Summary
Här presenterar vi ett protokoll för kirurgisk implantation av ett permanent indwelling optiskt fönster för murine bröstkorgen, som möjliggör högupplöst, intravital avbildning av lungan. Fönstrets persistens gör det väl lämpat för studier av dynamiska cellulära processer i lungan, särskilt de som långsamt utvecklas, såsom metastaserad progression av spridda tumörceller.
Abstract
Metastasering, som står för ~ 90% av cancerrelaterad dödlighet, innebär systemisk spridning av cancerceller från primära tumörer till sekundära platser som ben, hjärna och lunga. Även om de studeras utförligt, är de mekanistiska detaljerna i denna process fortfarande dåligt förstådda. Medan vanliga bildframställning modaliteter, inklusive datortomografi (CT), positron utsläpp tomografi (PET) och magnetic resonance imaging (MRI), erbjuder varierande grader av brutto visualisering, saknar var och en den tidsmässiga och rumsliga upplösning som krävs för att upptäcka dynamiken i enskilda tumör celler. För att ta itu med detta har många tekniker beskrivits för intravital imaging av gemensamma ögonbevarande platser. Av dessa platser, lungan har visat sig särskilt utmanande att få tillgång till intravital imaging på grund av dess delikatess och kritiska roll för att upprätthålla livet. Även om flera metoder tidigare har beskrivits för en-cells intravital imaging av intakta lungan, alla innebär mycket invasiva och terminal förfaranden, begränsa högsta möjliga bildframställning varaktighet till 6-12 h. Beskrivs här är en förbättrad teknik för permanent implantation av en minimalt invasiv bröstoptisk fönster för högupplöst bildbehandling av lungan (WHRIL). Kombinerat med en anpassad metod för mikrokartografi underlättar det innovativa optiska fönstret seriell intravital avbildning av den intakta lungan vid encellsupplösning över flera bildbehandlingssessioner och sträcker sig över flera veckor. Med tanke på den aldrig tidigare skådade tidsperioden under vilken avbildningsdata kan samlas in, kan WHRIL underlätta den accelererade upptäckten av de dynamiska mekanismerna bakom metastaserad progression och många ytterligare biologiska processer i lungan.
Introduction
Metastas är ansvarig för ~ 90% av dödsfallen och är den främsta orsaken till cancerrelaterad dödlighet1. Bland de viktigaste platserna för kliniskt observerade metastasering (ben, lever, lunga, hjärna)2, har lungan visat sig vara särskilt utmanande för in vivo-avbildning via intravital mikroskopi. Detta beror på att lungan är ett känsligt organ i evig rörelse. Lungornas kontinuerliga rörelse, ytterligare förvärrad av intrathoracic hjärt rörelse, representerar en betydande barriär mot korrekt imaging. Därför, på grund av dess relativa otillgänglighet till modaliteter för högupplöst intravital optisk avbildning, har cancertillväxt inom lungan ofta ansetts vara en ockult process3.
I den kliniska miljön möjliggör avbildningsteknik som datortomografi (CT), positronutsläppstomografi (PET) och magnetisk resonanstomografi (MRI) visualisering djupt inne i intakta vitala organ somlungan 4. Men medan dessa modaliteter ger utmärkta vyer av bruttoorganet (ofta även avslöjande patologi före uppkomsten av kliniska symtom), är de av otillräcklig upplösning för att upptäcka enskilda spridda tumörceller när de avancerar genom de tidiga stadierna av metastasering. Följaktligen, när de ovannämnda formerna ger någon indikation på metastasering till lungan, metastaserad foci är redan väl etablerad och prolifererande. Eftersom tumörmikromiljön spelar en central roll i cancerprogression och metastaseringsbildning5,6, finns det stort intresse för att undersöka de tidigaste stegen av metastaserad sådd in vivo. Detta intresse drivs ytterligare av den ökade uppskattningen som cancerceller sprider redan innan den primära tumören upptäcks7,8 och de ökande bevisen för att de överlever som enstaka celler och i vilande tillstånd i år till årtionden innan de växer ut till makrometastas9.
