliseres alle kirurgiske instrumenter i en autoklave. Hvis efterfølgende procedurer er planlagt, sterilisere instrumenter ved hjælp af en varm perle sterilisator. Til denne kirurgiske procedure anvendes en tips-only teknik.
- Strøm på den opvarmede kirurgiske perle og perle sterilisator.
- Bedøve musen med 5% isoflurane i anæstesikammeret.
- For at fjerne hår, generøst anvende depilatory creme til øverste venstre bryst snit site. Efter ikke længere end 20 s, fast tørre hår og depilatory creme ved hjælp af fugtet silkepapir. Gentag efter behov for at fjerne alt hår fra det kirurgiske sted.
- Ved hjælp af 2-0 silke sutur, binde en knude i bunden af en 22 G kateter, forlader 2-tommer lange haler (se figur 1A).
3. Lunge vindue kirurgi
- Vask hænder ved hjælp af antiseptisk sæbe.
- Før hver ny operation, don nye sterile handsker.
- For at forhindre hornhindetørring og skader på musens øjne, anvende oftalmologisk salve på begge øjne.
- Fortynd 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorphin i 90 μL steril PBS, og sprøjt derefter subkutant for at sikre præoperativ analgesi.
- Intuberere musen med silke sutur-bundet 22 G kateter15. Brug en inflation pære, bekræfte vellykket intubation ved at bemærke bilaterale bryst stige på pære klemme.
- Fastgør intubationskatetret ved at binde 2-0 silke suturen rundt om musens snude (se figur 1B).
- Placer musen på den opvarmede kirurgiske stativ og placere den i højre laterale decubitus at udsætte venstre brystkasse.
- Tilslut ventilatoren til intubationskatetret.
- Sørg for kontrolleret, stabil ventilation i ventilatoren og sænk derefter isofluorane til 3%. Ved procedurens begyndelse og periodisk i hele procedurens varighed vurderes anæstesiens tilstrækkelighed ved at udføre en tåspidstest.
- Ved hjælp af papir tape, cranially og caudally sikre for- og bagbenene, henholdsvis til den opvarmede kirurgiske fase. Placer et andet stykke tape langs længden af musens ryg for at maksimere eksponeringen for det kirurgiske felt (se figur 1C).
- Åbn alle kirurgiske instrumenter under emhætten for at bevare sterilitet.
- Steriliser det kirurgiske sted ved en generøs anvendelse af antiseptisk på musens hud.
- Brug sammenkævninger, løft huden og lav et ~10 mm cirkulært snit, ~7 mm til venstre for brystbenet og ~7 mm, der er bedre end underkostalmargenen (Figur 1D).
- Identificer omhyggeligt eventuelle større fartøjer. Hvis opdelingen af fartøjer er nødvendig, cauterize i begge ender med elektrokautery pen til at opretholde hæmostasis.
- Punktafgifter det bløde væv overlying ribbenene.
- Løft 6th eller 7th ribben ved hjælp af sammentak. Ved hjælp af en enkelt klinge af den stumpe mikro-dissekering saks, den afrundede side mod lungen, omhyggeligt gennembore intercostal muskel mellem 6th og 7th ribben for at komme ind i intrathoracic rummet (Figur 1E).
- Forsigtigt udledning trykluftbeholder på defekten til at kollapse lungen og adskille det fra brystvæggen. Brand trykluften i korte byger for at forhindre iatrogen lungeskade.
- Placer biopsistansen over skæreværktøjet (supplerende figur 1), og manøvrer forsigtigt skæreværktøjets bund gennem det intercostal indsnit (Figur 1F).
- Orient bunden af skæreværktøjet, så det er parallelt med brystvæggen. Punch en 5 mm cirkulær hul gennem brystkassen (Figur 1G).
BEMÆRK: Sørg for, at det eksponerede lungevæv er lyserødt uden tegn på skader. - Ved hjælp af 5-0 silke sutur, oprette en pung-streng søm ~ 1 mm fra hullet, omkredsligt, interlacing med ribbenene (Figur 1H).
- Placer vinduesrammen således, at kanterne af den cirkulære defekt justeres i vinduets rille (se figur 1I).
