Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Automatiseret, høj-gennemløbsdetektering af bakteriel overholdelse af værtsceller

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

Påvisning af host-bakterielle patogen interaktioner baseret på fænotypisk tilslutning ved hjælp af høj-throughput fluorescens mærkning billeddannelse sammen med automatiserede statistiske analysemetoder muliggør hurtig evaluering af potentielle bakterielle interaktioner med værtsceller.

Abstract

Identifikation af nye bakteriepatogener er afgørende for menneskers sundhed og sikkerhed. Bakteriel tilslutning til værtsceller er et vigtigt skridt i bakterielle infektioner og udgør et kendetegn for potentiel trussel. Derfor kan undersøgelse af klæbeevnen af bakterier til værtsceller bruges som en komponent i bakteriel trusselsvurdering. En standardmetode til optælling af bakteriel tilslutning til værtsceller er at inkubere bakterier med værtsceller, høste klæbebakterierne, plade de høstede celler på faste medier og derefter tælle de resulterende kolonidannende enheder (CFU). Alternativt kan bakteriel overholdelse af værtsceller evalueres ved hjælp af immunofluorescence mikroskopi-baserede tilgange. De konventionelle strategier for gennemførelse af disse tilgange er imidlertid tidskrævende og ineffektive. Her beskrives en nyligt udviklet automatiseret fluorescensmikroskopibaseret billeddannelsesmetode. Når det kombineres med høj-throughput billedbehandling og statistisk analyse, metoden muliggør hurtig kvantificering af bakterier, der klæber til værtsceller. To bakteriearter, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa og Gram-positive Listeria monocytogenes og tilsvarende negative kontroller, blev testet for at demonstrere protokollen. Resultaterne viser, at denne tilgang hurtigt og præcist opregner klæbende bakterier og reducerer eksperimentelle arbejdsbelastninger og tidslinjer betydeligt.

Introduction

Bakteriel vedhæftning er en proces, hvor bakterier tillægger andre celler eller overflader. Vellykket etablering af infektion med bakterielle patogener kræver vedhæftning til værtsceller, kolonisering af væv og i nogle tilfælde invasion af værtsceller1,2,3. Nye smitsomme sygdomme udgør store trusler mod folkesundheden, som det fremgår af den seneste covid-19-pandemi4,5,6. Det er vigtigt, at nye eller nye patogener ikke umiddelbart kan skelnes ved hjælp af genomiske tilgange, især i tilfælde, hvor patogenet er blevet manipuleret til at undgå påvisning eller ikke indeholder genomiske signaturer, der identificerer det som patogent. Derfor kan identifikation af potentielle patogener ved hjælp af metoder, der direkte vurderer kendetegnende for patogenitet, som bakteriel overholdelse af værtsceller, spille en afgørende rolle i patogenidentifikation.

Bakteriel tilslutning til værtsceller er blevet brugt til at evaluere mekanismer af bakteriel patogenese i årtier1,7. Mikroskopisk billeddannelse8,9 og optælling af bakteriekolonidannende enhed (CFU)10,11,12,13 ved post-infektion plating er to veludviklede laboratoriemetoder til test af mikrobiel tilslutning og / eller infektion af værtsceller14. I betragtning af mikrometerskalastørrelsen af bakterieceller kræver optællingen af de klæbende bakterieceller generelt brug af avancerede mikroskopiteknikker med høj forstørrelse samt billeddannelsesmetoder i høj opløsning, herunder elektronmikroskopi, ekspansionsmikroskopi (ExM)15,16og tredimensionel billeddannelse17 . Alternativt kan optællingen af bakterier, der er bundet til eller internaliseret i værtsceller, udføres ved at plating fortyndingsserien af høstede bakterier på fast agar og tælle de resulterende CFO'er10,12,13. Denne metode er besværlig og indeholder mange manuelle trin, som indfører vanskeligheder med at etablere en standardiseret eller automatiseret procedure, der kræves til analyser med højoverførselshastighed 18,19. Derfor vil udviklingen af nye metoder til evaluering af vedhæftede værtsceller adressere de aktuelle begrænsninger i feltet.

