Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanentemente permanente para el tórax murino, que permite obtener imágenes intravitales de alta resolución del pulmón. La permanencia de la ventana la hace muy adecuada para el estudio de los procesos celulares dinámicos en el pulmón, especialmente aquellos que evolucionan lentamente, como la progresión metastásica de las células tumorales diseminadas.
Abstract
La metástasis, que representa ~ 90% de la mortalidad relacionada con el cáncer, implica la propagación sistémica de las células cancerosas desde tumores primarios a sitios secundarios como el hueso, el cerebro y el pulmón. Aunque ampliamente estudiados, los detalles mecanicistas de este proceso siguen siendo poco conocidos. Si bien las modalidades de imágenes comunes, incluida la tomografía computarizada (TC), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (IRM), ofrecen diversos grados de visualización macroscópica, cada una carece de la resolución temporal y espacial necesaria para detectar la dinámica de las células tumorales individuales. Para abordar esto, se han descrito numerosas técnicas para la obtención de imágenes intravitales de sitios metastásicos comunes. De estos sitios, el pulmón ha demostrado ser especialmente difícil de acceder para las imágenes intravitales debido a su delicadeza y papel crítico en el mantenimiento de la vida. Aunque se han descrito previamente varios enfoques para la obtención de imágenes intravitales unicelulares del pulmón intacto, todos implican procedimientos altamente invasivos y terminales, lo que limita la duración máxima posible de la imagen a 6-12 h. Aquí se describe una técnica mejorada para la implantación permanente de una ventana óptica torácica mínimamente invasiva para imágenes de alta resolución del pulmón (WHRIL). Combinada con un enfoque adaptado a la microcartografía, la innovadora ventana óptica facilita la obtención de imágenes intravitales en serie del pulmón intacto a resolución de una sola célula en múltiples sesiones de imágenes y que abarcan varias semanas. Dada la duración sin precedentes durante el cual se pueden recopilar datos de imágenes, el WHRIL puede facilitar el descubrimiento acelerado de los mecanismos dinámicos subyacentes a la progresión metastásica y numerosos procesos biológicos adicionales dentro del pulmón.
Introduction
Responsable de ~ 90% de las muertes, la metástasis es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer1. Entre los principales sitios de metástasis clínicamente observados (hueso, hígado, pulmón, cerebro)2, el pulmón ha demostrado ser particularmente desafiante para las imágenes in vivo a través de microscopía intravital. Esto se debe a que el pulmón es un órgano delicado en movimiento perpetuo. El movimiento continuo de los pulmones, agravado aún más por el movimiento cardíaco intratorácico, representa una barrera sustancial para obtener imágenes precisas. Por lo tanto, debido a su relativa inaccesibilidad a las modalidades de imágenes ópticas intravitales de alta resolución, el crecimiento del cáncer dentro del pulmón a menudo se ha considerado un proceso oculto3.
En el entorno clínico, las tecnologías de imagen como la tomografía computarizada (TC), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (IRM) permiten la visualización en lo profundo de órganos vitales intactos como el pulmón4. Sin embargo, si bien estas modalidades proporcionan excelentes vistas del órgano grueso (a menudo incluso revelando patología antes de la aparición de los síntomas clínicos), son de resolución inadecuada para detectar células tumorales diseminadas individuales a medida que avanzan a través de las primeras etapas de la metástasis. En consecuencia, en el momento en que las modalidades antes mencionadas proporcionan cualquier indicación de metástasis al pulmón, los focos metastásicos ya están bien establecidos y proliferan. Dado que el microambiente tumoral juega un papel fundamental en la progresión del cáncer y la formación de metástasis5,6, existe un gran interés en investigar los primeros pasos de la siembra metastásica in vivo. Este interés se alimenta aún más por la mayor apreciación de que las células cancerosas se diseminan incluso antes de que se detecte el tumor primario7,8 y la creciente evidencia de que sobreviven como células individuales y en un estado latente durante años o décadas antes de crecer en macrometástasis9.