- Lås det implanterede vindue sikkert ved at binde 5-0 silke suturen tæt.
- Læg 100 μL cyanoacrylatgellimi i 1 mL-sprøjten.
- Tør lungen ved at påføre en stabil skånsom strøm af trykluft til ~10-20 s (Figur 1J).
- Brug sammenkrammer til at gribe vinduesrammen ved dens udvendige kant, løft forsigtigt for at sikre adskillelse af lungen fra undersiden af vinduesrammen.
- Dispenser et tyndt lag cyanoacrylatlim langs undersiden af den optiske vinduesramme (Figur 1K).
- Forøg det positive endeudløbstryk (PEEP) i respiratoren for at puste lungen op.
- Hold i 10-20 s, anvende blide, men fast tryk til at fastgøre den optiske vinduesramme på lungevævet (Figur 1L).
- Dispenser en 5 mm dråbe af det resterende cyanoacrylatgellimi på en rektangulær coverlip.
- Pick up 5 mm coverslip ved hjælp af vakuum pickupper. Dyp undersiden af dækslerne i klæbemidlet, og skrab derefter overskydende klæbemiddel tre gange mod siden af den rektangulære coverlip, således at der kun er et meget tyndt lag tilbage (Figur 1M).
- Placer forsigtigt coverlip til at passe ind i fordybningen i midten af den optiske vinduesramme og holdes over lungevævet i en vinkel. Fastgør kortvarigt ventilatoren for at generere positivt tryk, hyper-oppustning af lungen. Ved hjælp af en roterende bevægelse, orientere coverlip parallelt med lungevævet til at skabe direkte aposition mellem lungens overflade og undersiden af coverlip. Bevar et skånsomt tryk, så cyanoacrylatlimen kan indstilles (~25 s).
- Brug sammentakkerne til at adskille dækslerne fra vakuumopsamlingerne (Figur 1N).
- Ved hjælp af 5-0 silke sutur, igen skabe en pung-streng søm, denne gang <1 mm omskæring fra cut-kanten af huden snit. Put overskydende hud under vinduesrammens ydre kant, før du binder den tæt sammen med låseknuder.
- For at sikre en lufttæt forsegling mellem dækslet og vinduesrammen skal der dispenseres en lille mængde flydende cyanoacrylat ved metalglasgrænsefladen (se figur 1O).
- Fastgør en steril nål til en 1 mL insulinsprøjte. Sæt nålen under xiphoid processen, der bevæger sig mod venstre skulder og kommer ind i brysthulen gennem mellemgulvet. Træk forsigtigt sprøjten tilbage for at fjerne eventuel resterende luft fra brysthulen (se figur 1P).
- Fjern båndet fra musen.
- Sluk for isoflurane.
- Fortsæt ventilationen med 100% ilt, indtil musen ser ud til at være klar til at vågne.
- Skær forsigtigt 2-0 silke suturen rundt om musens snude og extubate musen.
- Overfør musen til et rent bur og overvåge, indtil fuldt tilbagebetalt. Aflive musen, hvis der er tegn på vejrtrækningsbesvær.
- Der tilvejebringes postoperativ analgesi ved subkutant indsprøjtning af 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorphin fortyndet i 90 μL steril fosfatbufferopløsning (PBS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trinene i den kirurgiske procedure, der er beskrevet i denne protokol, er sammenfattet og illustreret i figur 1. Kort, før operationen, mus er bedøvet og håret over venstre brystkasse fjernes. Mus er intuberet og mekanisk ventileret for at muliggøre overlevelse ved brud på brysthulen. Blødt væv, der overlyder ribbenene, fjernes, og der skabes en lille cirkulær defekt, der spænder over ribbenene på6. og7. ribben. Den optiske vinduesramme indsættes i defekten, og dens nederste side (uden for den klare blænde) klæbes til lungevævet. Vinduesrammen fastgøres derefter med en kombination af suturer og klæbemiddel, der forsegler brysthulen igen og tillader genoptagelse af normal vejrtrækning efter overflod. Når det er blevet implanteret, vil lungen klæbe til det optiske vindue (som er indarbejdet som en del af brystvæggen), med intrathoracic tryk gradienter bevaret. Dette gør det muligt for behagelig overlevelse af musen, muliggør daglig billeddannelse op til protokollen godtgørelse (2 uger). Intravital imaging kan derefter udføres gennem vinduet, som tidligere beskrevet for andre windows15,19,20.
