Summary
Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten werden erzeugt, indem embryonale Zellen aus endogenen Signalzentren innerhalb des frühen Embryos isoliert werden, wodurch relativ naive Zellcluster erzeugt werden, die leicht manipulierbar und ex vivokultiviert werden können. Dieser Artikel enthält Anweisungen zur Herstellung solcher Expflanzen und demonstriert ihren Nutzen, indem er die Rollen für die Knotensignalisierung während der Gastrulation abfragt.
Abstract
Zebrafischembryonen sind aufgrund ihrer optischen Klarheit und schnellen Entwicklung ein hervorragendes System, um Zellverhalten und Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Aufgrund der Komplexität und Redundanz embryonaler Signale kann es jedoch schwierig sein, die vollständige Rolle eines einzelnen Signals während der frühen Embryogenese zu erkennen. Durch die Explantierung der Tierregion des Zebrafisch-Blastoderms werden relativ naive Cluster embryonaler Zellen erzeugt, die ex vivoleicht kultiviert und manipuliert werden können. Durch die Einführung eines Gens von Interesse durch RNA-Injektion vor der Explantation kann man die Wirkung dieses Moleküls auf die Genexpression, das Zellverhalten und andere Entwicklungsprozesse relativ isoliert beurteilen. Darüber hinaus können Zellen aus Embryonen verschiedener Genotypen oder Zustände in einem einzigen chimären Explantat kombiniert werden, um Zell-Gewebe-Interaktionen und gewebespezifische Genfunktionen zu untersuchen. Dieser Artikel enthält Anweisungen zur Erzeugung von Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten und zeigt, dass ein einzelnes Signalmolekül - ein Knotenligand - ausreicht, um die Keimschichtbildung und Erweiterungsmorphogenese in ansonsten naiven embryonalen Geweben zu induzieren. Aufgrund ihrer Fähigkeit, embryonales Zellverhalten, Morphogengradienten und Genexpressionsmuster in einem vereinfachten Ex-vivo-System zu rekapitulieren, wird erwartet, dass diese Explantaten für viele Zebrafischforscher von großem Nutzen sind.
Introduction
Ein immerwährendes Ziel der Entwicklungsbiologie ist es, die Komplexität der Entwicklung von Embryonen zu entwirren, um den Ursprung der Tierform und -funktion zu verstehen. Selbst frühe Embryonen enthalten eine komplexe Mischung aus Signalmolekülen, Zell- und Gewebeinteraktionen und mechanischen Kräften, die alle einer strengen räumlichen und zeitlichen Regulierung unterliegen. Aus diesem Grund ist es oft schwierig, die genaue Rolle eines bestimmten Signals in einem Entwicklungsprozess von Interesse zu bestimmen. Durch die Entfernung embryonaler Gewebe aus ihrer endogenen Umgebung schafft die Embryonenexplantation eine vereinfachte Plattform, um die Entwicklungsrollen einzelner Gewebe und Moleküle in relativer Isolation zu erkennen. Explantationstechniken sind vielleicht am besten bei Xenopus laevisbekannt, wo sie verwendet wurden, um Gewebeinduktion, Zellsignalisierung, Zelladhäsion und Morphogenese zu untersuchen, neben anderen Prozessen1,2,3,4. Sogenannte Animal Cap Explantate, bei denen die Tierregion der Xenopus-Embryonen im Blastulastadium vor induktiven Wechselwirkungen5,6,7isoliert wird, sind eine weit verbreitete und leistungsfähige Explantattechnik. Unmanipulierte Tierkappen sind dazu bestimmt, Ektoderm7,8zu werden. Dennoch sind sie in der Lage, auf mehrere induktive Faktoren zu reagieren, so dass sie Gewebe aller drei Keimschichten bilden und gewebegerechte morphogenetische Bewegungen durchlaufenkönnen 9,10,11. Begrenzte genetische Werkzeuge und eine suboptimale Eignung für die Live-Bildgebung verhindern jedoch die Verwendung von Xenopus-Tierkappen-Explantaten für viele Entwicklungsbiologen. Durch die Explantierung von Blastoderm-Zellen aus Zebrafischembryonen können Forscher den Nutzen des Tierkappen-Assays mit der optischen Klarheit, der Fülle genetischer Werkzeuge und anderen experimentellen Vorteilen des Zebrafisch-Modellsystems kombinieren.
