Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’implantation chirurgicale d’une fenêtre optique à demeure permanente pour le thorax murin, qui permet une imagerie intravitale à haute résolution du poumon. La permanence de la fenêtre la rend bien adaptée à l’étude des processus cellulaires dynamiques dans le poumon, en particulier ceux qui évoluent lentement, tels que la progression métastatique des cellules tumorales disséminées.
Abstract
Les métastases, qui représentent environ 90% de la mortalité liée au cancer, impliquent la propagation systémique des cellules cancéreuses des tumeurs primaires aux sites secondaires tels que les os, le cerveau et les poumons. Bien que largement étudiés, les détails mécanistes de ce processus restent mal compris. Alors que les modalités d’imagerie courantes, y compris la tomodensitométrie (TDM), la tomographie par émission de positons (TEP) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), offrent divers degrés de visualisation globale, chacune n’a pas la résolution temporelle et spatiale nécessaire pour détecter la dynamique des cellules tumorales individuelles. Pour y remédier, de nombreuses techniques ont été décrites pour l’imagerie intravitale des sites métastatiques courants. Parmi ces sites, le poumon s’est avéré particulièrement difficile d’accès pour l’imagerie intravitale en raison de sa délicatesse et de son rôle essentiel dans le maintien de la vie. Bien que plusieurs approches aient déjà été décrites pour l’imagerie intravitale unicellulaire du poumon intact, toutes impliquent des procédures hautement invasives et terminales, limitant la durée maximale possible de l’imagerie à 6-12 h. Une technique améliorée pour l’implantation permanente d’une fenêtre optique thoracique mini-invasive pour l’imagerie pulmonaire à haute résolution (WHRIL) est décrite ici. Combinée à une approche adaptée de la microcartographie, la fenêtre optique innovante facilite l’imagerie intravitale en série du poumon intact à une résolution unicellulaire sur plusieurs sessions d’imagerie et sur plusieurs semaines. Compte tenu de la durée sans précédent pendant laquelle les données d’imagerie peuvent être recueillies, le WHRIL peut faciliter la découverte accélérée des mécanismes dynamiques sous-jacents à la progression métastatique et de nombreux processus biologiques supplémentaires dans les poumons.
Introduction
Responsable d’environ 90% des décès, les métastases sont la principale cause de mortalité liée au cancer1. Parmi les principaux sites de métastases cliniquement observées (os, foie, poumon,cerveau)2,le poumon s’est avéré particulièrement difficile pour l’imagerie in vivo par microscopie intravitale. C’est parce que le poumon est un organe délicat en mouvement perpétuel. Le mouvement continu des poumons, aggravé par le mouvement cardiaque intrathoracique, représente un obstacle important à l’imagerie précise. Par conséquent, en raison de son inaccessibilité relative aux modalités de l’imagerie optique intravitale à haute résolution, la croissance du cancer dans le poumon a souvent été considérée comme un processus occulte3.
Dans le milieu clinique, les technologies d’imagerie telles que la tomodensitométrie (TDM), la tomographie par émission de positons (TEP) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) permettent une visualisation profonde dans des organes vitaux intacts tels que le poumon4. Cependant, bien que ces modalités fournissent d’excellentes vues de l’organe brut (révélant souvent même une pathologie avant l’apparition des symptômes cliniques), elles sont d’une résolution inadéquate pour détecter les cellules tumorales disséminées individuelles à mesure qu’elles progressent dans les premiers stades des métastases. Par conséquent, au moment où les modalités susmentionnées fournissent toute indication de métastases au poumon, les foyers métastatiques sont déjà bien établis et prolifèrent. Étant donné que le microenvironnement tumoral joue un rôle central dans la progression du cancer et la formation de métastases5,6, il existe un grand intérêt à étudier les premières étapes de l’ensemencement métastatique in vivo. Cet intérêt est en outre alimenté par l’appréciation accrue que les cellules cancéreuses se propagent avant même que la tumeur primaire ne soit détectée7,8 et par les preuves croissantes qu’elles survivent en tant que cellules uniques et dans un état dormant pendant des années à des décennies avant de se transformer en macro-métastases9.
Auparavant, l’imagerie du poumon à résolution unicellulaire impliquait nécessairement des préparations ex vivo ou explantées10,11,12,13, limitant les analyses à des points temporels uniques. Bien que ces préparations fournissent des informations utiles, elles ne fournissent aucun aperçu de la dynamique des cellules tumorales dans l’organe connecté à un système circulatoire intact.
