Summary
Hier presenteren we een protocol voor de chirurgische implantatie van een permanent inwonend optisch venster voor de muriene thorax, dat een hoge resolutie, intravitale beeldvorming van de long mogelijk maakt. De duurzaamheid van het venster maakt het zeer geschikt voor de studie van dynamische cellulaire processen in de longen, vooral die welke langzaam evolueren, zoals gemetastaseerde progressie van verspreide tumorcellen.
Abstract
Metastase, goed voor ~ 90% van de kankergerelateerde mortaliteit, omvat de systemische verspreiding van kankercellen van primaire tumoren naar secundaire plaatsen zoals het bot, de hersenen en de longen. Hoewel uitgebreid bestudeerd, blijven de mechanistische details van dit proces slecht begrepen. Hoewel gemeenschappelijke beeldvormingsmodaliteiten, waaronder computertomografie (CT), positronemissietomografie (PET) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), verschillende gradaties van grove visualisatie bieden, mist elk de temporele en ruimtelijke resolutie die nodig is om de dynamiek van individuele tumorcellen te detecteren. Om dit aan te pakken, zijn tal van technieken beschreven voor intravitale beeldvorming van gemeenschappelijke metastatische sites. Van deze plaatsen is de long bijzonder moeilijk gebleken om toegang te krijgen voor intravitale beeldvorming vanwege de delicatesse en kritieke rol bij het in stand houden van het leven. Hoewel verschillende benaderingen eerder zijn beschreven voor eencellige intravitale beeldvorming van de intacte long, omvatten ze allemaal zeer invasieve en terminale procedures, waarbij de maximaal mogelijke beeldvormingsduur wordt beperkt tot 6-12 uur. Hier wordt een verbeterde techniek beschreven voor de permanente implantatie van een minimaal invasief thoracale optische venster voor hoge-resolutie beeldvorming van de long (WHRIL). In combinatie met een aangepaste benadering van microcartografie, vergemakkelijkt het innovatieve optische venster seriële intravitale beeldvorming van de intacte long met eencellige resolutie gedurende meerdere beeldvormingssessies en verspreid over meerdere weken. Gezien de ongekende tijdsduur waarover beeldvormingsgegevens kunnen worden verzameld, kan de WHRIL de versnelde ontdekking van de dynamische mechanismen die ten grondslag liggen aan metastatische progressie en tal van aanvullende biologische processen in de longen vergemakkelijken.
Introduction
Verantwoordelijk voor ~ 90% van de sterfgevallen, metastas is de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte1. Onder de belangrijkste plaatsen van klinisch waargenomen metastase (bot, lever, long, hersenen)2, is de long bijzonder uitdagend gebleken voor in vivo beeldvorming via intravitale microscopie. Dit komt omdat de long een delicaat orgaan is in perpetuum mobile. De continue beweging van de longen, verder verergerd door intrathoracale cardiale beweging, vormt een aanzienlijke barrière voor nauwkeurige beeldvorming. Daarom, vanwege de relatieve ontoegankelijkheid tot modaliteiten voor hoge resolutie intravitale optische beeldvorming, is kankergroei in de longen vaak beschouwd als een occult proces3.
In de klinische setting maken beeldvormingstechnologieën zoals computertomografie (CT), positronemissietomografie (PET) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) visualisatie diep in intacte vitale organen zoals de longmogelijk 4. Hoewel deze modaliteiten zorgen voor een uitstekend beeld van het grove orgaan (vaak zelfs onthullende pathologie voorafgaand aan het begin van klinische symptomen), zijn ze van onvoldoende resolutie om individuele gedissemineerde tumorcellen te detecteren terwijl ze zich door de vroege stadia van metastase ontwikkelen. Bijgevolg, tegen de tijd dat de bovengenoemde modaliteiten enige indicatie van metastase naar de long geven, zijn gemetastaseerde foci al goed ingeburgerd en prolifererend. Aangezien de tumormicro-omgeving een cruciale rol speelt bij de progressie van kanker en metastasevorming5,6, is er grote interesse in het onderzoeken van de vroegste stappen van gemetastaseerd zaaien in vivo. Deze interesse wordt verder gevoed door de toegenomen waardering dat kankercellen zich verspreiden nog voordat de primaire tumor wordt gedetecteerd7,8 en het toenemende bewijs dat ze overleven als afzonderlijke cellen en in een slapende toestand gedurende jaren tot decennia voordat ze uitgroeien in macro-metastase9.