Bisher haben Forscher zwei Geschmacksrichtungen von Zebrafisch-Explantaten verwendet: sogenannte Pescoids und die Blastoderm-Explantaten. Im Pescoid-Modell wird das gesamte Blastoderm, einschließlich der Randzone, aus dem Eigelb isoliert und ex vivo ohne die extraembryonale Eigelb-Synzytialschicht (YSL)entwickelt 12,13. Auf diese Weise haben Pescoids eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit den Fundulus-Explantaten, die vor Jahrzehnten von Jane Oppenheimer und J.P. Trinkaus14,15erzeugt wurden. Diese Explantate rekapitulieren viele Aspekte der embryonalen Musterung und Morphogenese12,13. Da diese Isolate jedoch endogene Signalzentren (den embryonalen Rand) enthalten, sind sie hinsichtlich ihres molekularen Milieus nicht vereinfacht. Alternativ können Forscher relativ naive Zebrafisch-Blastodermen-Explantaten erzeugen, indem sie die Randzone16,17,18,19,20,21ausschließen. Unmanipulierte Zebrafisch-Blastoderm-Explantate explantieren hohe Mengen an Knochenmorphogenetischem Protein (BMP) Morphogenen19 und führen zu nicht-neuralen Ektodermen und umhüllenden Schichten (EVL), wenn sie ex vivokultiviert werden18. Sie rekapitulieren jedoch viele Aspekte der axialen Musterung und Morphogenese als Reaktion auf exogene Signalgradienten19,20,21, ähnlich wie Xenopus-Tierkappen. Aus diesem Grund sind Blastoderm-Explantaten ein vorteilhaftes Modell, um die Rolle eines gegebenen Morphogens (oder von Morphogenen) bei der Keimschichtspezifikation, morphogenetischen Zellbewegungen und Signalgradienten in einer vereinfachten Signalumgebung zu untersuchen. Darüber hinaus können Blastodermen aus Embryonen verschiedener Genotypen oder Zustände in einem einzigen chimären Explantat19,21 kombiniertwerden,um die Zell-/Gewebeautonomie und induktive Wechselwirkungen zu untersuchen.
Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten können verwendet werden, um die Rolle embryonaler Signale (z. B. Nodal) bei der Morphogenese und Gewebespezifikation während der Gastrulation zu untersuchen. Durch die Injektion synthetischer ndr2-RNA (die für einen Knotenliganden kodiert) im Einzelzellstadium wird die Knotensignalisierung im gesamten Blastoderm des Embryos aktiviert. Explantate aus diesen Embryonen erzeugen Knotensignalgradienten, bilden alle drei Keimschichten und durchlaufen Konvergenz- und Erweiterungsgastrulationsbewegungen (C & E), wie sie bei intakten Embryonen beobachtet werden20. Zusätzlich werden chimäre Explantate verwendet, um die Fähigkeit von Mesodermgeweben zu veranschaulichen, Neuroektodermen aus nicht injizierten (naiven) Blastodermen zu induzieren. Dieses Protokoll enthält Anweisungen zur Herstellung von Zebrafisch-Blastodermen-Explantaten und demonstriert ihren Nutzen bei der Definition der Rolle der Knotensignalisierung bei der Gewebeinduktion und Morphogenese.
Protocol
1 Bereiten Sie die Reagenzien und Verbrauchsmaterialien vor
- Vorbereitung von Reagenzien
- Bereiten Sie 500 ml 3x Danieaus Lösung vor (Lösung 1, Tabelle 1).
- Bereiten Sie 1 l Eiwasser vor (Lösung 2, Tabelle 1).
- Bereiten Sie eine 1,2% ige Lösung von Agarose in Eiwasser vor. Die Agarose vollständig in der Mikrowelle schmelzen und dann in einem Wasserbad auf 55 °C abkühlen lassen.
- Es werden 4 ml Explantatmedien (Lösung 3, Tabelle 1, leicht modifiziert von19,21) pro Versuchsbedingung hergestellt.
HINWEIS: Denken Sie daran, bei der Berechnung des erforderlichen Volumens mindestens eine Vertiefung von Explantaten aus nicht injizierten (oder von der Kontrolle injizierten) Embryonen zu berücksichtigen.- Desinfizieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.
- Zellkulturmedien von 4 °C entfernen und mit 70% Ethanol besprühen/abwischen.
- Explantierte Medien herstellen und in den 28,5 °C heißen Inkubator legen, um sich zu erwärmen, während die Embryonen injiziert werden.
HINWEIS: Fügen Sie immer altersangepasste, intakte Geschwisterembryonen für Staging-Zwecke hinzu. Dekreionieren Sie diese Embryonen und kultivieren Sie sie auf Agarose-beschichteten Platten in 0,3-facher Danieau-Lösung (Lösung 4, Tabelle 1).