En sådan metode er beskrevet her, der bruger automatiseret høj gennemløbsmikroskopi kombineret med høj gennemløbsbilledbehandling og statistisk analyse. For at demonstrere tilgangen blev der udført eksperimenter med flere bakteriepatogener, herunder Pseudomonas aeruginosa, et opportunistisk Gram-negativt bakteriepatogen hos mennesker, dyr og planter14,20, som ofte viser sig at kolonisere luftvejene hos patienter med nedsat værtsforsvarsfunktioner. Denne fremgangsmåde optimerede den mikroskopiske billedbehandlingsproces, der er beskrevet i tidligere undersøgelser14,20. Billeddannelsesdetektering blev forenklet af fluorescensmærkede værtsceller og bakterier for hurtigt at spore nærheden af dem, hvilket dramatisk reducerede mikroskopibelastningen for at få billeder i høj opløsning til at skelne bakterier. Derudover erstattede den automatiserede statistiske analyse af billeder i optælling af værtsceller og bakterier det hånd-on eksperiment med bakteriel CFU-plating for at estimere forholdet mellem klæbende bakterietal pr. Værtscelle. For at bekræfte kompatibiliteten af denne metode er der også testet flere bakteriestammer og værtscelletyper, som Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus og Klebsiella pneumoniae samt menneskelige navlestrengsveendotelceller (HUVECs), og resultaterne understøtter metodens mangfoldighed og effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. A549 cellekultur

  1. A549-cellelinjen i F-12K-medium suppleret med 10 % fosterkvægsserum (FBS) og inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2.
  2. Skift medium hver 3-4 dage og passage på 85% -95% sammenløb.
  3. Skyl kortvarigt cellerne med 1 x fosfatbufferet saltvand (PBS, pH 7.4, medmindre andet er angivet) og behandl med 1 ml 0,25 % Trypsin-0,53 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) opløsning (nedsænkning af cellelaget) i ca. 2 min. ved 37 °C.
  4. Tilføj yderligere 6 mL komplet vækstmedium (F-12K medium + 10% FBS) for at stoppe proteaseaktiviteten. Derefter plade cellerne i en steril polystyren T-75 vævskultur kolbe ved en subkultivationsforhold på 1:3-1:8. Den sidste mængde kultur er 12 mL.
  5. Seed ca 1 x 104 A549 celler (celle koncentration: ~ 1 x 105 celler / mL) på hver brønd af en 96-brønd plade en dag før tilslutning assays.

2. Bakterievækst og farvning

  1. Udfør alt bakteriearbejde i et biosikkerhedsskab, biosikkerhedsniveau 2-laboratorium.
  2. Pod alle bakteriekulturer, herunder P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes og B. subtilis osv., fra den frosne glycerolbestand og dyrk dem i Tryptic Soy Bouillon (TSB, 3 mL) i en rystende inkubator ved 37 °C natten over, der opretholdes ved 250 o/min.
  3. Den næste dag skal du bruge en 1:100 fortynding af nattens kultur til at vaccinere en subkultur og dyrke dem i TSB (1 mL) i 3 timer til den eksponentielle fase, måle OD ved 600 nm (OD600)for at bekræfte. Sørg for, at OD600 ligger i intervallet 0,4-0,6.
  4. Før du udfører bakterie-vært tilslutning assay, plade seriel fortyndinger af bakteriel suspension på TSB-agar plader, inkubere dem natten over ved 37 °C, og derefter etablere bakterielle CFC'er fra antallet af kolonier. For P. aeruginosasvarer en OD600 på 1,0 til 2 x 108 levedygtige bakterieceller/mL, og for L. monocytogenessvarer en OD600 på 1,0 til 9 x 108 levedygtige bakterieceller/mL.
  5. Høst bakteriekulturerne i eksponentiel fase ved centrifugering ved 13.000 x g i 2 min ved stuetemperatur (RT), og vask dem derefter en gang ved hjælp af 1x PBS (1 mL). Resuspend bakteriepillerne i 1 mL af 1x PBS og bestemme koncentrationerne ved at måle OD600 af bakteriel suspensioner. For eksempel repræsenterer P. aeruginosa med OD600 på 0,5 en koncentration på 1 x 108 bakterieceller /mL.
  6. Plette bakteriel suspension ved hjælp af enten en grøn eller en rød fluorescerende farvestof på RT i 30 min med blid rotation i mørke. Til dette tilsættes 2 μL af det 500 gange koncentrerede bestandsfarvningsfarvestof i 1 mL bakteriel suspension for at fortynde farvestoffet 1 gange. For at vaske farvning farvestof, centrifuge de farvede bakterier på 13.000 x g i 2 min og genbruge pellet i 1 mL af 1x PBS i tre gange.
    BEMÆRK: Hvis fluorescens- (GFP-, RFP-, mCherry-, etc.) mærkede bakterier anvendes i eksperimentet, så spring over denne bakterielle farvning trin. GFP- tagged P. aeruginosa og rød fluorescerende farvestof-farvede L. monocytogenes blev anvendt i denne protokol.
  7. Saml de farvede bakterieceller eller GFP-mærkede bakterier ved centrifugering ved 13.000 x g i 2 min. Resuspend i frisk F-12K medium (1 mL) og måle OD600 af hver kultur. Efterfølgende fortyndes kulturerne til de ønskede koncentrationer baseret på infektionens mangfoldighed (MOI) og værtscellekoncentrationen. Det endelige volumen, der anvendes i dette eksperiment, er 500 μL.
    BEMÆRK: Hvis værtscellekoncentrationen, der tælles ved hjælp af TrypanBlue-farvning, f.eks. er 1 x 10 5 celler/mL, vil den ønskede koncentration af bakterieceller ved en MOI på 100 være 1 x 107 celler/mL. Koncentration af P. aeruginosa ved 0,5 OD600 er 1 x 108/mL. For at opnå den ønskede koncentration fortyndes P. aeruginosa-kulturen 10 gange, tilsæt 50 μL resuspended kultur til 450 μL frisk F-12K medium.