Til visualisering af forskellige celletyper, biologiske strukturer eller cellulære funktionelle tilstande kan den procedure, der præsenteres her, udføres på en lang række mus, der enten er blevet genetisk manipuleret til at udtrykke fluorescerende proteiner21 eller injiceret med farvestoffer22. Vinduets permanente karakter gør det kompatibelt med teknikker til omlocalisering af synsfelter som fotokonvertering23,24 eller mikrokartografi17,18. Mikrokartografi er en trianguleringsteknik baseret på brug af beregnede transformationer af koordinater af faste fiduciale mærker mellem billedbehandlingssessioner for at forudsige og re-lokalisere et interesseområde. I vinduet oprettet som beskrevet ovenfor, disse fiducial mærker er lette ridser ætset ind i vinduesrammen (Supplerende figur 2), der er let identificerbare under mikroskop. Dette gør det muligt at finde det samme synsfelt flere gange, selv i ellers umærket væv. Figur 2 viser resultatet af disse teknikker i en mus, hvor lunge-vaskulaturen er blevet mærket ved injektion af en farvestofmærket høj molekylvægtdextran (tetramethylrhodamin 155 kD dextran) og den samme mikro-vaskulatur, der er re-lokaliseret over 3 dage.
Denne dextran viste sig at være yderst nyttig til evaluering af forbigående vaskulære åbninger, der induceres i perioder med tumorcelleinvasation25,26,27. Faktisk har det vist sig, at i primære brysttumorer, denne høje molekylvægt dextran er ellers effektivt afsondret til vaskulaturen og ikke lækker ind i interstitium25. Dette er i modsætning til dextrans af lavere molekylvægt (såsom 10 kD eller 70 kD), som har vist sig at lække fra neoangiogenic fartøjer passivt28,29. I mellemtiden er den sunde lunge vaskulatur blevet observeret at være mere modstandsdygtig over for lækage, med dextrans >10 kD kun undslipper til interstitium ved fornærmelse mod organet, såsom ved udsættelse for exosomer30 eller vira31. Der findes også en række kontrastmidler til at måle andre parametre i lungen (f.eks. nukleare markører, levende/døde indikatorer, oxidative stressreportere, sporing af blodgennemstrømningshastighed) ud over vaskulær permeabilitet. En fremragende ressource katalogisering dem kan findes i protokollen ved Ueki et al.22.
WHRIL er en teknik, der er meget velegnet til at undersøge dynamikken i blodgennemstrømningen i lungerne. Dette kan opnås på flere måder. For det første, når afbildet ved hjælp af relativt langsomme billedhastigheder (~ 1-10 billeder i sekundet, fps) blodgennemstrømning hastigheder kan bestemmes af skyggerne, at umærkede erythrocytter gøre, når flyder i større fartøjer. Ved lave fps danner disse skygger linjer, hvis vinkel i forhold til fartøjet kan bruges til at beregne erythrocyt flowhastigheder32 (Figur 2, gule linjer). For det andet kan skygger også spores på mikroskoper med lav fps ved at justere fartøjerne med mikroskopets hurtige scanningsakse og erhverve kymografer ved hjælp af hurtig linjescanning33,34,35. Endelig, når billeddannelse ved høje billedhastigheder (>10 fps) på et mikroskop, der er i stand til at integrere signalet over tid (f.eks. en roterende diskkonfocal udstyret med en opladningskoblet enhed (CCD) detektor), kan individuelle partikler spores direkte16,17. I denne situation vises stationære objekter som lyse prikker, og flydende objekter sporer spor igennem med cirkulationen. Cellehastigheder kan kvantificeres ved at måle længden af sporene og dividere med rammeopsamlingstiden. Et eksempel på dette er givet i figur 3 og supplerende film 1, hvor 2 μm fluorescerende mikrosfærer er blevet intravaskulært injiceret i musen før billeddannelse.