Les progrès technologiques récents en imagerie ont permis la visualisation intravitale du poumon intact à une résolution unicellulaire sur des périodes allant jusqu’à 12 h14,15,16. Cela a été accompli dans un modèle murin utilisant un protocole qui impliquait la ventilation mécanique, la résection de la cage thoracique et l’immobilisation pulmonaire assistée par le vide. Cependant, bien qu’elle offre les premières images à résolution unicellulaire du poumon physiologiquement intact, la technique est très invasive et terminale, empêchant ainsi d’autres séances d’imagerie au-delà de la procédure d’index. Cette limitation empêche donc son application à l’étude des étapes métastatiques qui durent plus de 12 h, telles que la dormance et la réinitiation de la croissance14,15,16. De plus, les modèles de comportement cellulaire observés à l’aide de cette approche d’imagerie doivent être interprétés avec prudence, étant donné que les différences de pression induites par le vide sont susceptibles de provoquer des détournements dans le flux sanguin.
Pour surmonter ces limitations, une fenêtre mini-invasive pour l’imagerie pulmonaire à haute résolution (WHRIL) a récemment été développée, facilitant l’imagerie en série sur une longue période de jours à plusieurs semaines, sans avoir besoin de ventilation mécanique17. La technique implique la création d’une « cage thoracique transparente » avec une cavité thoracique scellée pour la préservation de la fonction pulmonaire normale. La procédure est bien tolérée, ce qui permet à la souris de récupérer sans altération significative de l’activité et de la fonction de base. Pour localiser de manière fiable exactement la même région pulmonaire à chaque séance d’imagerie respective, une technique connue sous le nom de microcartographie a été appliquée à cette fenêtre18. Grâce à cette fenêtre, il a été possible de capturer des images de cellules lorsqu’elles arrivent au lit vasculaire du poumon, traversent l’endothélium, subissent une division cellulaire et se développent en micro-métastases.
Ici, l’étude présente une description détaillée d’un protocole chirurgical amélioré pour l’implantation du WHRIL, qui simplifie la chirurgie tout en augmentant simultanément sa reproductibilité et sa qualité. Bien que ce protocole ait été conçu pour permettre l’étude des processus dynamiques sous-jacents aux métastases, la technique peut également être appliquée à l’investigation de nombreux processus de biologie et de pathologie pulmonaires.
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Protocol
Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été effectuées conformément aux lignes directrices et aux règlements pour l’utilisation des animaux vertébrés, y compris l’approbation préalable du comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement de l’Albert Einstein College of Medicine.
1. Passivation des fenêtres
- Rincer les cadres de fenêtre optiques (Figure supplémentaire 2) avec une solution à 1% (p/v) de détergent enzymatiquement actif.
- À l’intérieur d’un bocal en verre, immerger les cadres optiques des fenêtres dans une solution d’hydroxyde de sodium à 5 % (p/v) pendant 30 min à 70 °C.
- Retirez et lavez les cadres de fenêtre avec de l’eau désionisée.
- À l’intérieur d’un nouveau bocal en verre, immerger les cadres optiques des fenêtres dans une solution d’acide citrique à 7 % (p/v) pendant 10 min à 55 °C.
- Encore une fois, retirez et lavez les cadres de fenêtre avec de l’eau désionisée.
- Répétez l’étape 1.2; ensuite, retirez et lavez les cadres de fenêtre avec de l’eau désionisée.
2. Préparation à la chirurgie
- Effectuez la chirurgie dans une hotte ou une armoire à flux laminaire. Pour éviter la contamination du champ opératoire, assurez-vous de zones distinctes et séparées pour la préparation, la chirurgie et la récupération, respectivement.
- Avant la chirurgie, stérilisez tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave. Si des procédures ultérieures sont prévues, stérilisez à nouveau les instruments à l’aide d’un stérilisateur à billes chaudes. Pour cette intervention chirurgicale, une technique de pointe uniquement est utilisée.
- Allumez le stérilisateur de perles et de perles chirurgicales chauffées.
- Anesthésier la souris avec 5% d’isoflurane dans la chambre d’anesthésie.