Tidigare har avbildning av lungan vid encellsupplösning nödvändigtvis involverat ex vivo- eller explantpreparat10,11,12,13, vilket begränsar analyser till enstaka tidpunkter. Även om dessa preparat ger användbar information, ger de inte någon inblick i dynamiken i tumörceller i organet ansluten till ett intakt cirkulationssystem.
De senaste tekniska framstegen inom avbildning har möjliggjort intravital visualisering av den intakta lungan vid encellsupplösning under perioder på upp till 12 h14,15,16. Detta uppnåddes i en murine modell med hjälp av ett protokoll som involverade mekanisk ventilation, samband av ribcage och vakuum-assisterade lung immobilisering. Men trots att erbjuda de första enskilda cellupplösningsbilderna av den fysiologiskt intakta lungan, är tekniken mycket invasiv och terminal, vilket utesluter ytterligare bildbehandling sessioner utöver index förfarandet. Denna begränsning förhindrar därför dess tillämpning på studier av metastaserande steg som tar längre tid än 12 timmar, såsom vilande och återinitiering av tillväxt14,15,16. Vidare måste mönster av cellulärt beteende som observerats med denna bildframställningsmetod tolkas försiktigt, med tanke på att vakuuminducerade tryckskillnader sannolikt kommer att orsaka avledning i blodflödet.
För att övervinna dessa begränsningar utvecklades nyligen ett minimalt invasivt fönster för högupplöst avbildning av lungan (WHRIL), vilket underlättar seriell avbildning under en längre period av dagar till veckor, utan behov av mekanisk ventilation17. Tekniken innebär skapandet av en "transparent ribcage" med en förseglad brösthåla för bevarandet av normal lungfunktion. Förfarandet tolereras väl, vilket gör det möjligt för musen att återhämta sig utan meningsfull förändring av baslinjeaktivitet och funktion. För att på ett tillförlitligt sätt lokalisera exakt samma lungregion vid varje avbildningssession tillämpades en teknik som kallas mikrokartografi på detta fönster18. Genom detta fönster var det möjligt att fånga bilder av celler när de anländer till lungans kärlbädd, korsar endotel, genomgår celldelning och växer till mikrometastaser.
Här presenterar studien en detaljerad beskrivning av ett förbättrat kirurgiskt protokoll för implantation av WHRIL, vilket förenklar operationen samtidigt som dess reproducerbarhet och kvalitet ökar. Medan detta protokoll utformades för att möjliggöra undersökning av de dynamiska processer som ligger till grund för metastasering, tekniken kan alternativt tillämpas på undersökningar av många processer av lungbiologi och patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll har utförts i enlighet med riktlinjer och förordningar för användning av ryggradsdjur, inklusive förhandsgodkännande av Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Passivering av fönster
- Skölj de optiska fönsterramarna(kompletterande figur 2) med en 1% (w/v) lösning av enzymatiskt aktivt tvättmedel.
- I en glasburk, sänk ner de optiska fönsterramarna i 5% (w/v) natriumhydroxidlösning i 30 min vid 70 °C.
- Ta bort och tvätta fönsterramarna med avjoniserat vatten.
- I en ny glasburk, doppa de optiska fönsterramarna i 7% (w/v) citronsyralösning i 10 min vid 55 °C.
- Ta återigen bort och tvätta fönsterramarna med avjoniserat vatten.
- Upprepa steg 1.2; ta sedan bort och tvätta fönsterramar med avjoniserat vatten.
2. Förberedelse för kirurgi
- Utför operationen i en huva eller laminärt flödesskåp. För att undvika kontaminering av det operativa fältet, säkerställa distinkta, separerade områden för beredning, kirurgi respektive återhämtning.
- Före operationen sterilisera alla kirurgiska instrument i en autoklav. Om efterföljande procedurer planeras, sterilisera instrumenten igen med hjälp av en varmpärlasteriliserare. För detta kirurgiska ingrepp används en tips-endast teknik.
- Ström på den uppvärmda kirurgiska pärlan och pärlasteriliseraren.
- Bedöva musen med 5% isofluran i anestesikammaren.
