Summary
نحن نصف تقنية نقل عابرة سريعة في مراحل النمو المختلفة من Echinococcus granulosus باستخدام الجيل الثالث من ناقلات lentivirus.
Abstract
داء المشوكات الكيسي أو مرض الهيداتيد هو واحد من أهم الأمراض الطفيلية الحيوانية المنشأ التي تسببها المشوكات الحبيبية ، وهي دودة شريطية صغيرة تؤوي في أمعاء الأنياب. هناك حاجة ملحة للبحوث الجينية التطبيقية لفهم آليات التسبب في الأمراض ومكافحة الأمراض والوقاية منها. ومع ذلك ، فإن عدم وجود نظام فعال لتقييم الجينات يعوق التفسير المباشر للوراثة الوظيفية لطفيليات cestode ، بما في ذلك أنواع Echinococcus . توضح هذه الدراسة إمكانات النقل الجيني العابر للفيروسات الخيطية في الأشكال الميتاسيستولية والقوية . تم عزل البروتوسكوليسيس (PSCs) من الخراجات الهيداتية ونقلها إلى وسائط استزراع ثنائية الطور محددة لتتطور إلى ديدان قوية. تم نقل الديدان مع الجيل الثالث من فيروس lentivirus الذي تم حصاده ، إلى جانب خلايا HEK293T كعنصر تحكم في عملية النقل. تم الكشف عن تألق واضح في الديدان القوية على مدار 24 ساعة و 48 ساعة ، مما يشير إلى انتقال فيروسي عابر في E. granulosus. يقدم هذا العمل المحاولة الأولى للنقل العابر القائم على فيروس lentivirus في الديدان الشريطية ويوضح النتائج الواعدة ذات الآثار المحتملة في الدراسات التجريبية على بيولوجيا الدودة المسطحة.
Introduction
داء المشوكات الكيسي (CE) هو واحد من أهم أمراض الديدان الطفيلية التي تسببها المشوكات الحبيبية ، وهي دودة شريطية صغيرة داخل عائلة Taeniidae 1,2. وقد أجريت دراسات مستفيضة عن التشخيص المناعي وتطوير اللقاحات للإشعاع الحبيبي. ومع ذلك ، فإن المعرفة غير الكافية حول الأساس الجزيئي لبيولوجيا الطفيليات تشكل قيودا كبيرة في تشخيص وإدارة والوقاية من مرض hydatid 3,4,5,6.
في السنوات الأخيرة ، بسبب تطور تسلسل الجينوم وطرق النسخ ، تم إجراء مجموعة واسعة من الدراسات الجزيئية على الديدان المسطحة من قبل العديد من المجموعات البحثية7،8،9. ومع ذلك ، في عالم الطفيليات ، لا يزال التقدم في تكنولوجيا نقل الجينات في الديدان المسطحة الطفيلية محدودا مقارنة بطرق النقل العابرة القابلة للتكرار للغاية والتي تم تطويرها لبعض البروتوزوا10،11،12.
وقد برز استخدام أنظمة التوصيل الفيروسي كأداة أساسية لتوصيل الجينات المحورة وتحقيقات الجينات / البروتين على مدى العقدين الماضيين13. يصيب فيروس Lentivirus كلا من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة ، مما يجعل من الممكن إصابة الخلايا ما بعد الانقسام14،15،16. تشير الأدلة الحديثة إلى أن استخدام نظام نقل قائم على فيروس lentivirus في خلايا الثدييات يوفر القدرة على التغلب على معظم القيود المفروضة على تقنيات الضربة القاضية / الضربة القاضية السابقة. تم وصف تصميم وبناء ناقلات التعبير lentiviral مع علامات جزيئية مناسبة ، مثل تعبير GFP ، سابقا16. لذلك ، نقوم بتقييم النقل العابر للفيروسات اللينتيفيروسية لجين مراسل GFP في البروتوسكوليسيس والديدان القوية من E. granulosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني لتطوير البحوث الطبية ولجنة مراجعة أخلاقيات البحث العلمي ، رقم 958680. تصنف فيروسات Lentiviruses على أنها كائنات BSL-2. وبالتالي ، تم تنفيذ جميع إجراءات الزراعة المختبرية في هذا البروتوكول باستخدام ممارسات مختبرية معقمة وأجريت تحت غطاء تدفق صفائحي وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة. يوضح الشكل 1 عرضا تخطيطيا لبروتوكول الدراسة لمختلف مراحل E. granulosus.
