Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת חלון אופטי השוכנות לצמיתות עבור בית החזה מורין, המאפשר הדמיה תוך-ויאלית ברזולוציה גבוהה של הריאה. קביעות החלון הופכת אותו מתאים היטב לחקר תהליכים תאיים דינמיים בריאה, במיוחד אלה המתפתחים לאט, כגון התקדמות גרורתית של תאים סרטניים מופצים.
Abstract
גרורות, המהוות כ-90% מהתמותה הקשורה לסרטן, כוללת התפשטות מערכתית של תאים סרטניים מגידולים ראשוניים לאתרים משניים כגון העצם, המוח והריאה. למרות שנחקר בהרחבה, הפרטים המכניסטיים של תהליך זה נשארים מובנים היטב. בעוד שמודליות הדמיה נפוצות, כולל טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) והדמיה תהודה מגנטית (MRI), מציעות דרגות שונות של הדמיה גסה, כל אחת מהן חסרה את הרזולוציה הזמנית והמרחבית הדרושה כדי לזהות את הדינמיקה של תאי גידול בודדים. כדי לטפל בכך, טכניקות רבות תוארו עבור הדמיה תוך-וינטלית של אתרים גרורתיים נפוצים. מתוך אתרים אלה, הריאה הוכיחה מאתגרת במיוחד לגישה להדמיה תוך-ויאלית בשל עדינותה ותפקידה הקריטי בשמירה על החיים. למרות מספר גישות תוארו בעבר עבור הדמיה תוך-וינטלית של תא יחיד של הריאה שלם, כל כרוך מאוד פולשני הליכים סופני, הגבלת משך ההדמיה המרבי האפשרי ל 6-12 שעות. מתואר כאן טכניקה משופרת להשתלה קבועה של חלון אופטי בית החזה זעיר פולשני להדמיה ברזולוציה גבוהה של הריאה (WHRIL). בשילוב עם גישה מותאמת למיקרוקרטוגרפיה, החלון האופטי החדשני מאפשר הדמיה תוך-וינטלית סדרתית של הריאה השלמה ברזולוציה של תא בודד על פני מפגשי הדמיה מרובים ומשתרע על פני מספר שבועות. בהתחשב במשך הזמן חסר התקדים שבו ניתן לאסוף נתוני הדמיה, WHRIL יכול להקל על גילוי מואץ של המנגנונים הדינמיים שבבסיס ההתקדמות גרורתית ותהליכים ביולוגיים רבים נוספים בתוך הריאה.
Introduction
אחראי ~ 90% ממקרי המוות, גרורות הוא הגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן1. בין האתרים העיקריים של גרורות שנצפו קלינית (עצם, כבד, ריאות, מוח)2, הריאה הוכיחה מאתגרת במיוחד עבור הדמיה in vivo באמצעות מיקרוסקופיה תוך ויאלית. הסיבה לכך היא שהריאה היא איבר עדין בתנועה מתמדת. התנועה המתמשכת של הריאות, המורכבת עוד יותר על ידי תנועת לב תוך-גזעית, מהווה מחסום משמעותי להדמיה מדויקת. לכן, בשל חוסר נגישותה היחסית לאופנה להדמיה אופטית תוך-וינטלית ברזולוציה גבוהה, צמיחת הסרטן בתוך הריאה נחשבה לעתים קרובות לתהליך נסתר3.
בסביבה הקלינית, טכנולוגיות הדמיה כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) והדמיה תהודה מגנטית (MRI) מאפשרות הדמיה עמוק בתוך איברים חיוניים שלמים כגון הריאה4. עם זאת, בעוד שיטות אלה מספקות תצוגות מצוינות של האיבר ברוטו (לעתים קרובות אפילו חושף פתולוגיה לפני הופעת הסימפטומים הקליניים), הם ברזולוציה לקויה כדי לזהות תאים סרטניים מופצים בודדים כפי שהם מתקדמים דרך השלבים המוקדמים של גרורות. כתוצאה מכך, עד שהמודל הנ"ל מספק כל אינדיקציה לגרורות לריאה, מוקדים גרורתיים כבר מבוססים ומתרבים היטב. מאז microenvironment הגידול ממלא תפקיד מרכזי בהתקדמות הסרטן היווצרות גרורות5,6, יש עניין רב לחקור את השלבים המוקדמים ביותר של זריעה גרורתית ב vivo. עניין זה מתודלק עוד יותר על ידי ההערכה המוגברת שתאים סרטניים מופצים עוד לפני שהגידול העיקרי מזוהה7,8 והראיות הגוברות לכך שהם שורדים כתאים בודדים ובמצב רדום במשך שנים עד עשרות שנים לפני שנשרים לתוך מאקרו-גרורות9.