- För att ta bort hår, applicera generöst depilatorisk kräm på övre vänstra bröstsnittsstället. Efter högst 20 s, torka fast hår och depilatorisk kräm med fuktat vävnadspapper. Upprepa vid behov för att ta bort allt hår från operationsstället.
- Använd 2-0 silkessyst, knyt en knut vid basen av en 22 G-kateter och lämna 2-tums långa svansar (se figur 1A).
3. Lungfönsterkirurgi
- Tvätta händerna med antiseptisk tvål.
- Innan varje ny operation, don nya sterila handskar.
- För att förhindra hornhinnans torkning och skador på musens ögon, applicera oftalmisk salva på båda ögonen.
- Späd 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfin i 90 μL steril PBS och injicera sedan subkutant för att säkerställa preoperativ analgesi.
- Intubera musen med den silkes suturbundna 22 G katetern15. Använd en inflation glödlampa, bekräfta framgångsrik intubation genom att notera bilaterala brösthöjning på glödlampa klämma.
- Fäst intuberingskatetern genom att binda 2-0-silkessyssturen runt musens nos (se figur 1B).
- Placera musen på det uppvärmda kirurgiska stativet och placera det i höger lateral decubitus för att exponera vänster bröstkorg.
- Anslut fläkten till intuberingskatetern.
- Säkerställ kontrollerad, stabil ventilation på ventilatorn och sänk sedan isofluoranen till 3 %. Vid procedurens insjuknande och periodiskt under hela proceduren, bedöma anestesins lämplighet genom att utföra ett toe pinch-test.
- Med hjälp av papperstejp, kranialt och kaudiellt säkra fram- respektive bakbenen till det uppvärmda kirurgiska stadiet. Placera en annan tejpbit längs musens rygg för att maximera exponeringen för operationsfältet (se figur 1C).
- Öppna alla kirurgiska instrument under huven för att bevara steriliteten.
- Sterilisera operationsstället genom en generös applicering av antiseptiskt medel på musens hud.
- Använd tång, lyft huden och gör ett ~10 mm cirkulärt snitt, ~7 mm till vänster om bröstbenet och ~7 mm överlägset subkostalmarginalen (figur 1D).
- Identifiera noggrant alla större fartyg. Om uppdelningen av fartyg är nödvändig, cauterize i båda ändar med elektrocautery penna för att upprätthålla hemostas.
- Ta bort mjukvävnaden som överreagerar revbenen.
- Höj det6:e eller7:e revbenet med tång. Med hjälp av ett enda blad av den trubbiga mikro-dissekerande saxen, den rundade sidan mot lungan, försiktigt genomborra interkostala muskeln mellan6: e och 7:e revbenen för att komma in i intrathoracic utrymmet (figur 1E).
- Försiktigt urladda tryckluftsbehållare vid defekten för att kollapsa lungan och separera den från bröstväggen. Avfyra tryckluften i korta skurar för att förhindra iatrogen lungskada.
- Placera biopsistansen över skärverktyget(kompletterande figur 1) och manövrera försiktigt skärverktygets bas genom det interkostala snittet (figur 1F).
- Orientera skärverktygets botten så att den är parallell med bröstväggen. Stansa ett 5 mm cirkulärt hål genom bröstkorgen (figur 1G).
OBS: Se till att den exponerade lungvävnaden är rosa, utan tecken på skador. - Använd 5-0 silkessyssla, skapa en handväska-strängsöm ~ 1 mm från hålet, circumferentially, sammanflätning med revbenen (figur 1H).
- Placera fönsterramen så att kanterna på den cirkulära defekten ligger i linje med fönstrets spår (se bild 1I).
- Lås säkert det implanterade fönstret genom att tätt binda ner 5-0 silkessysturen.
- Ladda 100 μL cyanoakrylatgellim i 1 ml-sprutan.
- Torka lungan genom att applicera en stadig mild ström av tryckluft i ~10-20 s (Figur 1J).
- Använd tång för att greppa fönsterramen vid dess ytterkant, lyft försiktigt för att säkerställa separation av lungan från fönsterramens undersida.
- Dispensera ett tunt lager cyanoakrylatlim längs den optiska fönsterramens underjord(bild 1K).