Voorheen was beeldvorming van de long met eencellige resolutie noodzakelijkerwijs ex vivo of explantische preparaten10,11,12,13,waarbij analyses werden beperkt tot enkele tijdspunten. Hoewel deze preparaten nuttige informatie bieden, geven ze geen inzicht in de dynamiek van tumorcellen in het orgaan dat is verbonden met een intacte bloedsomloop.
Recente technologische ontwikkelingen in beeldvorming hebben intravitale visualisatie van de intacte long met eencellige resolutie mogelijk gemaakt gedurende perioden van maximaal 12 h14,15,16. Dit werd bereikt in een muizenmodel met behulp van een protocol dat mechanische ventilatie, resectie van de ribbenkast en vacuümondersteunde longimmobilisatie omvatte. Ondanks het aanbieden van de eerste beelden met een enkele celresolutie van de fysiologisch intacte long, is de techniek echter zeer invasief en terminaal, waardoor verdere beeldvormingssessies buiten de indexprocedure worden uitgesloten. Deze beperking voorkomt daarom de toepassing ervan op de studie van gemetastaseerde stappen die langer dan 12 uur duren, zoals rust en het opnieuw initiëren van groei14,15,16. Verder moeten patronen van cellulair gedrag waargenomen met behulp van deze beeldvormingsbenadering voorzichtig worden geïnterpreteerd, aangezien vacuümgeïnduceerde drukverschillen waarschijnlijk afleidingen in de bloedstroom veroorzaken.
Om deze beperkingen te overwinnen, is onlangs een minimaal invasief venster voor beeldvorming van de long met hoge resolutie (WHRIL) ontwikkeld, dat seriële beeldvorming over een langere periode van dagen tot weken mogelijk maakt, zonder de noodzaak van mechanische beademing17. De techniek omvat het creëren van een 'transparante ribbenkast' met een afgesloten thoracale holte voor het behoud van een normale longfunctie. De procedure wordt goed verdragen, waardoor de muis kan herstellen zonder zinvolle wijziging van de basislijnactiviteit en -functie. Om precies hetzelfde longgebied bij elke respectieve beeldvormingssessie betrouwbaar te lokaliseren, werd een techniek die bekend staat als microcartografie toegepast op dit venster18. Door dit venster was het mogelijk om beelden van cellen vast te leggen terwijl ze bij het vaatbed van de long aankomen, het endotheel kruisen, celdeling ondergaan en uitgroeien tot micrometastasen.
Hier presenteert de studie een gedetailleerde beschrijving van een verbeterd chirurgisch protocol voor implantatie van de WHRIL, dat de operatie vereenvoudigt en tegelijkertijd de reproduceerbaarheid en kwaliteit ervan verhoogt. Hoewel dit protocol is ontworpen om onderzoek mogelijk te maken naar de dynamische processen die ten grondslag liggen aan metastase, kan de techniek als alternatief worden toegepast op onderzoeken van tal van processen van longbiologie en pathologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, inclusief voorafgaande goedkeuring door het Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Passivering van ramen
- Spoel de optische kozijnen(aanvullende figuur 2)af met een 1% (w/v) oplossing van enzymatisch actief reinigingsmiddel.
- Dompel in een glazen pot de optische raamkozijnen onder in 5% (w/v) natriumhydroxideoplossing gedurende 30 minuten bij 70 °C.
- Verwijder en was de kozijnen met gedeïoniseerd water.
- Dompel in een nieuwe glazen pot de optische kozijnen onder in 7% (w/v) citroenzuuroplossing gedurende 10 min bij 55 °C.
- Nogmaals, verwijder en was de kozijnen met gedeïoniseerd water.
- Herhaal stap 1.2; verwijder en was vervolgens raamkozijnen met gedeïoniseerd water.
2. Voorbereiding op de operatie
- Voer de operatie uit in een kap of laminaire flowkast. Om besmetting van het operatieveld te voorkomen, moet u zorgen voor verschillende, gescheiden gebieden voor respectievelijk voorbereiding, chirurgie en herstel.
- Steriliseer voorafgaand aan de operatie alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf. Als volgende procedures worden gepland, steriliseer instrumenten dan opnieuw met behulp van een hete kraalsterilisator. Voor deze chirurgische ingreep wordt een tips-only techniek gebruikt.
- Schakel de verwarmde chirurgische kraal- en kralensterilisator in.
- Verdoof de muis met 5% isofluraan in de anesthesiekamer.
