Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur operativen Implantation eines dauerhaft verweilbaren optischen Fensters für den murinen Thorax vor, das eine hochauflösende, intravitale Bildgebung der Lunge ermöglicht. Die Permanenz des Fensters macht es gut geeignet für die Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse in der Lunge, insbesondere solcher, die sich langsam entwickeln, wie z.B. das metastatische Fortschreiten von disseminierten Tumorzellen.
Abstract
Metastasierung, die ~ 90% der krebsbedingten Mortalität ausmacht, beinhaltet die systemische Ausbreitung von Krebszellen von Primärtumoren zu sekundären Stellen wie Knochen, Gehirn und Lunge. Obwohl ausgiebig untersucht, sind die mechanistischen Details dieses Prozesses nach wie vor wenig verstanden. Während gängige Bildgebungsmodalitäten, einschließlich Computertomographie (CT), Positronenemissionstomographie (PET) und Magnetresonanztomographie (MRT), unterschiedliche Grade der groben Visualisierung bieten, fehlt jedem die zeitliche und räumliche Auflösung, die notwendig ist, um die Dynamik einzelner Tumorzellen zu erkennen. Um dies zu beheben, wurden zahlreiche Techniken für die intravitale Bildgebung von häufigen metastasierenden Stellen beschrieben. Von diesen Stellen hat sich die Lunge aufgrund ihrer Zartheit und ihrer entscheidenden Rolle bei der Erhaltung des Lebens als besonders schwierig für die intravitale Bildgebung erwiesen. Obwohl bereits mehrere Ansätze für die einzelzellige intravitale Bildgebung der intakten Lunge beschrieben wurden, beinhalten alle hochinvasive und terminale Verfahren, die die maximal mögliche Bildgebungsdauer auf 6-12 h begrenzen. Beschrieben wird hier eine verbesserte Technik zur dauerhaften Implantation eines minimalinvasiven thorakalen optischen Fensters zur hochauflösenden Bildgebung der Lunge (WHRIL). In Kombination mit einem angepassten Ansatz für die Mikrokartographie ermöglicht das innovative optische Fenster die serielle intravitale Bildgebung der intakten Lunge mit Einzelzellauflösung über mehrere Bildgebungssitzungen und mehrere Wochen hinweg. Angesichts der beispiellosen Zeitspanne, über die Bilddaten gesammelt werden können, kann das WHRIL die beschleunigte Entdeckung der dynamischen Mechanismen ermöglichen, die der metastatischen Progression und zahlreichen zusätzlichen biologischen Prozessen in der Lunge zugrunde liegen.
Introduction
Metastasen, die für ~ 90% der Todesfälle verantwortlich sind, sind die Hauptursache für krebsbedingte Mortalität1. Unter den Hauptorten klinisch beobachteter Metastasen (Knochen, Leber, Lunge, Gehirn)2hat sich die Lunge als besonders herausfordernd für die In-vivo-Bildgebung mittels intravitaler Mikroskopie erwiesen. Dies liegt daran, dass die Lunge ein empfindliches Organ in ständiger Bewegung ist. Die kontinuierliche Bewegung der Lunge, die durch intrathorakale Herzbewegungen noch verstärkt wird, stellt eine erhebliche Barriere für eine genaue Bildgebung dar. Aufgrund seiner relativen Unzugänglichkeit für Modalitäten für eine hochauflösende intravitale optische Bildgebung wurde das Krebswachstum in der Lunge daher oft als okkulter Prozess angesehen3.
Im klinischen Umfeld ermöglichen bildgebende Verfahren wie Computertomographie (CT), Positronenemissionstomographie (PET) und Magnetresonanztomographie (MRT) die Visualisierung tief in intakten lebenswichtigen Organen wie der Lunge4. Während diese Modalitäten jedoch hervorragende Ansichten des Bruttoorgans bieten (oft sogar die Pathologie vor dem Auftreten klinischer Symptome aufdecken), sind sie von unzureichender Auflösung, um einzelne disseminierte Tumorzellen zu erkennen, wenn sie durch die frühen Stadien der Metastasierung vordringen. Folglich sind metastasierende Herde bereits gut etabliert und vermehren sich, wenn die oben genannten Modalitäten einen Hinweis auf metastasierende Metastasen in der Lunge liefern. Da die Tumormikroumgebung eine zentrale Rolle bei der Krebsprogression und Metastasenbildung spielt5,6, besteht ein großes Interesse daran, die frühesten Schritte der metastatischen Aussaat in vivozu untersuchen. Dieses Interesse wird weiter angeheizt durch die erhöhte Wertschätzung, dass Krebszellen sich verbreiten, noch bevor der Primärtumor entdeckt wird7,8 und die zunehmenden Beweise, dass sie als Einzelzellen und in einem ruhenden Zustand für Jahre bis Jahrzehnte überleben, bevor sie in Makrometastasen auswachsen9.
