Summary
हम एक अक्षीय रूप से स्कैन किए गए प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप के विकास के साथ ऊतक परिवर्तन और धुंधलापन में नई प्रगति के संयोजन से पूरे माउस हृदय के मेसोस्कोपिक पुनर्निर्माण के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं।
Abstract
आनुवंशिक और गैर-आनुवंशिक हृदय रोग दोनों हृदय में गंभीर रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं का कारण बन सकते हैं। संरचनात्मक रीमॉडेलिंग, जैसे कोलेजन जमाव (फाइब्रोसिस) और सेलुलर मिसलिग्नमेंट, विद्युत चालन को प्रभावित कर सकते हैं, इलेक्ट्रोमैकेनिकल डिसफंक्शन पेश कर सकते हैं और अंततः, अतालता का कारण बन सकते हैं। इन कार्यात्मक परिवर्तनों के वर्तमान पूर्वानुमान मॉडल गैर-एकीकृत और कम-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक जानकारी पर आधारित हैं। बड़े पैमाने पर ऊतक में उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग करने में मानक इमेजिंग विधियों की अक्षमता के कारण इस ढांचे को परिमाण के एक अलग क्रम पर रखना चुनौतीपूर्ण है। इस काम में, हम एक पद्धतिगत ढांचे का वर्णन करते हैं जो माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन के साथ पूरे माउस दिल की इमेजिंग की अनुमति देता है। इस लक्ष्य की उपलब्धि के लिए एक तकनीकी प्रयास की आवश्यकता है जहां ऊतक परिवर्तन और इमेजिंग विधियों में प्रगति को जोड़ा गया है। सबसे पहले, हम एक अनुकूलित स्पष्टता प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो एक बरकरार दिल को एक नैनोपोरस, हाइड्रोगेल-हाइब्रिडाइज्ड, लिपिड-मुक्त रूप में बदलने में सक्षम है जो उच्च पारदर्शिता और गहरे धुंधलापन की अनुमति देता है। फिर, एक फ्लोरेसेंस लाइट-शीट माइक्रोस्कोप माइक्रोन-स्केल रिज़ॉल्यूशन के साथ एक मेसोस्कोपिक फील्ड ऑफ व्यू (एमएम-स्केल) की छवियों को तेजी से प्राप्त करने में सक्षम है। मेसोएसपीआईएम परियोजना के बाद, कल्पना की गई माइक्रोस्कोप एक एकल टोमोग्राफिक स्कैन में माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन के साथ पूरे माउस हृदय के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है। हमारा मानना है कि यह पद्धतिगत ढांचा विद्युत शिथिलता में साइटोआर्किटेक्चर अव्यवस्था की भागीदारी को स्पष्ट करने की अनुमति देगा और एक व्यापक मॉडल के लिए मार्ग प्रशस्त करेगा जो कार्यात्मक और संरचनात्मक डेटा दोनों पर विचार करता है, इस प्रकार संरचनात्मक कारणों की एकीकृत जांच को सक्षम करेगा जो ऊतक रीमॉडेलिंग के बाद विद्युत और यांत्रिक परिवर्तन ों का कारण बनता है।
Introduction
हृदय रोगों से जुड़े संरचनात्मक रीमॉडेलिंग विद्युत चालन को प्रभावित कर सकते हैं और अंग 1,2 के इलेक्ट्रोमैकेनिकल डिसफंक्शन पेश कर सकते हैं। कार्यात्मक परिवर्तनों की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्तमान दृष्टिकोण आमतौर पर फाइब्रोसिस जमाव, संवहनी पेड़ और हृदय के फाइबर वितरण के समग्र पुनर्निर्माण को प्राप्त करने के लिए एमआरआई और डीटी-एमआरआई का उपयोग करते हैं, और उनका उपयोग अंग 3,4 में अधिमान्य कार्रवाई संभावित प्रसार (एपीपी) पथों को मॉडल करने के लिए किया जाता है। ये रणनीतियाँ हृदय संगठन का एक सुंदर अवलोकन प्रदान कर सकती हैं। हालांकि, सेलुलर स्तर पर कार्डियक फ़ंक्शन पर संरचनात्मक रीमॉडेलिंग के प्रभाव की जांच करने के लिए उनका स्थानिक संकल्प अपर्याप्त है।
इस ढांचे को परिमाण के एक अलग क्रम पर रखना, जहां एकल कोशिकाएं कार्रवाई संभावित प्रसार पर व्यक्तिगत भूमिका निभा सकती हैं, चुनौतीपूर्ण है। मुख्य सीमा बड़े पैमाने पर (सेंटीमीटर आकार के) ऊतकों में उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग (माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन) करने के लिए मानक इमेजिंग विधियों की अक्षमता है। वास्तव में, ऊतक अपारदर्शिता के कारण उच्च रिज़ॉल्यूशन पर 3 डी में इमेजिंग जैविक ऊतक बहुत जटिल है। पूरे अंगों में 3 डी पुनर्निर्माण करने के लिए सबसे आम दृष्टिकोण पतले वर्गों को तैयार करना है। हालांकि, सटीक सेक्शनिंग, असेंबलिंग और इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण प्रयास और