בעבר, הדמיה של הריאה ברזולוציה של תא אחד כללה בהכרח תכשירים ex vivo או explant10,11,12,13, הגבלת ניתוחים לנקודות זמן בודדות. בעוד שתכשירים אלה מספקים מידע שימושי, הם אינם מספקים כל תובנה על הדינמיקה של תאים סרטניים בתוך האיבר המחובר למערכת מחזור שלמה.
ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה בהדמיה אפשרה הדמיה תוך-וינטלית של הריאה השלמה ברזולוציה של תא בודד על פני תקופות של עד 12 שעות14,15,16. זה נעשה במודל מורין באמצעות פרוטוקול שכלל אוורור מכני, כריתה של בית החזה, ושתקת ריאות בסיוע ואקום. עם זאת, למרות המציע את התמונות הראשונות ברזולוציה של תא בודד של הריאה השלם מבחינה פיזיולוגית, הטכניקה היא פולשנית מאוד סופני, ובכך מונע מפגשי הדמיה נוספים מעבר להליך האינדקס. מגבלה זו, אם כן, מונעת את יישומה לחקר צעדים גרורתיים הנגזרים מ- 12 שעות, כגון רדומים וייזום מחדש של צמיחה14,15,16. יתר על כן, דפוסים של התנהגות תאית שנצפו באמצעות גישה הדמיה זו חייבים להתפרש בזהירות, בהתחשב בכך הפרשי לחץ הנגרמים על ידי ואקום עלולים לגרום הסחות בזרימת הדם.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותח לאחרונה חלון זעיר פולשני להדמיה ברזולוציה גבוהה של הריאה (WHRIL), המקלה על הדמיה סדרתית על פני תקופה ממושכת של ימים עד שבועות, ללא צורך באוורור מכני17. הטכניקה כרוכה ביצירת 'בית החזה שקוף' עם חלל בית החזה אטום לשימור תפקוד תקין של הריאות. ההליך נסבל היטב, ומאפשר לעכבר להתאושש ללא שינוי משמעותי בפעילות הבסיסית ובתפקוד. כדי אמין לוקליזציה בדיוק באותו אזור ריאות בכל מפגש הדמיה בהתאמה, טכניקה המכונה microcartography הוחל על חלון זה18. דרך חלון זה, ניתן היה ללכוד תמונות של תאים כשהם מגיעים למיטת כלי הדם של הריאה, חוצים את האנדהותל, עוברים חלוקת תאים וגדלים למיקרו גרורות.
כאן, המחקר מציג תיאור מפורט של פרוטוקול כירורגי משופר להשתלה של WHRIL, אשר מפשט את הניתוח ובו זמנית להגדיל את יכולת הרבייה והאיכות שלה. בעוד פרוטוקול זה נועד לאפשר חקירה של התהליכים הדינמיים שבבסיס גרורות, הטכניקה עשויה להיות מיושמת לחילופין על חקירות של תהליכים רבים של ביולוגיה ריאות ופתולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות, כולל אישור מראש של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה מוסדית לטיפול בבעלי חיים והוועדה לשימוש בבעלי חיים.
1. פסיבציה של חלונות
- שטפו את מסגרות החלונות האופטיות (איור משלים 2) עם פתרון של 1% (w/v) של חומר ניקוי פעיל אנזימטית.
- בתוך צנצנת זכוכית, להטביע את מסגרות החלון האופטי 5% (w / v) פתרון נתרן הידרוקסיד במשך 30 דקות ב 70 °C (70 °F).
- הסר ושטוף את מסגרות החלון במים דה-יוניים.
- בתוך צנצנת זכוכית חדשה, להטביע את מסגרות החלון האופטי 7% (w / v) פתרון חומצת לימון במשך 10 דקות ב 55 °C (55 °F).
- שוב, להסיר ולשטוף את מסגרות החלון עם מים deionized.
- חזור על שלב 1.2; לאחר מכן, להסיר ולשטוף מסגרות חלון עם מים deionized.
2. הכנה לניתוח
- לבצע את הניתוח במכסה המנוע או בארון זרימה למינאר. כדי למנוע זיהום של השדה האופרטיבי, להבטיח אזורים נפרדים ומופרדים להכנה, ניתוח, והתאוששות, בהתאמה.
- לקראת הניתוח, לעקר את כל המכשירים הכירורגיים ב autoclave. אם ההליכים הבאים מתוכננים, לעקר מחדש מכשירים באמצעות מחטא חרוזים חם. עבור הליך כירורגי זה, טכניקה טיפים בלבד משמש.
- כוח על חרוז כירורגי מחומם וחיטוי חרוזים.
- להנשים את העכבר עם 5% איזופלוראן בתא ההרדמה.