Bisher umfasste die Bildgebung der Lunge mit Einzelzellauflösung notwendigerweise Ex-vivo- oder Explantatpräparate10,11,12,13, die analysen auf einzelne Zeitpunkte beschränkten. Während diese Präparate nützliche Informationen liefern, geben sie keinen Einblick in die Dynamik von Tumorzellen innerhalb des Organs, das mit einem intakten Kreislaufsystem verbunden ist.
Jüngste technologische Fortschritte in der Bildgebung haben die intravitale Visualisierung der intakten Lunge mit Einzelzellauflösung über Zeiträume von bis zu 12 hermöglicht 14,15,16. Dies wurde in einem murinen Modell unter Verwendung eines Protokolls erreicht, das mechanische Beatmung, Resektion des Brustkorbs und vakuumunterstützte Lungenimmobilisierung beinhaltete. Obwohl die Technik die ersten Einzelzellauflösungsbilder der physiologisch intakten Lunge bietet, ist sie hochinvasiv und terminal, wodurch weitere Bildgebungssitzungen über das Indexverfahren hinaus ausgeschlossen sind. Diese Einschränkung verhindert daher seine Anwendung auf die Untersuchung von metastatischen Schritten, die länger als 12 h dauern, wie Ruhephase und Wiedereinleitung des Wachstums14,15,16. Darüber hinaus müssen Muster des zellulären Verhaltens, die mit diesem bildgebenden Ansatz beobachtet wurden, vorsichtig interpretiert werden, da vakuuminduzierte Druckdifferenzen wahrscheinlich Umleitungen im Blutfluss verursachen.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde kürzlich ein minimal-invasives Fenster für die hochauflösende Bildgebung der Lunge (WHRIL) entwickelt, das die serielle Bildgebung über einen längeren Zeitraum von Tagen bis Wochen ermöglicht, ohne dass eine mechanische Beatmung erforderlich ist17. Die Technik beinhaltet die Schaffung eines "transparenten Brustkorbs" mit einer versiegelten Brusthöhle zur Erhaltung der normalen Lungenfunktion. Das Verfahren ist gut verträglich, so dass sich die Maus erholen kann, ohne die Ausgangsaktivität und -funktion sinnvoll zu verändern. Um bei der jeweiligen Bildgebungssitzung genau die gleiche Lungenregion zuverlässig zu lokalisieren, wurde auf dieses Fenster eine als Mikrokartographie bekannte Technik angewendet18. Durch dieses Fenster war es möglich, Bilder von Zellen aufzunehmen, wenn sie am Gefäßbett der Lunge ankommen, das Endothel überqueren, Zellteilung durchlaufen und zu Mikrometastasen heranwachsen.
Hier präsentiert die Studie eine detaillierte Beschreibung eines verbesserten Operationsprotokolls zur Implantation des WHRIL, das die Operation vereinfacht und gleichzeitig deren Reproduzierbarkeit und Qualität erhöht. Während dieses Protokoll entwickelt wurde, um die Untersuchung der dynamischen Prozesse zu ermöglichen, die der Metastasierung zugrunde liegen, kann die Technik alternativ auf Untersuchungen zahlreicher Prozesse der Lungenbiologie und -pathologie angewendet werden.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren durchgeführt, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch das Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Passivierung von Fenstern
- Spülen Sie die optischen Fensterrahmen (Ergänzende Abbildung 2) mit einer 1% igen (w/v) Lösung enzymatisch aktiver Reinigungsmittel ab.
- In einem Glasgefäß tauchen Sie die optischen Fensterrahmen 30 min bei 70 °C in 5% (w/v) Natronlauge ein.
- Entfernen und waschen Sie die Fensterrahmen mit entionisiertem Wasser.
- Tauchen Sie die optischen Fensterrahmen 10 min bei 55 °C in ein neues Glasgefäß in 7% (w/v) Zitronensäurelösung.
- Entfernen und waschen Sie die Fensterrahmen erneut mit entionisiertem Wasser.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2. Entfernen und waschen Sie dann die Fensterrahmen mit entionisiertem Wasser.
2. Vorbereitung auf die Operation
- Führen Sie die Operation in einer Haube oder einem Laminar-Flow-Schrank durch. Um eine Kontamination des Operationsfeldes zu vermeiden, stellen Sie unterschiedliche, getrennte Bereiche für die Vorbereitung, Operation und Genesung sicher.
- Sterilisieren Sie vor der Operation alle chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven. Wenn nachfolgende Verfahren geplant sind, sterilisieren Sie die Instrumente mit einem Heißperlensterilisator erneut. Für diesen chirurgischen Eingriff wird eine reine Trinkgeldtechnik verwendet.
- Schalten Sie die beheizte chirurgische Perle und den Perlensterilisator ein.
- Betäuben Sie die Maus mit 5% Isofluran in der Anästhesiekammer.
- Um Haare zu entfernen, tragen Sie großzügig enthaarende Creme auf die obere linke Brustschnittstelle auf. Nach nicht länger als 20 s die Haare und die Enthaarungscreme mit angefeuchtetem Seidenpapier fest abwischen. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, um alle Haare von der Operationsstelle zu entfernen.