- Om het haar te verwijderen, breng royaal ontharingscrème aan op de incisieplaats van de linkerbovenborst. Veeg na niet langer dan 20 s het haar en de ontharingscrème stevig weg met bevochtigd tissuepapier. Herhaal indien nodig om al het haar van de operatieplaats te verwijderen.
- Bind met behulp van 2-0 zijden hechtdraad een knoop aan de basis van een katheter van 22 G, waardoor 2-inch lange staarten overblijven (zie figuur 1A).
3. Longetalagechirurgie
- Was de handen met antiseptische zeep.
- Trek voor elke nieuwe operatie nieuwe steriele handschoenen aan.
- Om uitdroging van het hoornvlies en schade aan de ogen van de muis te voorkomen, brengt u oogheelkundige zalf aan op beide ogen.
- Verdun 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfine in 90 μL steriel PBS en injecteer vervolgens subcutaan om preoperatieve analgesie te garanderen.
- Intubeer de muis met de zijden hechtdraadgebonden 22 G-katheter15. Bevestig met behulp van een inflatielamp een succesvolle intubatie door bilaterale borststijging bij boldruk op te merken.
- Zet de intubatiekatheter vast door de 2-0 zijden hechtdraad rond de snuit van de muis te binden (zie figuur 1B).
- Plaats de muis op de verwarmde operatiestandaard en plaats deze in de rechter laterale decubitus om de linker thorax bloot te leggen.
- Sluit de ventilator aan op de intubatiekatheter.
- Zorg voor gecontroleerde, stabiele ventilatie op de ventilator en verlaag vervolgens de isofluor tot 3%. Beoordeel bij het begin van de procedure en periodiek gedurende de duur van de procedure de geschiktheid van anesthesie door een teenknijptest uit te voeren.
- Met behulp van papieren tape worden respectievelijk de voorste en achterpoten craniaal en caudaal vastgezet voor het verwarmde chirurgische stadium. Plaats nog een stuk tape over de lengte van de rug van de muis om de blootstelling aan het operatieveld te maximaliseren (zie figuur 1C).
- Open alle chirurgische instrumenten onder de motorkap voor het behoud van steriliteit.
- Steriliseer de chirurgische plaats door een royale toepassing van antisepticum op de huid van de muis.
- Til met behulp van een tang de huid op en maak een cirkelvormige incisie van ~ 10 mm, ~ 7 mm links van het borstbeen en ~ 7 mm superieur aan de subcostale marge(figuur 1D).
- Identificeer zorgvuldig alle belangrijke schepen. Als de verdeling van bloedvaten noodzakelijk is, cauteriseer dan aan beide uiteinden met de elektrocauterisatiepen om de hemostase te behouden.
- Snijd het zachte weefsel boven de ribben.
- Til de 6e of7e ribop met een tang. Met behulp van een enkel mes van de stompe micro-ontleedbare schaar, de afgeronde kant naar de long, doorboort voorzichtig de intercostale spier tussen de6e en7e ribben om de intrathoracale ruimte binnen te gaan (Figuur 1E).
- Ontlaad de persluchtbus subtiel bij het defect om de long in te klappen en te scheiden van de borstwand. Vuur de perslucht in korte uitbarstingen af om iatrogene longschade te voorkomen.
- Plaats de biopsiepons over het snijgereedschap(aanvullende figuur 1)en manoeuvreer de basis van het snijgereedschap voorzichtig door de intercostale incisie(figuur 1F).
- Oriënteer de basis van het snijgereedschap zodanig dat deze evenwijdig is aan de borstwand. Prik een cirkelvormig gat van 5 mm door de ribbenkast(figuur 1G).
OPMERKING: Zorg ervoor dat het blootgestelde longweefsel roze is, zonder tekenen van schade. - Maak met behulp van de 5-0 zijden hechtdraad een tas-stringsteek ~ 1 mm van het gat, omtrek, verweven met de ribben(figuur 1H).
- Plaats het raamkozijn zodanig dat de randen van het cirkelvormige defect in de groef van het raam worden uitgelijnd (zie figuur 1I).
- Vergrendel het geïmplanteerde raam stevig door de 5-0 zijden hechtdraad stevig vast te binden.
- Laad 100 μL cyanoacrylaatgellijm in de spuit van 1 ml.
- Droog de longen door een gestage zachte stroom perslucht aan te brengen gedurende ~ 10-20 s(figuur 1J).
- Gebruik een tang om het raamkozijn aan de buitenrand vast te pakken en til voorzichtig op om ervoor te zorgen dat de long wordt gescheiden van de ondergrond van het raamkozijn.