- Pronase-Aliquots (1 ml bei 20 mg/ml) von -20 °C entfernen und auf Eis auftauen lassen. Tauen Sie ein 1 mL Aliquot für jeweils drei Versuchsbedingungen auf.
- Agarose-Teller zubereiten
- Machen Sie die Injektionsplatten.
- Füllen Sie eine 100 mm x 15 mm große Petrischale aus Kunststoff zur Hälfte mit geschmolzener Agarose in Eiwasser.
- Legen Sie das Spritzgießwerkzeug vorsichtig in einem Winkel von 45° auf die geschmolzene Agarose und senken Sie es allmählich in die Agarose ab, um sicherzustellen, dass keine Blasen darunter eingeschlossen sind. Lassen Sie es vollständig abkühlen.
- Entfernen Sie die Form. Verwenden Sie den Teller sofort oder bewahren Sie ihn für später auf, indem Sie 2 ml Eiwasser hinzufügen, den Teller einwickeln und bei 4 ° C aufbewahren. Erwärmen Sie die Platte vor der Injektion für 15-30 min im 28,5 °C Inkubator.
- Machen Sie explantierte Schneidplatten.
- Geben Sie 3 ml geschmolzene 1,2% Agarose in Eiwasser in eine 60 mm x 15 mm große Petrischale und stellen Sie sicher, dass der gesamte Boden des Brunnens bedeckt ist. Lassen Sie es vollständig abkühlen.
- Kulturplatten mit Agarose beschichten.
- Geben Sie für jede Versuchsbedingung 1 ml geschmolzene 1,2% Agarose in Eiwasser in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, um sicherzustellen, dass der gesamte Boden des Brunnens beschichtet ist. Lassen Sie es vollständig abkühlen.
- Für die Herstellung von chimären Explantaten erstellen Sie eine Explantat-Schneidschale mit kleinen Vertiefungen, indem Sie zwölf 1 mm Glasperlen zu geschmolzener Agarose in einer 60 mm x 15 mm großen Petrischale hinzufügen. Entfernen Sie die Perlen mit einer Pinzette, sobald die Agarose vollständig abgekühlt ist.
- Machen Sie die Injektionsplatten.
2 Embryonen mit RNA injizieren
- Entfernen Sie mit Handschuhen ein Aliquot synthetischer ndr2 mRNA aus der Lagerung bei -80 °C und legen Sie es sofort auf Eis.
- Bereiten Sie die Injektionsnadel vor.
- Füllen Sie eine gezogene Glaskapillarnadel mit RNA. Legen Sie die gefüllte Nadel in einen Mikromanipulator und brechen Sie die Nadelspitze mit einer Pinzette.
- Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen mit einem Tischmikrometer mit einem Tropfen Mineralöl und passen Sie die Injektionszeit und den Druck auf den pneumatischen Injektor an, um einen Bolus der gewünschten Größe zu erreichen. Ein Bolus mit einem Durchmesser von 120 μm hat ein Volumen von 1 nL.
HINWEIS: Das gewünschte Volumen des Bolus hängt von der Konzentration der RNA und der gewünschten Dosis pro Embryo ab. Zum Beispiel, wenn RNA aliquoted bei 10 ng / μL ist, injizieren Sie 1 nL, um eine endgültige Menge von 10 pg zu erreichen.- Halten Sie die RNA-Nadelspitze im Öl eingetaucht, bis sie zum Injizieren bereit ist.
- Laden Sie die Embryonen und injizieren Sie.
- Ziehen Sie die Trennwände in Zuchtbecken, lassen Sie die Fische 10-15 Minuten laichen und sammeln Sie die Embryonen mit einem Teesieb.
- Laden Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette und einer Pipettenpumpe in die Injektionsplatte und drücken Sie die Eier dann mit einem behandschuhten Finger vorsichtig in die Mulden.
- Injizieren Sie 10 pg ndr2 RNA in das Eigelb von einzelligen Embryonen, bis die gewünschte Anzahl von Embryonen erreicht ist oder bis sich die Embryonen zu teilen beginnen.
HINWEIS: Injizieren Sie nicht nach dem Einzelzellstadium, um eine gleichmäßige Verteilung der RNA im gesamten Embryo zu gewährleisten. - Waschen Sie die Embryonen aus der Injektionsplatte in eine beschriftete 100 mm x 15 mm große Petrischale mit einem sanften Strom von Eiwasser aus einer Quetschflasche.
HINWEIS: Behalten Sie immer eine Gruppe altersgerechter, nicht injizierter Geschwister als Kontrollen bei. - Legen Sie die Embryonen in den 28,5 °C-Inkubator, bis sie das 128-Zell-Stadium erreicht haben. Entfernen Sie unbefruchtete Eier und tote Embryonen aus der Schale.