- Binden Sie mit einer 2-0-Seidennaht einen Knoten an der Basis eines 22-G-Katheters und lassen Sie 2 Zoll lange Schwänze zurück (siehe Abbildung 1A).
3. Lungenfenster-Chirurgie
- Waschen Sie die Hände mit antiseptischer Seife.
- Ziehen Sie vor jeder neuen Operation neue sterile Handschuhe an.
- Um eine Hornhauttrocknung und eine Schädigung der Augen der Maus zu verhindern, tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf.
- Verdünnen Sie 10 μL (0,1 mg/kg) Buprenorphin in 90 μL sterilem PBS und injizieren Sie dann subkutan, um eine präoperative Analgesie sicherzustellen.
- Intubieren Sie die Maus mit dem seidennahten 22 G Katheter15. Bestätigen Sie mit einer Inflationsbirne die erfolgreiche Intubation, indem Sie den bilateralen Brustanstieg beim Zwiebeldrücken feststellen.
- Sichern Sie den Intubationskatheter, indem Sie die 2-0 Seidennaht um die Schnauze der Maus binden (siehe Abbildung 1B).
- Legen Sie die Maus auf den beheizten chirurgischen Ständer und positionieren Sie sie im rechten seitlichen Dekubitus, um den linken Brustkorb freizulegen.
- Schließen Sie das Beatmungsgerät an den Intubationskatheter an.
- Sorgen Sie für eine kontrollierte, stabile Beatmung des Beatmungsgeräts und senken Sie dann das Isofluoran auf 3%. Beurteilen Sie zu Beginn des Eingriffs und regelmäßig während der gesamten Dauer des Eingriffs die Angemessenheit der Anästhesie, indem Sie einen Zehenquetschtest durchführen.
- Mit Papierband befestigen Sie kranial und kaudal die vorderen bzw. hinteren Gliedmaßen an der beheizten Operationsbühne. Legen Sie ein weiteres Stück Klebeband entlang der Länge des Rückens der Maus an, um die Exposition gegenüber dem Operationsfeld zu maximieren (siehe Abbildung 1C).
- Öffnen Sie alle chirurgischen Instrumente unter der Haube, um die Sterilität zu erhalten.
- Sterilisieren Sie die Operationsstelle durch eine großzügige Anwendung von Antiseptikum auf die Haut der Maus.
- Heben Sie mit einer Pinzette die Haut an und machen Sie einen ~ 10 mm kreisförmigen Schnitt, ~ 7 mm links vom Brustbein und ~ 7 mm über dem Unterkostalrand (Abbildung 1D).
- Identifizieren Sie sorgfältig alle wichtigen Schiffe. Wenn die Teilung der Gefäße notwendig ist, kauterisieren Sie an beiden Enden mit dem Elektrokauterstift, um die Hämostase aufrechtzuerhalten.
- Schneiden Sie das Weichgewebe über den Rippen aus.
- Heben Sie die6. oder7. Rippe mit einer Pinzette an. Mit einer einzigen Klinge der stumpfen Mikrodesektionsschere, der abgerundeten Seite zur Lunge hin, durchbohren Sie vorsichtig den Interkostalmuskel zwischen der6. und7. Rippe, um in den intrathorakalen Raum einzudringen (Abbildung 1E).
- Drücken Sie den Druckluftkanister am Defekt vorsichtig ab, um die Lunge zu kollabieren und von der Brustwand zu trennen. Feuern Sie die Druckluft in kurzen Ausbrüchen ab, um iatrogene Lungenverletzungen zu verhindern.
- Legen Sie den Biopsiestempel über das Schneidwerkzeug (Ergänzende Abbildung 1) und manövrieren Sie vorsichtig die Basis des Schneidwerkzeugs durch den Interkostalschnitt (Abbildung 1F).
- Richten Sie die Basis des Schneidwerkzeugs so aus, dass sie parallel zur Brustwand verläuft. Stanzen Sie ein 5 mm großes kreisförmiges Loch durch den Brustkorb (Abbildung 1G).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das exponierte Lungengewebe rosa ist, ohne Anzeichen von Schäden. - Erstellen Sie mit der 5-0-Seidennaht einen Handtaschenstich ~ 1 mm vom Loch entfernt, umlaufend, verflochten mit den Rippen (Abbildung 1H).
- Positionieren Sie den Fensterrahmen so, dass die Kanten des kreisförmigen Defekts innerhalb der Nut des Fensters ausgerichtet sind (siehe Abbildung 1I).
- Verriegeln Sie das implantierte Fenster sicher, indem Sie die 5-0 Seidennaht fest zusammenbinden.
- Laden Sie 100 μL Cyanacrylat-Gelkleber in die 1 mL Spritze.
- Trocknen Sie die Lunge, indem Sie einen stetigen, sanften Druckluftstrom für ~ 10-20 s anwenden (Abbildung 1J).