- Breng een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan langs de onderzijde van het optische raamkozijn (figuur 1K).
- Verhoog de positieve eind-expiratoire druk (PEEP) op de ventilator om de long op te blazen.
- Houd 10-20 s vast en oefen zachte maar stevige druk uit om het optische raamkozijn op het longweefsel te bevestigen(figuur 1L).
- Doseer een druppel van 5 mm van de resterende cyanoacrylaatgellijm op een rechthoekige deklap.
- Pak de 5 mm afdekplaat op met behulp van vacuüm pickups. Dompel de ondergrond van de coverslip in de lijm en schraap vervolgens de overtollige lijm drie keer af tegen de zijkant van de rechthoekige coverslip, zodat er slechts een zeer dunne laag overblijft (Figuur 1M).
- Plaats de afdekplaat zorgvuldig zodat deze in de uitsparing in het midden van het optische raamkozijn past en wordt onder een hoek boven het longweefsel gehouden. Klem de ventilator kort vast om positieve druk te genereren, waardoor de long hyperopgeblazen wordt. Gebruik een roterende beweging om de coverslip parallel aan het longweefsel te oriënteren om een directe appositie te creëren tussen het oppervlak van de long en de ondergrond van de coverslip. Houd een zachte druk aan en laat de cyanoacrylaatlijm uitharden (~ 25 s).
- Gebruik de tang om de afdekplaat van de vacuüm pickups te scheiden(figuur 1N).
- Maak met behulp van 5-0 zijden hechtdraad opnieuw een tas-stringsteek, dit keer < 1 mm om de snijrand van de huidincisie. Stop overtollige huid onder de buitenrand van het raamkozijn voordat u het stevig vastbindt met borgknopen.
- Om een luchtdichte afdichting tussen de afdekplaat en het raamkozijn te garanderen, doseert u een kleine hoeveelheid vloeibaar cyanoacrylaat op de metaal-glasinterface (zie figuur 1O).
- Bevestig een steriele naald aan een insulinespuit van 1 ml. Steek de naald onder het xiphoid-proces, ga naar de linkerschouder en ga via het diafragma de thoracale holte binnen. Zuig voorzichtig terug op de spuit om eventuele resterende lucht uit de thoracale holte te verwijderen (zie figuur 1P).
- Verwijder de tape van de muis.
- Schakel isofluraan uit.
- Blijf ventileren met 100% zuurstof totdat de muis klaar lijkt om te ontwaken.
- Snijd voorzichtig de 2-0 zijden hechtdraad rond de snuit van de muis en extubeer de muis.
- Breng de muis over naar een schone kooi en controleer totdat deze volledig is hersteld. Euthanaseer de muis als er tekenen van ademhalingsmoeilijkheden aanwezig zijn.
- Zorg voor postoperatieve analgesie door subcutaan 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfine verdund in 90 μL steriele fosfaat gebufferde oplossing (PBS) te injecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De stappen van de chirurgische ingreep die in dit protocol worden beschreven, zijn samengevat en geïllustreerd in figuur 1. Kortom, voorafgaand aan de operatie worden muizen verdoofd en wordt het haar over de linker thorax verwijderd. Muizen worden geïntubeerd en mechanisch geventileerd om te overleven bij het doorbreken van de thoracale holte. Zacht weefsel boven de ribben wordt weggesneden en er ontstaat een klein cirkelvormig defect, dat de6e en7e ribben overspant. Het optische raamkozijn wordt in het defect ingebracht en de onderkant (buiten de vrije opening) wordt aan het longweefsel gehecht. Het raamkozijn wordt vervolgens vastgezet met een combinatie van hechtingen en lijm, waardoor de thoracale holte opnieuw wordt afgesloten en de normale ademhaling na extubatie kan worden hervat. Wanneer succesvol geïmplanteerd, zal de long zich hechten aan het optische venster (dat is opgenomen als onderdeel van de borstwand), met intrathoracale drukgradiënten behouden. Dit maakt een comfortabele overleving van de muis mogelijk, waardoor dagelijkse beeldvorming mogelijk is tot aan het protocol (2 weken). Intravitale beeldvorming kan dan door het venster worden uitgevoerd, zoals eerder beschreven voor andere vensters15,19,20.