- Pour enlever les poils, appliquez généreusement une crème dépilatoire sur le site d’incision thoracique en haut à gauche. Après pas plus de 20 s, essuyez fermement les cheveux et la crème dépilatoire à l’aide de papier de soie humidifié. Répétez si nécessaire pour enlever tous les poils du site chirurgical.
- À l’aide d’une suture de soie 2-0, nouez un nœud à la base d’un cathéter de 22 G, en laissant une queue de 2 pouces de long (voir figure 1A).
3. Chirurgie de la fenêtre pulmonaire
- Lavez-vous les mains à l’aide de savon antiseptique.
- Avant chaque nouvelle chirurgie, enfilez de nouveaux gants stériles.
- Pour prévenir le dessèchement de la cornée et les dommages aux yeux de la souris, appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux.
- Diluer 10 μL (0,1 mg/kg) de buprénorphine dans 90 μL de PBS stérile, puis injecter par voie sous-cutanée pour assurer une analgésie préopératoire.
- Intuber la souris avec le cathéter 22 G attaché à la suture de soie15. À l’aide d’une ampoule gonflante, confirmez la réussite de l’intubation en notant l’élévation bilatérale de la poitrine lors de la compression de l’ampoule.
- Fixez le cathéter d’intubation en attachant la suture de soie 2-0 autour du museau de la souris (voir figure 1B).
- Placez la souris sur le support chirurgical chauffé et positionnez-la dans le décubitus latéral droit pour exposer le thorax gauche.
- Connectez le ventilateur au cathéter d’intubation.
- Assurer une ventilation contrôlée et stable sur le ventilateur, puis abaisser l’isofluorane à 3%. Au début de la procédure et périodiquement pendant toute la durée de la procédure, évaluez l’adéquation de l’anesthésie en effectuant un test de pincement des orteils.
- À l’aide de ruban adhésif en papier, fixez les membres antérieurs et postérieurs, respectivement, au stade chirurgical chauffé. Placez un autre morceau de ruban adhésif le long du dos de la souris pour maximiser l’exposition au champ chirurgical (voir La figure 1C).
- Ouvrez tous les instruments chirurgicaux sous le capot pour préserver la stérilité.
- Stériliser le site chirurgical par une application généreuse d’antiseptique sur la peau de la souris.
- À l’aide d’une pince, soulevez la peau et faites une incision circulaire d’environ 10 mm, d’environ 7 mm à gauche du sternum et d’environ 7 mm au-dessus de la marge sous-costale(Figure 1D).
- Identifiez soigneusement tous les principaux navires. Si la division des vaisseaux est nécessaire, cautériser aux deux extrémités avec le stylo d’électrocautérisation pour maintenir l’hémostase.
- Exciser les tissus mous recouvrant les côtes.
- Élevez la 6e oula 7e côte àl’aide d’une pince. À l’aide d’une seule lame des ciseaux à micro-dissection émoussés, le côté arrondi vers le poumon, perce soigneusement le muscle intercostal entre les6 ème et 7ème côtes pour entrer dans l’espace intrathoracique (Figure 1E).
- Déchargez délicatement la cartouche d’air comprimé au niveau du défaut pour effondrer le poumon et le séparer de la paroi thoracique. Tirez l’air comprimé en courtes rafales pour prévenir les lésions pulmonaires iatrogènes.
- Placez le poinçon de biopsie sur l’outil de coupe (Figure supplémentaire 1) et manœuvrez soigneusement la base de l’outil de coupe à travers l’incision intercostale (Figure 1F).
- Orientez la base de l’outil de coupe de manière à ce qu’elle soit parallèle à la paroi thoracique. Percez un trou circulaire de 5 mm à travers la cage thoracique (Figure 1G).
REMARQUE: Assurez-vous que le tissu pulmonaire exposé est rose, sans signes de dommages. - À l’aide de la suture de soie 5-0, créez un point de cordon de la bourse à environ 1 mm du trou, circonférentiellement, entrelacé avec les côtes (Figure 1H).
- Positionnez le cadre de la fenêtre de telle sorte que les bords du défaut circulaire s’alignent dans la rainure de la fenêtre (voir Figure 1I).
- Verrouillez solidement la fenêtre implantée en attachant fermement la suture de soie 5-0.
- Chargez 100 μL d’adhésif en gel cyanoacrylate dans la seringue de 1 mL.