1. جمع الخراجات hydatid
- جمع الخراجات الكبدية من الأغنام المصابة بشكل طبيعي والتي يتم ذبحها بشكل روتيني في مسلخ.
- قم بتعقيم سطح الكيس بالكامل باستخدام شاش معقم وكحول بنسبة 70٪ قبل شفط البروتوسكوليتس (PSCs).
- شفط 20-50 مل من السائل الهيداتي إلى أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 مل.
- بعد التصريف ، قم بمسح الكيس بشفرة حادة ، ونقل الطبقة الجرثومية إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل ، وهزه لفترة قصيرة (~ 2 دقيقة) لزيادة جمع PSCs. انقل الطبقة الجرثومية إلى أنبوب جديد 1.5 مل للتوصيف الجزيئي.
- اغسل PSCs 3-5x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- راقب PSCs في 0.1٪ eosin لمدة 5 دقائق لتحديد صلاحية PSC تحت المجهر الضوئي. استخدم PSCs مع قابلية جدوى بنسبة 95٪ على الأقل للثقافة.
- عالج راسب PSC ب 2 مل من البيبسين (2 مجم / مل ، درجة الحموضة 2) لمدة 15-20 دقيقة.
- لعزل PSCs الفردية ، أعد تعليق رواسب PSC في PBS ومررها عبر طبقتين من الشاش المعقم في أنبوب مخروطي جديد معقم سعة 50 مل.
ملاحظة: احسب متوسط ثلاث عمليات تعداد على 50 ميكرولتر من رواسب PSC باستخدام مجهر ضوئي. بالنسبة للتجارب اللاحقة، استخدم القيمة المقدرة لتحديد PSCs/μL. يجب أن يتميز كل عزل كيس هيداتيد بناء على تعدد أشكال النيوكليوتيدات بالطرق الجزيئية ، مثل تسلسل PCR17 أو تحليل منحنى الانصهار عالي الدقة18.
2. زراعة ثنائية الطور من PSCs من E. حبيبي للحصول على الديدان البالغة
ملاحظة: يجب استزراع PSCs المعزولة في ظروف معقمة تحت خزانة تدفق صفحية من الفئة الثانية. تحضير المراحل الصلبة والسائلة لوسط الاستزراع ثنائي الطور بشكل منفصل قبل الانتقال إلى الخطوات التالية19.
- تحضير وسط الثقافة ثنائي الطور ليتكون من مرحلتين.
- بالنسبة للمرحلة الصلبة ، أضف 10 مل من مصل البقر إلى قارورة سعة 25 مل واتركها لتتخثر عند 76 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
- بالنسبة للمرحلة السائلة (CMRL المعدلة) ، امزج 100 مل من مصل العجل الجنيني المعطل حراريا (FCS) ، و 36 مل من مستخلص الخميرة بنسبة 5٪ ، و 5.6 مل من الجلوكوز بنسبة 30٪ (في الماء المقطر) ، و 1.4 مل من صفراء الكلاب بنسبة 5٪ في PBS ، ومخزن مؤقت HEPES 20 mM ، و 10 mM NaHCO3 في 260 مل من CMRL-1066 متوسط. وأخيرا، أضف البنسلين (100 وحدة دولية/مل) والستربتومايسين (100 ملغم/مل) إلى الخليط.
- أضف 10 مل من وسط الطور السائل إلى كل قارورة ثقافة25 سم 2 .
- أضف ~ 5000 PSCs إلى قارورة الثقافة وانقل القارورة إلى حاضنة CO 2 (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
- بعد 24-48 ساعة ، انقل PSCs إلى قارورة جديدة ذات طور صلب (مصل البقر) وأضف 1 مل من نفس وسط الطور السائل الطازج لكل قارورة. انقل القوارير إلى حاضنة CO 2 (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
- كل 5-7 أيام ، استبدل الوسط بوسط طور سائل طازج بناء على التغيرات في لون وسط الاستزراع والنسبة المقدرة ل PSCs المتباينة.
ملاحظة: تستجيب البروتوسكوليتس بسرعة للتغيرات البيئية بعد استزراعها ، ومعظمها يخضع للتمايز في غضون 2-3 أسابيع. بسبب استهلاك العناصر الغذائية ونمو وتطور البروتوسكوليتس ، يتغير الرقم الهيدروجيني لوسط الثقافة ، ويتحول لونه نحو البرتقالي والأصفر.