Voor visualisatie van verschillende celtypen, biologische structuren of cellulaire functionele toestanden, kan de hier gepresenteerde procedure worden uitgevoerd op een breed scala aan muizen die genetisch zijn gemanipuleerd om fluorescerende eiwitten21 tot expressie te brengen of geïnjecteerd met kleurstoffen22. De permanente aard van het venster maakt het compatibel met technieken voor herlokalisatie van gezichtsvelden zoals fotoconversie23,24 of microcartografie17,18. Microcartografie is een triangulatietechniek gebaseerd op het gebruik van berekende transformaties van coördinaten van vaste fiduciële tekens tussen beeldvormingssessies om een interessegebied te voorspellen en opnieuw te lokaliseren. In het venster dat is gemaakt zoals hierboven beschreven, zijn deze fiduciële markeringen lichte krassen geëtst in het raamkozijn (aanvullende figuur 2) die gemakkelijk herkenbaar zijn onder de microscoop. Dit maakt het mogelijk om meerdere keren hetzelfde gezichtsveld te vinden, zelfs in anderszins ongemarkeerd weefsel. Figuur 2 toont het resultaat van deze technieken bij een muis waarbij de longvasculatuur is gelabeld door injectie van een kleurstof-gelabeld dextran met hoog molecuulgewicht (tetramethylrhodamine 155 kD dextran) en dezelfde micro-vasculatuur opnieuw gelokaliseerd gedurende 3 dagen.
Deze dextran bleek uiterst nuttig te zijn bij het evalueren van voorbijgaande vasculaire openingen die worden geïnduceerd tijdens perioden van tumorcelinvasatie25,26,27. Inderdaad, het is aangetoond dat, in primaire borsttumoren, dit dextran met hoog molecuulgewicht anders effectief wordt gesekwestreerd naar de vasculatuur en niet lekt in het interstitium25. Dit in tegenstelling tot dextrans met een lager molecuulgewicht (zoals 10 kD of 70 kD), waarvan is aangetoond dat ze passief uit neoangiogene vatenlekken 28,29. Ondertussen is waargenomen dat de gezonde longvasculatuur beter bestand is tegen lekkage, waarbij dextrans >10 kD alleen naar het interstitium ontsnapt bij belediging van het orgaan, zoals bij blootstelling aan exosomen30 of virussen31. Er bestaan ook verschillende contrastmiddelen om andere parameters in de long te meten (bijv. Nucleaire markers, levende / dode indicatoren, oxidatieve stressverslaggevers, bloedstroomsnelheidstrackers) naast vasculaire permeabiliteit. Een uitstekende bron die ze catalogiseert, is te vinden in het protocol van Ueki et al.22.
De WHRIL is een techniek die zeer geschikt is om de dynamiek van de bloedstroom in de longen te onderzoeken. Dit kan op verschillende manieren worden bereikt. Ten eerste, wanneer afgebeeld met behulp van relatief langzame framesnelheden (~ 1-10 frames per seconde, fps), kunnen bloedstroomsnelheden worden bepaald door de schaduwen die ongelabelde erytrocyten maken wanneer ze in grotere vaten stromen. Bij lage fps vormen deze schaduwen lijnen waarvan de hoek ten opzichte van het vat kan worden gebruikt om erytrocytendebieten32 te berekenen (figuur 2, gele lijnen). Ten tweede kunnen schaduwen ook worden gevolgd op microscopen met lage fps door de vaten uit te lijnen met de snelle scanas van de microscoop en kymografen te verkrijgen met behulp van snelle lijnscanning33,34,35. Ten slotte, bij beeldvorming met hoge framesnelheden (>10 fps) op een microscoop die in staat is om het signaal in de loop van de tijd te integreren (bijv. Een draaiende schijf confocal uitgerust met een charge-coupled device (CCD) detector), kunnen individuele deeltjes direct worden getraceerd16,17. In deze situatie verschijnen stilstaande objecten als heldere stippen en sporen vloeiende objecten sporen door met de circulatie. Celsnelheden kunnen worden gekwantificeerd door de lengte van de sporen te meten en te delen door de frame-acquisitietijd. Een voorbeeld hiervan wordt gegeven in figuur 3 en supplementele film 1, waar 2 μm fluorescerende microsferen intravasculair in de muis zijn geïnjecteerd voordat ze worden afgebeeld.