- Séchez le poumon en appliquant un flux doux et régulier d’air comprimé pendant environ 10 à 20 s(Figure 1J).
- À l’aide de pinces pour saisir le cadre de la fenêtre par son bord extérieur, soulevez doucement pour assurer la séparation du poumon de la sous-surface du cadre de la fenêtre.
- Distribuer une fine couche d’adhésif cyanoacrylate le long de la sous-surface du cadre de la fenêtre optique (Figure 1K).
- Augmenter la pression expiratoire positive (PEEP) sur le ventilateur pour gonfler le poumon.
- En maintenant pendant 10 à 20 s, appliquez une pression douce mais ferme pour fixer le cadre de la fenêtre optique sur le tissu pulmonaire(Figure 1L).
- Distribuer une goutte de 5 mm de l’adhésif de gel cyanoacrylate restant sur un couvercle rectangulaire.
- Récupérez le couvercle de 5 mm à l’aide de micros sous vide. Trempez la sous-surface du couvercle dans l’adhésif, puis grattez l’excès d’adhésif trois fois contre le côté du couvercle rectangulaire, de sorte qu’il ne reste qu’une très fine couche (Figure 1M).
- Positionnez soigneusement le couvercle pour qu’il s’adapte à l’intérieur de l’évidement au centre du cadre optique de la fenêtre et est maintenu au-dessus du tissu pulmonaire à un angle. Serrez brièvement le ventilateur pour générer une pression positive, hyper-gonflant le poumon. À l’aide d’un mouvement de rotation, orientez le couvercle parallèlement au tissu pulmonaire pour créer une apposition directe entre la surface du poumon et la sous-surface du couvercle. Maintenez une pression douce, ce qui permet à l’adhésif cyanoacrylate de se fixer (~ 25 s).
- Utilisez les pinces pour séparer le couvercle des capteurs à vide (Figure 1N).
- En utilisant une suture de soie 5-0, créez à nouveau un point de cordon de la bourse, cette fois <1 mm circonférentiellement du bord coupé de l’incision cutanée. Placez tout excès de peau sous le bord extérieur du cadre de la fenêtre avant de l’attacher fermement avec des nœuds de verrouillage.
- Pour assurer une étanchéité à l’air entre le couvercle et le cadre de la fenêtre, distribuer une petite quantité de cyanoacrylate liquide à l’interface métal-verre (voir Figure 1O).
- Fixez une aiguille stérile à une seringue à insuline de 1 mL. Insérez l’aiguille sous le processus xiphoïde, en avançant vers l’épaule gauche, en entrant dans la cavité thoracique par le diaphragme. Retirez doucement la seringue pour retirer l’air résiduel de la cavité thoracique (voir Figure 1P).
- Retirez la bande de la souris.
- Désactivez l’isoflurane.
- Continuez la ventilation avec 100% d’oxygène jusqu’à ce que la souris semble prête à se réveiller.
- Coupez soigneusement la suture de soie 2-0 autour du museau de la souris et extubez la souris.
- Transférez la souris dans une cage propre et surveillez jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie. Euthanasier la souris si des signes de difficulté à respirer sont présents.
- Fournir une analgésie postopératoire en injectant par voie sous-cutanée 10 μL (0,1 mg/kg) de buprénorphine diluée dans 90 μL de solution tamponnée stérile au phosphate (PBS).
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Representative Results
Les étapes de l’intervention chirurgicale décrites dans ce protocole sont résumées et illustrées à la figure 1. Brièvement, avant la chirurgie, les souris sont anesthésiées et les poils sur le thorax gauche sont enlevés. Les souris sont intubées et ventilées mécaniquement pour permettre leur survie lors de la rupture de la cavité thoracique. Les tissus mous recouvrant les côtes sont excisés et un petit défaut circulaire est créé, couvrant les6ème et7ème côtes. Le cadre de fenêtre optique est inséré dans le défaut et sa face inférieure (à l’extérieur de l’ouverture claire) est collée au tissu pulmonaire. Le cadre de la fenêtre est ensuite fixé avec une combinaison de sutures et d’adhésif, refermant la cavité thoracique et permettant la reprise d’une respiration normale après l’extubation. Une fois implanté avec succès, le poumon adhère à la fenêtre optique (qui est incorporée dans la paroi thoracique), avec des gradients de pression intrathoraciques préservés. Cela permet une survie confortable de la souris, permettant une imagerie quotidienne jusqu’à l’allocation de protocole (2 semaines). L’imagerie intravitale peut ensuite être effectuée à travers la fenêtre, comme décrit précédemment pour les autres fenêtres15,19,20.
Pour la visualisation de différents types de cellules, de structures biologiques ou d’états fonctionnels cellulaires, la procédure présentée ici peut être effectuée sur un large éventail de souris qui ont été génétiquement manipulées pour exprimer des protéines fluorescentes21 ou injectées avec des colorants22. Le caractère permanent de la fenêtre la rend compatible avec les techniques de relocalisation des champs de vision telles que la photoconversion23,24 ou la microcartographie17,18. La microcartographie est une technique de triangulation basée sur l’utilisation de transformations calculées de coordonnées de marques fiduciales fixes entre les sessions d’imagerie afin de prédire et de relocaliser une région d’intérêt. Dans la fenêtre créée comme décrit ci-dessus, ces marques fiduciales sont des rayures légères gravées dans le cadre de la fenêtre (Figure supplémentaire 2) qui sont facilement identifiables au microscope. Cela permet de trouver le même champ de vision plusieurs fois, même dans des tissus autrement non marqués. La figure 2 illustre le résultat de ces techniques chez une souris où le système vasculaire pulmonaire a été marqué par injection d’un dextran de haut poids moléculaire marqué par colorant (tétraméthylrhodamine 155 kD dextran) et la même micro-vascularisation relocalisée sur 3 jours.
Ce dextran s’est avéré extrêmement utile pour évaluer les ouvertures vasculaires transitoires qui sont induites pendant les périodes d’intravasation des cellules tumorales25,26,27. En effet, il a été démontré que, dans les tumeurs mammaires primaires, ce dextran de haut poids moléculaire est par ailleurs effectivement séquestré dans le système vasculaire et ne s’écoule pas dans l’interstitium25. Ceci est en contraste avec les dextrans de poids moléculaire inférieur (tels que 10 kD ou 70 kD), dont il a été démontré qu’ils fuyaient passivement des vaisseaux néoangiogéniques28,29. Pendant ce temps, le système vasculaire pulmonaire sain a été observé comme étant plus résistant aux fuites, le dextrans >10 kD ne s’échappant vers l’interstitium que lors d’une insulte à l’organe, par exemple lors d’une exposition à des exosomes30 ou à des virus31. Il existe également une variété d’agents de contraste pour mesurer d’autres paramètres dans les poumons (p. ex., marqueurs nucléaires, indicateurs vivants/morts, rapporteurs de stress oxydatif, trackers de vitesse du flux sanguin) en plus de la perméabilité vasculaire. Une excellente ressource les cataloguant peut être trouvée dans le protocole par Ueki et al.22.
Le WHRIL est une technique très bien adaptée à l’étude de la dynamique du flux sanguin dans les poumons. Cela peut être accompli de plusieurs façons. Tout d’abord, lorsqu’elles sont imagées à l’aide de fréquences d’images relativement lentes (~ 1-10 images par seconde, fps), les vitesses du flux sanguin peuvent être déterminées par les ombres que les érythrocytes non marqués produisent lorsqu’ils circulent dans des vaisseaux plus gros. À faible ips, ces ombres forment des lignes dont l’angle par rapport au vaisseau peut être utilisé pour calculer les débits érythrocytaires32 (Figure 2,lignes jaunes). Deuxièmement, les ombres peuvent également être suivies sur des microscopes à faible ips en alignant les vaisseaux avec l’axe de balayage rapide du microscope et en acquérant des kymographes à l’aide d’un balayage linéaire rapide33,34,35. Enfin, lors de l’imagerie à des fréquences d’images élevées (>10 ips) sur un microscope capable d’intégrer le signal dans le temps (par exemple, un disque en rotation confocal équipé d’un détecteur de dispositif à couplage de charge (CCD)), des particules individuelles peuvent être tracées directement16,17. Dans cette situation, les objets stationnaires apparaissent comme des points lumineux et les objets qui circulent tracent des traces à travers la circulation. Les vitesses des cellules peuvent être quantifiées en mesurant la longueur des pistes et en divisant par le temps d’acquisition de la trame. Un exemple de ceci est donné dans la figure 3 et le film supplémentaire 1, où des microsphères fluorescentes de 2 μm ont été injectées par voie intravasculaire dans la souris avant l’imagerie.
Avec la possibilité de revenir de manière répétée et cohérente au même champ de vision, la visualisation des processus qui évoluent sur plusieurs jours est désormais possible. Comme démonstration de cette application, le WHRIL a été utilisé pour visualiser la progression métastatique des cellules cancéreuses du sein dans les poumons17,21: c’est-à-dire pour suivre au fil du temps le sort des cellules tumorales individuelles qui arrivent à la vascularisation pulmonaire. Ce concept est représenté à la figure 4A, où une seule cellule tumorale disséminée est visualisée peu de temps après son hébergement dans un segment de micro-vascularisation pulmonaire. Le retour au même endroit les jours suivants révèle le sort de la cellule tumorale (par exemple, recirculation, extravasation, etc.). Appliqué à l’étude des étapes culminantes de la progression métastatique dans le poumon, il a été possible de chroniquer visuellement les processus dynamiques, y compris l’arrivée des cellules tumorales (Figure 4B), l’extravasation (Figure 4C), et la prolifération pour former des macro-métastases (Figure 4D).
Figure 1: Résumé de la chirurgie pour l’implantation de la fenêtre d’imagerie pulmonaire à haute résolution (WHRIL). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: La microcartographie permet la relocalisation de positions fixes à l’intérieur de la fenêtre optique. L’imagerie intravitale multiphotonique d’une seule région du poumon sous le couvercle optiquement transparent montre une microvascularisation déplacée pendant 3 jours consécutifs à l’aide de la microcartographie. Les flèches jaunes indiquent un point de branche clairement définissable à partir d’un seul navire identifié chaque jour consécutif. Les lignes jaunes mettent en évidence les ombres que les érythrocytes non marqués font lorsqu’ils circulent dans des vaisseaux plus gros. L’angle de ces lignes par rapport au vaisseau peut être utilisé pour calculer les débits érythrocytaires. Rouge = tdTomato cellules endothéliales marquées et 155 kDa Tétraméthylrhodamine dextran marqué sérum sanguin, Vert = cellules tumorales marquées GFP, Bleu = deuxième génération harmonique. Barre d’échelle = 15 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Visualisation du débit sanguin. Les débits sanguins peuvent être visualisés en injectant des microsphères fluorescentes de 2 μm de diamètre rétro-orbitale et en imageant leur passage dans les vaisseaux sanguins. Lorsqu’elles sont imagées sur un microscope capable d’intégrer le signal au fil du temps (par exemple, un disque en rotation confocal équipé d’un détecteur CCD), les microsphères stationnaires apparaissent sous forme de points lumineux (flèches) et les sphères qui circulent tracent des traces à travers la circulation (lignes entre crochets). Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Le WHRIL peut capturer chaque étape de la cascade métastatique dans le poumon en visualisant directement le sort des cellules tumorales disséminées. (A) Le suivi du sort des cellules tumorales disséminées (vert) est réalisable avec l’imagerie en série, sur plusieurs jours, via le WHRIL. Le jour 1, on observe qu’une cellule tumorale est arrivée et logée dans le système vasculaire pulmonaire. Au jour 2 et au jour 3, la cellule n’est plus présente dans le système vasculaire pulmonaire, ayant recirculé ou est morte. Barre d’échelle = 15 μm. (B-D) Visualisation de chacun des stades de la métastase des cellules tumorales dans le poumon. (B) Cellule tumorale disséminée intravasculaire (verte) logée dans le système vasculaire pulmonaire après l’arrivée. (C) Cellule tumorale disséminée (verte) après extravasation dans le parenchyme pulmonaire. (D) Cellules tumorales qui ont proliféré et se sont développées en micro-métastases. Rouge = tdTomato cellules endothéliales marquées et 155 kDa Tétraméthylrhodamine dextran marqué sérum sanguin, Vert = cellules tumorales marquées GFP, Bleu = deuxième génération harmonique. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Film supplémentaire 1 : Vidéo correspondant à la figure 3 montrant le système vasculaire pulmonaire avec des microsphères circulantes de 2 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Figure supplémentaire 1: Dessins de conception mécanique de l’outil decoupe en acier inoxydable utilisé pour guider le poinçon de biopsie de 5 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Dessins de conception mécanique pour le cadre de fenêtre en acier inoxydable. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Dessins de conception mécanique pour l’outil de support de fenêtre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Sur les sites de métastases à distance tels que le poumon, l’imagerie optique à haute résolution fournit un aperçu de la dynamique élaborée des métastases des cellules tumorales. En permettant la visualisation in vivo de cellules cancéreuses uniques et de leurs interactions avec le tissu hôte, l’imagerie intravitale à haute résolution s’est avérée essentielle à la compréhension des mécanismes sous-jacents aux métastases.
Décrit ici est un protocole chirurgical amélioré pour l’implantation thoracique permanente d’une fenêtre optique conçue pour permettre l’imagerie en série du poumon murin via la microscopie multiphotonique à haute résolution. La fenêtre créée à l’aide de ce protocole est bien tolérée et, compte tenu de sa capacité à refermer avec succès la cavité thoracique, est capable de maintenir les gradients de pression intrathoraciques nécessaires à la ventilation spontanée (contrairement à toute autre fenêtre décrite précédemment pour l’imagerie du poumon murin14,15,16,36,37 ). Cela permet à la souris de se réveiller de l’anesthésie, de respirer indépendamment et de survivre confortablement avec la cage thoracique transparente pendant une période prolongée de plusieurs semaines.
À l’aide de cette fenêtre, il a été possible de visualiser, avec une résolution unicellulaire, toutes les étapes de la métastase, y compris l’arrivée, l’extravasation et la croissance en micrométastases.
Bien que le protocole nécessite une certaine compétence technique, avec de la pratique et une attention particulière à plusieurs étapes clés, la procédure peut être effectuée avec un taux de réussite élevé. Tout d’abord, lors de l’enlèvement des poils avant la chirurgie, il est essentiel de protéger la peau de la souris en retirant la crème dépilatoire avec un tissu humidifié après pas plus de 20 s de contact. Pendant la chirurgie, une extrême prudence doit être faite pour éviter de couper les vaisseaux. Des saignements excessifs, le plus souvent rencontrés en raison de la division des artères brachiales ou mammaires internes lors de l’ablation du coussinet adipeux mammaire, peuvent obscurcir la visualisation dans le champ chirurgical ou entraîner la mort par exsanguination. Ce protocole décrit récemment l’utilisation d’un poinçon de biopsie et d’un outil de coupe(figure supplémentaire 1),qui accélèrent et simplifient considérablement la création du défaut circulaire à travers la cage thoracique, ainsi qu’un outil de porte-fenêtre facilitant l’implantation. La mise en œuvre de ces avancées améliore considérablement le taux de réussite de la procédure et réduit le niveau requis de compétences chirurgicales préalables. Les laboratoires individuels peuvent utiliser les dessins des figures supplémentaires pour fabriquer ces outils avec des ateliers d’usinage internes ou commerciaux. Une recherche sur Internet pour les « sites d’enchères d’ateliers d’usinage » donnera plusieurs applications en ligne qui aideront à trouver des ateliers d’usinage commerciaux locaux.
Enfin, il est crucial de s’assurer que le tissu pulmonaire reste sec avant l’application d’adhésif. L’écueil le plus courant entraînant une fixation infructueuse du couvercle est l’incapacité à assurer l’élimination complète de l’humidité de la surface du poumon avant l’apposition avec le cadre ou le verre de couverture. De plus, pour garantir des images de qualité, une couche de colle extrêmement fine (<10 μm) doit être appliquée. L’excès de colle doit être gratté avant la mise en place du verre de couverture.
La principale limitation de l’IVI à travers le WHRIL est la profondeur de pénétration relativement limitée réalisable. Par conséquent, la pathologie survenant profondément dans le poumon est inaccessible. Malgré cette limitation, la technique peut encore produire une abondance d’informations cliniquement pertinentes, en particulier dans les investigations oncologiques, compte tenu de la propension décrite pour les métastases pulmonaires localisées périphériquement38,39,40,41. En fin de compte, cette approche d’imagerie offre un avantage considérable par rapport aux essais ex vivo standard et à d’autres méthodes d’imagerie in vivo, qui soit déconnectent les tissus desprocessus physiologiques vitaux10,11, 12,13, ou limitent l’analyse longitudinale à une durée maximale de12h14, 15,16,37,42, respectivement.