3. Bakteriel tilslutning og værtscellefarvning

  1. Først vaskes de seedede A549 cellemonomer tre gange med varm 1x PBS. For hver vask tilsættes 100 μL 1x PBS til hver brønd, forsigtigt pipette op og ned tre gange, bortskaffe 1x PBS eller vente 10 s efter tilsætning og derefter støvsuge for at fjerne 1x PBS. For at bestemme kinetikken i bakterieforeningen skal cellerne overlejres med 100 μL af ønskede koncentrationer af bakterieophæng med forskellige MOI'er (0, 1, 10 og 100). Skru bakterierne ned ved 200 x g i 10 min og inkuber de inficerede A549-celler ved 37 °C, 5 % CO2 i yderligere 1 time.
    BEMÆRK: I dette eksperiment havde hver betingelse en teknisk trelicate.
  2. Fjern de ubundne bakterier ved at vaske monolayers fem gange med varm 1x PBS som beskrevet ovenfor. Tilsæt 100 μL på 4% formaldehyd (i 1x PBS) i hver brønd af de 96-brønds plader for at fastgøre cellerne. Lad pladerne sidde på is i 15 minutter og vask derefter fikseringsopløsningen af ved hjælp af 1x PBS tre gange.
  3. For at plette kernerne skal du tilføje 50 ng/mL af 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og inkubere det i 10 min på RT. Efter inkubation vaskes brøndene tre gange ved hjælp af 1x PBS. Dæk de inficerede A549-celler med 100 μL 1x PBS for at undgå tørring. Proces for det næste trin eller opbevar pladen ved 4 °C i op til 2 dage i mørke.