- Heben Sie den Fensterrahmen mit einer Pinzette vorsichtig an der Außenkante an, um die Trennung der Lunge von der Unterseite des Fensterrahmens sicherzustellen.
- Verteilen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber entlang der Unterseite des optischen Fensterrahmens (Abbildung 1K).
- Erhöhen Sie den positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) auf das Beatmungsgerät, um die Lunge aufzublasen.
- Halten Sie 10-20 s und üben Sie sanften, aber festen Druck aus, um den optischen Fensterrahmen am Lungengewebe zu befestigen (Abbildung 1L).
- Geben Sie einen 5 mm Tropfen des restlichen Cyanacrylat-Gelklebers auf einen rechteckigen Deckglas.
- Nehmen Sie den 5-mm-Deckglas mit Vakuum-Tonabnehmern auf. Tauchen Sie die Unterseite des Deckglases in den Klebstoff und kratzen Sie dann überschüssigen Klebstoff dreimal gegen die Seite des rechteckigen Deckglases ab, so dass nur eine sehr dünne Schicht übrig bleibt (Abbildung 1M).
- Positionieren Sie den Deckstab vorsichtig so, dass er in die Aussparung in der Mitte des optischen Fensterrahmens passt und schräg über dem Lungengewebe gehalten wird. Klemmen Sie das Beatmungsgerät kurz ein, um Einen positiven Druck zu erzeugen, wodurch die Lunge hyperinflationiert wird. Richten Sie den Deckstreifen mit einer rotierenden Bewegung parallel zum Lungengewebe aus, um eine direkte Apposition zwischen der Lungenoberfläche und der Unterseite des Deckglases zu erzeugen. Halten Sie einen sanften Druck aufrecht, so dass der Cyanacrylatkleber abbinden kann (~ 25 s).
- Verwenden Sie die Pinzette, um den Deckglas von den Vakuumabnehmern zu trennen (Abbildung 1N).
- Erzeugen Sie mit 5-0 Seidennaht erneut einen Handtaschenstich, diesmal <1 mm umschneidend von der Schnittkante des Hautschnitts. Stecken Sie überschüssige Haut unter den äußeren Rand des Fensterrahmens, bevor Sie sie mit verriegelnden Knoten fest binden.
- Um eine luftdichte Abdichtung zwischen Deckglas und Fensterrahmen zu gewährleisten, dosieren Sie eine kleine Menge flüssiges Cyanacrylat an der Metall-Glas-Grenzfläche (siehe Abbildung 1O).
- Befestigen Sie eine sterile Nadel an einer 1 ml Insulinspritze. Führen Sie die Nadel unterhalb des Xiphoid-Prozesses ein, bewegen Sie sich in Richtung der linken Schulter und treten Sie durch das Zwerchfell in die Brusthöhle ein. Ziehen Sie die Spritze vorsichtig zurück, um Restluft aus der Brusthöhle zu entfernen (siehe Abbildung 1P).
- Entfernen Sie das Band von der Maus.
- Schalten Sie Isofluran aus.
- Setzen Sie die Beatmung mit 100% Sauerstoff fort, bis die Maus zum Erwachen bereit zu sein scheint.
- Schneiden Sie die 2-0 Seidennaht vorsichtig um die Schnauze der Maus und extubieren Sie die Maus.
- Bringen Sie die Maus in einen sauberen Käfig und überwachen Sie sie, bis sie vollständig wiederhergestellt ist. Euthanasieren Sie die Maus, wenn Anzeichen von Atembeschwerden vorhanden sind.
- Postoperative Analgesie durch subkutane Injektion von 10 μL (0,1 mg/kg) Buprenorphin, verdünnt in 90 μL steriler phosphatgepufferter Lösung (PBS).
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Representative Results
Die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte des chirurgischen Verfahrens sind in Abbildung 1zusammengefasst und veranschaulicht. Kurz gesagt, vor der Operation werden Mäuse betäubt und die Haare über dem linken Brustkorb entfernt. Mäuse werden intubiert und mechanisch beatmet, um das Überleben bei Durchbrechen der Brusthöhle zu ermöglichen. Weichgewebe, das über den Rippen liegt, wird ausgeschnitten und ein kleiner kreisförmiger Defekt entsteht, der die6. und7. Rippe überspannt. Der optische Fensterrahmen wird in den Defekt eingesetzt und seine Unterseite (außerhalb der freien Öffnung) wird am Lungengewebe haften. Der Fensterrahmen wird dann mit einer Kombination aus Nähten und Klebstoff gesichert, wodurch die Brusthöhle wieder verschlossen wird und die Wiederaufnahme der normalen Atmung nach der Extubation ermöglicht wird. Bei erfolgreicher Implantation haftet die Lunge am optischen Fenster (das als Teil der Brustwand eingebaut ist), wobei intrathorakale Druckgradienten erhalten bleiben. Dies ermöglicht ein komfortables Überleben der Maus und ermöglicht eine tägliche Bildgebung bis zur Protokollmenge (2 Wochen). Intravitale Bildgebung kann dann durch das Fenster durchgeführt werden, wie zuvor für andere Fenster15,19,20beschrieben .