Anteriormente, la obtención de imágenes del pulmón a resolución unicelular ha implicado necesariamente preparaciones ex vivo o explante10,11,12,13,limitando los análisis a puntos de tiempo únicos. Si bien estas preparaciones proporcionan información útil, no proporcionan ninguna idea de la dinámica de las células tumorales dentro del órgano conectado a un sistema circulatorio intacto.
Los recientes avances tecnológicos en imágenes han permitido la visualización intravital del pulmón intacto a resolución unicelular durante períodos de hasta 12 h14,15,16. Esto se logró en un modelo murino utilizando un protocolo que involucró ventilación mecánica, resección de la caja torácica e inmovilización pulmonar asistida por vacío. Sin embargo, a pesar de ofrecer las primeras imágenes de resolución celular única del pulmón fisiológicamente intacto, la técnica es altamente invasiva y terminal, lo que impide más sesiones de imágenes más allá del procedimiento índice. Esta limitación, por tanto, impide su aplicación al estudio de pasos metastásicos que tardan más de 12 h, como la latencia y el reinicio del crecimiento14,15,16. Además, los patrones de comportamiento celular observados utilizando este enfoque de imágenes deben interpretarse con cautela, dado que es probable que los diferenciales de presión inducidos por el vacío causen desviaciones en el flujo sanguíneo.
Para superar estas limitaciones, recientemente se desarrolló una Ventana mínimamente invasiva para imágenes de alta resolución del pulmón (WHRIL), que facilita la obtención de imágenes en serie durante un período prolongado de días a semanas, sin necesidad de ventilación mecánica17. La técnica consiste en la creación de una "caja torácica transparente" con una cavidad torácica sellada para la preservación de la función pulmonar normal. El procedimiento es bien tolerado, lo que permite que el ratón se recupere sin alteraciones significativas en la actividad y función basales. Para localizar de forma fiable exactamente la misma región pulmonar en cada sesión de imagen respectiva, se aplicó a esta ventana una técnica conocida como microcartografía18. A través de esta ventana, fue posible capturar imágenes de células a medida que llegan al lecho vascular del pulmón, cruzan el endotelio, se dividen celularmente y crecen en micrometástasis.
Aquí, el estudio presenta una descripción detallada de un protocolo quirúrgico mejorado para la implantación del WHRIL, que simplifica la cirugía al tiempo que aumenta su reproducibilidad y calidad. Si bien este protocolo fue diseñado para permitir la investigación de los procesos dinámicos subyacentes a la metástasis, la técnica puede aplicarse alternativamente a las investigaciones de numerosos procesos de biología y patología pulmonar.
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Protocol
Todos los procedimientos descritos en este protocolo se han realizado de acuerdo con las pautas y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluida la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina Albert Einstein.
1. Pasivación de ventanas
- Enjuague los marcos ópticos de las ventanas (Figura suplementaria 2) con una solución al 1% (p/v) de detergente enzimáticamente activo.
- Dentro de un frasco de vidrio, sumerja los marcos ópticos de las ventanas en una solución de hidróxido de sodio al 5% (p/v) durante 30 min a 70 °C.
- Retire y lave los marcos de las ventanas con agua desionizada.
- Dentro de un frasco de vidrio nuevo, sumerja los marcos ópticos de las ventanas en una solución de ácido cítrico al 7% (p/v) durante 10 min a 55 °C.
- Una vez más, retire y lave los marcos de las ventanas con agua desionizada.
- Repita el paso 1.2; luego, retire y lave los marcos de las ventanas con agua desionizada.
2. Preparación para la cirugía
- Realice la cirugía en una campana o gabinete de flujo laminar. Para evitar la contaminación del campo operatorio, asegure áreas distintas y separadas para la preparación, la cirugía y la recuperación, respectivamente.
- Antes de la cirugía, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un autoclave. Si se planean procedimientos posteriores, vuelva a esterilizar los instrumentos con un esterilizador de cuentas calientes. Para este procedimiento quirúrgico, se utiliza una técnica de solo puntas.
- Encienda el esterilizador de cuentas y cuentas quirúrgicas calentadas.
- Anestesiar al ratón con 5% de isoflurano en la cámara de anestesia.