4. Automatiseret fluorescensbilleddannelse, behandling og analyse

  1. For at bevare dataintegriteten skal du tilfældigt og manuelt vælge fem placeringer af hver brønd for at tage billederne ved 20x forstørrelse. Fang de fluorescerende billeder af A549-celler og bakterier under henholdsvis DAPI- og GFP-kanaler. Brug PE-Cy5 kanal for bakterier farves af den røde fluorescerende farvestof.
  2. Hvis du vil have en bedre opløsning, skal du behandle alle billederne til udfladning og dekonvolution af baggrunden. Indstil parametrene som 68 μm diameter af rullebolden til udjævning og auto-måle punkt spredning funktion (PSF) af billedet deconvolution baseret på målet.
  3. For at tælle alle kvalificerede celler og bakterier skal du måle fluorescensintensiteten af værtscellerne og bakterierne og indstille værtscellernes og bakteriernes svageste fluorescensintensitet som tærskler for celletælling. Tæl alle bakterier, der er mellem en værtscelle inden for 15 μm afstand, da klæbebakterierne som diameteren af A549-cellen er 10,59-14,93 μm21.
    BEMÆRK: En standardindstilling i billeddannelsessystemet tæller selektivt værtscellerne med diametre fra 5-100 μm og bakterier fra 0,2-5 μm i størrelse (bredde og længde).
  4. Baseret på de ovennævnte manuelle billedbehandlingsresultater skal du anvende parametrene for billedudjævning, dekonvolution, objektstørrelser, afstand og fluorescensintensiteter på resten af de automatiserede billeder. Efter den automatiserede analyse skal du overveje kritiske udlæsninger, såsom samlede antal værtsceller, cellestørrelser og former, samlede bakterietal og det gennemsnitlige bakterietal pr. værtscelle, som var den vigtigste indikator, for at bestemme bakteriel overholdelse.
  5. Dataeksport og statistisk analyse
    1. Eksporter de analyserede resultater fra alle billeder til et regneark (f.eks. 'xlsx'-format). Det automatiserede system genererer to sæt resultater: 1) det gennemsnitlige klæbende bakterietal fra hvert billede; 2) de informative data for hver enkelt værtscelle, såsom klæbende bakteriel tælle på en enkelt celle, værtsstørrelse, og den gennemsnitlige fluorescens intensitet af værtscelle og bakterier, fra det tilsvarende billede.
    2. Beregn det gennemsnitlige antal og standardafvigelsen af klæbende bakterietal fra alle billeder for at repræsentere bakterielthedsniveauet sammenlignet med negative kontroller. I denne metode fungerede E. coli og B. subtilis som negativ kontrol ved test af henholdsvis Gram-negativ og Gram-positiv bakteriel tilslutning. Udfør tovejs ANOVAs for at teste for betydelig variation mellem datapunkter på tværs af behandling for tre uafhængige eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at udvikle fluorescens imaging-baserede bakteriel tilslutning assay, P. aeruginosa stamme PAO1 og dens negative tilslutning modstykke E. coli blev brugt til at teste protokollen effektivitet, som tilslutning af disse bakterier til A549 celler var blevet rapporteret14,20,22. For det første blev GFP- mærket P. aeruginosa (PAO1) og GFP-mærket E. coli inkuberet sammen med en human udødeliggjort epitelcellelinje A549 ved henholdsvis forskellige MOI'er. Resultaterne viste, at PAO1 overholdt A549-celler på en dosisafhængig måde (figur 1A,B); i mellemtiden blev der også bekræftet næsten nul-tilslutning af E. coli (figur 1A,B). Der blev taget og analyseret 50 billeder ved hver moi. Tovejs-ANOVAs blev udført for at teste de betydelige variationer fra tre uafhængige eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: Gram-negativ bakteriel P. aeruginosa klæbede til A549-celler inden for 1 time efter co-inkubation. (A) Mikroskopiske billeder for en oversigt over bakteriel tilslutning, hvor billederne blev taget ved hjælp af 20x forstørrelse. PAO1 og den negative tilslutningskontrol E. coli klæbede til A549-celler ved den angivne mangfoldighed af infektioner (MOI'er). Bakterier var GFP-fluorescens mærket. A549 cellekerner blev plettet af DAPI. Skalastangen er 50 μm. (B) Kvantificering af klæbende bakterietal pr. A549-celle. For hver testet bakteriestamme (PAO1 og E. coli)i hver MOI blev der anvendt i alt 50 billeder på analysen ved hver tilstand. Data er gennemsnitlige ± standardafvigelse (SD) fra en repræsentant for tre uafhængige eksperimenter. Den tovejs ANOVA statistiske analyse blev udført. * p < 0,05, *** p < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Lignende resultater blev også observeret, da Gram-positive bakterier, L. monocytogens23,24 og dens negative kontrol B. subtilis, blev anvendt ( Figur2A,B). Tilslutningen til A549-celler var signifikant i L. monocytogenes end B. subtilis (Figur 2A,B).

Figure 2
Figur 2: Grampositive bakteriel L. monocytogenes klæbede til A549-celler inden for 1 time efter co-inkubation. (A) Mikroskopiske billeder til en oversigt over L. monocytogenes, samt den negative kontrol B. subtilis tilslutning til A549 celler på forskellige MOI'er. Bakterier blev plettet ved hjælp af en rød-fluorescerende farvestof. A549 cellekerner blev plettet med DAPI. Skalastangen er 50 μm. (B) Kvantificering af klæbende bakterietal pr. A549-celle. For hver testet bakteriestamme (L. monocytogenes og B. subtilis) i hver MOI blev der anvendt i alt 50 billeder på analysen ved hver tilstand. Data er ± SD fra en repræsentant for tre uafhængige eksperimenter. Den tovejs ANOVA statistiske analyse blev udført. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Et repræsentativt billede af værts-tilhænger P. aeruginosa segmentering og tæller er vist i figur 3 (Gule masker: udvalgte bakterier, rød kontur: enkelt bakteriel tæller). Indstillingerne for både værts- og bakteriemål er beskrevet i afsnittet Protokol.