Zur Visualisierung verschiedener Zelltypen, biologischer Strukturen oder zellulärer Funktionszustände kann das hier vorgestellte Verfahren an einer Vielzahl von Mäusen durchgeführt werden, die entweder genetisch manipuliert wurden, um fluoreszierende Proteine zu exprimieren21 oder mit Farbstoffen22injiziert wurden. Die permanente Beschaffenheit des Fensters macht es kompatibel mit Techniken zur Relokalisierung von Sichtfeldern wie Photokonversion23,24 oder Mikrokartographie17,18. Mikrokartographie ist eine Triangulationstechnik, die auf der Verwendung von berechneten Transformationen von Koordinaten fester Fiducialmarkierungen zwischen Bildgebungssitzungen basiert, um eine Region von Interesse vorherzusagen und neu zu lokalisieren. In dem wie oben beschrieben erzeugten Fenster sind diese Fugenmarkierungen leichte Kratzer, die in den Fensterrahmen geätzt sind (Ergänzende Abbildung 2), die unter dem Mikroskop leicht zu erkennen sind. Dadurch ist es möglich, das gleiche Sichtfeld auch in ansonsten nicht markiertem Gewebe mehrfach zu finden. Abbildung 2 zeigt das Ergebnis dieser Techniken bei einer Maus, bei der das Lungengefäßsystem durch Injektion eines farbstoffmarkierten hochmolekularen Dextrans (Tetramethylrhodamin 155 kD Dextran) markiert und das gleiche Mikrogefäßsystem über 3 Tage relokalisiert wurde.
Dieses Dextran erwies sich als äußerst nützlich bei der Beurteilung transienter Gefäßöffnungen, die während der Intravasation von Tumorzellen induziert werden25,26,27. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass dieses hochmolekulare Dextran bei primären Brusttumoren ansonsten effektiv an das Gefäßsystem gebunden ist und nicht in das Interstitium25ausläuft. Dies steht im Gegensatz zu Dextrans mit niedrigerem Molekulargewicht (wie 10 kD oder 70 kD), von denen gezeigt wurde, dass sie passiv aus neoangiogenen Gefäßen austreten28,29. Inzwischen wurde beobachtet, dass das gesunde Lungengefäßsystem resistenter gegen Leckagen ist, wobei Dextrans >10 kD nur bei Beleidigung des Organs in das Interstitium entweicht, z. B. bei Exposition gegenüber Exosomen30 oder Viren31. Es gibt eine Vielzahl von Kontrastmitteln, um neben der vaskulären Permeabilität auch andere Parameter in der Lunge zu messen (z. B. Kernmarker, lebende / tote Indikatoren, oxidative Stress-Reporter, Blutflussgeschwindigkeits-Tracker). Eine ausgezeichnete Ressource, die sie katalogisiert, kann im Protokoll von Ueki et al.22gefunden werden.
Das WHRIL ist eine Technik, die sich sehr gut eignet, um die Dynamik des Blutflusses in der Lunge zu untersuchen. Dies kann auf verschiedene Arten erreicht werden. Erstens, wenn sie mit relativ langsamen Bildraten (~ 1-10 Bilder pro Sekunde, fps) abgebildet werden, können die Blutflussgeschwindigkeiten durch die Schatten bestimmt werden, die unbeschriftete Erythrozyten erzeugen, wenn sie in größere Gefäße fließen. Bei niedrigen fps bilden diese Schatten Linien, deren Winkel relativ zum Gefäß zur Berechnung der Erythrozytenflussraten32 verwendet werden kann(Abbildung 2, gelbe Linien). Zweitens können Schatten auch auf Low-fps-Mikroskopen verfolgt werden, indem die Gefäße an der schnellen Scanachse des Mikroskops ausgerichtet und Kymographen mit rapid line scanning33,34,35erfasst werden. Schließlich können bei der Bildgebung mit hohen Bildraten (>10 fps) auf einem Mikroskop, das in der Lage ist, das Signal im Laufe der Zeit zu integrieren (z. B. eine rotierende konfokale Scheibe, die mit einem CCD-Detektor (Charge-Coupled Device) ausgestattet ist), einzelne Partikel direkt verfolgt werden16,17. In dieser Situation erscheinen stationäre Objekte als helle Punkte, und fließende Objekte verfolgen Spuren mit der Zirkulation. Die Zellgeschwindigkeiten können quantifiziert werden, indem die Länge der Spuren gemessen und durch die Bilderfassungszeit dividiert wird. Ein Beispiel hierfür ist in Abbildung 3 und Supplemental Movie 1dargestellt, wo 2 μm fluoreszierende Mikrosphären vor der Bildgebung intravaskulär in die Maus injiziert wurden.