- Para eliminar el vello, aplique generosamente crema depilatoria en el sitio de la incisión torácica superior izquierda. Después de no más de 20 s, limpie firmemente el cabello y la crema depilatoria con papel de seda humedecido. Repetir según sea necesario para eliminar todo el vello del sitio quirúrgico.
- Usando sutura de seda 2-0, ate un nudo en la base de un catéter de 22 G, dejando colas largas de 2 pulgadas (ver Figura 1A).
3. Cirugía de la ventana pulmonar
- Lávese las manos con jabón antiséptico.
- Antes de cada nueva cirugía, póngase guantes estériles nuevos.
- Para evitar el secado corneal y el daño a los ojos del ratón, aplique ungüento oftálmico en ambos ojos.
- Diluir 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina en 90 μL de PBS estéril, y luego inyectar por vía subcutánea para asegurar la analgesia preoperatoria.
- Intubar al ratón con el catéter de 22 G atado a sutura de seda15. Usando una bombilla de inflado, confirme la intubación exitosa observando el aumento bilateral del pecho al apretar la bombilla.
- Asegure el catéter de intubación atando la sutura de seda 2-0 alrededor del hocico del ratón (ver Figura 1B).
- Coloque el ratón en el soporte quirúrgico calentado y colóquelo en el decúbito lateral derecho para exponer el tórax izquierdo.
- Conecte el ventilador al catéter de intubación.
- Asegure una ventilación controlada y estable en el ventilador y luego reduzca el isofluorano al 3%. Al inicio del procedimiento y periódicamente durante toda la duración del procedimiento, evalúe la adecuación de la anestesia mediante la realización de una prueba de pellizco del dedo del pie.
- Usando cinta de papel, asegure craneal y caudalmente las extremidades delanteras y traseras, respectivamente, a la etapa quirúrgica calentada. Coloque otro trozo de cinta adhesiva a lo largo de la espalda del ratón para maximizar la exposición al campo quirúrgico (ver Figura 1C).
- Abra todos los instrumentos quirúrgicos debajo del capó para la preservación de la esterilidad.
- Esterilizar el sitio quirúrgico mediante una generosa aplicación de antiséptico a la piel del ratón.
- Usando fórceps, levante la piel y haga una incisión circular de ~ 10 mm, ~ 7 mm a la izquierda del esternón y ~ 7 mm superior al margen subcostal (Figura 1D).
- Identifique cuidadosamente cualquier buque importante. Si es necesaria la división de vasos, cauterizar en ambos extremos con la pluma de electrocauterización para mantener la hemostasia.
- Extirpar el tejido blando que recubre las costillas.
- Eleve la6ª o 7ª costilla usandofórceps. Usando una sola cuchilla de las tijeras de microdisección roma, el lado redondeado hacia el pulmón, perfore cuidadosamente el músculo intercostal entre las costillas6 y7 para ingresar al espacio intratorácico(Figura 1E).
- Descargue delicadamente el bote de aire comprimido en el defecto para colapsar el pulmón y separarlo de la pared torácica. Dispare el aire comprimido en ráfagas cortas para evitar lesiones pulmonares iatrogénicas.
- Coloque la punción de biopsia sobre la herramienta de corte (Figura suplementaria 1) y maniobre cuidadosamente la base de la herramienta de corte a través de la incisión intercostal (Figura 1F).
- Oriente la base de la herramienta de corte de tal manera que esté paralela a la pared torácica. Perforar un orificio circular de 5 mm a través de la caja torácica (Figura 1G).
NOTA: Asegúrese de que el tejido pulmonar expuesto sea rosado, sin signos de daño. - Usando la sutura de seda 5-0, cree una puntada de cuerda de bolso ~ 1 mm desde el agujero, circunferencialmente, entrelazada con las costillas (Figura 1H).
- Coloque el marco de la ventana de tal manera que los bordes del defecto circular se alineen dentro de la ranura de la ventana (consulte la Figura 1I).
- Bloquee de forma segura la ventana implantada atando firmemente la sutura de seda 5-0.
- Cargue 100 μL de adhesivo de gel de cianoacrilato en la jeringa de 1 ml.
- Seque el pulmón aplicando un flujo suave y constante de aire comprimido durante ~ 10-20 s(Figura 1J).
- Usando pinzas para agarrar el marco de la ventana por su borde exterior, levante suavemente para garantizar la separación del pulmón de la superficie inferior del marco de la ventana.
- Dispensar una capa delgada de adhesivo de cianoacrilato a lo largo de la superficie inferior del marco óptico de la ventana(Figura 1K).
- Aumente la presión positiva al final de la espiración (PEEP) en el ventilador para inflar el pulmón.
- Sosteniendo durante 10-20 s, aplique una presión suave pero firme para fijar el marco de la ventana óptica al tejido pulmonar (Figura 1L).
- Dispense una gota de 5 mm del adhesivo de gel de cianoacrilato restante en una funda rectangular.
- Recoge la cubierta de 5 mm con pastillas de vacío. Sumerja la superficie inferior de la cubierta en el adhesivo y luego raspe el exceso de adhesivo tres veces contra el lado de la cubierta rectangular, de modo que solo quede una capa muy delgada(Figura 1M).
- Coloque cuidadosamente la cubierta para que quepa dentro del hueco en el centro del marco de la ventana óptica y se mantenga por encima del tejido pulmonar en ángulo. Sujete brevemente el ventilador para generar presión positiva, hiperinflando el pulmón. Usando un movimiento giratorio, oriente la cubierta paralela al tejido pulmonar para crear una aposición directa entre la superficie del pulmón y la superficie inferior de la cubierta. Mantenga una presión suave, permitiendo que el adhesivo de cianoacrilato se fije (~ 25 s).
- Utilice las pinzas para separar la cubierta de las pastillas de vacío (Figura 1N).
- Usando sutura de seda 5-0, vuelva a crear una puntada de cuerda de bolso, esta vez <1 mm circunferencialmente desde el borde de corte de la incisión de la piel. Coloque cualquier exceso de piel debajo del borde exterior del marco de la ventana antes de atarlo firmemente con nudos de bloqueo.
- Para asegurar un sellado hermético entre la cubierta y el marco de la ventana, dispense una pequeña cantidad de cianoacrilato líquido en la interfaz metal-vidrio (ver Figura 1O).
- Coloque una aguja estéril en una jeringa de insulina de 1 ml. Inserte la aguja debajo de la apófisis xifoidea, avanzando hacia el hombro izquierdo, entrando en la cavidad torácica a través del diafragma. Retire suavemente la jeringa para eliminar el aire residual de la cavidad torácica (consulte la Figura 1P).
- Retire la cinta del ratón.
- Apague el isoflurano.
- Continúe la ventilación con oxígeno al 100% hasta que el ratón parezca listo para despertar.
- Corte cuidadosamente la sutura de seda 2-0 alrededor del hocico del ratón y extuba al ratón.
- Transfiera el ratón a una jaula limpia y monitoree hasta que se recupere por completo. Eutanasiar al ratón si hay signos de dificultad para respirar.
- Proporcionar analgesia postoperatoria inyectando por vía subcutánea 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina diluida en 90 μL de solución tamponada con fosfato estéril (PBS).
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Representative Results
Los pasos del procedimiento quirúrgico descritos en este protocolo se resumen e ilustran en la Figura 1. Brevemente, antes de la cirugía, los ratones son anestesiados y se elimina el vello sobre el tórax izquierdo. Los ratones son intubados y ventilados mecánicamente para permitir la supervivencia tras la ruptura de la cavidad torácica. Se extirpa el tejido blando que recubre las costillas y se crea un pequeño defecto circular, que abarca las costillas6 y7. El marco óptico de la ventana se inserta en el defecto y su lado inferior (fuera de la abertura clara) se adhiere al tejido pulmonar. El marco de la ventana se asegura con una combinación de suturas y adhesivo, volviendo a sellar la cavidad torácica y permitiendo la reanudación de la respiración normal después de la extubación. Cuando se implanta con éxito, el pulmón se adherirá a la ventana óptica (que se incorpora como parte de la pared torácica), con gradientes de presión intratorácica conservados. Esto permite una supervivencia cómoda del ratón, lo que permite obtener imágenes diarias hasta la asignación de protocolo (2 semanas). Las imágenes intravitales se pueden realizar a través de la ventana, como se describió anteriormente para otras ventanas15,19,20.
Para la visualización de varios tipos de células, estructuras biológicas o estados funcionales celulares, el procedimiento presentado aquí se puede realizar en una amplia gama de ratones que han sido manipulados genéticamente para expresar proteínas fluorescentes21 o inyectados con colorantes22. El carácter permanente de la ventana la hace compatible con técnicas de relocalización de campos de visión como la fotoconversión23,24 o la microcartografía17,18. La microcartografía es una técnica de triangulación basada en el uso de transformaciones computarizadas de coordenadas de marcas fiduciales fijas entre sesiones de imagen con el fin de predecir y relocalizar una región de interés. En la ventana creada como se describió anteriormente, estas marcas fiduciales son arañazos ligeros grabados en el marco de la ventana(Figura suplementaria 2)que son fácilmente identificables bajo el microscopio. Esto hace posible encontrar el mismo campo de visión varias veces, incluso en tejido no marcado. La Figura 2 demuestra el resultado de estas técnicas en un ratón donde la vasculatura pulmonar ha sido marcada mediante la inyección de un dextrano de alto peso molecular marcado con colorante (tetrametilrodamina 155 kD dextrano) y la misma microvasculatura relocalizada durante 3 días.
Se encontró que este dextrano es extremadamente útil en la evaluación de aberturas vasculares transitorias que se inducen durante los períodos de intravasación de células tumorales25,26,27. De hecho, se ha demostrado que, en los tumores primarios de mama, este dextrano de alto peso molecular se secuestra efectivamente a la vasculatura y no se filtra en el intersticio25. Esto contrasta con los dextrans de menor peso molecular (como 10 kD o 70 kD), que se ha demostrado que se filtran de los vasos neoangiogénicos pasivamente28,29. Mientras tanto, se ha observado que la vasculatura pulmonar sana es más resistente a las fugas, con dextrans >10 kD que solo escapan al intersticio tras el insulto al órgano, como la exposición a exosomas30 o virus31. También existe una variedad de agentes de contraste para medir otros parámetros en el pulmón (por ejemplo, marcadores nucleares, indicadores vivos / muertos, reporteros de estrés oxidativo, rastreadores de velocidad del flujo sanguíneo) además de la permeabilidad vascular. Un excelente recurso catalogándolos se puede encontrar en el protocolo de Ueki et al.22.
El WHRIL es una técnica que es muy adecuada para investigar la dinámica del flujo sanguíneo en el pulmón. Esto se puede lograr de varias maneras. Primero, cuando se toman imágenes utilizando velocidades de fotogramas relativamente lentas (~ 1-10 cuadros por segundo, fps) las velocidades del flujo sanguíneo pueden determinarse por las sombras que producen los eritrocitos no etiquetados cuando fluyen en vasos más grandes. A fps bajos, estas sombras forman líneas cuyo ángulo en relación con el vaso se puede utilizar para calcular los caudales de eritrocitos32 (Figura 2,líneas amarillas). En segundo lugar, las sombras también se pueden rastrear en microscopios de baja fps alineando los vasos con el eje de escaneo rápido del microscopio y adquiriendo kymographs utilizando escaneo de línea rápida33,34,35. Finalmente, cuando se toman imágenes a altas velocidades de fotogramas (>10 fps) en un microscopio capaz de integrar la señal a lo largo del tiempo (por ejemplo, un disco giratorio confocal equipado con un detector de dispositivo de carga acoplada (CCD)), las partículas individuales se pueden rastrear directamente16,17. En esta situación, los objetos estacionarios aparecen como puntos brillantes, y los objetos que fluyen trazan pistas a través de la circulación. Las velocidades de las celdas se pueden cuantificar midiendo la longitud de las pistas y dividiendo por el tiempo de adquisición del marco. Un ejemplo de esto se da en la Figura 3 y la Película Suplementaria 1,donde se han inyectado 2 μm de microesferas fluorescentes en el ratón antes de la obtención de imágenes.
Con la capacidad de volver repetida y consistentemente al mismo campo de visión, ahora es posible la visualización de procesos que evolucionan durante varios días. Como demostración de esta aplicación, el WHRIL se utilizó para visualizar la progresión metastásica de las células de cáncer de mama dentro de los pulmones17,21:es decir, para rastrear a lo largo del tiempo el destino de las células tumorales individuales que llegan a la vasculatura pulmonar. Este concepto se representa en la Figura 4A,donde se visualiza una sola célula tumoral diseminada poco después de alojarse en un segmento de microvasculatura pulmonar. Volver a esa misma ubicación en los días posteriores revela el destino de la célula tumoral (por ejemplo, recirculación, extravasación, etc.). Aplicado a la investigación de los pasos culminantes de la progresión metastásica en el pulmón, fue posible hacer una crónica visual de los procesos dinámicos, incluida la llegada de células tumorales(Figura 4B),la extravasación(Figura 4C)y la proliferación para formar macrometástasis(Figura 4D).
Figura 1: Resumen de la cirugía para la implantación de la Ventana para Imágenes de Alta Resolución del Pulmón (WHRIL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La microcartografía permite la relocalización de posiciones fijas dentro de la ventana óptica. La imagen intravital multifotónica de una sola región del pulmón debajo de la cubierta ópticamente transparente muestra la microvasculatura reubicada durante 3 días consecutivos utilizando microcartografía. Las flechas amarillas indican un punto de ramificación claramente definible de un solo buque identificado cada día consecutivo. Las líneas amarillas resaltan las sombras que los eritrocitos no etiquetados producen cuando fluyen en vasos más grandes. El ángulo de estas líneas en relación con el vaso se puede utilizar para calcular los caudales de eritrocitos. Rojo = células endoteliales marcadas con tdTomato y 155 kDa Tetrametilrhodamina dextrano marcado con suero sanguíneo, Verde = células tumorales marcadas con GFP, Azul = segunda generación armónica. Barra de escala = 15 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visualización del caudal sanguíneo. Las tasas de flujo sanguíneo se pueden visualizar inyectando microesferas fluorescentes de 2 μm de diámetro retroorbitalmente e imaginando su paso a través de los vasos sanguíneos. Cuando se toman imágenes en un microscopio capaz de integrar la señal a lo largo del tiempo (por ejemplo, un disco giratorio confocal equipado con un detector CCD), las microesferas estacionarias aparecen como puntos brillantes (flechas), y las esferas que fluyen trazan pistas a través de la circulación (líneas entre corchetes). Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El WHRIL puede capturar cada paso de la cascada metastásica dentro del pulmón visualizando directamente el destino de las células tumorales diseminadas. (A) El seguimiento del destino de las células tumorales diseminadas (verde) se puede lograr con imágenes en serie, durante varios días, a través del WHRIL. En el día 1, se observa que una célula tumoral ha llegado y se ha alojado en la vasculatura pulmonar. En el día 2 y el día 3 la célula ya no está presente en la vasculatura pulmonar, ya que ha recirculado o muerto. Barra de escala = 15 μm. (B-D) Visualización de cada una de las etapas de la metástasis de células tumorales en el pulmón. (B) Una célula tumoral diseminada intravascular (verde) alojada en la vasculatura pulmonar después de la llegada. (C) Célula tumoral diseminada (verde) después de extravasar en el parénquima pulmonar. (D) Células tumorales que han proliferado y crecido en micro-metástasis. Rojo = células endoteliales marcadas con tdTomato y 155 kDa Tetrametilrhodamina dextrano marcado con suero sanguíneo, Verde = células tumorales marcadas con GFP, Azul = segunda generación armónica. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película suplementaria 1: Video correspondiente a la Figura 3 que muestra la vasculatura pulmonar con microesferas circulantes de 2 μm. Haga clic aquí para descargar esta película.
Figura suplementaria 1: Dibujos de diseño mecánico para laherramienta de corte de aceroinoxidable utilizada para guiar la punción de biopsia de 5 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 2: Dibujos de diseño mecánico para el marco de la ventana de acero inoxidable. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 3: Dibujos de diseño mecánico para la herramienta de soporte de ventana. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En sitios de metástasis a distancia, como el pulmón, las imágenes ópticas de alta resolución proporcionan información sobre la dinámica elaborada de la metástasis de las células tumorales. Al permitir la visualización in vivo de células cancerosas individuales y sus interacciones con el tejido huésped, las imágenes intravitales de alta resolución han demostrado ser fundamentales para comprender los mecanismos subyacentes a la metástasis.
Aquí se describe un protocolo quirúrgico mejorado para la implantación torácica permanente de una ventana óptica diseñada para permitir la obtención de imágenes en serie del pulmón murino a través de microscopía multifotónica de alta resolución. La ventana creada con este protocolo es bien tolerada y, dada su capacidad para resellar con éxito la cavidad torácica, es capaz de mantener los gradientes de presión intratorácica necesarios para la ventilación espontánea (a diferencia de cualquier otra ventana descrita anteriormente para la obtención de imágenes del pulmón murino14,15,16,36,37 ). Esto permite que el ratón se despierte de la anestesia, respire de forma independiente y sobreviva cómodamente con la caja torácica transparente durante un período prolongado de tiempo que abarca varias semanas.
Usando esta ventana, fue posible visualizar, con resolución de una sola célula, todos los pasos de la metástasis, incluyendo la llegada, la extravasación y el crecimiento en micrometástasis.
Aunque el protocolo requiere cierta competencia técnica, con práctica y atención cuidadosa a varios pasos clave, el procedimiento se puede realizar con una alta tasa de éxito. Primero, al eliminar el vello antes de la cirugía, es fundamental proteger la piel del ratón eliminando la crema depilatoria con un tejido humedecido después de no más de 20 s de contacto. Durante la cirugía, se debe tener extrema precaución para evitar cortar los vasos. El sangrado excesivo, que se encuentra con mayor frecuencia debido a la división de las arterias braquiales o mamarias internas durante la extracción de la almohadilla de grasa mamaria, puede oscurecer la visualización en el campo quirúrgico o conducir a la muerte a través de la exsanguinación. Recientemente descrito en este protocolo es la utilización de una punción de biopsia y una herramienta de corte(Figura suplementaria 1),que aceleran y simplifican considerablemente la creación del defecto circular a través de la caja torácica, y una herramienta de soporte de ventana que facilita la implantación. La implementación de estos avances mejora significativamente la tasa de éxito del procedimiento y reduce el nivel requerido de habilidad quirúrgica previa. Los laboratorios individuales pueden usar los dibujos en las figuras suplementarias para fabricar estas herramientas con talleres de máquinas internos o comerciales. Una búsqueda en Internet de "sitios de ofertas de talleres mecánicos" producirá varias aplicaciones en línea que ayudarán a encontrar talleres de máquinas comerciales locales.
Finalmente, es crucial asegurarse de que el tejido pulmonar permanezca seco antes de la aplicación del adhesivo. El escollo más común que resulta en una fijación fallida de la cubierta es la falta de seguridad para garantizar la eliminación completa de la humedad de la superficie pulmonar antes de la aposición con el marco o el vidrio de la cubierta. Además, para garantizar imágenes de calidad, se debe aplicar una capa extremadamente delgada de pegamento (<10 μm). El exceso de pegamento debe rasparse antes de la colocación del vidrio de la cubierta.
La principal limitación de IVI a través del WHRIL es la profundidad relativamente limitada de penetración alcanzable. Por lo tanto, la patología que ocurre en lo profundo del pulmón es inaccesible. A pesar de esta limitación, la técnica aún puede arrojar una gran cantidad de información clínicamente relevante, especialmente en investigaciones oncológicas, dada la proclividad descrita para las metástasis pulmonares localizadas periféricamente38,39,40,41. En última instancia, este enfoque de imagen proporciona una ventaja considerable sobre los ensayos ex vivo estándar y otros métodos para imágenes in vivo, que desconectan el tejido de los procesos fisiológicos vitales10,11,12,13, o limitan el análisis longitudinal a una duración máxima de 12 h14,15,16,37,42, respectivamente.
Para las imágenes repetidas durante este período de tiempo, aún se deben superar varios desafíos. Primero, es importante mantener la salud de la piel alrededor de la ventana implantada, ya que, mientras el tejido herido no esté expuesto, la piel alrededor aún puede inflamarse o infectarse. La aplicación rutinaria de un ungüento antibiótico ayudará a prevenir esto. En segundo lugar, con el tiempo, el exudado de la piel cortada puede congelarse debajo del marco de la ventana e impedir la colocación de la placa fijadora utilizada para inmovilizar al ratón en la etapa de microscopio. Colocar un pañuelo húmedo sobre el WHRIL durante 10-15 minutos suavizará este exudado y permitirá la colocación del marco de la ventana. En tercer lugar, uno de los mecanismos del cuerpo para excretar el exceso de agua y mantener la homeostasis es a través de la exhalación de vapor. Por lo tanto, demasiada ingesta de líquidos (principalmente como resultado de la inyección de agentes de contraste o suspensiones de células tumorales) hará que la superficie pulmonar excrete este exceso de agua y dará como resultado que el tejido pulmonar se desprenda del WHRIL. Esto se puede evitar limitando el volumen de inyecciones a un máximo de 50 μL a la vez. Finalmente, incluso con el mejor de los cuidados, el tejido pulmonar puede desprenderse ocasionalmente del WHRIL debido a que el ratón ingiere un gran volumen de agua o debido a que el ratón se esfuerza demasiado. Cuando esto ocurre, el desprendimiento del tejido pulmonar del WHRIL generalmente ocurre lentamente, comenzando en el borde exterior. Por lo tanto, puede ser imposible seguir algunos campos de visión ubicados en el primer día de la imagen durante toda la duración de la ventana. Se encontró que los mejores resultados de imagen se obtendrán en los primeros días y que el empleo de técnicas de mosaico como la imagen intravital de alta resolución de gran volumen publicada anteriormente21 puede minimizar el impacto de esta limitación.
Dado que el WHRIL está integrado en la pared torácica del ratón, la deriva durante las imágenes generalmente no es un problema significativo, siempre y cuando se preste atención para garantizar que la fijación entre la ventana y el microscopio sea firme. Aún así, se puede observar una pequeña cantidad de deriva durante el tiempo inmediatamente posterior a la colocación del ratón en la etapa del microscopio. Esto puede provenir de la relajación del cuerpo del ratón o de la expansión térmica de los componentes del microscopio (placa de etapa, etapa XY, lente de objetivo) debido a la cámara ambiental. Esta deriva se puede evitar asignando ~ 30 minutos para el equilibrio antes de comenzar el procedimiento de imagen. Este período de tiempo permite que la fisiología del ratón se estabilice bajo la anestesia y permite que todos los componentes alcancen el equilibrio térmico. Cualquier pequeña cantidad de deriva residual puede ser manejada fácilmente por algoritmos computacionales como StackReg43 o HyperStackReg44.
Finalmente, este protocolo es una mejora con respecto a la versión escrita anterior por dos razones. En primer lugar, el formato visual permite una mejor conceptualización del protocolo quirúrgico. Esto es particularmente útil para los pasos cruciales donde 1) el pulmón se seca aplicando un flujo suave y constante de aire comprimido (paso 3.24, Figura 1J),2) el cobertor se fija al orificio central del marco de la ventana de una manera que evita el atrapamiento de burbujas (paso 3.31), y 3) se agrega una pequeña cantidad de cianoacrilato líquido en la interfaz metal-vidrio para garantizar un sello hermético entre el vidrio de la cubierta y el marco de la ventana (paso 3.34, Figura 1O).
En conclusión, con el advenimiento del WHRIL, dada su facilidad para la visualización subcelular del mismo tejido pulmonar a lo largo de un período prolongado, los investigadores están recientemente facultados para abordar muchas preguntas sin respuesta. Específicamente, el protocolo descrito en este documento permite la exploración fundamental de los procesos dinámicos subyacentes a numerosas patologías, incluida la progresión de la metástasis del cáncer.
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Disclosures
Los autores no revelan conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561 de Montefiore, METAvivor Early Career Award, el Centro de Biofotónica Gruss-Lipper y su Programa integrado de imágenes, y Jane A. y Myles P. Dempsey. Nos gustaría agradecer al Centro de Imágenes Analíticas (AIF) en la Facultad de Medicina Einstein por el apoyo de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
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