Med evnen til gentagne gange og konsekvent at vende tilbage til det samme synsfelt er visualisering af processer, der udvikler sig over flere dage, nu mulig. Som en demonstration af denne ansøgning, WHRIL blev brugt til at visualisere den metastatiske progression af brystkræftceller i lungerne17,21: det vil sige at spore over tid skæbne individuelle tumorceller, der ankommer til lunge vasculature. Dette koncept er afbildet i figur 4A, hvor en enkelt formidlet tumorcelle visualiseres kort efter logi i et segment af lungemikro-vaskulatur. Vender tilbage til det samme sted på de efterfølgende dage afslører tumorcellens skæbne (f.eks recirkulation, ekstravasation, osv.). Anvendt til undersøgelse af de kulminerende trin i metastatisk progression i lungen, var det muligt at visuelt krønike dynamiske processer, herunder tumorcelle ankomst (Figur 4B), ekstravasation (Figur 4C), og spredning til at danne makro-metastaser (Figur 4D).
Figur 1: Resumé af kirurgi for implantation af vinduet for høj opløsning Imaging af lungen (WHRIL). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mikrokartografi gør det muligt at omfordele faste positioner i det optiske vindue. Multiphoton intravital billeddannelse af en enkelt region af lungen under optisk gennemsigtig coverslip viser mikrovasculature flyttet over 3 på hinanden følgende dage ved hjælp af mikrokartografi. Gule pile angiver et klart definerbart grenpunkt fra et enkelt fartøj, der er identificeret hver dag i træk. Gule linjer fremhæver skygger, som umærkede erythrocytter laver, når de flyder i større fartøjer. Vinklen på disse linjer i forhold til fartøjet kan bruges til at beregne erythrocyt flowhastigheder. Rød = tdTomato mærket endotelceller og 155 kDa Tetramethylrhodamin dextran mærket blod serum, Grøn = GFP mærket tumorceller, Blå = anden harmoniske generation. Skalalinje = 15 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Visualisering af blodgennemstrømningen. Blodgennemstrømningshastigheder kan visualiseres ved at injicere fluorescerende mikrosfærer med en diameter på 2 μm i diameter retro-orbitally og billeddannelse deres passage gennem blodkarrene. Når billedet på et mikroskop, der er i stand til at integrere signalet over tid (f.eks. en roterende diskkonfocal udstyret med en CCD-detektor), fremstår stationære mikrosfærer som lyse prikker (pile), og flydende kugler sporer spor igennem med cirkulationen (bracketed lines). Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. WHRIL kan fange hvert trin i den metastatiske kaskade i lungen ved direkte at visualisere skæbnen for spredte tumorceller. (A) Sporing af skæbne formidlet tumorceller (grøn) er opnåelig med seriel billeddannelse, over flere dage, gennem WHRIL. På dag 1 observeres en tumorcelle at være ankommet til og indgivet i lungelåræt. På dag 2 og dag 3 cellen er ikke længere til stede i lunge vaskulatur, der enten recirkuleret eller døde. Skalabar = 15 μm. (B-D) Visualisering af hvert af stadierne af tumorcellemetase i lungen. (B) En intravaskulær formidlet tumorcelle (grøn) indgivet i lunge vaskulaturen efter ankomsten. (C) Formidlet tumorcelle (grøn) efter ekstravasering i lungeparenchyma. (D) Tumorceller, der har spredt sig og vokset til mikro-metastaser. Rød = tdTomato mærket endotelceller og 155 kDa Tetramethylrhodamin dextran mærket blod serum, Grøn = GFP mærket tumorceller, Blå = anden harmoniske generation. Skalalinje = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende film 1: Video svarende til figur 3, der viser lungelrulat med cirkulerende 2 μm mikrosfærer. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende figur 1: Mekaniske design tegninger til stainless-stål skæreværktøj, der anvendes til at guide 5 mm biopsi punch.