Mit der Möglichkeit, immer wieder und konsequent in das gleiche Sichtfeld zurückzukehren, ist nun die Visualisierung von Prozessen, die sich über mehrere Tage entwickeln, möglich. Als Demonstration dieser Anwendung wurde das WHRIL verwendet, um das metastatische Fortschreiten von Brustkrebszellen in der Lunge zu visualisieren17,21: das heißt, um im Laufe der Zeit das Schicksal einzelner Tumorzellen zu verfolgen, die im Lungengefäßsystem ankommen. Dieses Konzept ist in Abbildung 4Adargestellt, wo eine einzelne disseminierte Tumorzelle kurz nach der Unterbringung in einem Segment des Lungenmikrogefäßsystems visualisiert wird. Die Rückkehr an denselben Ort an den folgenden Tagen zeigt das Schicksal der Tumorzelle (z. B. Rezirkulation, Extravasation usw.). Angewandt auf die Untersuchung der kulminierenden Schritte der metastatischen Progression in der Lunge war es möglich, dynamische Prozesse visuell zu dokumentieren, einschließlich der Ankunft von Tumorzellen (Abbildung 4B), Extravasation (Abbildung 4C) und Proliferation zur Bildung von Makrometastasen (Abbildung 4D).
Abbildung 1: Zusammenfassung der Operation zur Implantation des Fensters für die hochauflösende Bildgebung der Lunge (WHRIL). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Mikrokartographie ermöglicht die Relokalisierung fester Positionen innerhalb des optischen Fensters. Die intravitale Multiphotonenbildgebung einer einzelnen Region der Lunge unter dem optisch transparenten Deckglas zeigt die Mikrovaskulatur, die über 3 aufeinanderfolgende Tage mittels Mikrokartographie verlagert wurde. Gelbe Pfeile zeigen einen klar definierbaren Zweigpunkt von einem einzelnen Gefäß an, der an jedem aufeinanderfolgenden Tag identifiziert wird. Gelbe Linien heben Schatten hervor, die unbeschriftete Erythrozyten bilden, wenn sie in größere Gefäße fließen. Der Winkel dieser Linien relativ zum Gefäß kann verwendet werden, um Erythrozytenflussraten zu berechnen. Rot = tdTomatomarkierte Endothelzellen und 155 kDa Tetramethylrhodamin-Dextran-markiertes Blutserum, Grün = GFP-markierte Tumorzellen, Blau = zweite harmonische Generation. Maßstabsbalken = 15 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Visualisierung der Blutflussrate. Blutflussraten können visualisiert werden, indem fluoreszierende Mikrosphären mit einem Durchmesser von 2 μm retroorbital injiziert werden und ihre Passage durch die Blutgefäße abgebildet wird. Wenn sie auf einem Mikroskop abgebildet werden, das in der Lage ist, das Signal im Laufe der Zeit zu integrieren (z. B. eine rotierende Konfokalscheibe, die mit einem CCD-Detektor ausgestattet ist), erscheinen stationäre Mikrosphären als helle Punkte (Pfeile), und fließende Kugeln verfolgen Spuren mit der Zirkulation (Klammerlinien). Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Das WHRIL kann jeden Schritt der metastatischen Kaskade in der Lunge erfassen, indem es das Schicksal von disseminierten Tumorzellen direkt visualisiert. (A) Die Verfolgung des Schicksals von disseminierten Tumorzellen (grün) ist mit serieller Bildgebung über mehrere Tage durch das WHRIL möglich. An Tag 1 wird beobachtet, dass eine Tumorzelle im Lungengefäßsystem angekommen ist und sich dort festsetzt. An Tag 2 und Tag 3 ist die Zelle nicht mehr im Lungengefäßsystem vorhanden, nachdem sie entweder rezirkuliert oder abgestorben ist. Maßstabsbalken = 15 μm. (B-D) Visualisierung jedes Der Stadien der Tumorzellmetastasierung in der Lunge. (B) Eine intravaskuläre disseminierte Tumorzelle (grün), die sich nach der Ankunft im Lungengefäßsystem festsetzt. (C) Disseminierte Tumorzelle (grün) nach Extravasation in das Lungenparenchym. (D) Tumorzellen, die sich vermehrt haben und zu Mikrometastasen herangewachsen sind. Rot = tdTomatomarkierte Endothelzellen und 155 kDa Tetramethylrhodamin-Dextran-markiertes Blutserum, Grün = GFP-markierte Tumorzellen, Blau = zweite harmonische Generation. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzender Film 1: Video entsprechend Abbildung 3, das das Lungengefäßsystem mit zirkulierenden 2 μm Mikrosphären zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1: Mechanische Konstruktionszeichnungen für dasSchneidwerkzeug aus flecklosem Stahl, das zur Führung des 5-mm-Biopsiestempels verwendet wird.
Ergänzende Abbildung 2: Mechanische Konstruktionszeichnungen für den Edelstahl-Fensterrahmen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Mechanische Konstruktionszeichnungen für das Fensterhalterwerkzeug. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
An Stellen der Fernmetastasierung wie der Lunge gibt die hochauflösende optische Bildgebung Einblick in die aufwendige Dynamik der Tumorzellmetastasierung. Durch die In-vivo-Visualisierung einzelner Krebszellen und ihrer Wechselwirkungen mit dem Wirtsgewebe hat sich die hochauflösende intravitale Bildgebung als entscheidend für das Verständnis der Mechanismen erwiesen, die der Metastasierung zugrunde liegen.