Pour l’imagerie répétée au cours de cette période, plusieurs défis doivent encore être surmontés. Tout d’abord, il est important de maintenir la santé de la peau autour de la fenêtre implantée, car, bien que le tissu blessé ne soit pas exposé, la peau autour peut encore devenir enflammée ou infectée. L’application systématique d’une pommade antibiotique aidera à prévenir cela. Deuxièmement, avec le temps, l’exsudat de la peau coupée peut se congeler sous le cadre de la fenêtre et empêcher le placement de la plaque de fixation utilisée pour immobiliser la souris au stade du microscope. Placer un tissu humide sur le WHRIL pendant 10-15 min ramollira cet exsudat et permettra de placer le cadre de la fenêtre. Troisièmement, l’un des mécanismes du corps pour excréter l’excès d’eau et maintenir l’homéostasie est l’expiration de la vapeur. Ainsi, un apport hydrique trop important (principalement à la suite de l’injection d’agents de contraste ou de suspensions de cellules tumorales) entraînera l’excrétion de cet excès d’eau par la surface pulmonaire et entraînera le détachement du tissu pulmonaire du WHRIL. Cela peut être évité en limitant le volume des injections à un maximum de 50 μL à la fois. Enfin, même avec les meilleurs soins, le tissu pulmonaire peut parfois se détacher du WHRIL en raison de l’ingestion par la souris d’un grand volume d’eau ou en raison du surmenage de la souris. Lorsque cela se produit, le détachement du tissu pulmonaire du WHRIL se produit généralement lentement, en commençant par le bord extérieur. Ainsi, il peut être impossible de suivre certains champs de vision situés le premier jour d’imagerie pendant toute la durée de la fenêtre. Il a été constaté que les meilleurs résultats d’imagerie seront obtenus dans les premiers jours et que l’utilisation de techniques de mosaïque telles que l’imagerie intravitale à haute résolution à grand volume21 publiée précédemment peut minimiser l’impact de cette limitation.
Étant donné que le WHRIL est intégré dans la paroi thoracique de la souris, la dérive pendant l’imagerie n’est généralement pas un problème important, tant que l’on veille à ce que la fixation entre la fenêtre et le microscope soit ferme. Néanmoins, une petite quantité de dérive peut être observée pendant le temps qui suit immédiatement le placement de la souris au microscope. Cela peut provenir de la relaxation du corps de la souris ou de la dilatation thermique des composants du microscope (plaque de scène, étage XY, lentille d’objectif) due à la chambre environnementale. Cette dérive peut être évitée en allouant environ 30 minutes pour l’équilibrage avant de commencer la procédure d’imagerie. Cette période de temps permet à la physiologie de la souris de se stabiliser sous anesthésie et permet à tous les composants de parvenir à l’équilibre thermique. Toute petite quantité de dérive résiduelle peut facilement être gérée par des algorithmes de calcul tels que StackReg43 ou HyperStackReg44.
Enfin, ce protocole est une amélioration par rapport à la version écrite précédente pour deux raisons. Tout d’abord, le format visuel permet une meilleure conceptualisation du protocole chirurgical. Ceci est particulièrement utile pour les étapes cruciales où 1) le poumon est séché en appliquant un flux doux et régulier d’air comprimé (étape 3.24, Figure 1J),2) le couvercle est fixé à l’alésage central du cadre de la fenêtre de manière à empêcher le piégeage des bulles (étape 3.31), et 3) une petite quantité de cyanoacrylate liquide est ajoutée à l’interface métal-verre pour assurer une étanchéité à l’air entre le verre de couverture et le cadre de la fenêtre (étape 3.34, figure 1O).
En conclusion, avec l’avènement du WHRIL, étant donné son aptitude à la visualisation subcellulaire du même tissu pulmonaire sur une période prolongée, les chercheurs sont nouvellement habilités à répondre à de nombreuses questions sans réponse. Plus précisément, le protocole décrit ici permet une exploration fondamentale des processus dynamiques sous-jacents à de nombreuses pathologies, y compris la progression des métastases cancéreuses.
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Disclosures
Les auteurs ne divulguent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes : CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561 de Montefiore, METAvivor Early Career Award, le Gruss-Lipper Biophotonics Center et son programme d’imagerie intégrée, et Jane A. et Myles P. Dempsey. Nous tenons à remercier l’Analytical Imaging Facility (AIF) de l’Einstein College of Medicine pour son soutien en imagerie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
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