- Öka det positiva slututmattande trycket (PEEP) på ventilatorn för att blåsa upp lungan.
- Håll i 10-20 s, applicera försiktigt men fast tryck för att fästa den optiska fönsterramen på lungvävnaden(figur 1L).
- Dispensera en 5 mm droppe av det återstående cyanoakrylatgellimmet på ett rektangulärt täckslip.
- Plocka upp 5 mm täcksläp med vakuumupphämtningar. Doppa täckslipets undersida i limet och skrapa sedan bort överflödigt lim tre gånger mot sidan av det rektangulära täckslipet, så att endast ett mycket tunt lager återstår (figur 1M).
- Placera försiktigt täckslipet så att det passar inuti urtaget i mitten av den optiska fönsterramen och hålls ovanför lungvävnaden i en vinkel. Kläm kort fast ventilatorn för att generera positivt tryck, hyper-blåsa upp lungan. Med hjälp av en roterande rörelse, orientera täckslipet parallellt med lungvävnaden för att skapa direkt apposition mellan lungytan och täckslipets underjord. Håll ett mjukt tryck så att cyanoakrylatlimmet kan ställas in (~25 s).
- Använd tångarna för att separera täcket från vakuumupphämtningarna(bild 1N).
- Med hjälp av 5-0 silkessysa, skapa igen en handväska-strängstygn, den här gången <1 mm omkrets från hudsnittets skärkant. Stoppa in överflödig hud under fönsterramens ytterkant innan du binder fast den ordentligt med låsknutar.
- För att säkerställa en lufttät tätning mellan täcket och fönsterramen, dispensera en liten mängd flytande cyanoakrylat vid metallglasgränssnittet (se figur 1O).
- Fäst en steril nål på en 1 ml insulinspruta. Sätt in nålen under xiphoidprocessen, avancera mot vänster axel och gå in i brösthålan genom membranet. Dra försiktigt tillbaka sprutan för att avlägsna eventuell kvarvarande luft från brösthålan (se figur 1P).
- Ta bort tejpen från musen.
- Stäng av isofluran.
- Fortsätt ventilationen med 100% syre tills musen verkar redo att vakna.
- Skär försiktigt 2-0 silkes sutur runt musens nos och extubera musen.
- Överför musen till en ren bur och övervaka tills den är helt återställd. Avliva musen om tecken på andningssvårigheter förekommer.
- Ge postoperativ analgesi genom att subkutant injicera 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfin utspädd i 90 μL steril fosfatbuffrad lösning (PBS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stegen i det kirurgiska ingreppet som beskrivs i detta protokoll sammanfattas och illustreras i figur 1. Kort, före operationen, sövs möss och håret över vänster bröstkorg avlägsnas. Möss är intuberade och mekaniskt ventilerade för att möjliggöra överlevnad vid brott i brösthålan. Mjukvävnad som överlyssnar revbenen är struken, och en liten cirkulär defekt skapas som sträcker sig över6: e och 7:e revbenen. Den optiska fönsterramen sätts in i defekten och dess undersida (utanför den klara bländaren) fästs vid lungvävnaden. Fönsterramen säkras sedan med en kombination av suturer och lim, återförslutning av brösthålan och tillåter återupptagande av normal andning efter extubation. När den framgångsrikt implanteras kommer lungan att hålla fast vid det optiska fönstret (som ingår som en del av bröstväggen), med intrathoracic tryckgradienter bevarade. Detta möjliggör bekväm överlevnad av musen, vilket möjliggör daglig avbildning upp till protokollbidraget (2 veckor). Intravital avbildning kan sedan utföras genom fönstret, som tidigare beskrivits för andra fönster15,19,20.