समय की आवश्यकता होती है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण जो नमूने को काटने की मांग नहीं करता है, वह एक पारदर्शी ऊतक उत्पन्न करना है। पिछले वर्षों के दौरान, ऊतकों को स्पष्ट करने के लिए कई पद्धतियों का प्रस्ताव किया गया है 5,6,7,8। बड़े पैमाने पर, पारदर्शी और फ्लोरोसेंटली-लेबल ऊतकों का उत्पादन करने की चुनौती हाल ही में सच्चे ऊतक परिवर्तन दृष्टिकोण (क्लैरिटी9, शील्ड10) विकसित करके हासिल की गई है। विशेष रूप से, स्पष्टता विधि एक बरकरार ऊतक के एक नैनोपोरस, हाइड्रोगेल-हाइब्रिडाइज्ड, लिपिड-मुक्त रूप में परिवर्तन पर आधारित है जो झिल्ली लिपिड बाइलेयर के चयनात्मक हटाने से उच्च पारदर्शिता प्रदान करने में सक्षम बनाता है। विशेष रूप से, यह विधि कार्डियक तैयारी 11,12,13,14 में भी सफल पाई गई है। हालांकि, चूंकि दिल एक सक्रिय समाशोधन के लिए उपयुक्त होने के लिए बहुत नाजुक है, इसलिए इसे निष्क्रिय दृष्टिकोण का उपयोग करके साफ किया जाना चाहिए, जिसे पूर्ण पारदर्शिता प्रदान करने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है।
लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी जैसी उन्नत इमेजिंग तकनीकों के संयोजन में, क्लैरिटी में माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन पर 3 डी बड़े पैमाने पर हृदय के ऊतकों को चित्रित करने की क्षमता है। प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी में, नमूने की रोशनी का पता लगाने के उद्देश्य के फोकल प्लेन में सीमित प्रकाश की एक पतली शीट के साथ प्रदर्शन किया जाता है। प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को रोशनी विमान15 के लंबवत एक अक्ष के साथ एकत्र किया जाता है। डिटेक्शन आर्किटेक्चर वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी के समान है, जिससे अधिग्रहण लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की तुलना में बहुत तेज हो जाता है। प्रकाश शीट के माध्यम से नमूने को स्थानांतरित करने से सेंटीमीटर आकार के नमूनों तक बड़े नमूनों की एक पूरी टोमोग्राफी प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। हालांकि, गॉसियन बीम के आंतरिक गुणों के कारण, सीमित स्थानिक विस्तार के लिए केवल एक बहुत पतली (कुछ माइक्रोन के क्रम में) प्रकाश-शीट प्राप्त करना संभव है, इस प्रकार दृश्य के क्षेत्र (एफओवी) को काफी सीमित कर दिया गया है। हाल ही में, इस सीमा को दूर करने के लिए एक नई उत्तेजना योजना पेश की गई है और मस्तिष्क इमेजिंग के लिए लागू की गई है, जिससे आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन16 के साथ 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति मिलती है।
इस पेपर में, एक निष्क्रिय समाशोधन दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है, जो स्पष्टता प्रोटोकॉल द्वारा आवश्यक समाशोधन समय में महत्वपूर्ण कमी को सक्षम करता है। यहां वर्णित पद्धतिगत ढांचा मिनटों के क्रम में अधिग्रहण समय के साथ एकल टोमोग्राफिक स्कैन में माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन के साथ एक पूरे माउस दिल का पुनर्निर्माण करने की अनुमति देता है।
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Protocol
सभी पशु हैंडलिंग और प्रक्रियाओं को वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा पर यूरोपीय संसद के निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय के सिद्धांतों और नियमों के अनुरूप था। प्रायोगिक प्रोटोकॉल को इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (प्रोटोकॉल संख्या 647/2015-पीआर) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी जानवरों को ENVIGO, इटली द्वारा प्रदान किया गया था। इन प्रयोगों के लिए, 6 महीने की उम्र के 5 पुरुष C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया गया था।
1. समाधान तैयार करना
- एक रासायनिक हुड में फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (पीएच 7.6) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) तैयार करें। कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए एलिकोट स्टोर करें।