Figure 3
Figur 3: Eksempelbilleder af bakteriel segmentering og optælling i den automatiserede analyseproces. (A) Mikroskopiske billeder af P. aeruginosa klæbede til A549 ved en MOI på 100 uden bakteriel segmentering og optælling. (B) Det samme billede efter den statistiske analyse af bakteriel segmentering og optælling. Gule masker: udvalgte bakterier, rød kontur: enkelt bakterietal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Resultaterne af de automatiserede analyser, herunder værtscellestørrelser og -områder, bakterie- og værtscelletal samt de gennemsnitlige bakterietal pr. værtscelle, der repræsenterer status for værtscellesundhed, bakterietilholdningsniveau og bakteriel cytotoksicitet, er angivet i tabel 1 og tabel 2. Tabel 1 repræsenterer de klæbende bakterietal på et gennemsnitligt celleniveau fra forskellige billeder, mens tabel 2 repræsenterer klæbende bakterietal, der analyseres på et billede på et enkelt A549-celleniveau. Disse repræsentative billeder blev taget fra A549 celler inficeret med PAO1 på en MOI på 100. De analyserede resultater af det oprindelige billede i figur 3 blev angivet som Billede 1 i tabel 1 og tabel 2.

Tabel 1: Statistiske analyseresultater af 9 repræsentative billeder på celleniveau. Klik her for at downloade denne tabel.

I hvert billede repræsenterer antallet af værtsummer og bakterielle sumpunkter de samlede antal værtskerner og de samlede bakterietal, der genkendes af systemet, baseret på de parametre, der er beskrevet ovenfor. Derudover repræsenterer den automatiserede beregning af bakteriepletter forholdet den gennemsnitlige bakterielle antal pr værtscelle, der stammer fra bakterier sum pletter / vært sum tæller. Desuden kan yderligere aflæsninger også medtages; for eksempel illustrerer de bakterietilfredse værtstællinger det universelle eller specifikke fænomen med værtsbakteriertilhold. Når de bakterie-klæbende vært tæller er meget mindre end vært sum tæller, i modsætning hertil, den gennemsnitlige bakterielle tal pr vært er relativt høj, hvilket repræsenterer, at en sådan overholdelse fænotype har en betydelig heterogenitet.

Tabel 2: Enkelt cellulær statistisk analyse af et repræsentativt billede. Klik her for at downloade denne tabel.

Ental celleanalyse giver flere detaljer om værtscelle og bakterielle mål i hvert billede, hvilket er mere nyttigt, når man samler andre bakterielle funktioner og anvender dem til den automatiserede beregningsanalyse for at udvikle et mere kraftfuldt værktøj til evaluering af den potentielle bakterielle patogenitet, som en Machine Learning-model, der studeres. I denne protokol repræsenterer værtsstørrelse og -område diametre og områder for hver farvet værtskerner, og værtslyscensintensiteten repræsenterer den gennemsnitlige intensitet af de farvede kerner. Bakteriel spot tæller og område repræsenterer klæbende bakterielle mål til hver værtscelle og deres samlede områder. Bakteriel fluorescensintensitet repræsenterer den gennemsnitlige intensitet af alle klæbende bakterier.

Det er ikke overraskende, at nogle ondartede bakterier ikke klæber til A549, mens nogle bakterier med høje niveauer af bakteriel tilslutning ikke nødvendigvis korrelerer med patogenitet. En anden værtscelletype, HUVECs, blev også testet for at maksimere anvendelsen af denne metode. Resultaterne viste den effektive påvisning og de forskellige fænotyper af bakterier (Figur 4). Forskellige værtsceller kan øge vurderingen af potentielle bakterielle patogener; for eksempel var patogene Serratia rubidaea og Streptococcus agalactiae klæbende til HUVEC, men ikke til A549-celler (Figur 4). Desuden var den cytotoksiske Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) ikke tilhænger af hverken A549 eller HUVEC (figur 4). Derfor er det afgørende at sikre, at metoden er egnet til flere værtscelletyper til at reagere på specificiteten af værtsbakterier interaktioner. Både A549- og HUVEC-celler blev inkuberet sammen med bakterier ved en MOI på 100 ved 37 °C i 1 time.