För visualisering av olika celltyper, biologiska strukturer eller cellulära funktionella tillstånd kan proceduren som presenteras här utföras på ett brett spektrum av möss som antingen har genetiskt manipulerats för att uttrycka fluorescerande proteiner21 eller injiceras med färgämnen22. Fönstrets permanenta karaktär gör det kompatibelt med tekniker för omlokalisering av synfält som fotokonversion23,24 eller mikrokartografi17,18. Mikrokartografi är en trianguleringsteknik baserad på att använda datoromvandlade omvandlingar av koordinater för fasta fiduciala märken mellan bildbehandlingssessioner för att förutsäga och omlokalisera en region av intresse. I fönstret som skapats enligt beskrivningen ovan är dessa fiduciala märken lätta repor etsade i fönsterramen(kompletterande figur 2) som lätt kan identifieras under mikroskopet. Detta gör det möjligt att hitta samma synfält flera gånger, även i annars omärkt vävnad. Figur 2 visar resultatet av dessa tekniker i en mus där lungvaskulaturen har märkts genom injektion av en färgämnesmärkt hög molekylvikt dextran (tetramethylrhodamine 155 kD dextran) och samma mikro-vaskulatur omlokaliserad under 3 dagar.
Denna dextran befanns vara mycket användbar vid utvärdering av transienta vaskulär öppningar som induceras under perioder av tumörcell intravasation25,26,27. Det har faktiskt visat sig att i primära brösttumörer är denna höga molekylvikt dextran annars effektivt bindad till vaskulaturen och läcker inte in i interstitium25. Detta står i kontrast till dextrans av lägre molekylvikt (såsom 10 kD eller 70 kD), som har visat sig läcka från neoangiogena kärl passivt28,29. Under tiden har den friska lungvaskulaturen observerats vara mer resistent mot läckage, med dextrans >10 kD som endast flyr till interstitiumet vid förolämpning mot organet, till exempel vid exponering för exosomer30 eller virus31. Det finns också en mängd olika kontrastmedel för att mäta andra parametrar i lungan (t.ex. kärnmarkörer, levande/döda indikatorer, oxidativa stressreportrar, blodflödeshastighetsspårare) utöver vaskulär permeabilitet. En utmärkt resurs som katalogiserar dem finns i protokollet av Ueki et al.22.
WHRIL är en teknik som är mycket väl lämpad för att undersöka dynamiken i blodflödet i lungan. Detta kan åstadkommas på flera sätt. För det första, när de avbildas med relativt långsamma bildhastigheter (~ 1-10 bilder per sekund, fps) blodflödeshastigheter kan bestämmas av skuggorna som omärkta erytrocyter gör när de flyter i större kärl. Vid låga fps bildar dessa skuggor linjer vars vinkel i förhållande till kärlet kan användas för att beräkna erytrocytflödet32 (figur 2, gula linjer). För det andra kan skuggor också spåras på låg fpsmikroskop genom att justera kärlen med mikroskopets snabba skanningsaxel och förvärva kymografier med snabb linjeskanning33,34,35. Slutligen, när avbildning vid höga bildhastigheter (>10 fps) på ett mikroskop som kan integrera signalen över tid (t.ex. en snurrande diskkonfokal utrustad med en laddningskopplad enhet (CCD) detektor), kan enskilda partiklar spåras direkt16,17. I det här fallet visas stationära objekt som ljusa prickar, och flödande föremål spårar spår genom med cirkulationen. Cellhastigheter kan kvantifieras genom att mäta spårens längd och dividera med bildförvärvstiden. Ett exempel på detta ges i figur 3 och kompletterande film 1, där 2 μm fluorescerande mikrosfärer har injicerats intravaskulärt i musen före avbildning.
Med möjligheten att upprepade gånger och konsekvent återgå till samma synfält är visualisering av processer som utvecklas under flera dagar nu möjlig. Som en demonstration av denna applikation användes WHRIL för att visualisera den metastaserande progressionen av bröstcancerceller i lungorna17,21: det vill säga att spåra med tiden ödet för enskilda tumörceller som anländer till lungvaskulaturen. Detta begrepp skildras i figur 4A, där en enda spridd tumörcell visualiseras kort efter logi i ett segment av lungmikro-vaskulatur. Att återvända till samma plats på efterföljande dagar avslöjar tumörcellens öde (t.ex. återcirkulation, extravasation, etc.). Tillämpas på undersökningen av de kulminerande stegen av metastaserad progression i lungan, var det möjligt att visuellt krönika dynamiska processer, inklusive tumörcell ankomst (figur 4B), extravasation (figur 4C), och spridning för att bilda makrometastaser (figur 4D).
Figur 1: Sammanfattning av kirurgi för implantation av fönstret för högupplöst avbildning av lungan (WHRIL). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Mikrokartografi möjliggör omlokalisering av fasta positioner i det optiska fönstret. Multiphoton intravital imaging av en enda region av lungan under det optiskt transparenta täcket visar mikrovaskulatur flyttas under 3 på varandra följande dagar med hjälp av mikrokartografi. Gula pilar indikerar en tydligt definierbar grenpunkt från ett enda fartyg som identifieras varje dag i följd. Gula linjer markerar skuggor som omärkta erytrocyter gör när de flyter i större kärl. Vinkeln på dessa linjer i förhållande till kärlet kan användas för att beräkna erytrocytflödeshastigheter. Röd = tdTomato märkta endotelceller och 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran märkt blodserum, Grön = GFP märkta tumörceller, Blå = andra harmoniska generationen. Skalstreck = 15 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Visualisering av blodflödet. Blodflödet kan visualiseras genom att injicera fluorescerande mikrosfärer med 2 μm diameter retro-orbitally och avbilda deras passage genom blodkärlen. När de avbildas på ett mikroskop som kan integrera signalen över tid (t.ex. en snurrande diskkonfokal utrustad med en CCD-detektor), visas stationära mikrosfärer som ljusa prickar (pilar) och flödande sfärer spårar spår genom med cirkulationen (gafflade linjer). Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. WHRIL kan fånga varje steg i den metastaserande kaskaden i lungan genom att direkt visualisera ödet för spridade tumörceller. (A) Att spåra ödet för spridda tumörceller (gröna) kan uppnås med seriell avbildning, under flera dagar, genom WHRIL. På dag 1 observeras en tumör cell ha anlänt till och fastnat i lung vaskulaturen. På dag 2 och dag 3 är cellen inte längre närvarande i lungvaskulaturen, efter att antingen ha återcirkulerat eller dött. Skalstång = 15 μm. (B-D) Visualisering av vart och ett av stadierna av tumörcellmetastasering i lungan. (B) En intravaskulära spridas tumör cell (grön) som fastnat i lungvaskulaturen efter ankomsten. (C) Spridas tumör cell (grön) efter extravasating i lung parenkym. (D) Tumörceller som har förökat sig och odlats till mikrometastaser. Röd = tdTomato märkta endotelceller och 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran märkt blodserum, Grön = GFP märkta tumörceller, Blå = andra harmoniska generationen. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1: Video som motsvarar figur 3 som visar lungvaskulaturen med cirkulerande 2 μm mikrosfärer. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande bild 1: Mekaniska konstruktionsritningar för stainless-steel skärverktyg som används för att styra 5 mm biopsi stans. Klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 2: Mekaniska konstruktionsritningar för fönsterramen i rostfritt stål. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Mekaniska konstruktionsritningar för fönsterhållarens verktyg. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På platser av avlägsna metastasering såsom lungan, högupplösta optisk imaging ger insikt i den utarbetade dynamiken i tumör cell metastasering. Genom att möjliggöra in vivo-visualisering av enstaka cancerceller och deras interaktioner med värdvävnaden har högupplöst intravital avbildning visat sig vara avgörande för att förstå mekanismerna bakom metastasering.
Beskrivs här är ett förbättrat kirurgiskt protokoll för permanent bröst implantation av ett optiskt fönster utformad för att möjliggöra seriell avbildning av murin lunga via högupplöst multiphoton mikroskopi. Fönstret som skapas med hjälp av detta protokoll tolereras väl och, med tanke på dess förmåga att framgångsrikt återförsluta brösthålan, kan upprätthålla de intrathoracic tryckgradienter som är nödvändiga för spontan ventilation (i motsats till något annat tidigare beskrivet fönster för avbildning av murinlungan 14,15,16,36,37 ). Detta tillåter musen att vakna från anestesi, andas självständigt och bekvämt överleva med den transparenta ribcage under en längre tid som sträcker sig över flera veckor.
Med hjälp av detta fönster var det möjligt att visualisera, med encellsupplösning, alla steg av metastasering, inklusive ankomst, extravasation och tillväxt i mikrometastaser.
Även om protokollet kräver viss teknisk skicklighet, med övning och noggrann uppmärksamhet på flera viktiga steg, kan proceduren utföras med en hög framgångsgrad. För det första, när du tar bort hår före operationen, är det viktigt att skydda musens hud genom att ta bort den depilatoriska krämen med en fuktad vävnad efter högst 20 s kontakt. Under operationen bör extrem försiktighet iakttas för att undvika att skära kärl. Överdriven blödning, oftast påträffas på grund av uppdelningen av antingen brachial eller inre bröst artärer under avlägsnandet av bröst fett pad, kan skymma visualisering i det kirurgiska fältet eller leda till döden genom exsanguination. Nyligen beskrivet i detta protokoll är användningen av en biopsi stans och skärverktyg(Kompletterande figur 1), som avsevärt påskyndar och förenklar skapandet av den cirkulära defekten genom revbenskorgen, och ett fönsterhållare verktyg som gör implantationen enklare. Genomförandet av dessa framsteg förbättrar avsevärt framgången för förfarandet och minskar den erforderliga nivån av tidigare kirurgisk skicklighet. Enskilda laboratorier kan använda ritningarna i tilläggsfigurerna för att tillverka dessa verktyg med antingen interna eller kommersiella maskinverkstäder. En internetsökning efter "budgivningswebbplatser för maskinverkstad" kommer att ge flera onlineapplikationer som hjälper till att hitta lokala kommersiella maskinverkstäder.
Slutligen är det viktigt att se till att lungvävnaden förblir torr före lim applicering. Den vanligaste fallgropen som resulterar i misslyckad täckslipsfäste är underlåtenhet att säkerställa fullständig borttagning av fukt från lungytan före apposition med ramen eller täckglaset. För att säkerställa kvalitetsbilder bör dessutom ett extremt tunt lager lim (<10 μm) appliceras. Överflödigt lim bör skrapas bort före placeringen av täckglaset.
Den största begränsningen av IVI genom WHRIL är det relativt begränsade penetrationsdjupet som kan uppnås. Därför är patologi som förekommer djupt inne i lungan otillgänglig. Trots denna begränsning kan tekniken fortfarande ge ett överflöd av kliniskt relevant information, särskilt i onkologiska undersökningar, med tanke på den beskrivna proclivity för perifert lokaliserade lungmetastaser38,39,40,41. I slutändan ger denna avbildningsmetod en betydande fördel jämfört med standard ex vivo-analyser och andra metoder för in vivo-avbildning, som antingen kopplar bort vävnad från vitala fysiologiska processer10,11,12,13eller begränsar longitudinell analys till en maximal varaktighet på 12 h14,15,16,37,42, respektive.
För upprepad avbildning under denna tidsperiod måste flera utmaningar fortfarande övervinnas. För det första är det viktigt att upprätthålla hudens hälsa runt det implanterade fönstret, för även om den skadade vävnaden inte exponeras kan huden runt fortfarande bli inflammerad eller infekterad. Rutinmässig applicering av en antibiotisk salva hjälper till att förhindra detta. För det andra, med tiden, kan exsuda från den skurna huden kongas under fönsterramen och förhindra placeringen av fixturingplattan som används för att immobilisera musen i mikroskopstadiet. Att placera en våt vävnad över WHRIL i 10-15 min kommer att mjuka upp detta utstrålande och möjliggöra placering av fönsterramen. För det tredje är en av kroppens mekanismer för att utsöndra överskott av vatten och upprätthålla homeostas via utandning av ånga. Således kommer för mycket vätskeintag (främst som ett resultat av injektion av kontrastmedel eller tumörcellsupphängningar) att orsaka att lungytan utsöndrar detta överskott av vatten och kommer att resultera i att lungvävnaden lossnar från WHRIL. Detta kan undvikas genom att begränsa injektionsvolymen till högst 50 μL åt gången. Slutligen, även med den bästa vården, kan lungvävnad ibland lossna från WHRIL på grund av att musen intar en stor mängd vatten eller på grund av att musen överskrider sig själv. När detta inträffar sker detachement av lungvävnaden från WHRIL vanligtvis långsamt, med början vid ytterkanten. Således kan det vara omöjligt att följa vissa synfält som ligger på den första dagen av avbildning under hela fönstrets varaktighet. Det konstaterades att de bästa bildframställningsresultaten kommer att erhållas inom de första dagarna och att användning av mosaiktekniker som den tidigare publicerade Large-Volume High-Resolution Intravital Imaging21 kan minimera effekten av denna begränsning.
Med tanke på att WHRIL är integrerad i musens bröstvägg är drift under avbildning i allmänhet inte en viktig fråga, så länge man är försiktig för att säkerställa att fästet mellan fönstret och mikroskopet är fast. Fortfarande kan en liten mängd drift observeras under tiden omedelbart efter placeringen av musen i mikroskopstadiet. Detta kan komma från avslappning av musens kropp eller från den termiska expansionen av mikroskopkomponenterna (scenplatta, XY-steg, objektivlins) på grund av miljökammaren. Denna drift kan undvikas genom att tilldela ~ 30 min för jämvikt innan avbildningsproceduren påbörjas. Denna tidsperiod gör det möjligt för musens fysiologi att stabiliseras under anestesin och gör det möjligt för alla komponenter att komma till termisk jämvikt. Varje liten mängd restdrift kan enkelt hanteras av beräkningsalgoritmer som StackReg43 eller HyperStackReg44.
Slutligen är detta protokoll en förbättring jämfört med den tidigare skrivna versionen av två skäl. För det första möjliggör det visuella formatet en bättre konceptualisering av det kirurgiska protokollet. Detta är särskilt användbart för de avgörande stegen där 1) lungan torkas genom att applicera en stadig mild ström av tryckluft (steg 3.24, figur 1J), 2) täckslipet är fäst vid fönsterramens centrala borrhål på ett sätt som förhindrar insnärjning av bubblor (steg 3.31) och 3) en liten mängd flytande cyanoacrylat tillsätts vid metallglasgränssnittet för att säkerställa en lufttät tätning mellan täckglaset och 3) en liten mängd flytande cyanoacrylat tillsätts vid metallglasgränssnittet för att säkerställa en lufttät tätning mellan täckglaset ( steg 3.31) och 3) en liten mängd flytande cyanoacrylat tillsätts vid metallglasgränssnittet för att säkerställa en lufttät tätning mellan täckglaset och 3) en liten mängd flytande cyanoakrylat tillsätts vid metallglasgränssnittet för att säkerställa en lufttät tätning mellan täckglaset (steg 3.31) och 3) en liten mängd flytande cyanoakrylat tillsätts vid metallglasgränssnittet för att säkerställa en lufttät tätning mellan täckglaset och 3) en liten mängd flytande cyanoakrylat tillsätts vid metallglasgränssnittet för att säkerställa en lufttät tätning mellan täckglaset och fönstret (steg 3.31) en liten mängd flytande cyanoacrylat tillsätts vid metallglasgränssnittet för att säkerställa en lufttät tätning mellan täckglaset och 3) en liten mängd flytande cyanoakrylat tillsätts vid metallglasgränssnittet för att säkerställa en lufttät tätning mellan täckglaset 3.34, figur 1O).
Sammanfattningsvis, med tillkomsten av WHRIL, med tanke på dess mottaglighet för subcellulär visualisering av samma lungvävnad under en längre period, är utredarna nyligen bemyndigade att ta itu med många obesvarade frågor. Specifikt möjliggör protokollet som beskrivs häri grundläggande utforskning av de dynamiska processer som ligger till grund för många patologier, inklusive progressionen av cancermetastasering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna avslöjar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av följande bidrag: CA216248, CA013330, Montefiores Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561, METAvivor Early Career Award, Gruss-Lipper Biophotonics Center och dess Integrated Imaging Program och Jane A. och Myles P. Dempsey. Vi vill tacka Analytical Imaging Facility (AIF) vid Einstein College of Medicine för bildstöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D.
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E.
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D.
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P.