3. زراعة أحادية اللون من PSCs من E. حبيبي
- تأكد من أن الزراعة أحادية الطور تتم قبل 24-48 ساعة من النقل.
- الثقافة ~ 5000 PSCs في قارورة ثقافة 25 سم2 مع RPMI و 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS).
- انقل القوارير إلى حاضنة CO 2 (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) حتى الاستخدام.
4. زراعة الخلايا لإنتاج الفيروس وإعداده
ملاحظة: تم الحصول على خلايا الكلى الجنينية البشرية 293T (HEK293T) لإنتاج النواقل من مركز أبحاث علم الأمراض والخلايا الجذعية بجامعة كرمان للعلوم الطبية.
- انقل 5 × 10 5 خلايا HEK293T إلى قارورة25 سم 2 تحتوي على5 مل من DMEM مع 10٪ FBS و 100 U / mL البنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين.
- احتضان خلايا HEK293T عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ومرورها في وسط الثقافة الكامل كل 48 ساعة. أخيرا ، استخدم خلايا HEK293T منخفضة المرور لنقل20.
5. إنتاج وتحضير الفيروس مع الجيل الثالث من ناقلات الفيروسات اللينية
ملاحظة: تم استخدام ناقل الفيروس lentivirus pCDH513b (ناقل النقل) و PLPII و PLPI و PMD2G (ناقلات المساعدة) للتعبير عن جين مراسل GFP. انظر جدول المواد والشكل التكميلي S1.
- اليوم 1:
- بعد التربسين خلايا HEK293T21 في لوحات زراعة 6 آبار ، البذور 7 × 104 خلايا لكل بئر مع DMEM طازج خال من المضادات الحيوية يحتوي على 10٪ FBS.
- استخدم الخلايا عند التقاء 50٪ -60٪ للنقل بطريقة فوسفات الكالسيوم.
- اليوم 2:
- استبدل وسط زراعة الخلايا قبل 2-3 ساعات من التجربة ب DMEM طازج خال من المضادات الحيوية يحتوي على 2٪ FBS.
- في أنبوب 1.5 مل ، امزج الجيل الثالث من البلازميدات الفيروسية ، بما في ذلك 7 ميكروغرام / ميكرولتر pCDH513b (ناقل النقل) ، و 4 ميكروغرام / ميكرولتر PLPII ، و 4 ميكروغرام / ميكرولتر PLPI ، و 2 ميكروغرام / ميكرولتر PMD2G (ناقلات مساعدة).
- أضف المخزن المؤقت HEPES (0.28 M NaCl و 0.05 M HEPES و 1.5 mM Na2HPO4 ؛ نطاق الأس الهيدروجيني الأمثل ، 7.00-7.28) إلى الخليط إلى حجم 422 ميكرولتر.
- أضف 16 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) بنسبة 1٪ إلى الخليط.
- أضف 62 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم 2.5 مللي متر إلى الأنابيب واخلطها جيدا.
- أضف 500 ميكرولتر من 2x محلول ملحي مخزن مؤقتا ب HEPES (HBS) إلى الخليط ، قطرة قطرة ، في غضون 1-2 دقيقة باستخدام ماصة باستور. اخلطي بلطف حتى يتم الحصول على محلول شبه معتم ، واحتضني الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أضف الخليط إلى كل طبق ببطء ووزعه بحركات دائرية بطيئة.
- احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 واستبدل الوسط بعد 4-6 ساعات ب DMEM خال من المضادات الحيوية يحتوي على 10٪ FBS.
- اليوم 3:
- تأكد من نجاح النقل العابر وصلاحية الخلية باستخدام مجهر فلوري مقلوب.
- اليوم 4:
- حصاد الفيروسات من وسط الاستزراع عن طريق جمع السوبرناتانت في كل بئر وتخزينها في -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تركيز فيروسات lentivirus المحصودة ومعايرتها من أجل النقل الدقيق22.
- حصاد الفيروسات من وسط الاستزراع عن طريق جمع السوبرناتانت في كل بئر وتخزينها في -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
6. نقل عابر لمراحل مختلفة من E. granulosus مع الفيروس
- اليوم 1:
- استخدم لوحة زراعة من 12 بئرا لنقل الجينات. الثقافة 5 × 103-5 × 104 خلايا HEK293T في ثلاث خلايا ، مع وسيط DMEM كامل كمرجع داخلي.
- استمع إلى 150 PSCs جديدة بمعدل ثلاثة أضعاف في RPMI و 10٪ FBS.
- ثقافة 30 الديدان القوية، ثلاثية في DMEM تحتوي على 10٪ FBS معطل حراريا.
ملاحظة: يجب أن تكون جميع وسائط النقل خالية من المضادات الحيوية. احتفظ بثلاثة آبار تحكم غير معالجة لخلايا HEK293T و PSCs والديدان القوية في هذه العملية. - تحضير خليط من 1 × 106 فيروسات مع كاشف نقل 4 ميكروغرام / مل (انظر جدول المواد) لنقل خلايا HEK293T ومراحل مختلفة من الدودة.
- أضف الخليط إلى كل طبق ببطء ووزعه بحركات دائرية بطيئة. احتضن الألواح لمدة 4-6 ساعات في حاضنة CO 2 (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2). استبدل الوسط لكل عينة بنفس الوسط الاستزراعي الكامل لتقليل الآثار السامة لكاشف النقل.
- اليوم 2:
- كرر الخطوات 6.1.4-6.1.5 لزيادة كفاءة النقل العابر لخلايا HEK293T وPSCs والديدان القوية.
- احتضان جميع اللوحات لمدة 24-48 ساعة في حاضنة CO2 بنفس ظروف الثقافة بناء على نوع وسائط الخلية.
- اليوم 3:
- تحقق مما إذا كان النقل ناجحا باستخدام المجهر الفلوري.
ملاحظة: فكر في استخدام المزيد من المقايسات التأكيدية مثل PCR / qPCR20,23 أو تقنيات النشاف الغربية 24 في إجراء نقل الجينات.
- تحقق مما إذا كان النقل ناجحا باستخدام المجهر الفلوري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، نصف تقنية نقل عابرة سريعة وفعالة في E. granulosus باستخدام الجيل الثالث من ناقلات lentivirus. لقد قمنا بزراعة PSCs في وسط استزراع ثنائي الطور للحصول على ديدان قوية ، كما هو موضح سابقا25,26. تتطور البروتوسكوليتس إلى ديدان قوية بعد 6 أسابيع في المختبر. لوحظت مراحل مختلفة من E. granulosus في وسط الاستزراع ثنائي الطور ، بما في ذلك PSCs الغازية (الشكل 2A) ، و PSCs المراوغة (الشكل 2B) ، والديدان القوية مع تكوين البروجلوتيد الأول والثالث (الشكل 2C-E). تم نقل البروتوسكوليكس والديدان القوية التي تم الحصول عليها من الثقافات أحادية الطور وثنائية الطور ، على التوالي ، باستخدام فيروسات lentivirus المعبرة عن GFP (الشكل 3). لتجنب تأثيرات التألق الذاتي ، تمت مقارنة الملاحظات المجهرية مع التألق الخلفي في جميع مجموعات العينات الثلاث ، واعتبرت جميع العينات فوق مستوى الخلفية هذا منقولة.
قمنا بتعديل إضاءة الحقل وخفضنا الغالق لمنع أي انبعاث محتمل للتألق الذاتي في عينات التحكم لكل علاج. ثم فحصنا العينات المعالجة بالنواقل الفيروسية اللينتيفيروسية، حيث اعتبر انبعاث الضوء الأخضر ضد حقل أسود انتقالا عابرا فعالا. خلايا HEK293T - التحكم في عملية النقل العابرة - تعبر بوضوح عن GFP (الشكل 3D). عبرت الديدان البالغة عن GFP بشكل أكثر وضوحا في الطبقة التيغومنتالية (الشكل 3F) ؛ ومع ذلك ، أظهرت PSCs مستوى أقل إلى حد ما من التعبير GFP بعد 48 ساعة. تسببت بعض بقايا سائل الكيس و / أو حطام الطبقة الجرثومية حول PSCs في بعض التألق في الخلفية في العينات المنقولة. زادت شدة التألق في خلايا HEK293T والديدان القوية بعد 24 ساعة و 48 ساعة (لوحظت تغييرات طفيفة في PSCs).
الشكل 1: عرض تخطيطي لبروتوكول الدراسة. اختصار: PSCs = protoscoleces. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المراحل المختلفة للمكورات الحبيبية في وسط الثقافة ثنائي الطور. (أ) PSCs الغازية ، (B) PSCs المخربة ، (C ، D) الديدان في عملية الستروبليون ، (E) الديدان القوية مع تكوين proglottid الثالث ، (F) الديدان في مراحل مختلفة من الستروب في وسط الاستزراع. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النقل العابر لمراحل مختلفة من المكورات الحبيبية وخط خلية التحكم في المجهر الضوئي والتألق . (A,D) HEK293T الخلايا كتحكم في عملية التوصيل، (B، E) protoscoleces، و (C، F) الديدان القوية. (ز، ح، ط) مجهر الضوء والإزهار المختلط. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر و 100 ميكرومتر و 500 ميكرومتر .