Beschrieben wird hier ein verbessertes Operationsprotokoll für die dauerhafte thorakale Implantation eines optischen Fensters, das die serielle Bildgebung der murinen Lunge mittels hochauflösender Multiphotonenmikroskopie ermöglicht. Das mit diesem Protokoll erstellte Fenster ist gut verträglich und aufgrund seiner Fähigkeit, die Brusthöhle erfolgreich wieder zu versiegeln, in der Lage, die für die spontane Beatmung notwendigen intrathorakalen Druckgradienten aufrechtzuerhalten (im Gegensatz zu jedem anderen zuvor beschriebenen Fenster für die Bildgebung der murinen Lunge14,15,16,36,37 ). Dies ermöglicht es der Maus, aus der Narkose zu erwachen, selbstständig zu atmen und mit dem transparenten Brustkorb über einen längeren Zeitraum von mehreren Wochen bequem zu überleben.
Mit diesem Fenster war es möglich, mit Einzelzellauflösung alle Schritte der Metastasierung zu visualisieren, einschließlich Ankunft, Extravasation und Wachstum in Mikrometastasen.
Obwohl das Protokoll einige technische Fähigkeiten erfordert, kann das Verfahren mit Übung und sorgfältiger Beachtung mehrerer wichtiger Schritte mit einer hohen Erfolgsquote durchgeführt werden. Erstens, wenn Haare vor der Operation entfernt werden, ist es wichtig, die Haut der Maus zu schützen, indem die Enthaarungscreme mit einem angefeuchteten Gewebe nach nicht mehr als 20 s Kontakt entfernt wird. Während der Operation sollte äußerste Vorsicht geboten sein, um das Schneiden von Gefäßen zu vermeiden. Übermäßige Blutungen, die am häufigsten aufgrund der Teilung der brachialen oder inneren Brustarterien während der Entfernung des Brustfettpolsters auftreten, können die Visualisierung im chirurgischen Bereich verdecken oder durch Exsanguination zum Tod führen. Neu beschrieben in diesem Protokoll ist die Verwendung eines Biopsiestanz- und Schneidwerkzeugs (Ergänzende Abbildung 1), die die Erzeugung des kreisförmigen Defekts durch den Brustkorb erheblich beschleunigen und vereinfachen, und eines Fensterhalterwerkzeugs, das die Implantation erleichtert. Die Umsetzung dieser Fortschritte verbessert die Erfolgsrate des Verfahrens erheblich und reduziert das erforderliche Maß an chirurgischen Vorkenntnissen. Einzelne Labore können die Zeichnungen in den Ergänzungsfiguren verwenden, um diese Werkzeuge entweder in eigenen oder gewerblichen Maschinenwerkstätten herzustellen. Eine Internetsuche nach "Bieterseiten für Maschinengeschäfte" führt zu mehreren Online-Anwendungen, die bei der Suche nach lokalen kommerziellen Maschinenwerkstätten helfen.
Schließlich ist es entscheidend sicherzustellen, dass das Lungengewebe vor dem Klebstoffauftrag trocken bleibt. Die häufigste Falle, die zu einer erfolglosen Befestigung des Deckglases führt, ist das Versäumnis, die vollständige Entfernung der Feuchtigkeit von der Lungenoberfläche vor der Anlagerung mit dem Rahmen oder dem Deckglas sicherzustellen. Um qualitativ hochwertige Bilder zu gewährleisten, sollte außerdem eine extrem dünne Klebeschicht (<10 μm) aufgetragen werden. Überschüssiger Kleber sollte vor dem Einsetzen des Deckglases abgekratzt werden.
Die Haupteinschränkung von IVI durch das WHRIL ist die relativ begrenzte eindringliche Eindringtiefe. Daher ist eine Pathologie, die tief in der Lunge auftritt, unzugänglich. Trotz dieser Einschränkung kann die Technik immer noch eine Fülle klinisch relevanter Informationen liefern, insbesondere in onkologischen Untersuchungen, angesichts der beschriebenen Neigung zu peripher lokalisierten Lungenmetastasen38,39,40,41. Letztendlich bietet dieser bildgebende Ansatz einen erheblichen Vorteil gegenüber Standard-Ex-vivo-Assays und anderen Methoden für die In-vivo-Bildgebung, die entweder Gewebe von lebenswichtigen physiologischen Prozessen trennen10,11, 12,13, oder die Längsschnittanalyse auf eine maximale Dauer von 12 h14,15,16,37,42, beziehungsweise.