- हाइड्रोजेल समाधान तैयार करें: एक रासायनिक हुड में 0.01 एम पीबीएस में 4% एक्रिलामाइड, 0.05% बिस-एक्रिलामाइड, 0.25% इनिटियाटियोर एवी -044 मिलाएं। पूरी तैयारी के दौरान अभिकर्मकों और घोल को बर्फ पर रखें। हाइड्रोगेल एलिकोट को कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- समाशोधन समाधान तैयार करें: 200 एमएम बोरिक एसिड, 4% सोडियम डोडेसिल-सल्फेट (एसडीएस) को विआयनीकृत पानी में मिलाएं; एक रासायनिक हुड में पीएच 8.6। एसडीएस वर्षा से बचने के लिए समाधान को 21-37 डिग्री सेल्सियस के बीच स्टोर करें।
- प्रयोग के दिन ताजा टायरोड समाधान तैयार करें: 10 mM ग्लूकोज, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1.2 mM MgCl2, और 4.7 mM KCl जोड़ें; 1 M NaOH का उपयोग करके pH 7.4 तक टाइट करें।
2. दिल का अलगाव
- हार्ट आइसोलेशन प्रक्रिया से 30 मिनट पहले 500 आईयू हेपरिन के 0.1 एमएल को इंजेक्ट करें।
- ताजा टायरोड समाधान के साथ 30-एमएल सिरिंज और तीन 6-सेमी पेट्री व्यंजन भरें। पेट्री व्यंजनों में से एक की सीमा पर एक छोटी दरार (गहराई में 3-4 मिमी) बनाएं और इसे स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
- सिरिंज में 1 मिमी व्यास का प्रवेशनी ठीक करें और इसे पेट्री डिश की दरार में डालें। सुनिश्चित करें कि सिरिंज में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
- 4% पीएफए के साथ 20-एमएल सिरिंज भरें और इसे रासायनिक हुड में रखें। हुड के नीचे एक खाली पेट्री डिश तैयार करें।
- माउस को 1.0 एल /मिनट की प्रवाह दर पर 3% आइसोफ्लुरेन / ऑक्सीजन के साथ एनेस्थेटाइज करें और लागू पशु कल्याण नियमों के अनुसार ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इसका त्याग करें।
- बलिदान के बाद, छाती पर फर को हटा दें और दिल तक पूरी पहुंच के लिए छाती खोलें।
- दिल को अलग करें, इसे पेट्री डिश में डुबोएं जो पहले 50 एमएल टायरोड सॉल्यूशन से भरा था। हृदय को उजागर करने के लिए महाधमनी आर्क के पास महाधमनी को तुरंत काटने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें।
- एक स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के तहत दिल को स्थानांतरित करें और सावधानीपूर्वक प्रवेशनी करें। ऊतक क्षति से बचने के लिए कैनुला को महाधमनी (2 मिमी से अधिक नहीं) में बहुत गहराई से न डालें।
- कैनुला में दिल को ठीक करने के लिए थोड़ा क्लैंप और एक सीवन (आकार 5/0) का उपयोग करें।
- वाहिकाओं से रक्त निकालने के लिए 10 एमएल / मिनट के निरंतर दबाव के साथ टायरोड समाधान के 30 एमएल के साथ दिल को भरें।
- सिरिंज से कैनुला को अलग करें और टायरोड समाधान से भरे पेट्री डिश में दिल रखें। कैनुला में हवा के बुलबुले न होने के लिए सावधान रहें; अन्यथा, हवा के बुलबुले को ठीक से हटा दें।
- ठंडे 4% पीएफए से भरे 20-एमएल सिरिंज को कैनुला से जोड़ें और एक ही निरंतर दबाव पर दिल को शुद्ध करें।
- रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (ओ / एन) पर 4% पीएफए के 10 एमएल में दिल को इनक्यूबेट करें। ऊतक क्षरण से बचने के लिए, कम से कम समय में चरण 2.6-2.13 का प्रदर्शन करें।
3. दिल की सफाई
- अगले दिन, 0.01 एम पीबीएस में 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 बार दिल धोएं।
नोट: इस चरण के बाद, दिल को कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस + 0.01% सोडियम एज़ाइड (एनएएन 3) में संग्रहीत किया जा सकता है। - 3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हिलने (15 आरपीएम) में हाइड्रोगेल समाधान के 30 एमएल में दिल को इनक्यूबेट करें।
- एक ड्रायर, एक वैक्यूम पंप और एक ट्यूब सिस्टम का उपयोग करके कमरे के तापमान पर नमूना दें जो ड्रायर को पंप और नाइट्रोजन पाइपलाइन दोनों से जोड़ता है।
- नमूने को ड्रायर में रखें और उस पर टोपी रखते हुए शीशी खोलें।
- ड्रायर को बंद करें और नाइट्रोजन पाइपलाइन खोलकर ट्यूब से ऑक्सीजन निकालें।
- 10 मिनट के लिए ड्रायर से ऑक्सीजन निकालने के लिए वैक्यूम पंप चालू करें।
- पंप को बंद करें और नाइट्रोजन पाइपलाइन खोलने के लिए ड्रायर के नॉब का उपयोग करें। एक बार जब दबाव वायुमंडलीय दबाव के बराबर हो जाता है, तो सावधानी से ड्रायर खोलें और जल्दी से शीशी को बंद करें।