الشكل التكميلي S1: خريطة PCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA استنساخ وناقلات التعبير. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن فهم الأساس الجزيئي للديدان الخيطية وبيولوجيا Platyhelminthes أمر بالغ الأهمية لفهم إمراض الطفيليات الحيوانية المنشأ27. يعد عدم وجود نظام فعال لتقييم الجينات عقبة رئيسية أمام التفسير المباشر لعلم الوراثة الوظيفي لطفيليات cestode ، بما في ذلك أنواع Echinococcus 12,27. توضح هذه الدراسة الإمكانات الممتازة للفيروس lentivirus في النقل العابر E. granulosus.
يجمع النقل الفيروسي Lentiviral بين بساطة الاستخدام وسرعة النقل العابر مع التعبير القوي عن خطوط الخلايا المستقرة لتوصيل الجينات المحورة إلى خلايا الثدييات28. وكان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو توضيح عملية نقل النواقل الفيروسية اللينتيفيروسية، والتي ستكون حاسمة في أبحاث داء المشوكات في المستقبل.
يجب الإشارة إلى نقاط حرجة محددة في هذا البروتوكول. يجب مراعاة ظروف سير العمل المعقمة الصارمة بسبب إغفال المضادات الحيوية في وسط الثقافة ، والتي بدونها يمكن توقع التلوث البكتيري والفطري بعد 24 ساعة. يقلل التلوث الميكروبي من حركية الطفيليات وقدرتها على البقاء ، وسيتم فقدان كل من العينات المنقولة والضابطة بعد 72 ساعة.
اختيار المراحل المناسبة في دورة حياة Platyhelminthes وظروف الثقافة المناسبة هي المفتاح لنجاح نقل الجينات12,27. لقد اختبرنا طريقة النقل الفيروسي اللئيم لدينا في المراحل الفوقية والقوية. أظهرت النتائج أن الديدان القوية كانت أكثر استجابة للنقل العابر للجين من PSCs ، والتي قد تكون نتيجة للبنية التيجومنتالية الواسعة في الأشكال القوية. ومع ذلك ، نظرا لطبيعة النقل الفيروسي اللئيم ، فإن شدة التألق في PSCs متعددة الخلايا والديدان القوية، عادة ما تكون أقل بكثير مما هي عليه في خلايا HEK293T أحادية الطبقة26.
منذ فترة طويلة نوقشت إمكانية استخدام المشوكات كنموذج جديد في الديدان المسطحة لدراسة الظواهر البيولوجية. لذلك ، يمكن أن يكون الفهم الأفضل لبيولوجيا المشوكات ككائن حي نموذجي مفيدا لتوسيع أبحاث الخلايا الجذعية وتنظيم التعبير الجيني والبيولوجيا التطورية للديدان الطفيلية الأخرى8،29،30،31،32. هناك حاجة ملحة لإجراء بحوث وراثية تطبيقية على المستويين الجينومي والنسخي للمكورات المشقوقة ومختلف أنظمة نماذج الدودة المسطحة الطفيلية والحية الحرة. لذلك، فإن تطوير عملية نقل جينية فعالة للديدان الشريطية يمهد الطريق لتقنيات جديدة، مثل الضربة القاضية الجينية القائمة على الفيروسات أو تحرير الجينات بوساطة كريسبر-كاس32,33. يقدم هذا العمل النقل الفيروسي في نموذج الدودة الشريطية ويوضح نتائج واعدة ، مع آثار محتملة على بيولوجيا الدودة المسطحة. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات المتعمقة لتحسين الطريقة وتطوير إمكانية تطبيق هذه التقنية للتجارب المستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل لجنة منح الباحثين النخبة تحت رقم الجائزة 958680 من المعهد الوطني لتطوير البحوث الطبية (NIMAD) ، طهران ، إيران.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
References
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
- Eckert, J., Thompson, R. C. A.
- Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
- Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q.
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
- Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
- Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
- Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
- Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
- Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
- Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P.
- Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
- Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J.
- Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T.
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
- Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
- Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
- Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
- Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
- Wang, X., McManus, M.
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
- Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
- Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
- Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
- Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
- Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
- Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
- Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).