Met de mogelijkheid om herhaaldelijk en consistent terug te keren naar hetzelfde gezichtsveld, is visualisatie van processen die zich gedurende meerdere dagen ontwikkelen nu mogelijk. Als demonstratie van deze toepassing werd de WHRIL gebruikt om de gemetastaseerde progressie van borstkankercellen in de longen te visualiseren17,21: dat wil zeggen, om in de loop van de tijd het lot te volgen van individuele tumorcellen die bij de longvasculatuur aankomen. Dit concept is afgebeeld in figuur 4A, waar een enkele gedissemineerde tumorcel wordt gevisualiseerd kort na verblijf in een segment van longmicro-vasculatuur. Terugkeren naar diezelfde locatie op de volgende dagen onthult het lot van de tumorcel (bijv. Recirculatie, extravasatie, enz.). Toegepast op het onderzoek naar de culminerende stappen van gemetastaseerde progressie in de long, was het mogelijk om dynamische processen visueel te beschrijven, waaronder de aankomst van tumorcellen(figuur 4B),extravasatie(figuur 4C)en proliferatie om macrometastase te vormen(figuur 4D).
Figuur 1: Samenvatting van de operatie voor de implantatie van het venster voor hoge-resolutie beeldvorming van de long (WHRIL). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Microcartografie maakt de herlokalisatie van vaste posities binnen het optische venster mogelijk. Multifoton intravitale beeldvorming van een enkel gebied van de long onder de optisch transparante coverslip toont microvasculatuur verplaatst over 3 opeenvolgende dagen met behulp van microcartografie. Gele pijlen geven een duidelijk definieerbaar aftakkingspunt aan van een enkel vaartuig dat elke opeenvolgende dag wordt geïdentificeerd. Gele lijnen markeren schaduwen die ongelabelde erytrocyten maken wanneer ze in grotere vaten stromen. De hoek van deze lijnen ten opzichte van het vat kan worden gebruikt om erytrocytendebieten te berekenen. Rood = tdTomato gelabelde endotheelcellen en 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran gelabeld bloedserum, Groen = GFP gelabelde tumorcellen, Blauw = tweede harmonische generatie. Schaalbalk = 15 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Visualisatie van de bloedstroomsnelheid. Bloedstroomsnelheden kunnen worden gevisualiseerd door fluorescerende microsferen met een diameter van 2 μm retro-orbitaal te injecteren en hun passage door de bloedvaten in beeld te brengen. Wanneer ze worden afgebeeld op een microscoop die in staat is om het signaal in de loop van de tijd te integreren (bijvoorbeeld een confocale draaiende schijf uitgerust met een CCD-detector), verschijnen stationaire microsferen als heldere stippen (pijlen) en vloeiende bollen sporen sporen door met de circulatie (lijnen tussen haakjes). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. De WHRIL kan elke stap van de metastatische cascade in de long vastleggen door het lot van gedissemineerde tumorcellen direct te visualiseren. A)Het volgen van het lot van gedissemineerde tumorcellen (groen) is haalbaar met seriële beeldvorming, gedurende meerdere dagen, via de WHRIL. Op dag 1 wordt waargenomen dat een tumorcel is aangekomen bij en zich heeft vastgezet in de longvasculatuur. Op dag 2 en dag 3 is de cel niet langer aanwezig in de longvasculatuur, nadat deze is gerecirculeerd of is overleden. Schaalbalk = 15 μm. (B-D) Visualisatie van elk van de stadia van tumorcelmetastase in de long. BEen intravasculaire gedissemineerde tumorcel (groen) die zich na aankomst in de longvasculatuur bevindt. ( C) Gedissemineerde tumorcel (groen) na extravasatie in het longparenchym. (D) Tumorcellen die zich hebben vermenigvuldigd en zijn uitgegroeid tot micro-metastasen. Rood = tdTomato gelabelde endotheelcellen en 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran gelabeld bloedserum, Groen = GFP gelabelde tumorcellen, Blauw = tweede harmonische generatie. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende film 1: Video die overeenkomt met figuur 3 met de longvasculatuur met circulerende microsferen van 2 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Mechanische ontwerptekeningen voor hetsnijgereedschap zondertainless-staal dat wordt gebruikt om de 5 mm biopsypons te begeleiden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Mechanische ontwerptekeningen voor het roestvrijstalen raamkozijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Mechanische ontwerptekeningen voor het raamhoudergereedschap. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Op plaatsen van verre metastase, zoals de long, geeft optische beeldvorming met hoge resolutie inzicht in de uitgebreide dynamiek van tumorcelmetastase. Door in vivo visualisatie van afzonderlijke kankercellen en hun interacties met het gastheerweefsel mogelijk te maken, is intravitale beeldvorming met hoge resolutie instrumenteel gebleken voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan metastase.