- כדי להסיר את השיער, יש למרוח בנדיבות קרם דפילטורי על אתר ההסתה של החזה השמאלי העליון. לאחר לא יותר מ 20 s, לנגב בחוזקה את השיער ואת קרם depilatory באמצעות נייר טישו לח. יש לחזור על הפעולה לפי הצורך כדי להסיר את כל השיער מאתר הניתוח.
- בעזרת תפר משי 2-0, קשרו קשר בבסיס צנתר 22 גרם, והותירו זנבות באורך 2 אינץ' (ראו איור 1A).
3. ניתוח חלון ריאות
- יש לשטוף ידיים באמצעות סבון חיטוי.
- לפני כל ניתוח חדש, דון כפפות סטריליות חדשות.
- כדי למנוע ייבוש קרנית ונזק לעיני העכבר, יש למרוח משחה עיניים על שתי העיניים.
- לדלל 10 μL (0.1 מ"ג/ק"ג) של buprenorphine ב 90 μL של PBS סטרילי, ולאחר מכן להזריק תת עורית כדי להבטיח מנטל לפני הניתוח.
- צנררו את העכבר עם צנתר 22 גרם קשור לתבל משי15. באמצעות נורת אינפלציה, לאשר צנרור מוצלח על ידי ציין עליית חזה דו צדדית על לחיצת נורה.
- אבטחו את צנתר הצנרור על ידי קשירת תבר המשי 2-0 סביב חוטמו של העכבר (ראו איור 1B).
- מניחים את העכבר על הדוכן הכירורגי המחומם וממקמים אותו בדקוביטוס לרוחב ימין כדי לחשוף את בית החזה השמאלי.
- חבר את מכונת ההנשמה לקטטר הצנרור.
- ודא אוורור מבוקר ויציב על מכונת ההנשמה ולאחר מכן להוריד את isofluorane ל 3%. בתחילת ההליך ומדי פעם לאורך כל ההליך, להעריך את ההתאמה של הרדמה על ידי ביצוע בדיקת צביטת הבוהן.
- באמצעות סרט נייר, מאובטחים באופן קרני ובאופן גס את הגפיים הקדמיות והי האחוריות, בהתאמה, לשלב הניתוח המחומם. מקם פיסת סרט נוספת לאורך גב העכבר כדי למקסם את החשיפה לשדה הניתוחי (ראו איור 1C).
- פתח את כל המכשירים הכירורגיים מתחת למכסה המנוע לשימור סטריליות.
- לחטא את האתר הכירורגי על ידי יישום נדיב של חיטוי לעור של העכבר.
- באמצעות מלקחיים, הרימו את העור ובצעו חתך מעגלי ~ 10 מ"מ, ~ 7 מ"מ משמאל לחזה החזה ו ~ 7 מ"מ מעולה על השוליים התת-ציליים (איור 1D).
- זהה בזהירות כל כלי שיט עיקרי. אם חלוקת כלי הדם נחוצה, לצרוב בשני קצות עם עט electrocautery כדי לשמור על hemostasis.
- לחתוך את הרקמה הרכה מעל הצלעות.
- הגבה את הצלעהשישית אוהשביעית באמצעות מלקחיים. באמצעות להב יחיד של המספריים המיקרו-ניתוח קהים, הצד המעוגל לכיוון הריאה, חודר בזהירות את השריר הבין-צלעי ביןהצלעות 6 ו-7 כדי להיכנס לחלל התוך-אתורי(איור 1E).
- פריקה עדינה של מיכל אוויר דחוס בפגם כדי למוטט את הריאה ולהפריד אותה מקיר החזה. תדליקו את האוויר הדחוס בהתפרצויות קצרות כדי למנוע פגיעה ריאות יטרוגנית.
- הניחו את אגרוף הביופסיה מעל כלי החיתוך(איור 1 משלים)ותמרנו בזהירות את בסיס כלי החיתוך באמצעות החתך הבין-צלעי (איור 1F).
- כוון את הבסיס של כלי החיתוך כך שהוא מקביל לקיר החזה. נקבו חור עגול בקורס 5 מ"מ דרך כלוב הצלעות(איור 1G).
הערה: ודא כי רקמת הריאה החשופה היא ורודה, ללא סימני נזק. - בעזרת תפר משי 5-0, צור תפר חוט ארנק ~ 1 מ"מ מהחור, בהיקף, שזור עם הצלעות(איור 1H).
- מקם את מסגרת החלון כך שקצוות הפגם המעגלי יתיישרו בתוך החריץ של החלון (ראו איור 1I).
- נעלו היטב את החלון המושתל על ידי תיוץ הדוק של תיל המשי 5-0.
- טען 100 μL של דבק ג'ל ציאנואקרילט לתוך מזרק 1 מ"ל.
- יבש את הריאה על ידי החלת זרם עדין יציב של אוויר דחוס עבור ~ 10-20 s(איור 1J).