- दिल को 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डिगैस्ड हाइड्रोगेल समाधान में रखें।
- जब हाइड्रोगेल ठीक से बहुलक हो जाता है और पूरी तरह से जिलेटिनस दिखाई देता है, तो सावधानीपूर्वक इसमें से दिल को हटा दें और इसे नमूना धारक में रखें।
- क्लियरिंग कक्षों में से एक में दिल के साथ नमूना धारक डालें और समाशोधन समाधान के लीक से बचने के लिए इसे ठीक से बंद करें।
- समाशोधन समाधान के पुनर्चक्रण को शुरू करने के लिए पानी के स्नान पर स्विच करें जहां क्लियरिंग समाधान कंटेनर रखा गया है और पेरिस्टालिक पंप।
- स्पष्टीकरण प्रक्रिया को तेज करने के लिए सप्ताह में एक बार कंटेनर में समाशोधन समाधान बदलें।
4. सेलुलर झिल्ली धुंधला
- एक बार जब दिल पूरी तरह से स्पष्ट दिखाई देता है, तो इसे नमूना धारक से हटा दें और इसे 24 घंटे के लिए 50 एमएल गर्म पीबीएस में धो लें। 24 घंटे के लिए पीबीएस के 50 एमएल + ट्राइटन-एक्स (पीबीएस-टी 1 एक्स) के 1% में फिर से धो लें।
- नमूने को 0.01 मिलीग्राम / एमएल गेहूं जर्म एग्लूटिनिन (डब्ल्यूजीए) - एलेक्सा फ्लोर 633 में पीबीएस-टी 1 एक्स के 3 एमएल में 7 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर झटकों (50 आरपीएम) में इनक्यूबेट करें।
- 7-दिवसीय इनक्यूबेशन के बाद, नमूने को 24 घंटे के लिए हिलाने में कमरे के तापमान पर पीबीएस-टी 1 एक्स के 50 एमएल में धो लें।
- नमूने को 15 मिनट के लिए 4% पीएफए में इनक्यूबेट करें और फिर इसे 5 मिनट के लिए पीबीएस में 3 बार धोएं।
नोट: इस चरण के बाद, दिल को कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस + 0.01% एनएन 3 में संग्रहीत किया जा सकता है। - आवश्यक अपवर्तक सूचकांक (आरआई = 1.46) प्रदान करने के लिए 0.01 एम पीबीएस (20% और 47% टीडीई / पीबीएस) में 8 घंटे के लिए 2,2'-थियोडीथेनॉल (टीडीई) की बढ़ती सांद्रता में दिल को इनक्यूबेट करें, 0.01 एम पीबीएस में 68% टीडीई की अंतिम एकाग्रता तक। यह छवियों16 प्राप्त करने के लिए आरआई मिलान माध्यम (आरआई-माध्यम) है।
5. दिल बढ़ना और अधिग्रहण
नोट: ऑप्टिकल सिस्टम के सभी घटकों को सामग्री की तालिका में विस्तार से सूचीबद्ध किया गया है।
- धीरे से बाहरी क्यूवेट (क्वार्ट्ज, 45 मिमी × 45 मिमी × 42.5 मिमी) के लगभग 80% को आरआई-माध्यम से भरें।
नोट: यहां, विभिन्न गैर-वाष्पशील समाधानों का उपयोग करना संभव है जो 1.46 के आरआई की गारंटी देते हैं। - धीरे से आंतरिक क्यूवेट (क्वार्ट्ज, 45 मिमी × 12.5 मिमी × 12.5 मिमी) को उसी आरआई-माध्यम के साथ भरें।
- आंतरिक क्यूवेट के अंदर नमूना विसर्जित करें। ऊपर वर्णित नमूना ऊष्मायन नमूने को आयोजित किए बिना आरआई-माध्यम के अंदर स्थिर रहने की अनुमति देता है।
- धीरे से पतले चिमटी का उपयोग करके नमूने को क्यूवेट के तल पर ले जाएं और स्कैनिंग के दौरान ऊतक में उत्तेजना प्रकाश पथ को कम करने के लिए क्यूवेट के मुख्य अक्ष के समानांतर अपने अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ हृदय को व्यवस्थित करें।
- धीरे से दो स्क्रू के साथ आंतरिक क्यूवेट के ऊपर अनुरूप प्लग को ठीक करें।
- मैग्नेट का उपयोग करके नमूने को माइक्रोस्कोप चरण में माउंट करें।
- आंतरिक क्यूवेट को बाहरी में डुबोने के लिए ऊर्ध्वाधर नमूना चरण को मैन्युअल रूप से अनुवाद करें।
- उत्तेजना प्रकाश स्रोत (638 एनएम की तरंग दैर्ध्य) चालू करें, कम शक्ति (3 मेगावाट के क्रम में) स्थापित करें।
- ऊतक के आंतरिक तल को रोशन करने के लिए मोटरचालित अनुवादक का उपयोग करके नमूने को स्थानांतरित करें।
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर (HCImageLive) चालू करें और पूरे सेटअप को नियंत्रित करने वाले कस्टम सॉफ़्टवेयर द्वारा कैमरे के अधिग्रहण ट्रिगर को चलाने के लिए बाहरी (लाइट-शीट) मोड पर कैमरा ट्रिगर सेट करें।
- स्कैन सेटिंग्स पैनल में ऑटोसेव सक्षम करें और आउटपुट फ़ोल्डर सेट करें जहां छवियों को सहेजने की आवश्यकता है।
- नमूना को कैमरा सेंसर के एफओवी के केंद्र में ले जाने के लिए रैखिक अनुवादकों के साथ एक्सवाई विमान में नमूना स्थिति को मैन्युअल रूप से समायोजित करें।