Für die wiederholte Bildgebung über diesen Zeitraum müssen noch einige Herausforderungen bewältigt werden. Erstens ist es wichtig, die Gesundheit der Haut um das implantierte Fenster herum zu erhalten, denn während das verletzte Gewebe nicht freigelegt wird, kann sich die Haut um sie herum immer noch entzünden oder infizieren. Die routinemäßige Anwendung einer antibiotischen Salbe hilft, dies zu verhindern. Zweitens kann mit der Zeit Exsudat aus der geschnittenen Haut unter dem Fensterrahmen erstarrt sein und die Platzierung der Fixierplatte verhindern, die zur Ruhigstellung der Maus im Mikroskopstadium verwendet wird. Das Platzieren eines feuchten Gewebes über dem WHRIL für 10-15 min wird dieses Exsudat erweichen und die Platzierung des Fensterrahmens ermöglichen. Drittens ist einer der Mechanismen des Körpers zur Ausscheidung von überschüssigem Wasser und zur Aufrechterhaltung der Homöostase das Ausatmen von Dampf. So führt eine zu hohe Flüssigkeitsaufnahme (meist als Folge der Injektion von Kontrastmitteln oder Tumorzellsuspensionen) dazu, dass die Lungenoberfläche dieses überschüssige Wasser ausscheidet und sich das Lungengewebe vom WHRIL löst. Dies kann vermieden werden, indem das Volumen der Injektionen auf maximal 50 μL gleichzeitig begrenzt wird. Schließlich kann sich lungengewebe selbst bei bester Pflege gelegentlich vom WHRIL lösen, weil die Maus eine große Menge Wasser aufnimmt oder weil die Maus sich überanstrengt. Wenn dies geschieht, erfolgt die Ablösung des Lungengewebes vom WHRIL typischerweise langsam, beginnend am äußeren Rand. Daher kann es unmöglich sein, einige Sichtfelder zu verfolgen, die sich am ersten Tag der Bildgebung für die gesamte Dauer des Fensters befinden. Es wurde festgestellt, dass die besten Bildgebungsergebnisse innerhalb der ersten Tage erzielt werden und dass der Einsatz von Mosaiktechniken wie der zuvor veröffentlichten Large-Volume High-Resolution Intravital Imaging21 die Auswirkungen dieser Einschränkung minimieren kann.
Da das WHRIL in die Brustwand der Maus integriert ist, ist die Drift während der Bildgebung in der Regel kein wesentliches Problem, solange darauf geachtet wird, dass die Befestigung zwischen Fenster und Mikroskop fest sitzt. Dennoch kann in der Zeit unmittelbar nach dem Einsetzen der Maus in das Mikroskopstadium eine kleine Drift beobachtet werden. Dies kann von der Entspannung des Mauskörpers oder von der thermischen Ausdehnung der Mikroskopkomponenten (Bühnenplatte, XY-Stufe, Objektivlinse) aufgrund der Umweltkammer herrühren. Diese Drift kann vermieden werden, indem vor Beginn des Bildgebungsverfahrens ~ 30 Minuten für das Gleichgewicht zugewiesen werden. Diese Zeitspanne ermöglicht es der Maus, sich unter Narkose zu stabilisieren und alle Komponenten ins thermische Gleichgewicht zu bringen. Jede kleine Menge an Restdrift kann leicht von Rechenalgorithmen wie StackReg43 oder HyperStackReg44verarbeitet werden.
Schließlich ist dieses Protokoll aus zwei Gründen eine Verbesserung gegenüber der vorherigen schriftlichen Version. Erstens ermöglicht das visuelle Format eine bessere Konzeptualisierung des Operationsprotokolls. Dies ist besonders nützlich für die entscheidenden Schritte, bei denen 1) die Lunge durch Aufbringen eines stetigen, sanften Druckluftstroms getrocknet wird (Schritt 3.24, Abbildung 1J),2) der Deckglas an der zentralen Bohrung des Fensterrahmens so befestigt wird, dass das Einklemmen von Blasen verhindert wird (Schritt 3.31), und 3) eine kleine Menge flüssiges Cyanacrylat an der Metall-Glas-Schnittstelle hinzugefügt wird, um eine luftdichte Abdichtung zwischen dem Deckglas und dem Fensterrahmen zu gewährleisten (Stufe 3.31) 3.34, Abbildung 1O).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Forscher mit dem Aufkommen des WHRIL angesichts seiner Zugänglichkeit zur subzellulären Visualisierung desselben Lungengewebes über einen längeren Zeitraum neu in die Lage versetzt wurden, viele unbeantwortete Fragen zu beantworten. Insbesondere ermöglicht das hier beschriebene Protokoll eine grundlegende Untersuchung der dynamischen Prozesse, die zahlreichen Pathologien zugrunde liegen, einschließlich des Fortschreitens der Krebsmetastasierung.
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Disclosures
Die Autoren legen keine Interessenkonflikte offen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch folgende Zuschüsse unterstützt: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561 von Montefiore, METAvivor Early Career Award, das Gruss-Lipper Biophotonics Center und sein Integrated Imaging Program sowie Jane A. und Myles P. Dempsey. Wir danken der Analytical Imaging Facility (AIF) am Einstein College of Medicine für die Unterstützung der Bildgebung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
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