Figure 4
Figur 4: Specificiteten af bakteriel tilslutning til værtscellerne A549 og HUVEC. De bakteriestammer, herunder S. rubidaea, S. agalactiae, cytotoksisk enterohemorrhagic E. coli (EHEC), PAO1 ,P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP),E. coli, S. aureus og S. aureus ΔsaeR, blev testet på både A549- og HUVEC-celler ved en MOI på 100 for 1 h co-inkubation ved 37 °C, 5 % CO2. Bakterier blev plettet med et rødt fluorescerende farvestof. Klæbende bakterietal blev kvantificeret fra 45 billeder / bakteriestamme i tre uafhængige eksperimenter. Data er ± SD fra en repræsentant for tre uafhængige eksperimenter. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p<0.0001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskriver en automatiseret tilgang til optælling af bakteriel vedhæftet fil til værtsceller. Den beskrevne tilgang har flere attraktive fordele i forhold til konventionelle metoder. For det første muliggør denne tilgang en præcis kvantificering af antallet af mikrobielle patogenceller, der er fastgjort til individuelle værtsceller. Det er vigtigt, at denne kvantificering kan udføres uden behov for besværlig bakteriehøst, serielle fortyndinger, plating på faste medier og bestemmelse af CFUs10,11,12. Som sådan reducerer den beskrevne teknik den samlede arbejdsbyrde, der kræves for at kvantificere bakteriel overholdelse. Det bør erkendes, at fordelene ved den foreslåede tilgang forstærkes, når man søger at påvise overholdelsesfænotyper i store screeningseksperimenter, herunder identifikation af bakterie- eller værtsgener i henholdsvis mutant- eller CRISPR-biblioteker, der regulerer denne proces. For det andet giver den direkte evaluering af interaktioner mellem værts- og bakterieceller ved hjælp af fluorescensmikroskopi oplysninger til belysende mekanismer for bakteriel patogenitet, herunder ændringer i en værts- eller bakteriecelleoverlevelse, morfologi eller dynamik. Endelig giver den automatiserede statistiske analyse, der udføres på billeder indsamlet i analysen, ikke kun en samlet kvantificering af den gennemsnitlige bakterielle tilknytning til værtsceller, men muliggør også evaluering af dynamiske, encellede værtspatogeninteraktioner.

På trods af disse fordele har de beskrevne metoder nogle vigtige begrænsninger. For det første er fluorescens farvning af bakterier påkrævet for at opregne deres tilslutning til værtsceller. Således skal det fluorescerende farvningsfarvestof selektivt plette bakterier end deres værtscellemodparter. Derudover må farvningsfarven ikke ændre fastgørelsesfænotypen af de bakterier, der bærer den. Derfor skal optimeringen af bakteriel fluorescensfarvning (f.eks. koncentration, farvningsvarighed) bestemmes forud for udførelsen af de beskrevne tilslutningsundersøgelser. I denne protokol påvirker fluorescerende farvning af bakteriestammer, herunder P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli og B. subtilis i 30 min, ikke deres tilslutning til værtsceller. For det andet, på grund af specificiteten af forskellige værtsbakterier interaktioner, en enkelt værtscelletype kan ikke være tilstrækkelig til at evaluere bakteriel tilknytning til værtsceller. Derfor kan flere værtscelletyper være nødvendige for at få en fuldstændig forståelse af, i hvilken grad en given mikrobe kan klæbe til værtscelleoverflader. For det tredje var bakteriesegmenteringen ikke fuldt ud effektiv, når bakterier fremdriver sammenlægningen under co-inkubationen, f.eks. S. aureus, eller når bakterier dannede klumper ved en højere MOI (>100), f.eks. I dette tilfælde skal der anvendes en højere forstørrelse til at fange billederne, eller flere billeder skal anvendes i analysen for at reducere effekten af bakteriel aggregering.

Humane lungeepelceller (A549) og HUVECs blev anvendt i undersøgelserne for at demonstrere metodens plasticitet med hensyn til værtscelletype, og begge udviste høje niveauer af modtagelighed for bakteriel overholdelse. Brugen af to værtscelletyper viste også, at den beskrevne metode kunne anvendes bredt til at karakterisere klæbende værtsbakterieinteraktioner hurtigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Dr. Kaite Zlotkowski af Biotek Inc. for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Forsvarsministeriet under kontraktnummer W911NF1920013 til PdF, Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) og Indenrigsministeriet i henhold til kontrakt nr. 140D6319C0029 til PdF. Oplysningernes indhold afspejler ikke nødvendigvis regeringens holdning eller politik, og der bør ikke udledes nogen officiel godkendelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Tags

Immunologi og infektion udgave 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Automatiseret, høj-gennemløbsdetektering af bakteriel overholdelse af værtsceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter