Summary
Burada, akciğerin yüksek çözünürlüklü, intravital görüntülemesini sağlayan murine toraks için kalıcı olarak indwelling optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz. Pencerenin kalıcılığı, akciğerdeki dinamik hücresel süreçlerin, özellikle de yayılan tümör hücrelerinin metastatik ilerlemesi gibi yavaş gelişen süreçlerin incelenmesine çok uygun hale getirir.
Abstract
Kansere bağlı mortalitenin ~%90'ını oluşturan metastaz, kanser hücrelerinin primer tümörlerden kemik, beyin ve akciğer gibi ikincil bölgelere sistemik yayılmasını içerir. Kapsamlı bir şekilde çalışılsa da, bu sürecin mekanistik ayrıntıları yenememiştir. Bilgisayarlı tomografi (BT), pozitron emisyon tomografisi (PET) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) dahil olmak üzere yaygın görüntüleme yöntemleri farklı derecelerde brüt görselleştirme sunarken, her biri bireysel tümör hücrelerinin dinamiklerini tespit etmek için gerekli zamansal ve mekansal çözünürlükte değildir. Bunu gidermek için, yaygın metastatik bölgelerin intravital görüntülemesi için çok sayıda teknik tanımlanmıştır. Bu sitelerden akciğer, inceliği ve yaşamı sürdürmedeki kritik rolü nedeniyle intravital görüntülemeye erişimin özellikle zor olduğunu kanıtlamıştır. Sağlam akciğerin tek hücreli intravital görüntülemesi için daha önce çeşitli yaklaşımlar tanımlanmış olsa da, hepsi son derece invaziv ve terminal prosedürler içerir ve mümkün olan maksimum görüntüleme süresini 6-12 saat ile sınırlar. Burada açıklanan, Akciğerin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi için minimal invaziv torasik optik Pencerenin (WHRIL) kalıcı implantasyonu için geliştirilmiş bir tekniktir. Mikrokartografiye uyarlanmış bir yaklaşımla birlikte, yenilikçi optik pencere, çoklu görüntüleme seanslarında tek hücreli çözünürlükte ve birden fazla haftaya yayılan sağlam akciğerin seri intravital görüntülemesini kolaylaştırır. Görüntüleme verilerinin toplanabileceği eşi görülmemiş süre göz önüne alındığında, WHRIL metastatik ilerlemenin altında kalan dinamik mekanizmaların ve akciğer içindeki çok sayıda ek biyolojik işlemin hızlandırılmış keşfini kolaylaştırabilir.
Introduction
Ölümlerin ~%90'ından sorumlu olan metastaz, kansere bağlı mortalitenin başlıca nedenidir1. Klinik olarak gözlenen metastazın (kemik, karaciğer, akciğer, beyin) başlıca bölgeleri arasında2, akciğerin intravital mikroskopi ile in vivo görüntüleme için özellikle zor olduğu kanıtlanmıştır. Bunun nedeni, akciğerin sürekli hareket halinde hassas bir organ olmasıdır. Akciğerlerin intratorasik kardiyak hareketle daha da birleşen sürekli hareketi, doğru görüntüleme için önemli bir bariyeri temsil eder. Bu nedenle, yüksek çözünürlüklü intravital optik görüntüleme için yöntemlere görece erişilemeyenliği nedeniyle, akciğer içindeki kanser büyümesi genellikle bir okült süreç olarak kabul edilmiştir3.
Klinik ortamda, bilgisayarlı tomografi (BT), pozitron emisyon tomografisi (PET) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi görüntüleme teknolojileri akciğer4gibi sağlam hayati organların derinliklerinde görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler brüt organın mükemmel görüşlerini sağlarken (genellikle klinik semptomların başlangıcından önce patolojiyi ortaya çıkarır), metastazın erken aşamalarında ilerledikçe bireysel yayılan tümör hücrelerini tespit etmek için yetersiz çözünürlüktedirler. Sonuç olarak, yukarıda belirtilen yöntemler akciğere herhangi bir metastaz belirtisi sağladığında, metastatik odaklar zaten iyi kurulmuş ve çoğalmaktadır. Tümör mikroçevrasyonu kanser ilerlemesi ve metastaz oluşumunda önemli bir rol oynadığından5,6, metastatik tohumlamanın en erken adımlarını araştırmaya büyük ilgi vardır. Bu ilgi, kanser hücrelerinin primer tümör tespit etmeden önce bile yaydığı artan takdirve makro metastaz9'abüyümeden önce yıllarca tek hücreli ve uykuda bir durumda hayatta kaldıklarına dair artan kanıtlarla daha da besleniyor.
Daha önce, akciğerin tek hücreli çözünürlükte görüntülenmesi mutlaka ex vivo veya explant preparatlarını içeriyordu10,11,12,13, analizleri tek zaman noktalarıyla sınırlandırmak. Bu preparatlar yararlı bilgiler sağlarken, sağlam bir dolaşım sistemine bağlı organ içindeki tümör hücrelerinin dinamikleri hakkında herhangi bir fikir sağlamaz.
Görüntülemedeki son teknolojik gelişmeler, 12 saat14,15,16'ya kadar olan dönemlerde sağlam akciğerin tek hücreli çözünürlükte intravital görselleştirilmesini sağlamıştır. Bu, mekanik havalandırma, göğüs kafesinin rezeksiyonu ve vakum destekli akciğer hareketsizleştirmeyi içeren bir protokol kullanılarak bir murine modelinde gerçekleştirildi. Bununla birlikte, fizyolojik olarak bozulmamış akciğerin ilk tek hücre çözünürlüklü görüntülerini sunmasına rağmen, teknik son derece invaziv ve terminaldir, böylece indeks prosedürünün ötesinde daha fazla görüntüleme seansı önler. Bu nedenle, bu sınırlama, uyku hali ve büyümenin yeniden başlatılması gibi 12 saatten uzun süren metastatik adımların incelenmesine uygulanmasını engeller14,15,16. Ayrıca, vakum kaynaklı basınç farklarının kan akışında sapmalara neden olabileceği göz önüne alındığında, bu görüntüleme yaklaşımı kullanılarak gözlenen hücresel davranış kalıpları dikkatlice yorumlanmalıdır.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, mekanik ventilasyona gerek kalmadan, uzun bir süre boyunca haftalarca seri görüntülemeyi kolaylaştıran, Akciğerin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülemesi (WHRIL) için minimal invaziv bir Pencere geliştirilmiştir17. Teknik, normal akciğer fonksiyonunun korunması için kapalı bir torasik boşluğa sahip bir 'şeffaf göğüs kafesi' oluşturulmasını gerektirir. Prosedür iyi tolere edilir, farenin temel etkinlik ve işlevde anlamlı bir değişiklik yapmadan iyileşmesine izin verilir. İlgili her görüntüleme seansında tam olarak aynı akciğer bölgesini güvenilir bir şekilde lokalize etmek için, bu pencereye mikrokartografi olarak bilinen bir teknik uygulanmıştır18. Bu pencereden, akciğerin damar yatağına ulaşan, endotelleri geçen, hücre bölünmesi geçiren ve mikro metastazlara dönüşen hücrelerin görüntülerini yakalamak mümkündü.
Burada, çalışma WHRIL implantasyonu için geliştirilmiş bir cerrahi protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunar, bu da ameliyatı basitleştirirken aynı zamanda tekrarlanabilirliğini ve kalitesini artırır. Bu protokol metastazın altında kalan dinamik süreçlerin araştırılmasını sağlamak için tasarlanmış olsa da, teknik alternatif olarak akciğer biyolojisi ve patolojisinin çok sayıdaki süreçlerinin araştırılmasına uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, Albert Einstein Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından önceden onaylandığı da dahil olmak üzere omurgalı hayvanların kullanımına ilişkin yönergelere ve düzenlemelere uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.
1. Pencerelerin pasivasyonu
- Optik pencere çerçevelerini(Ek Şekil 2)%1 (w/v) enzimatik olarak aktif deterjan çözeltisi ile durulayın.
- Bir cam kavanozun içinde, optik pencere çerçevelerini 70 °C'de 30 dakika boyunca% 5 (w/ v) sodyum hidroksit çözeltisi içine batırın.
- Pencere çerçevelerini deiyonize suyla çıkarın ve yıkayın.
- Yeni bir cam kavanozun içinde, optik pencere çerçevelerini 55 °C'de 10 dakika boyunca% 7 (w/ v) sitrik asit çözeltisi içine batırın.
- Yine pencere çerçevelerini deiyonize su ile çıkarın ve yıkayın.
- 1.2. adımı yineleyin; ardından, pencere çerçevelerini deiyonize suyla çıkarın ve yıkayın.
2. Ameliyata hazırlık
- Ameliyatı bir başlıkta veya laminer akış kabininde gerçekleştirin. Ameliyat alanının kirlenmesini önlemek için, sırasıyla hazırlık, ameliyat ve iyileşme için ayrı, ayrılmış alanlar sağlayın.
- Ameliyattan önce, tüm cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin. Sonraki prosedürler planlanıyorsa, sıcak boncuk sterilizatörü kullanarak aletleri yeniden sterilize edin. Bu cerrahi işlem için sadece uçlara yönelik bir teknik kullanılır.
- Isıtılmış cerrahi boncuk ve boncuk sterilizatör üzerinde güç.
- Anestezi odasında% 5 izofluran ile fareyi uyuşturun.
- Saçı çıkarmak için, sol üst göğüs kesi bölgesine cömertçe tüy döken krem uygulayın. 20 s'den uzun bir süre sonra, nemlendirilmiş kağıt mendil kullanarak saçları ve epilasyon kremini sıkıca silin. Tüm saçları cerrahi bölgeden çıkarmak için gerektiği gibi tekrarlayın.
- 2-0 ipek dikiş kullanarak, 22 G kateterin tabanına bir düğüm bağlayın ve 2 inç uzunluğunda kuyruklar bırakın (bkz. Şekil 1A).
3. Akciğer penceresi ameliyatı
- Antiseptik sabun kullanarak ellerinizi yıkayın.
- Her yeni ameliyattan önce, yeni steril eldivenler tak.
- Korneanın kurumasını ve farenin gözlerine zarar görmesini önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
- 90 μL steril PBS'de 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfin seyreltin ve ardından ameliyat öncesi analjezi sağlamak için deri altı enjekte edin.
- Fareyi ipek dikişle bağlanmış 22 G kateter15ile entübe edin. Bir şişirme ampulü kullanarak, ampul sıkma üzerine bilateral göğüs yükselmesine dikkat ederek başarılı entübasyonu onaylayın.
- 2-0 ipek dikişi farenin snout'unun etrafına bağlayarak entübasyon kateterini sabitleyin (bkz. Şekil 1B).
- Fareyi ısıtılmış cerrahi standa yerleştirin ve sol toraksı ortaya çıkarmak için sağ yanal decubitus'a yerleştirin.
- Ventilatörü entübasyon kateterine bağlayın.
- Ventilatörde kontrollü, kararlı havalandırma sağlayın ve ardından izofluoranı% 3'e düşürün. İşlemin başlangıcında ve işlem süresi boyunca periyodik olarak, ayak parmağı çimdikleme testi yaparak anestezinin yeterliliğini değerlendirin.
- Kağıt bant kullanarak, sırasıyla ön ve arka uzuvları ısıtmalı cerrahi aşamaya kadar kranially ve kaudally sabitleyin. Cerrahi alana maruz kalmayı en üst düzeye çıkarmak için farenin sırtı boyunca başka bir bant parçası yerleştirin (bkz. Şekil 1C).
- Sterilitenin korunması için kaputun altındaki tüm cerrahi aletleri açın.
- Farenin cildine cömert bir antiseptik uygulaması ile cerrahi bölgeyi sterilize edin.
- Forseps kullanarak cildi kaldırın ve sternumun solunda ~7 mm ve altkostal kenardan ~7 mm daha üstün bir ~10 mm dairesel kesi yapın (Şekil 1D).
- Büyük gemileri dikkatlice tanımlayın. Damarların bölünmesi gerekliyse, hemostazı korumak için elektrokoter kalemi ile her iki ucunda da dağlayın.
- Kaburgaların üzerine gelen yumuşak dokuyu aşın.
- 6veya 7. kaburgayı ethps kullanarak yükseltin. Künt mikro diseksiyon makasının tek bir bıçağını kullanarak, akciğere doğru yuvarlanmış taraf, intratorasik boşluğa girmek için6 ve7. kaburgalar arasındaki interkostal kası dikkatlice delin (Şekil 1E).
- Akciğeri çökertmek ve göğüs duvarından ayırmak için kusurdaki basınçlı hava bidonlarını hassas bir şekilde boşaltın. İyatrojenik akciğer yaralanmasını önlemek için basınçlı havayı kısa aralıklarla ateşleyin.
- Biyopsi delme teli kesici aletin üzerine yerleştirin (Ek Şekil 1) ve kesici aletin tabanını interkostal kesiden dikkatlice manevra edin (Şekil 1F).
- Kesici aletin tabanını göğüs duvarına paralel olacak şekilde yönlendirin. Göğüs kafesi boyunca 5 mm dairesel bir delik açın (Şekil 1G).
NOT: Maruz kalan akciğer dokusunun hasar belirtisi olmadan pembe olduğundan emin olun. - 5-0 ipek dikişi kullanarak, delikten ~ 1 mm, çevresel olarak kaburgalarla kesişen bir çanta-dize dikişi oluşturun (Şekil 1H).
- Pencere çerçevesini dairesel kusurun kenarları pencerenin oluğuna hiza olacak şekilde konumlandırın (bkz. Şekil 1I).
- 5-0 ipek dikişi sıkıca bağlayarak implante edilmiş pencereyi güvenli bir şekilde kilitleyin.
- 100 μL siyanoakrilat jel yapıştırıcısını 1 mL şırınna yükleyin.
- ~10-20 sn (Şekil 1J) için sabit bir yumuşak basınçlı hava akışı uygulayarakakciğeri kurutun.
- Pencere çerçevesini dış kenarından kavramak için ön ayaklar kullanarak, akciğerin pencere çerçevesinin yüzey altı yüzeyinden ayrılmasını sağlamak için hafifçe kaldırın.
- Optik pencere çerçevesinin yüzey altı boyunca ince bir siyanoakrilat yapıştırıcı tabakası dağıtın (Şekil 1K).
- Akciğeri şişirmek için ventilatördeki pozitif uç ekspiratuar basıncı (PEEP) artırın.
- 10-20 sn boyunca tutarak, optik pencere çerçevesini akciğer dokusuna takmak için yumuşak ama sert basınç uygulayın (Şekil 1L).
- Kalan siyanoakrilat jel yapıştırıcısının 5 mm'lik bir damlasını dikdörtgen bir kapakçığa dağıtın.
- Vakumlu pikaplar kullanarak 5 mm kapak kapağını alın. Kapak alt kısmını yapıştırıcıya batırın ve daha sonra dikdörtgen kapak ucunun yanına üç kez fazla yapıştırıcı kazıyın, böylece sadece çok ince bir tabaka kalır (Şekil 1M).
- Kapak kapağını optik pencere çerçevesinin ortasındaki girintinin içine sığacak şekilde dikkatlice yerleştirin ve akciğer dokusunun üzerinde bir açıyla tutulur. Pozitif basınç oluşturmak için ventilatörü kısaca kenetleyin, akciğeri aşırı şişirin. Dönen bir hareket kullanarak, akciğer yüzeyi ile örtünün yüzeyi arasında doğrudan bir appozisyon oluşturmak için kapak kapağını akciğer dokusuna paralel olarak yönlendirin. Siyanoakrilat yapıştırıcının (~25 s) ayarını yaparak hafif basıncı koruyun.
- Kapak kapağını vakumlu pikaplardan ayırmak için tokmakları kullanın (Şekil 1N).
- 5-0 ipek dikiş kullanarak, yine bir çanta-dize dikiş oluşturun, bu kez cilt kesisinin kesme kenarından çevresel olarak <1 mm. Kilit düğümleri ile sıkıca bağlamadan önce pencere çerçevesinin dış kenarının altına fazla deri sokun.
- Kapak ve pencere çerçevesi arasında hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için, metal cam arayüzünde az miktarda sıvı siyanoakrilat dağıtın (bkz. Şekil 1O).
- 1 mL insülin şırıngasına steril bir iğne takın. İğneyi xiphoid işleminin altına yerleştirin, sol omuza doğru ilerleyin, diyaframdan torasik boşluğa girin. Torasik boşluktan kalan havayı çıkarmak için şırınnayı hafifçe geri çekin (bkz. Şekil 1P).
- Bandı fareden çıkarın.
- Isoflurane'yi kapatın.
- Fare uyanmaya hazır görünene kadar havalandırmaya% 100 oksijenle devam edin.
- Farenin snout etrafındaki 2-0 ipek dikişi dikkatlice kesin ve fareyi suşun.
- Fareyi temiz bir kafese aktarın ve tamamen iyileşene kadar izleyin. Nefes almada zorluk belirtileri varsa fareyi ötenazi edin.
- 90 μL steril fosfat tamponlu çözeltide (PBS) seyreltilmiş 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfin deri altından enjekte ederek postoperatif analjezi sağlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde açıklanan cerrahi prosedürün adımları Şekil 1'deözetlenmiş ve gösterilmiştir. Kısaca, ameliyattan önce fareler uyuşturulur ve sol toraksın üzerindeki saçlar çıkarılır. Fareler, torasik boşluğun ihlali üzerine hayatta kalmayı sağlamak için entübe edilir ve mekanik olarak havalandırılır. Kaburgaları aşırı saran yumuşak doku eksilir ve6 ve7. kaburgaları kapsayan küçük bir dairesel kusur oluşturulur. Optik pencere çerçevesi kusura yerleştirilir ve alt tarafı (açık diyaframın dışında) akciğer dokusuna yapışır. Pencere çerçevesi daha sonra dikiş ve yapıştırıcı kombinasyonu ile sabitlenerek torasik boşluğun yeniden mühürlenmesi ve ekstübasyondan sonra normal solunumun yeniden başlamasına izin verilir. Başarılı bir şekilde yerleştirildiğinde, akciğer optik pencereye (göğüs duvarının bir parçası olarak dahil edilen) yapışır ve intratorasik basınç gradyanları korunur. Bu, farenin rahat bir şekilde hayatta kalmasına izin vererek protokol ödeneğine (2 hafta) kadar günlük görüntüleme sağlar. İntravital görüntüleme daha önce diğer pencereler15 , 19,20için açıklandığı gibi pencereden gerçekleştirilebilir.
Çeşitli hücre tiplerinin, biyolojik yapıların veya hücresel fonksiyonel durumların görselleştirilmesi için, burada sunulan prosedür, floresan proteinleri21 ifade etmek için genetik olarak manipüle edilmiş veya boyalarla enjekte edilmiş çok çeşitli fareler üzerinde gerçekleştirilebilir22. Pencerenin kalıcı doğası, fotokonversiyon23 , 24veya mikrokartografi17,18gibi görüş alanlarının yeniden haline getirilmesi için tekniklerle uyumlu hale getirir. Mikrokartografi, ilgi çekici bir bölgeyi tahmin etmek ve yeniden yerelleştirmek için görüntüleme seansları arasındaki sabit fidüsiyal izlerin koordinatlarının hesaplanan dönüşümlerini kullanmaya dayanan bir nirengi tekniğidir. Yukarıda açıklandığı gibi oluşturulan pencerede, bu fidücial izler, mikroskop altında kolayca tanımlanabilen pencere çerçevesine kazınmış ışık çizikleridir (Ek Şekil 2). Bu, işaretlenmemiş dokuda bile aynı görüş alanını birden çok kez bulmayı mümkün kılar. Şekil 2, akciğer vaskülatının boya etiketli yüksek moleküler ağırlıklı dektran (tetrametrilrhodamin 155 kD dektran) ve aynı mikro-vaskülatürün 3 gün içinde yeniden lokalize edildiği bir farede bu tekniklerin sonucunu göstermektedir.
Bu dektranın tümör hücre intravazasyonu dönemlerinde indüklenen geçici vasküler açıklıkların değerlendirilmesinde son derece yararlı olduğu bulunmuştur25,26,27. Gerçekten de, primer meme tümörlerinde, bu yüksek moleküler ağırlık dektranın vaskülasyona etkili bir şekilde inzal ettiği ve intersityum25'esızmadığı gösterilmiştir. Bu, pasif olarak28,29neoanjiyojenik damarlardan sızdığı gösterilen daha düşük moleküler ağırlıktaki (10 kD veya 70 kD gibi) dekstransın aksinedir. Bu arada, sağlıklı akciğer vaskülatın sızıntıya karşı daha dirençli olduğu gözlenmiştir, dekstrans >10 kD sadece organa hakaret üzerine intersityuma kaçar, örneğin ekzozomlara maruz kalmada30 veya virüsler31. Vasküler geçirgenliğe ek olarak akciğerdeki diğer parametreleri (örneğin, nükleer belirteçler, canlı / ölü göstergeler, oksidatif stres muhabirleri, kan akışı hızı izleyicileri) ölçmek için çeşitli kontrast ajanları da mevcuttur. Bunları kataloglayan mükemmel bir kaynak Ueki ve ark.22tarafından protokolde bulunabilir.
WHRIL, akciğerdeki kan akışının dinamiklerini araştırmak için çok uygun bir tekniktir. Bu birkaç şekilde gerçekleştirilebilir. İlk olarak, nispeten yavaş kare hızları (saniyede ~ 1-10 kare) kullanılarak görüntülendiğinde, fps) kan akışı hızları, etiketlenmemiş eritrositlerin daha büyük damarlarda akarken yaptığı gölgeler tarafından belirlenebilir. Düşük fps'de, bu gölgeler, gemiye göre açısı eritrosit akış hızlarını hesaplamak için kullanılabilecek çizgiler oluşturur32 (Şekil 2, sarı çizgiler). İkincisi, gölgeler, damarları mikroskobun hızlı tarama ekseni ile hizalayarak ve hızlı hat taraması33 , 34,35kullanarak kymografiler eldeederekdüşük fps mikroskoplarda da izlenebilir. Son olarak, sinyali zaman içinde entegre edebilen bir mikroskopta yüksek kare hızlarında (>10 fps) görüntüleme yaparken (örneğin, şarj bağlantılı bir cihaz (CCD) dedektörü ile donatılmış bir dönen disk konfokal), tek tek parçacıklar doğrudan16,17. Bu durumda, sabit nesneler parlak noktalar olarak görünür ve akan nesneler sirkülasyonla izleri izler. Hücre hızları, paletlerin uzunluğu ölçülerek ve kare alma süresine bölünerek ölçülebilir. Bunun bir örneği Şekil 3 ve Ek Film 1'de verilmiştir, burada 2 μm floresan mikroküreler görüntülemeden önce fareye intravasküler olarak enjekte edilmiştir.
Tekrar tekrar ve tutarlı bir şekilde aynı görüş alanına dönme yeteneğiyle, birden fazla gün içinde gelişen süreçlerin görselleştirilmesi artık mümkündür. Bu uygulamanın bir göstergesi olarak WHRIL, akciğerlerdeki meme kanseri hücrelerinin metastatik ilerlemesini görselleştirmek için kullanıldı17,21: yani zamanla akciğer vaskülatına ulaşan bireysel tümör hücrelerinin kaderini izlemek için. Bu kavram, akciğer mikro-vaskültürünü segmentinde kaldıktan kısa bir süre sonra tek bir yayılan tümör hücresinin görselleştirildiği Şekil 4A'datasvir edilmiştir. Sonraki günlerde aynı yere geri dönmek tümör hücresinin kaderini ortaya koymaktadır (örneğin, devridaim, ekstravazasyon vb.). Akciğerde metastatik ilerlemenin doruğa ulaşan adımlarının araştırılmasına uygulanan, tümör hücresinin gelişi (Şekil 4B), ekstravazasyon ( Şekil4C) ve makro metastaz oluşturmak için çoğalma dahil olmak üzere dinamik süreçleri görsel olarak kronikleştirmek mümkündü (Şekil 4D).
Şekil 1: Akciğerin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi için Pencerenin (WHRIL) implantasyonu için cerrahinin özeti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikrokartografi, optik pencere içindeki sabit konumların yeniden konumlandırılmasını sağlar. Akciğerin tek bir bölgesinin optik olarak şeffaf kapak alt kısmı altında çok sesli intravital görüntülemesi, mikrokartografi kullanılarak art arda 3 gün boyunca mikrovaskülerin yer değiştirdiğini göstermektedir. Sarı oklar, her ardışık gün tanımlanan tek bir damardan açıkça tanımlanabilir bir dal noktasını gösterir. Sarı çizgiler, etiketsiz eritrositlerin daha büyük kaplarda akarken yaptığı gölgeleri vurgular. Bu çizgilerin gemiye göre açısı eritrosit akış hızlarını hesaplamak için kullanılabilir. Kırmızı = tdTomato etiketli endotel hücreleri ve 155 kDa Tetrametilrhodamin dektran etiketli kan serumu, Yeşil = GFP etiketli tümör hücreleri, Mavi = ikinci harmonik nesil. Ölçek çubuğu = 15 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kan akış hızının görselleştirilmesi. Kan akış hızları, 2 μm çapında floresan mikrokürenin retro yörüngeye enjekte edilmesi ve kan damarlarından geçişlerinin görüntülenmesi ile görselleştirilebilir. Sinyali zaman içinde entegre edebilen bir mikroskopta görüntülendiğinde (örneğin, CCD dedektörü ile donatılmış bir dönen disk konfokal), sabit mikrokürecikler parlak noktalar (oklar) olarak görünür ve akan küreler sirkülasyonla (köşeli çizgiler) izleri izler. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. WHRIL, yayılan tümör hücrelerinin kaderini doğrudan görselleştirerek akciğer içindeki metastatik basamaklamanın her adımını yakalayabilir. (A) Yayılan tümör hücrelerinin (yeşil) kaderini izlemek, whril aracılığıyla birkaç gün boyunca seri görüntüleme ile elde edilebilir. 1. günde, akciğer damarı içine bir tümör hücresinin geldiği ve saplandığı gözlenir. 2. ve 3. Ölçek çubuğu = 15 μm. (B-D) Akciğerdeki tümör hücre metastazının her aşamasının görselleştirilmesi. (B) İntravasküler yayılımlı tümör hücresi (yeşil) geldikten sonra akciğer damarı içine saplanmıştır. (C) Akciğer parenkimine ekstravazasyon yaptıktan sonra tümör hücresini (yeşil) yaygınlaştırmıştır. (D) Çoğalan ve mikro metastaz haline gelen tümör hücreleri. Kırmızı = tdTomato etiketli endotel hücreleri ve 155 kDa Tetrametilrhodamin dektran etiketli kan serumu, Yeşil = GFP etiketli tümör hücreleri, Mavi = ikinci harmonik nesil. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Film 1: Şekil 3'e karşılık gelen ve dolaşımdaki 2 μm mikroküre ile akciğer vaskülatını gösteren video. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 1: 5 mm biyopsi zımbasını yönlendirmek için kullanılanlekesiz çelik kesici takım için mekanik tasarım çizimleri.
Ek Şekil 2: Paslanmaz çelik pencere çerçevesi için mekanik tasarım çizimleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Pencere tutucu aracı için mekanik tasarım çizimleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Akciğer gibi uzak metastaz bölgelerinde, yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme tümör hücre metastazının ayrıntılı dinamikleri hakkında fikir sağlar. Tek kanser hücrelerinin in vivo görselleştirilmesini ve konak doku ile etkileşimlerini sağlayarak, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme metastazın altında kalan mekanizmaları anlamak için etkili olmuştur.
Burada, yüksek çözünürlüklü çoktoğraflı mikroskopi ile murine akciğerin seri görüntülenmesini sağlamak için tasarlanmış bir optik pencerenin kalıcı torasik implantasyonu için geliştirilmiş bir cerrahi protokol açıklanmıştır. Bu protokol kullanılarak oluşturulan pencere iyi tolere edilir ve torasik boşluğu başarıyla yeniden düzenleme yeteneği göz önüne alındığında, spontan havalandırma için gerekli intratorasik basınç gradyanlarını koruyabilir (murine akciğerin görüntülenmesi için daha önce açıklanan diğer pencerelerin aksine14,15,16,36,37 ). Bu, farenin anesteziden uyanmasını, bağımsız nefes almasını ve şeffaf göğüs kafesi ile birden fazla hafta boyunca uzun bir süre rahatça hayatta kalmasına izin sağlar.
Bu pencereyi kullanarak, tek hücreli çözünürlükle, mikrometazlara varış, ekstravazasyon ve büyüme de dahil olmak üzere metastaz adımlarının tümünü görselleştirmek mümkündü.
Protokol bazı teknik yeterlilik gerektirmesine rağmen, pratik ve birkaç önemli adıma dikkat ederek, prosedür yüksek bir başarı oranı ile gerçekleştirilebilir. İlk olarak, ameliyattan önce saçları çıkarırken, 20 s'den fazla temastan sonra nemlendirilmiş bir doku ile tüy döken kremi çıkararak farenin cildini korumak önemlidir. Ameliyat sırasında damarların kesilmemesi için çok dikkatli olunmalıdır. Meme yağ yastığının çıkarılması sırasında brakial veya iç meme arterlerinin bölünmesi nedeniyle en sık karşılaşılan aşırı kanama, cerrahi alandaki görselleştirmeyi gizleyebilir veya eksanguinasyon yoluyla ölüme yol açabilir. Bu protokolde yeni açıklanan, göğüs kafesi yoluyla dairesel kusurun oluşturulmasını önemli ölçüde hızlandıran ve basitleştiren bir biyopsi zımba ve kesici aletin (Ek Şekil 1) ve implantasyonu kolaylaştıran bir pencere tutucu aletinin kullanılmasıdır. Bu ilerlemelerin uygulanması, prosedürün başarı oranını önemli ölçüde artırır ve gerekli önceki cerrahi beceri seviyesini azaltır. Bireysel laboratuvarlar, bu aletleri şirket içi veya ticari makine atölyeleri ile üretmek için ek rakamlardaki çizimleri kullanabilir. "Makine atölyesi teklif siteleri" için bir internet araması, yerel ticari makine dükkanlarını bulmaya yardımcı olacak birkaç çevrimiçi uygulama sağlayacaktır.
Son olarak, yapışkan uygulamadan önce akciğer dokusunun kuru kalmasını sağlamak çok önemlidir. Başarısız kapak ataşmanı ile sonuçlanan en yaygın tuzak, çerçeve veya kapak camı ile apposition yapmadan önce akciğer yüzeyinden nemin tamamen çıkarılmasının sağlanamamasıdır. Ayrıca, kaliteli görüntüler sağlamak için son derece ince bir tutkal tabakası (<10 μm) uygulanmalıdır. Kapak camının yerleştirilmesinden önce fazla tutkal kazınmalıdır.
WHRIL aracılığıyla IVI'nin ana sınırlaması, elde edilebilir nispeten sınırlı penetrasyon derinliğidir. Bu nedenle akciğerin derinliklerinde meydana gelen patolojiye erişilemez. Bu sınırlamaya rağmen, teknik, periferik lokalize akciğer metastazları için açıklanan eğilimi göz önüne alındığında, özellikle onkolojik araştırmalarda klinik olarak ilgili çok sayıda bilgi verebilir38,39,40,41. Sonuç olarak, bu görüntüleme yaklaşımı, dokuyu hayati fizyolojik süreçlerden 10 , 11 , 12 , 13 veya uzunlamasına analizi maksimum 12 h14,15,16,37,42, ile sınırlayan in vivo görüntüleme için standart ex vivo testlere ve diğer yöntemlere göre önemli bir avantajsağlar. sırasıyla.
Bu süre zarfında tekrarlanan görüntüleme için, hala birkaç zorluğun üstesinden gelinmelidir. İlk olarak, implante edilen pencerenin etrafındaki cildin sağlığını korumak önemlidir, çünkü yaralı doku maruz kalmasa da, etrafındaki cilt hala iltihaplanabilir veya enfekte olabilir. Antibiyotik merhem rutin uygulaması bunu önlemeye yardımcı olacaktır. İkincisi, zamanla, kesilmiş deriden dışarı çıkmak pencere çerçevesinin altına konjeal olabilir ve fareyi mikroskop aşamasında hareketsiz hale getirmek için kullanılan sabitleme plakasının yerleştirilmesini engelleyebilir. WHRIL üzerine 10-15 dakika ıslak bir doku yerleştirmek bu eksüdayı yumuşatacak ve pencere çerçevesinin yerleştirilmesine izin verecektir. Üçüncüsü, vücudun fazla suyu atma ve homeostaz sürdürme mekanizmalarından biri buharın solunmasıdır. Bu nedenle, çok fazla sıvı alımı (çoğunlukla kontrast ajanların veya tümör hücre süspansiyonlarının enjeksiyonu sonucu) akciğer yüzeyinin bu fazla suyu atmasını sağlayacak ve akciğer dokusunun WHRIL'den kopmasıyla sonuçlanacaktır. Bu, enjeksiyon hacmini bir seferde maksimum 50 μL ile sınırlayarak önlenebilir. Son olarak, en iyi bakımla bile, akciğer dokusu zaman zaman farenin büyük miktarda su yutması veya farenin kendini aşırı yorması nedeniyle WHRIL'den ayrılabilir. Bu durumda, akciğer dokusunun WHRIL'den ayrıştırısı genellikle dış kenardan başlayarak yavaşça gerçekleşir. Bu nedenle, görüntülemenin ilk gününde bulunan bazı görüş alanlarını pencerenin tam süresi boyunca takip etmek imkansız olabilir. en iyi görüntüleme sonuçlarının ilk birkaç gün içinde elde edileceğini ve daha önce yayınlanan Büyük Hacimli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Görüntüleme21 gibi mozaikleme tekniklerinin kullanımının bu sınırlamanın etkisini en aza indirebileceği bulunmuştur.
WHRIL'in farenin göğüs duvarına entegre olduğu göz önüne alındığında, pencere ve mikroskop arasındaki bağlantının sağlam olduğundan emin olmak için bakım ödendiği sürece görüntüleme sırasında sürüklenme genellikle önemli bir sorun değildir. Yine de, farenin mikroskop aşamasına yerleştirilmesinden hemen sonraki süre boyunca biraz sürüklenme gözlenebilir. Bu, farenin vücudunun gevşemesinden veya çevre odası nedeniyle mikroskop bileşenlerinin (sahne plakası, XY aşaması, objektif lens) termal genişlemesinden kaynaklanabilir. Görüntüleme prosedürüne başlamadan önce denge için ~30 dk ayrılarak bu sürüklenme önlenebilir. Bu süre, farenin fizyolojisinin anestezi altında stabilize olmasını sağlar ve tüm bileşenlerin termal dengeye gelmesini sağlar. Herhangi bir küçük miktarda artık sürüklenme, StackReg43 veya HyperStackReg 44gibi hesaplama algoritmaları tarafından kolayca işlenebilir.
Son olarak, bu protokol iki nedenden dolayı önceki yazılı sürüme göre bir geliştirmedir. İlk olarak, görsel format cerrahi protokolün daha iyi kavramsallaştırılmasını sağlar. Bu, özellikle 1) akciğerin sabit bir basınçlı hava akışı uygulanarak kurutulduğu önemli adımlar için yararlıdır (adım 3.24, Şekil 1J), 2) kapakçık, pencere çerçevesinin merkezi deliğine kabarcıkların sıkışmasını önleyecek şekilde tutturulur (adım 3.31) ve 3) kapak ve pencere çerçevesi arasında hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için metal cam arayüzüne az miktarda sıvı siyanoakrilat eklenir (adım 3.34, Şekil 1O).
Sonuç olarak, WHRIL'in ortaya çıkmasıyla, aynı akciğer dokusunun uzun bir süre boyunca hücre altı görselleştirilmesine olan yeteneği göz önüne alındığında, araştırmacılar cevaplanmamış birçok soruyu ele almak için yeni yetkilendirilmiştir. Özellikle, burada özetlenen protokol, kanser metastazının ilerlemesi de dahil olmak üzere çok sayıda patolojinin altında kalan dinamik süreçlerin temelden araştırılmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını açıklarlar.
Acknowledgments
Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklendi: CA216248, CA013330, Montefiore'den Ruth L. Kirschstein T32 Eğitim HibeSI CA200561, METAvivor Erken Kariyer Ödülü, Gruss-Lipper Biyofotoğraf Merkezi ve Entegre Görüntüleme Programı ve Jane A. ve Myles P. Dempsey. Görüntüleme desteği için Einstein Tıp Fakültesi Analitik Görüntüleme Tesisi'ne (AIF) teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D.
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E.
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D.
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P.