Hier wordt een verbeterd chirurgisch protocol beschreven voor de permanente thoracale implantatie van een optisch venster dat is ontworpen om seriële beeldvorming van de muizenlong mogelijk te maken via multifotonenmicroscopie met hoge resolutie. Het venster dat met behulp van dit protocol is gemaakt, wordt goed verdragen en is, gezien het vermogen om de thoracale holte met succes te hersluiten, in staat om de intrathoracale drukgradiënten te behouden die nodig zijn voor spontane beademing (in tegenstelling tot elk ander eerder beschreven venster voor beeldvorming van de muizenlong14,15,16,36,37 ). Hierdoor kan de muis ontwaken uit anesthesie, onafhankelijk ademen en comfortabel overleven met de transparante ribbenkast gedurende een langere periode van meerdere weken.
Met behulp van dit venster was het mogelijk om, met eencellige resolutie, alle stappen van metastase te visualiseren, inclusief aankomst, extravasatie en groei tot micrometastasen.
Hoewel het protocol enige technische vaardigheid vereist, met oefening en zorgvuldige aandacht voor verschillende belangrijke stappen, kan de procedure met een hoog slagingspercentage worden uitgevoerd. Ten eerste, bij het verwijderen van haar voorafgaand aan de operatie, is het van cruciaal belang om de huid van de muis te beschermen door de ontharingscrème te verwijderen met een bevochtigd weefsel na niet meer dan 20 s contact. Tijdens de operatie moet uiterste voorzichtigheid worden betracht om te voorkomen dat bloedvaten worden doorgesneden. Overmatig bloeden, meestal aangetroffen als gevolg van de deling van de brachiale of interne borstslagaders tijdens het verwijderen van het borstvetkussen, kan de visualisatie in het chirurgische veld verdoezelen of tot de dood leiden door exsanguinatie. Nieuw beschreven in dit protocol is het gebruik van een biopsiepons en snijgereedschap(aanvullende figuur 1), die de creatie van het cirkelvormige defect door de ribbenkast aanzienlijk versnelt en vereenvoudigt, en een raamhoudergereedschap dat implantatie gemakkelijker maakt. De implementatie van deze vooruitgang verbetert het slagingspercentage van de procedure aanzienlijk en vermindert het vereiste niveau van eerdere chirurgische vaardigheden. Individuele laboratoria kunnen de tekeningen in de aanvullende figuren gebruiken om deze gereedschappen te vervaardigen met eigen of commerciële machinewerkplaatsen. Een zoekopdracht op internet naar "biedsites voor machinewinkels" zal verschillende online toepassingen opleveren die zullen helpen bij het vinden van lokale commerciële machinewinkels.
Ten slotte is het cruciaal om ervoor te zorgen dat het longweefsel droog blijft voordat het wordt aangebracht. De meest voorkomende valkuil die resulteert in mislukte coverslipbevestiging is het niet garanderen van volledige verwijdering van vocht van het longoppervlak voordat het met het frame of de afdekglas wordt geplaatst. Bovendien moet, om kwaliteitsbeelden te garanderen, een extreem dun laagje lijm (<10 μm) worden aangebracht. Overtollige lijm moet worden afgeschraapt voordat het dekglas wordt geplaatst.
De belangrijkste beperking van IVI via de WHRIL is de relatief beperkte penetratiediepte die haalbaar is. Daarom is pathologie die diep in de longen optreedt ontoegankelijk. Ondanks deze beperking kan de techniek nog steeds een overvloed aan klinisch relevante informatie opleveren, vooral in oncologische onderzoeken, gezien de beschreven neiging tot perifeer gelokaliseerde longmetastasen38,39,40,41. Uiteindelijk biedt deze beeldvormingsbenadering een aanzienlijk voordeel ten opzichte van standaard ex vivo assays en andere methoden voor in vivo beeldvorming, die ofwel weefsel loskoppelen van vitale fysiologische processen10,11,12,13,of longitudinale analyse beperken tot een maximale duur van 12 uur14,15,16,37,42, respectievelijk.