- टोमोग्राफिक पुनर्निर्माण के लिए हृदय सीमाओं की पहचान करने के लिए रैखिक मोटरचालित अनुवादक का उपयोग करके जेड-अक्ष के साथ नमूने को स्थानांतरित करें।
- इमेजिंग सत्र के लिए तैयार लेजर शक्ति को ~ 20 mW तक बढ़ाएं।
- टोमोग्राफिक अधिग्रहण शुरू करें, इमेजिंग सॉफ्टवेयर के अनुक्रम पैनल में स्टार्ट बटन पर क्लिक करें, और एक ही समय में नमूने को मोटरचालित अनुवादक का उपयोग करके 6 μm / s के निरंतर वेग पर Z-अक्ष के साथ ले जाएं।
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Representative Results
विकसित निष्क्रिय समाशोधन सेटअप लगभग 3 महीनों में एक साफ वयस्क माउस दिल (10 मिमी x 6 मिमी x 6 मिमी के आयाम के साथ) प्राप्त करने की अनुमति देता है। सेटअप के सभी घटकों को चित्र 1 में दिखाए गए अनुसार लगाया गया है। प्रत्येक समाशोधन कक्ष (3 डिग्री सेल्सियस के क्रम) के बीच नगण्य तापमान ढाल सभी कक्षों में उचित सीमा में तापमान बनाए रखने की अनुमति देता है।
चित्रा 1: निष्क्रिय समाशोधन सेटअप का योजनाबद्ध। समाशोधन समाधान (फ़िल्टर किए जाने के बाद) पेरिस्टालिक पंप की मदद से नमूना कक्षों के माध्यम से क्रमिक रूप से प्रसारित होता है। 50 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित पानी के स्नान में समाधान कंटेनर का रखरखाव कक्षों के भीतर समाधान तापमान 37-45 डिग्री सेल्सियस के बीच होने की अनुमति देता है। Biorender.com के साथ बनाई गई छवि. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2 एक पूरे दिल की समाशोधन प्रक्रिया का परिणाम दिखाता है। जैसा कि कोस्टेंटिनी एट अल.16 द्वारा पहले ही रिपोर्ट किया गया है, आरआई-माध्यम के रूप में टीडीई के साथ स्पष्टता पद्धति का संयोजन नमूने की अंतिम मात्रा में महत्वपूर्ण बदलाव नहीं करता है और न ही नमूने के अनिसोट्रोपिक विरूपण की ओर जाता है।
चित्रा 2: स्पष्टता प्रोटोकॉल से पहले (बाईं ओर) और बाद में (दाईं ओर) दिल की प्रतिनिधि छवि। दिल पूरी तरह से पारदर्शी और थोड़ा ओवरसाइज़ हो जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एक बार जब दिल साफ हो गया, तो सेलुलर झिल्ली को पूरे अंग के साइटोआर्किटेक्चर पुनर्निर्माण करने के लिए एलेक्सा फ्लोर 633-संयुग्मित डब्ल्यूजीए के साथ दाग दिया गया। कस्टम-निर्मित फ्लोरेसेंस लाइट-शीट माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) पूरे एफओवी में 3 डी माइक्रोन-स्केल रिज़ॉल्यूशन सुनिश्चित करने में सक्षम था।
चित्र 3: मेसोएसपीआईएम। कस्टम-निर्मित फ्लोरेसेंस लाइट-शीट माइक्रोस्कोप का सीएडी प्रतिपादन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
डिटेक्शन ऑप्टिक्स के संख्यात्मक एपर्चर (एनए = 0.1) को ध्यान में रखते हुए, सिस्टम के रेडियल (एक्सवाई) पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शन (पीएसएफ) का अनुमान 4-5 μm के क्रम में लगाया जा सकता है। दूसरी ओर, उत्तेजना प्रकाशिकी लगभग 6 μm (पूर्ण चौड़ाई आधा अधिकतम, FWHM) की न्यूनतम कमर के साथ एक प्रकाश-शीट का उत्पादन करती है जो FoV (चित्रा 4A-C) के किनारे पर 175 μm तक भिन्न होती है। लेजर बीम के अक्षीय स्कैन के साथ कैमरा रोलिंग शटर के सिंक्रनाइज़ेशन ने उत्सर्जन संकेत को केवल प्रकाश-शीट की कमर के साथ उत्तेजित नमूना भाग में एकत्र करना सुनिश्चित किया, जिसके परिणामस्वरूप पूरे एफओवी (चित्रा 4 बी-डी) के साथ लगभग 6.7 μm का औसत एफडब्ल्यूएचएम हुआ।
चित्र 4: प्रकाश-शीट उत्पादन और लक्षण वर्णन। (A) 638 nm के लेजर स्रोत के साथ उत्पन्न एक उत्तेजना प्रकाश-शीट को फील्ड ऑफ व्यू (FoV) के केंद्र पर केंद्रित किया जाता है और 3.25 μm के पिक्सेल आकार और 10 ms के एक्सपोज़र समय के साथ अधिग्रहित किया जाता है। प्रकाश की तीव्रता सामान्यीकृत है और एक रंगीन मानचित्र के साथ रिपोर्ट की जाती है। प्रकाश तीव्रता प्रोफ़ाइल की पूर्ण चौड़ाई आधा अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) का मूल्यांकन एफओवी के साथ 15 अलग-अलग स्थितियों में किया जाता है। परिणाम C में दिखाए जाते हैं। (बी) 1.92 हर्ट्ज पर संचालित कैमरा रोलिंग शटर और असमर्थ लेंस द्वारा संचालित प्रकाश बीम स्थिति के बीच सिंक्रनाइज़ेशन द्वारा उत्पन्न उत्तेजना प्रकाश-शीट की छवि। प्रकाश तीव्रता प्रोफ़ाइल के एफडब्ल्यूएचएम का मूल्यांकन एफओवी के साथ किया जाता है और परिणाम डी में दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