Supplerende figur 2: Mekaniske designtegninger til vinduesrammen i rustfrit stål. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Mekaniske designtegninger til vinduesholderværktøjet. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På steder med fjern metastaser såsom lungen, høj opløsning optisk billeddannelse giver indsigt i den udførlige dynamik tumorcelle metastaser. Ved at muliggøre in vivo visualisering af enkelt kræftceller og deres interaktioner med værtsvævet, høj opløsning intravital billeddannelse har vist sig medvirkende til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for metastaser.
Beskrevet her er en forbedret kirurgisk protokol for permanent thorax implantation af et optisk vindue designet til at muliggøre seriel billeddannelse af murin lunge via høj opløsning multiphoton mikroskopi. Vinduet skabt ved hjælp af denne protokol er veltolereret, og i betragtning af dets evne til at reseal brysthulen, er i stand til at opretholde intrathoracic tryk gradienter er nødvendige for spontan ventilation (i modsætning til enhver anden tidligere beskrevet vindue til billeddannelse af murin lunge14,15,16,36,37 ). Dette gør det muligt for musen at vågne fra anæstesi, trække vejret uafhængigt og komfortabelt overleve med den gennemsigtige brystkasse i en længere periode, der spænder over flere uger.
Ved hjælp af dette vindue var det muligt med encellet opløsning at visualisere alle trinene i metastaser, herunder ankomst, ekstravasation og vækst til mikrometastaser.
Selvom protokollen kræver nogle tekniske færdigheder, med praksis og omhyggelig opmærksomhed på flere vigtige trin, kan proceduren udføres med en høj succesrate. For det første, når du fjerner hår før operationen, er det afgørende at beskytte musens hud ved at fjerne depilatory creme med et fugtet væv efter ikke mere end 20 s kontakt. Under operationen, ekstrem forsigtighed bør betales for at undgå at skære fartøjer. Overdreven blødning, oftest stødt på grund af opdelingen af enten brachial eller indre brystårer under fjernelse af bryst fedt pad, kan skjule visualisering i det kirurgiske område eller føre til døden gennem exsanguination. Nyligt beskrevet i denne protokol er udnyttelsen af en biopsi punch og skære værktøj (supplerende figur 1), som betydeligt fremskynde og forenkle oprettelsen af den cirkulære defekt gennem brystkassen, og et vindue indehaveren værktøj gør implantation lettere. Gennemførelsen af disse fremskridt forbedrer succesraten for proceduren betydeligt og reducerer det krævede niveau af forudgående kirurgisk dygtighed. Individuelle laboratorier kan bruge tegningerne i de supplerende tal til at fremstille disse værktøjer med enten interne eller kommercielle maskinværksteder. En søgning på internettet efter "maskinværksted budgivning sites" vil give flere online-applikationer, der vil støtte til at finde lokale kommercielle maskinværksteder.
Endelig er det afgørende at sikre, at lungevævet forbliver tørt før klæbemiddelpåføring. Den mest almindelige faldgrube resulterer i mislykket coverslip vedhæftet fil er manglende sikring af fuldstændig fjernelse af fugt fra lungeoverfladen forud for apposition med rammen eller dækglas. For at sikre kvalitetsbilleder bør der desuden påføres et ekstremt tyndt lag lim (<10 μm). Overskydende lim skal skrabes af, før dækglasset placeres.
Den største begrænsning af IVI gennem WHRIL er den relativt begrænsede dybde af penetration opnåelige. Derfor er patologi, der forekommer dybt inde i lungen, utilgængelig. På trods af denne begrænsning kan teknikken stadig give en overflod af klinisk relevante oplysninger, især i onkologiske undersøgelser, i betragtning af den beskrevne tilbøjelighed til perifert lokaliserede lungemetastaser38,39,40,41. I sidste ende giver denne billeddannelsesmetode en betydelig fordel i forhold til standard ex vivo-analyser og andre metoder til in vivobilleddannelse, som enten afbryder væv fra vitale fysiologiske processer10,11,12,13eller begrænser langsgående analyse til en maksimal varighed på 12 timer 14,15,16,37,42, henholdsvis.