- באמצעות מלקחיים כדי לאחוז במסגרת החלון בקצה החיצוני שלה, הרם בעדינות כדי להבטיח הפרדה של הריאה מהפנים התחתיות של מסגרת החלון.
- יש לפזר שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט לאורך הפנים התחתיות של מסגרת החלון האופטית(איור 1K).
- להגביר את הלחץ הסופי-תפוגה החיובי (PEEP) על מכונת ההנשמה כדי לנפח את הריאה.
- מחזיקים במשך 10-20 שניות, מפעילים לחץ עדין אך מוצק כדי לחבר את מסגרת החלון האופטית לרקמת הריאה(איור 1L).
- יש לפזר טיפה של 5 מ"מ של דבק ג'ל הציאנואקרילט הנותר על כיסוי מלבני.
- הרימו את כיסוי ה-5 מ"מ באמצעות טנדרים ואקום. טובלים את הפנים התחתונות של כיסוי הדבק לתוך הדבק, ולאחר מכן לגרד את דבק עודף שלוש פעמים על הצד של כיסוי מלבני, כך שרק שכבה דקה מאוד נשארה (איור 1M).
- מקם בזהירות את כיסוי כדי להתאים בתוך ההפסקה במרכז מסגרת החלון האופטי והוא מוחזק מעל רקמת הריאה בזווית. לחץ בקצרה על מכונת ההנשמה כדי ליצור לחץ חיובי, מנפח את הריאה. באמצעות תנועה מסתובבת, כוון את כיסוי מקביל לרקמת הריאה כדי ליצור פריסה ישירה בין פני הריאה לבין הפנים התחתיות של כיסוי. שמור על לחץ עדין, ומאפשר דבק cyanoacrylate להגדיר (~ 25 s).
- השתמשו במלקחיים כדי להפריד את הכיסויים מאיסוף הוואקום(איור 1N).
- באמצעות תפר משי 5-0, שוב ליצור תפר ארנק מחרוזת, הפעם <1 מ"מ בהיקף מן הקצה לחתוך של חתך העור. יש לתחוב עור עודף מתחת לשפה החיצונית של מסגרת החלון לפני קשירתו בחוזקה עם קשרים נעילה.
- כדי להבטיח אטם הדוק אוויר בין כיסוי למסגרת החלון, יש לחלק כמות קטנה של ציאנואקרילט נוזלי בממשק הזכוכית המתכתית (ראו איור 1O).
- חבר מחט סטרילית למזרק אינסולין 1 מ"ל. הכנס את המחט מתחת לתהליך xiphoid, מתקדם לכיוון הכתף השמאלית, נכנס לחלל בית החזה דרך הסרעפת. יש לסגת בעדינות מהמזרק כדי להסיר כל שאריות אוויר מחלל בית החזה (ראו איור 1P).
- הסר את הקלטת מהעכבר.
- כבה איזופלוראן.
- המשך אוורור עם 100% חמצן עד שהעכבר נראה מוכן להתעורר.
- חותכים בזהירות את תפר המשי 2-0 סביב חוטם העכבר ומסלקים את העכבר.
- העבר את העכבר לכלוב נקי ולפקח עד להתאוששות מלאה. המתת חסד את העכבר אם קיימים סימנים של קושי בנשימה.
- ספק שך מזיק לאחר הניתוח על ידי הזרקה תת עורית 10 μL (0.1 מ"ג/ קילוגרם) של buprenorphine מדולל ב 90 μL של פתרון חוצץ פוספט סטרילי (PBS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלבי ההליך הכירורגי המתואר בפרוטוקול זה מסוכמים ומאוירים באיור 1. לזמן קצר, לפני הניתוח, עכברים הם מרדים ואת השיער מעל בית החזה השמאלי מוסר. עכברים מצנררים ומאווררים מכנית כדי לאפשר הישרדות עם פריצת חלל בית החזה. רקמות רכות מעל הצלעות נקטעות, ונוצר פגם מעגלי קטן, המשתרע על צלעותה-6 וה-7. מסגרת החלון האופטי מוכנסת לפגם והצד התחתון שלו (מחוץ לצמצם הצלול) דבק ברקמת הריאה. לאחר מכן, מסגרת החלון מאובטחת בשילוב של תפרים ודבק, חותם מחדש את חלל בית החזה ומאפשר חידוש נשימה רגילה לאחר התרוממות רוח. כאשר מושתל בהצלחה, הריאה תדבוק בחלון האופטי (המשולב כחלק מקיר החזה), עם שיפועי לחץ תוך-אתוריים שנשמרו. זה מאפשר הישרדות נוחה של העכבר, המאפשר הדמיה יומית עד קצבת הפרוטוקול (2 שבועות). לאחר מכן ניתן לבצע הדמיה תוך-וינטלית דרך החלון, כפי שתואר בעבר עבור חלונות אחרים15,19,20.
להדמיה של סוגי תאים שונים, מבנים ביולוגיים, או מצבים תפקודיים תאיים, ההליך המוצג כאן יכול להתבצע על מגוון רחב של עכברים שעברו מניפולציה גנטית כדי לבטא חלבונים פלואורסצנטיים21 או מוזרק עם צבעים22. האופי הקבוע של החלון הופך אותו תואם לטכניקות לאיתור מחדש של שדות תצוגה כגון פוטו-קונברה23,24 או מיקרוקרטוגרפיה17,18. מיקרוקרטוגרפיה היא טכניקת טריאנגולציה המבוססת על שימוש בתמורות מחושבות של קואורדינטות של סימנים פידמיים קבועים בין מפגשי הדמיה כדי לחזות ולהתאים מחדש אזור עניין. בחלון שנוצר כמתואר לעיל, סימנים פיודואליים אלה הם שריטות קלות שנחרטו במסגרת החלון (איור משלים 2) שניתן לזהות בקלות מתחת למיקרוסקופ. זה מאפשר למצוא את אותו שדה ראייה מספר פעמים, אפילו ברקמה לא מסומנת אחרת. איור 2 מדגים את התוצאה של טכניקות אלה בעכבר שבו vasculature הריאות כבר מסומן על ידי הזרקה של dextran משקל מולקולרי גבוה תווית צבע (tetramethylrhodamine 155 kD dextran) ואותו מיקרו-vasculature מחדש לוקליזציה במשך 3 ימים.
דקסטרן זה נמצאה שימושית מאוד בהערכת פתחי כלי דם חולפים המושרים בתקופות של התפשטות תאים סרטניים25,26,27. ואכן, הוכח כי, בגידולים ראשוניים בשד, דקסטרן משקל מולקולרי גבוה זה מבודד ביעילות את כלי הים ואינו דולף לתוך interstitium25. זאת בניגוד לדקסטרנים בעלי משקל מולקולרי נמוך יותר (כגון 10 kD או 70 kD), אשר הוכחו דולפים מכלים ניאואנגיוגניים באופן פסיבי28,29. בינתיים, vasculature הריאות הבריא נצפתה להיות עמיד יותר לדליפה, עם dextrans >10 kD רק בורחים interstitium עלבון לאיבר, כגון עם חשיפה exosomes30 או וירוסים31. מגוון של סוכני ניגוד קיימים גם כדי למדוד פרמטרים אחרים בריאה (למשל, סמנים גרעיניים, אינדיקטורים חיים / מתים, כתבי מתח חמצוני, מעקב אחר מהירות זרימת הדם) בנוסף חמידות כלי דם. משאבים מצוינים מקטלג אותם ניתן למצוא בפרוטוקול על ידי Ueki ואח'22.
WHRIL היא טכניקה המתאימה מאוד לחקור את הדינמיקה של זרימת הדם בריאה. זה יכול להתבצע בכמה דרכים. ראשית, כאשר התמונה באמצעות קצבי פריימים איטיים יחסית (~ 1-10 פריימים לשנייה, fps) מהירויות זרימת הדם יכולות להיקבע על ידי הצללים שאריתרוציטים ללא תווית יוצרים כאשר הם זורמים בכלי שיט גדולים יותר. ב-fps נמוך, צללים אלה יוצרים קווים שהזווית שלהם ביחס לכלי השיט יכולים לשמש לחישוב קצבי זרימת אריתרוציטים32 (איור 2, קווים צהובים). שנית, ניתן לעקוב אחר צללים גם במיקרוסקופים נמוכים של fps על ידי יישור כלי השיט עם ציר הסריקה המהירה של המיקרוסקופ ורכישת קימאוגרפים באמצעות סריקת קווים מהירה33,34,35. לבסוף, כאשר הדמיה בקצבי פריימים גבוהים (>10 fps) על מיקרוסקופ המסוגל לשלב את האות לאורך זמן (למשל, קונפוקלה של דיסק מסתובב המצויד בגלאי התקן מצמיד טעינה (CCD), ניתן לעקוב אחר חלקיקים בודדים ישירות16,17. במצב זה, אובייקטים נייחים מופיעים כנקודות בהירות, ואובייקטים זורמים להתחקות אחר עקבות דרך עם מחזור הדם. ניתן לכמת את מהירויות התא על-ידי מדידת אורך המסלולים וחלוקה לפי זמן רכישת המסגרת. דוגמה לכך ניתנת באיור 3 ובסרט המשלים 1, שבו 2 מיקרוספרות פלואורסצנטיות של מיקרומטר הוזרקו תוך-וסקולרי לעכבר לפני ההדמיה.
עם היכולת לחזור שוב ושוב ובעקביות לאותו שדה ראייה, הדמיה של תהליכים המתפתחים על פני ימים מרובים אפשרית כעת. כהדגמה של יישום זה, WHRIL שימש לדמיין את ההתקדמות גרורתית של תאים סרטניים השד בתוך הריאות17,21: כלומר, כדי לעקוב אחר גורלם של תאים סרטניים בודדים המגיעים vasculature הריאות. מושג זה מתואר באיור 4A, שבו תא גידול אחד מופץ מדמיין זמן קצר לאחר לינה בקטע של מיקרו-vasculature ריאות. החזרה לאותו מיקום בימים שלאחר מכן חושפת את גורלו של תא הגידול (למשל, תגמול, אקזרציה וכו '). החל על חקירת הצעדים שהגיעו לשיאם של התקדמות גרורתית בריאה, ניתן היה לתעד חזותית תהליכים דינמיים, כולל הגעת תאים סרטניים (איור 4B), אקסטרוקציה (איור 4C),והתפשטות ליצירת גרורות מאקרו(איור 4D).
איור 1: סיכום הניתוח להשתלת החלון להדמיה ברזולוציה גבוהה של הריאה (WHRIL). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקרוקרטוגרפיה מאפשרת הקצאה מחדש של מיקומים קבועים בתוך החלון האופטי. הדמיה תוך-וינטלית מולטיפוטנית של אזור בודד בריאה מתחת לכיסוי השקוף אופטית מראה מיקרווסקולטורה שהועתקה במשך 3 ימים רצופים באמצעות מיקרוקרטוגרפיה. חצים צהובים מצביעים על נקודת ענף מוגדרת בבירור מכלי שיט יחיד שזוהה בכל יום ברציפות. קווים צהובים מדגישים צללים שאריתרוציטים ללא תווית מייצרים כאשר הם זורמים בכלי שיט גדולים יותר. הזווית של קווים אלה ביחס לכלי יכול לשמש לחישוב קצבי זרימת אריתרוציטים. אדום = tdTomato שכותרתו תאי אנדותל ו 155 kDa Tetramethylrhodamine דקסטרן שכותרתו סרום דם, ירוק = GFP שכותרתו תאים סרטניים, כחול = דור הרמוני שני. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיה של קצב זרימת הדם. ניתן לדמיין את קצב זרימת הדם על ידי הזרקת מיקרוספרות פלואורסצנטיות בקוטר 2 מיקרומטר רטרו-מסלולית והדמיה של המעבר שלהם דרך כלי הדם. כאשר הם מצויים על מיקרוסקופ המסוגל לשלב את האות לאורך זמן (למשל, קונפוקלד דיסק מסתובב המצויד בגלאי CCD), מיקרוספירות נייחות מופיעות כנקודות בהירות (חצים) וספירות זורמות עוקבות אחר רצועות עם מחזור הדם (קווים סוגריים מרובעים). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. WHRIL יכול ללכוד כל שלב של מפל גרורתי בתוך הריאה על ידי הדמיה ישירה את גורלם של תאים סרטניים מופצים. (א)מעקב אחר גורלם של תאים סרטניים מופצים (ירוק) ניתן להשגה באמצעות הדמיה סדרתית, במשך מספר ימים, באמצעות WHRIL. ביום הראשון, תא גידול נצפה שהגיע ונתקע באזור הריאות. ביום 2 וביום 3 התא כבר לא נמצא vasculature הריאות, לאחר גם recirculated או מת. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. (B-D) הדמיה של כל אחד משלבי גרורות תאי הגידול בריאה. (B)תא גידול תוך וסקולרי המופצה (ירוק) התקוע בכלי הדם של הריאות לאחר ההגעה. (C)תאים סרטניים מופצים (ירוקים) לאחר ההפצה לתוך פרנשימה הריאה. (D)תאים סרטניים שהתרבו וגדלו למיקרו גרורות. אדום = tdTomato שכותרתו תאי אנדותל ו 155 kDa Tetramethylrhodamine דקסטרן שכותרתו סרום דם, ירוק = GFP שכותרתו תאים סרטניים, כחול = דור הרמוני שני. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרט משלים 1: סרטון המתאים לאיור 3 המציג את כלי הדם של הריאות עם מיקרוספירות של 2 מיקרומטר במחזור. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
איור 1 משלים: שרטוטי עיצוב מכניים לכלי חיתוךהפלדה החשוף המשמש להנחיה של אגרוף הביופסיה 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור 2 משלים: שרטוטי עיצוב מכניים למסגרת החלון מפלדת אל-חלד. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: שרטוטי עיצוב מכניים לכלי מחזיק החלון. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באתרים של גרורות רחוקות כגון הריאה, הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה מספקת תובנה על הדינמיקה המשוכללת של גרורות תאים סרטניים. על ידי הפעלת הדמיה של תאים סרטניים בודדים והאינטראקציות שלהם עם הרקמה המארחת, הדמיה תוך-וינטלית ברזולוציה גבוהה הוכיחה את עצמה כמכשיר להבנת המנגנונים הבסיסיים של גרורות.
המתואר כאן הוא פרוטוקול כירורגי משופר להשתלת בית החזה הקבועה של חלון אופטי שנועד לאפשר הדמיה סדרתית של הריאה המורינה באמצעות מיקרוסקופיה מולטיפוטונית ברזולוציה גבוהה. החלון שנוצר באמצעות פרוטוקול זה הוא נסבל היטב, ובהתחשב ביכולתו לסכל מחדש בהצלחה את חלל בית החזה, הוא מסוגל לשמור על שיפועי הלחץ התוך-חושיים הדרושים לאוורור ספונטני (בניגוד לכל חלון אחר שתואר בעבר להדמיה של הריאה המורינה14,15,16,36,37 ). זה מאפשר לעכבר להתעורר מהרדמה, לנשום באופן עצמאי, ולשרוד בנוחות עם בית החזה השקוף במשך תקופה ממושכת של זמן המשתרע על פני שבועות מרובים.
באמצעות חלון זה, ניתן היה לדמיין, ברזולוציה של תא אחד, את כל השלבים של גרורות, כולל הגעה, בזבזנות, וצמיחה לתוך micrometastases.
למרות הפרוטוקול דורש קצת מיומנות טכנית, עם תרגול ותשומת לב זהירה למספר צעדים מרכזיים, ההליך יכול להתבצע עם שיעור הצלחה גבוה. ראשית, בעת הסרת שיער לפני הניתוח, זה קריטי כדי להגן על העור של העכבר על ידי הסרת קרם depilatory עם רקמה לחה לאחר לא יותר מ 20 של מגע. במהלך הניתוח, יש לשלם זהירות קיצונית כדי למנוע חיתוך כלי שיט. דימום מוגזם, הנפוץ ביותר נתקל עקב חלוקה של עורקי brachial או פנימיים ממארי במהלך הסרת כרית שומן המאמרי, יכול לטשטש הדמיה בשדה הניתוח או להוביל למוות באמצעות דימום. מתואר לאחרונה בפרוטוקול זה הוא ניצול של אגרוף ביופסיה וכלי חיתוך (איור 1 משלים),אשר לזרז ולפשט במידה ניכרת את יצירת הפגם המעגלי דרך כלוב הצלעות, וכלי מחזיק חלון מקל על ההשתלה. יישום התקדמות זו משפר באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של ההליך ומפחית את הרמה הנדרשת של מיומנות כירורגית קודמת. מעבדות בודדות יכולות להשתמש בשרטוטים בדמויות התוספות כדי לייצר כלים אלה עם חנויות מכונות פנימיות או מסחריות. חיפוש באינטרנט עבור "אתרי הצעות מחיר של חנויות מכונה" יניב מספר יישומים מקוונים שיסייעו במציאת חנויות מכונות מסחריות מקומיות.
לבסוף, חיוני להבטיח כי רקמת הריאה נשארת יבשה לפני יישום דבק. המלכודת הנפוצה ביותר וכתוצאה מכך קובץ מצורף כיסוי לא מוצלח הוא כישלון להבטיח הסרה מלאה של לחות מפני הריאה לפני ההנפה עם מסגרת או זכוכית כיסוי. יתר על כן, כדי להבטיח תמונות איכותיות, יש להחיל שכבה דקה במיוחד של דבק (<10 מיקרומטר). דבק עודף צריך להיות גירד לפני המיקום של הכיסוי.
המגבלה העיקרית של IVI באמצעות WHRIL היא עומק החדירה המוגבל יחסית בר השגה. לכן, פתולוגיה המתרחשת עמוק בתוך הריאה אינה נגישה. למרות מגבלה זו, הטכניקה עדיין יכולה להניב שפע של מידע רלוונטי מבחינה קלינית, במיוחד בחקירות אונקולוגיות, בהתחשב נטייה המתוארת עבור גרורות ריאות מקומיות היקפיות38,39,40,41. בסופו של דבר, גישת הדמיה זו מספקת יתרון ניכר על פני בדיקות ex vivo סטנדרטיות ושיטות אחרות להדמיית in vivo, אשר גם לנתק רקמה מתהליכים פיזיולוגיים חיוניים10,11,12,13, או להגביל ניתוח אורך למשך מרבי של 12 שעות14,15,16,37,42, בהתאמה.
עבור הדמיה חוזרת לאורך תקופה זו, יש עדיין להתגבר על מספר אתגרים. ראשית, חשוב לשמור על בריאות העור סביב החלון המושתל, שכן בעוד הרקמה הפצועה אינה חשופה, העור סביב עדיין עשוי להיות מודלק או נגוע. יישום שגרתי של משחה אנטיביוטית יעזור למנוע זאת. שנית, עם הזמן, להפיץ מן העור לחתוך עשוי להתכנס מתחת למסגרת החלון ולמנוע את המיקום של צלחת מתקן המשמש לשתק את העכבר בשלב המיקרוסקופ. הצבת רקמה רטובה מעל WHRIL במשך 10-15 דקות תרכך את ההפרה הזו ותאפשר מיקום של מסגרת החלון. שלישית, אחד המנגנונים של הגוף להפרשת עודפי מים ושמירה על הומאוסטזיס הוא באמצעות נשיפה של אדים. לכן, צריכת נוזלים רבה מדי (בעיקר כתוצאה מהזרקת חומרי ניגודיות או השעיות תאים סרטניים) תגרום לפני הריאה להפריש את עודפי המים ותגרום לרקמת הריאה להתנתק מה- WHRIL. ניתן להימנע מכך על ידי הגבלת נפח הזריקות למקסימום של 50 μL בכל פעם. לבסוף, אפילו עם הטיפול הטוב ביותר, רקמת הריאה עשויה להתנתק מדי פעם מן WHRIL בשל העכבר בליעת נפח גדול של מים או בשל העכבר overexerting עצמו. כאשר זה קורה, ניתוק של רקמת הריאה מן WHRIL מתרחשת בדרך כלל לאט, החל בקצה החיצוני. לכן, זה עשוי להיות בלתי אפשרי לעקוב אחר כמה שדות תצוגה הממוקמים ביום הראשון של הדמיה למשך כל החלון. נמצא כי תוצאות ההדמיה הטובות ביותר יתקבלו בימים הראשונים וכי שימוש בטכניקות פסיפס כגון הדמיה תוך-ויאלית ברזולוציה גבוהה בנפח גדולשפורסמה בעבר יכולה למזער את ההשפעה של מגבלה זו.
בהתחשב בכך WHRIL משולב לתוך דופן החזה של העכבר, להיסחף במהלך הדמיה הוא בדרך כלל לא בעיה משמעותית, כל עוד הטיפול משולם כדי להבטיח כי הקובץ המצורף בין החלון ואת המיקרוסקופ הוא מוצק. ובכל זאת, כמות קטנה של סחיפה ניתן לראות במהלך הזמן מיד לאחר מיקום העכבר בשלב המיקרוסקופ. זה עשוי לבוא הרפיה של גוף העכבר או מן ההתפשטות התרמית של רכיבי המיקרוסקופ (לוח במה, שלב XY, עדשה אובייקטיבית) בשל התא הסביבתי. ניתן להימנע מסחיפה זו על-ידי הקצאת ~ 30 דקות עבור שיווי משקל לפני תחילת הליך ההדמיה. פרק זמן זה מאפשר לפיזיולוגיה של העכבר להתייצב תחת ההרדמה ומאפשר לכל הרכיבים להגיע לשיווי משקל תרמי. כל כמות קטנה של סחיפה שיורית יכולה בקלות להיות מטופלת על ידי אלגוריתמים חישוביים כגון StackReg43 או HyperStackReg44.
לבסוף, פרוטוקול זה הוא שיפור לעומת הגירסה הכתובה הקודמת משתי סיבות. ראשית, הפורמט החזותי מאפשר מושג טוב יותר של הפרוטוקול הכירורגי. זה שימושי במיוחד עבור השלבים המכריעים שבהם 1) הריאה מיובשת על ידי החלת זרם עדין יציב של אוויר דחוס (שלב 3.24, איור 1J), 2) כיסוי מחובר לכיסוי המרכזי של מסגרת החלון באופן המונע מלכוד של בועות (שלב 3.31), ו 3) כמות קטנה של ציאנואקרילט נוזלי מתווסף בממשק זכוכית מתכת כדי להבטיח אטם הדוק אוויר בין כיסוי מסגרת החלון (צעד 3.34, איור 10).
לסיכום, עם הופעתו של WHRIL, בהתחשב בהנוחות שלה להדמיה תת-תאית של אותה רקמת ריאה לאורך תקופה ארוכה, החוקרים מוסמכים לאחרונה לענות על שאלות רבות ללא מענה. באופן ספציפי, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר חקירה יסודית של התהליכים הדינמיים שבבסיסם פתולוגיות רבות, כולל התקדמות גרורות סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם חושפים ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: CA216248, CA013330, רות ל. קירששטיין T32 של מונטיפיורי הכשרה Grant CA200561, פרס METAvivor תחילת הקריירה, המרכז לביופוטונייקה Gruss-Lipper ותוכנית ההדמיה המשולבת שלה, וג'יין א' ומיילס פ. דמפסי. ברצוננו להודות למתקן ההדמיה האנליטית (AIF) במכללת איינשטיין לרפואה על תמיכת ההדמיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D.
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E.
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D.
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P.