माइक्रोस्कोप के जेड-पीएसएफ का अनुमान फ्लोरोसेंट नैनोस्फीयर (चित्रा 5) के टोमोग्राफिक पुनर्निर्माण द्वारा भी लगाया गया था। पिछले मूल्यांकन के साथ अच्छे समझौते में, फिट द्वारा 6.4 μm के FWHM का अनुमान लगाया जा सकता है।
चित्रा 5: जेड-अक्ष में पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शन। ऑप्टिकल सिस्टम के पॉइंट स्प्रेड फंक्शन (पीएसएफ) का अनुमान इमेजिंग फ्लोरोसेंट सब-माइक्रोन-स्केल नैनोस्फीयर (638 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ एक प्रकाश शीट के साथ उत्तेजित) द्वारा लगाया जाता है, जिसका पिक्सेल आकार 3.25 μm × 3.25 μm × 2.0 μm होता है। ऑप्टिकल अक्ष (Z) के साथ पीएसएफ तीव्रता प्रोफ़ाइल को काले बिंदुओं के रूप में दर्शाया जाता है। पीएसएफ प्रोफाइल को गॉसियन फ़ंक्शन के साथ फिट किया गया है जिसमें μ = 18.6 μm और σ = 2.7 μm है। फिट द्वारा अनुमानित पीएसएफ का एफडब्ल्यूएचएम 6.4 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
ऊतक की उच्च पारदर्शिता के कारण, 638 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर अक्षीय रूप से स्कैन की गई प्रकाश-शीट की महत्वपूर्ण विकृति के बिना पूरे दिल को रोशन करना संभव था। फ्लोरेसेंस सिग्नल को 500 एमएस एक्सपोजर समय और 1.92 हर्ट्ज की फ्रेम दर पर काम करने वाले एससीएमओएस सेंसर द्वारा एकत्र किया गया था। पिछले परिमाणीकरण के आधार पर, टोमोग्राफिक अधिग्रहण 6 μm / s के Z-स्कैन वेग का उपयोग करके किया गया था, और 1.92 Hz की फ्रेम दर मानते हुए, प्रत्येक 3.12 μm पर एक फ्रेम प्राप्त किया गया था, जो सिस्टम Z-PSF को लगभग दो गुना अधिक नमूना देता है। बाएं वेंट्रिकल कक्ष के दो प्रतिनिधि फ्रेम (कोरोनल और अनुप्रस्थ विमानों पर) चित्रा 6 में दिखाए गए हैं। यह परिणाम पूरे अंग में पर्याप्त सिग्नल / शोर अनुपात के साथ तीन आयामों में एकल सेलुलर झिल्ली को हल करने के लिए सिस्टम की क्षमता की पुष्टि करता है (चित्रा 6)।
चित्रा 6: माउस हृदय ऊतक पुनर्निर्माण। स्पष्ट दिल एलेक्सा फ्लोर 633 से संयुग्मित डब्ल्यूजीए के साथ सना हुआ था और 638 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ लेजर स्रोत द्वारा उत्तेजित था। (ए) कोरोनल और (बी) अनुप्रस्थ प्रतिनिधि खंड। (सी-डी) ऊतक परिवर्तन उच्च ऊतक पारदर्शिता पैदा करता है, जिससे दीवार की गहराई में छोटी संरचनाओं को हल करने की अनुमति मिलती है। ऑप्टिकल सिस्टम माइक्रोमेट्रिक संरचनाओं (पैनल) को हल करने के लिए पर्याप्त अक्षीय रिज़ॉल्यूशन दिखाता है। (ई) 3 डी कम-रिज़ॉल्यूशन हृदय प्रतिपादन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस काम में, उच्च रिज़ॉल्यूशन पर एक पूरे माउस दिल को साफ करने, दागने और छवि बनाने के लिए एक सफल दृष्टिकोण पेश किया गया था। सबसे पहले, एक ऊतक परिवर्तन प्रोटोकॉल (स्पष्टता) को अनुकूलित और प्रदर्शन किया गया था, हृदय ऊतक पर इसके आवेदन के लिए थोड़ा संशोधित किया गया था। दरअसल, पूरे दिल के 3 डी में एक कुशल पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए, प्रकाश प्रकीर्णन की घटना को रोकना आवश्यक है। स्पष्टता पद्धति हमें एक अत्यधिक पारदर्शी बरकरार दिल प्राप्त करने की अनुमति देती है, लेकिन निष्क्रिय रूप से (लगभग 5 महीने) प्रदर्शन करने पर इसे लंबे इनक्यूबेशन बार की आवश्यकता होती है। मस्तिष्क के संबंध में, हृदय ऊतक एक सक्रिय समाशोधन के लिए उपयुक्त नहीं है, जो एक विद्युत क्षेत्र का लाभ उठाता है। कम वोल्टेज पर भी, विद्युत क्षेत्र क्षति और ऊतक टूटने की ओर जाता है। यहां, लगभग 3 महीनों में पूरी तरह से साफ दिल प्राप्त करने के लिए एक निष्क्रिय समाशोधन दृष्टिकोण अनुकूलित किया गया था। समीपस्थ महाधमनी के माध्यम से हृदय को अलग करने और अलग करने के बाद, प्रोटोकॉल के खंड 3 में वर्णित स्पष्टता पद्धति का प्रदर्शन किया गया था। प्रक्रिया को गति देने के लिए, एक होममेड पैसिव क्लियरिंग सेटअप की व्यवस्था की गई थी (चित्रा 1), जिसने ऊतक समाशोधन के समय को लगभग 40% तक कम कर दिया। सेटअप क्लियरिंग समाधान के लिए एक कंटेनर, एक पानी स्नान, एक पेरिस्टालिक पंप, विभिन्न नमूना धारकों वाले कई कक्ष, प्रत्येक कक्ष के लिए कैप्सूल फिल्टर और समाधान के पुनर्चक्रण के लिए एक ट्यूबिंग प्रणाली से बना है। पंप कंटेनर से समाधान को प्रत्येक कक्ष के माध्यम से लगातार निकालता है और प्रसारित करता है, जहां नमूने समाशोधन के लिए आयोजित किए जाते हैं। कक्षों में प्रवेश करने से पहले, समाधान एक कैप्सूल फिल्टर के माध्यम से बहता है ताकि समाशोधन के दौरान ऊतकों से दूर लिपिड को फंसाया जा सके। 