For gentagne billeddannelser i denne periode, flere udfordringer skal stadig overvindes. For det første er det vigtigt at opretholde hudens sundhed omkring det implanterede vindue, for mens det sårede væv ikke udsættes, kan huden omkring stadig blive betændt eller inficeret. Rutinemæssig anvendelse af en antibiotisk salve vil hjælpe med at forhindre dette. For det andet, med tiden, ekssefolie fra den afskårne hud kan størkne under vinduesrammen og forhindre placeringen af den fiksering plade, der anvendes til at immobilisere musen i mikroskop fase. Placering af et vådt væv over WHRIL i 10-15 min vil blødgøre denne ekssemit og tillade placering af vinduesrammen. For det tredje er en af kroppens mekanismer til udskillelse af overskydende vand og vedligeholdelse af homøostase via udånding af damp. Således, for meget væskeindtag (for det meste som følge af injektion af kontrastmidler eller tumor celle suspensioner) vil få lungeoverfladen til at udskille dette overskydende vand og vil resultere i lungevæv løsrivning fra WHRIL. Dette kan undgås ved at begrænse antallet af injektioner til højst 50 μL ad gangen. Endelig, selv med den bedste pleje, lungevæv kan lejlighedsvis løsrive sig fra WHRIL på grund af musen indtager en stor mængde vand eller på grund af musen overexerting sig selv. Når dette sker, løsrivelse af lungevæv fra WHRIL typisk sker langsomt, startende ved den udvendige kant. Det kan således være umuligt at følge nogle synsfelter, der er placeret på den første billeddag i hele vinduets varighed. Det blev konstateret, at de bedste billeddannelsesresultater vil blive opnået inden for de første par dage, og at anvende mosaikteknikker som den tidligere offentliggjorte Large-Volume High-Resolution Intravital Imaging21 kan minimere virkningen af denne begrænsning.
Da WHRIL er integreret i musens brystvæg, er drift under billeddannelse generelt ikke et væsentligt problem, så længe der er sørget for at sikre, at fastgørelsen mellem vinduet og mikroskopet er fast. Stadig, nogle små mængder af drift kan observeres i løbet af tiden umiddelbart efter placering af musen i mikroskop fase. Dette kan komme fra afslapning af musens krop eller fra den termiske udvidelse af mikroskop komponenter (fase plade, XY fase, objektiv linse) på grund af miljøkammeret. Denne afdrift kan undgås ved at tildele ~ 30 min til ækvilibrering, før du starter billedbehandlingsproceduren. Denne periode gør det muligt for musens fysiologi at stabilisere sig under anæstesi og gør det muligt for alle komponenter at komme til termisk ligevægt. Enhver lille mængde restdrift kan nemt håndteres af beregningsalgoritmer som StackReg43 eller HyperStackReg44.
Endelig er denne protokol en forbedring i forhold til den tidligere skriftlige version af to grunde. For det første giver det visuelle format mulighed for en bedre konceptualisering af den kirurgiske protokol. Dette er især nyttigt for de afgørende trin, hvor 1) lungen tørres ved at påføre en stabil skånsom strøm af trykluft (trin 3.24, figur 1J), 2) dækslet er fastgjort til vinduesrammens centrale boring på en måde, der forhindrer fastklemning af bobler (trin 3.31) og 3) en lille mængde flydende cyanoacrylat tilsættes ved metalglasgrænsefladen for at sikre en lufttæt forsegling mellem dækglasset og vinduesrammen (trin 3.34, figur 1O).
Afslutningsvis, med fremkomsten af WHRIL, i betragtning af dens amenability til subcellulær visualisering af det samme lungevæv på tværs af en længere periode, efterforskere er nyligt bemyndiget til at løse mange ubesvarede spørgsmål. Specifikt, protokollen skitseret heri muliggør grundlæggende udforskning af de dynamiske processer, der ligger til grund for mange patologier, herunder progression af kræft metastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne afslører ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: CA216248, CA013330, Montefiore's Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561, METAvivor Early Career Award, Gruss-Lipper Biophotonics Center og dets integrerede imaging program, og Jane A. og Myles P. Dempsey. Vi vil gerne takke Analytical Imaging Facility (AIF) på Einstein College of Medicine for billedbehandling støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D.
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E.
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D.
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P.