Voor herhaalde beeldvorming gedurende deze periode moeten nog verschillende uitdagingen worden overwonnen. Ten eerste is het belangrijk om de gezondheid van de huid rond het geïmplanteerde venster te behouden, want terwijl het gewonde weefsel niet wordt blootgesteld, kan de huid eromheen nog steeds ontstoken of geïnfecteerd raken. Routinematige toepassing van een antibiotische zalf zal dit helpen voorkomen. Ten tweede kan exsudaat uit de gesneden huid na verloop van tijd stollen onder het raamkozijn en de plaatsing van de bevestigingsplaat voorkomen die wordt gebruikt om de muis in het microscoopstadium te immobiliseren. Het plaatsen van een nat weefsel over de WHRIL gedurende 10-15 minuten zal dit exsudaat verzachten en plaatsing van het raamkozijn mogelijk maken. Ten derde is een van de mechanismen van het lichaam voor het uitscheiden van overtollig water en het handhaven van homeostase via uitademing van damp. Te veel vochtinname (meestal als gevolg van injectie van contrastmiddelen of tumorcelsuspensies) zal er dus voor zorgen dat het longoppervlak dit overtollige water uitscheidt en zal ertoe leiden dat het longweefsel loskomt van de WHRIL. Dit kan worden voorkomen door het injectievolume te beperken tot maximaal 50 μL per keer. Ten slotte kan longweefsel, zelfs met de beste zorg, af en toe loskomen van de WHRIL als gevolg van het feit dat de muis een grote hoeveelheid water inneemt of omdat de muis zichzelf overbelast. Wanneer dit gebeurt, treedt het losmaken van het longweefsel van de WHRIL meestal langzaam op, beginnend aan de buitenrand. Het kan dus onmogelijk zijn om sommige gezichtsvelden op de eerste dag van beeldvorming te volgen voor de volledige duur van het venster. Het bleek dat de beste beeldvormingsresultaten binnen de eerste paar dagen zullen worden verkregen en dat het gebruik van mozaïektechnieken zoals de eerder gepubliceerde Large-Volume High-Resolution Intravital Imaging21 de impact van deze beperking kan minimaliseren.
Aangezien de WHRIL is geïntegreerd in de borstwand van de muis, is drift tijdens het beeldlen over het algemeen geen belangrijk probleem, zolang er zorg wordt besteed om ervoor te zorgen dat de bevestiging tussen het raam en de microscoop stevig is. Toch kan een kleine hoeveelheid drift worden waargenomen gedurende de tijd onmiddellijk na plaatsing van de muis in het microscoopstadium. Dit kan komen door de ontspanning van het lichaam van de muis of door de thermische uitzetting van de microscoopcomponenten (podiumplaat, XY-fase, objectieflens) als gevolg van de omgevingskamer. Deze afwijking kan worden vermeden door ~ 30 minuten toe te wijzen voor equilibratie voordat de beeldvormingsprocedure wordt gestart. Deze periode zorgt ervoor dat de fysiologie van de muis zich kan stabiliseren onder de anesthesie en alle componenten in staat stelt om tot thermisch evenwicht te komen. Elke kleine hoeveelheid resterende drift kan gemakkelijk worden verwerkt door computationele algoritmen zoals StackReg43 of HyperStackReg44.
Ten slotte is dit protocol om twee redenen een verbetering ten opzichte van de eerdere schriftelijke versie. Ten eerste maakt het visuele formaat een betere conceptualisering van het chirurgische protocol mogelijk. Dit is met name handig voor de cruciale stappen waarbij 1) de long wordt gedroogd door een gestage zachte stroom perslucht aan te brengen (stap 3.24, figuur 1J),2) de afdekplaat op de centrale boring van het raamkozijn wordt bevestigd op een manier die beknelling van bellen voorkomt (stap 3.31), en 3) een kleine hoeveelheid vloeibaar cyanoacrylaat wordt toegevoegd aan de metaal-glasinterface om een luchtdichte afdichting tussen het afdekglas en het raamkozijn te garanderen (stap 3.34, figuur 1o).
Kortom, met de komst van de WHRIL, gezien de mogelijkheid om subcellulair te visualiseren van hetzelfde longweefsel over een langere periode, zijn onderzoekers nieuw gemachtigd om veel onbeantwoorde vragen te beantwoorden. In het bijzonder maakt het hierin beschreven protocol fundamentele verkenning mogelijk van de dynamische processen die ten grondslag liggen aan tal van pathologieën, waaronder de progressie van kankermetastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs onthullen geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: CA216248, CA013330, Montefiore's Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561, METAvivor Early Career Award, het Gruss-Lipper Biophotonics Center en zijn Integrated Imaging Program, en Jane A. en Myles P. Dempsey. We willen de Analytical Imaging Facility (AIF) van het Einstein College of Medicine bedanken voor de ondersteuning van beeldvorming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D.
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E.
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D.
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P.