37-45 डिग्री सेल्सियस के बीच समाशोधन समाधान के लिए इष्टतम तापमान, समाधान कंटेनर को 50 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखकर पुनर्चक्रण के दौरान कक्षों के भीतर बनाए रखा जाता है। प्रक्रिया के दौरान सप्ताह में एक बार कंटेनर में समाशोधन समाधान को बदलने की सलाह दी जाती है। उपयोग किए गए सभी घटक सामग्री की तालिका में विस्तार से सूचीबद्ध हैं। यहां प्रस्तुत अनुकूलित समाधान हमें मानक निष्क्रिय समाशोधन तकनीक के संबंध में काफी कम समय में एक पूरे निष्क्रिय रूप से साफ माउस दिल को प्राप्त करने की अनुमति देता है, इस प्रकार अंग को नुकसान पहुंचाए बिना आवश्यक प्रयोगात्मक समय को कम करता है। फ्लोरोसेंट लेक्टिन (डब्ल्यूजीए - एलेक्सा फ्लूर 633) का उपयोग करके सेलुलर झिल्ली और एंडोथेलियम के सजातीय लेबलिंग के लिए धुंधला दृष्टिकोण भी अनुकूलित किया गया था।
हृदय साइटोआर्किटेक्चर को एक समर्पित मेसोएसपीआईएम विकसित करके पुनर्निर्मित किया गया है जो नमूने में प्रकाश-शीट को अक्षीय रूप से साफ करता है (https://mesospim.org)। कस्टम-निर्मित फ्लोरेसेंस लाइट-शीट माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन के साथ एक मेसोस्कोपिक एफओवी (मिलीमीटर के क्रम में) की छवियों को तेजी से प्राप्त करने में सक्षम था। इस तरह, एकल कार्डियोमायोसाइट्स को हल किया जा सकता है और पूरे अंग के 3 डी पुनर्निर्माण में मैप किया जा सकता है। माइक्रोस्कोप एक प्रकाश-शीट के साथ साफ किए गए नमूने को रोशन करता है, जो गैल्वानोमेट्रिक दर्पण का उपयोग करके 638 एनएम पर लेजर बीम को स्कैन करके गतिशील रूप से उत्पन्न होता है। एक एससीएमओएस कैमरा 2x आवर्धन योजना में डिटेक्शन आर्म की विशेषता है जो इसे एक स्कैन में पूरे एफओवी को प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। उद्देश्य के बाद एक लॉन्ग-पास फिल्टर रखकर फ्लोरेसेंस सिग्नल का चयन किया गया था। कैमरा रोलिंग शटर मोड में काम करने के लिए सेट किया गया था: किसी भी समय, सक्रिय कैमरा पिक्सेल (यानी, छवि के संपर्क में) की लाइनों को प्रकाश-शीट के फोकल बैंड के इन-प्लेन शिफ्ट के साथ सिंक्रनाइज़ किया जाता है, जो विद्युत रूप से अक्षम लेंस द्वारा किया जाता है। इस दृष्टिकोण ने केंद्रित प्रकाश-शीट के सबसे पतले हिस्से में केवल छवियों को प्राप्त करके पूरे एफओवी में ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता को अधिकतम किया। यह समाधान पारंपरिक कॉन्फ़िगरेशन से भिन्न होता है, जहां अधिग्रहण में प्रकाश-शीट की फोकल गहराई की पूरी श्रृंखला शामिल होती है, जिससे एफओवी के बड़े हिस्से में पीक ऑप्टिकल सेक्शनिंग रिज़ॉल्यूशन को रोका जाता है। एक एकीकृत नमूना चरण क्यूवेट का समर्थन करता है, जिससे इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान नमूने की स्थिति और अक्षीय आंदोलन को अनुकूलित किया जा सकता है। इस तरह, लगातार आंतरिक वर्गों को प्राप्त करके टोमोग्राफिक पुनर्निर्माण संभव है। प्राप्त छवियों में एक मेसोस्कोपिक एफओवी और एक माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन है, जबकि पूरे माउस दिल के लिए आवश्यक अधिग्रहण समय ~ 15 मिनट है। कैमरा रोलिंग शटर और एफओवी को साफ करने वाली उत्तेजना प्रकाश किरण के बीच सिंक्रनाइज़ेशन एक उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 4) के साथ पूरे छवि विमान को प्राप्त करने की अनुमति देता है। यह नमूना रेडियल विस्थापन और बहु-आसन्न-स्टैक्स-आधारित इमेजिंग की आवश्यकता के बिना, एकल टोमोग्राफिक अधिग्रहण में नमूने के प्रत्यक्ष पुनर्निर्माण की अनुमति देता है। विशेष रूप से, माइक्रोस्कोप ने एक एकल इमेजिंग सत्र में लगभग (10 मिमी x 6 मिमी x 6 मिमी) के पूरे अंग के पुनर्निर्माण की अनुमति दी, जिसमें निकट-आइसोट्रोपिक वोक्सेल आकार और पूरे अंग में एकल कोशिकाओं को संभावित रूप से हल करने के लिए पर्याप्त सिग्नल-टू-पृष्ठभूमि अनुपात था।
यह उल्लेखनीय है कि प्रस्तावित प्रोटोकॉल कुछ महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत करता है जिन्हें अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, समीपस्थ महाधमनी के माध्यम से हृदय का प्रवेशन काफी मुश्किल हो सकता है, लेकिन अंग को ठीक से धोने और ठीक करने के लिए यह एक आवश्यक कदम है। जुड एट अल.17 ने दिखाया कि इस चरण को प्रभावी ढंग से कैसे किया जाए। इसके अलावा, क्लैरिटी प्रोटोकॉल द्वारा आवश्यक डिगैसिंग प्रक्रिया भी काफी जटिल है, लेकिन यह ऊतक संरक्षण के लिए आवश्यक है; यदि यह चरण ठीक से नहीं किया जाता है, तो ऊतक को समाधान को साफ़ करने में इनक्यूबेशन के दौरान नुकसान और क्षय का सामना करना पड़ सकता है।
इसके अलावा, हालांकि प्रस्तुत प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो छोटे फ्लोरोसेंट जांच के लिए उपयुक्त है, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग हमेशा एंटीबॉडी के उच्च आणविक भार के कारण धुंधला होने में अच्छी दक्षता प्रदान नहीं करता है। प्रत्येक इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल के लिए उचित अनुकूलन की आवश्यकता होती है, और एंटीबॉडी प्रवेश में सुधार के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों की कल्पना की गई है, उदाहरण के लिए, ऊतक विस्तार18 और / या पीएच और आयनिक शक्ति19 में भिन्नता।
मेसोएसपीआईएम सेटअप भी दो मुख्य सीमाएं प्रस्तुत करता है: i) नमूने में प्रकाश-शीट संरक्षण ऊतक पारदर्शिता पर दृढ़ता से निर्भर है, और ii) कैमरा सेंसर का आयाम एफओवी को सीमित करता है। पूरे दिल के अंदर एक आदर्श अपवर्तक सूचकांक मिलान की गारंटी देना बहुत चुनौतीपूर्ण है, और अपवर्तक सूचकांक पर छोटे बदलाव प्रकाश प्रकीर्णन पैदा कर सकते हैं, जिससे छवि की गुणवत्ता में गिरावट आ सकती है। इस संबंध में, एक दोहरी-पक्ष रोशनी योजना शुरू की जा सकती है। दो उत्तेजना भुजाएं नमूना के एक तरफ से दूसरी तरफ रोशनी को बारी-बारी से अधिकतम केंद्रित रोशनी के साथ दो अलग-अलग और संरेखित गतिशील प्रकाश चादरें उत्पन्न कर सकती हैं। इसके अलावा, कम क्षेत्र विरूपण के साथ उच्च संख्यात्मक एपर्चर टेलीसेंट्रिक लेंस के साथ संयोजन में बहुत बड़े सेंसर के साथ नई पीढ़ी के उच्च-रिज़ॉल्यूशन बैक-इल्युमिनेटेड एससीएमओएस का उपयोग करके एफओवी को बेहतर बनाया जा सकता है। यह कार्यान्वयन हमें एक ही ऑप्टिकल सेक्शन क्षमता को बनाए रखने वाले बड़े अंगों या विस्तारित ऊतकों का पुनर्निर्माण करने की अनुमति देगा और इस प्रकार सेंटीमीटर आकार के साफ नमूनों के माइक्रोन-स्केल 3 डी छवियों का उत्पादन करेगा।
यद्यपि प्रस्तुत प्रोटोकॉल को अभी भी नमूना तैयार करने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है और पूरे अंग के विश्वसनीय साइटोआर्किटेक्चर पुनर्निर्माण को प्राप्त करने के लिए उच्च स्तर की पारदर्शिता की आवश्यकता होती है, दृष्टिकोण का मुख्य महत्व समाशोधन प्रोटोकॉल के सुधार और माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन पर एकल स्कैन में मेसोस्कोपिक पुनर्निर्माण करने की क्षमता में रहता है। भविष्य में, इन प्रगतियों को विभिन्न जैविक संरचनाओं को एकीकृत करने वाले पूरे अंग पुनर्निर्माण को प्राप्त करने के लिए एक बहु-धुंधला प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जा सकता है।
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Disclosures
खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं।
Acknowledgments
इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से अनुदान समझौते नो 952166 (मरम्मत), एफआईएसआर कार्यक्रम के तहत एमयूआर, परियोजना FISR2019_00320 और रीजन टोस्काना, बैंडो राइसर्का सैल्यूट 2018, परकेयर परियोजना से धन प्राप्त हुआ है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
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