3 Die Embryonen dehorionieren
- Sobald die Embryonen das 128-Zell-Stadium erreicht haben, legen Sie sie in beschriftete Glas-Petrischalen und dekantieren Sie so viel Eiwasser wie möglich aus ihnen.
- Beschriften Sie Glaskristallisationsgeschirr mit Laborband (entsprechend kleinen Schalennamen) und füllen Sie 2/3 des Weges mit Eiwasser. Platzieren Sie diese Schalen neben dem Seziermikroskop für eine schnelle Zugänglichkeit.
- 1 ml Pronasevorrat (20 mg/ml, auf Eis aufgetaut) zu 15 ml 3x Danieaus Lösung in einem 50 mL konischen Röhrchen geben.
HINWEIS: Diese Menge reicht für bis zu drei Versuchsbedingungen aus. Erhöhen Sie das Volumen von Pronase und 3x Danieaus Lösung für zusätzliche Explantationsbedingungen.
VORSICHT: Pronase ist ein Reizstoff; Tragen Sie daher Handschuhe bei der Handhabung. - Fügen Sie mindestens 5 ml Pronaselösung zu jeder Glas petrischale mit Embryonen hinzu.
- Rühren Sie die Glasschalen in einer kreisförmigen Bewegung und überwachen Sie den Fortschritt der Dekationierung konsequent unter einem Seziermikroskop.
- Sobald die Chorionen zu knittern beginnen und 1-2 Embryonen aus ihren Chorionen heraus sind, tauchen Sie vorsichtig die Glas-Petrischale mit Pronase und die Embryonen in die entsprechende Glaskristallisationsschale mit Eiwasser.
- Waschen Sie die dekaionierten Embryonen.
- Waschen Sie die Embryonen dreimal mit Eiwasser, indem Sie sanft Eiwasser aus der Schale geben und dann dekantieren.
- Die dritte und letzte Wäsche erfolgt mit 0,3x Danieaus Lösung.
HINWEIS: Wenn die Embryonen nach dem Waschen noch Chorionen haben, pipettieren Sie die Embryonen vorsichtig, bis die Chorionen entfernt sind, oder lassen Sie sie für ein oder zwei Minuten in der Wäsche (Eiwasser oder 0,3x Danieaus Lösung) ruhen und vorsichtig mit kreisenden Bewegungen rühren.
- Dehorionierte Embryonen mit einem Petrischalendeckel abdecken und in den Inkubator (28,5 °C) zurückbringen, bis sie das 256-Zell-Stadium erreicht haben.
4 Explantate schneiden
- Füllen Sie die mit Agarose beschichtete 60 mm x 15 mm Petrischale mit 3x Danieaus Lösung.
- Sobald sich die Embryonen im 256-Zell-Stadium befinden, übertragen Sie sie in die mit Agarose beschichtete Platte, die 3x Danieaus Lösung enthält, und richten Sie sie entlang der Mitte der Schale aus.
- Schneiden Sie die Explantate mit einer Pinzette ab (Abbildung 1).
- Verwenden Sie eine Geschlossen gehaltene Pinzette, um den Embryo zu stabilisieren, und verwenden Sie die andere, um den Blastoderm auf etwa der Hälfte seiner Höhe (vom Rand bis zum Tierpol) zu durchschneiden (Abbildung 1A).
- Zum Schneiden drücken Sie die Blastodermzellen vorsichtig mit einer Pinzette zusammen. Nehmen Sie dann die stabilisierende Pinzette und führen Sie sie entlang der anderen Pinzette, um ungefähr die Hälfte über die Blastoderme zu schneiden (Abbildung 1B).
- Drehen Sie den Embryo, legen Sie die Pinzette in den vorhandenen Schnitt und trennen Sie dann das verbleibende Blastoderm orthogonal zum ersten Schnitt (Abbildung 1C).
- Halten Sie die Explantate in 3x Danieaus Lösung für mindestens 5 minuten, um zu heilen, und geben Sie sie dann in den Brunnen einer 6-Well-Platte, die mit Agarose beschichtet und mit 4 ml Explantatmedien gefüllt ist.
HINWEIS: Schneiden Sie Explantaten aus nicht injizierten (oder kontrollinjizierten) Geschwistern als Negativkontrollen aus. Wenn Explantate korrekt durchgeführt werden, verlängern oder exprimieren diese Explantate keine Marker von Endoderm, Mesoderm oder Neuroektoderm. - Legen Sie die explantierten Kulturplatten in den 28,5 °C Inkubator, bis der gewünschte Zeitpunkt/das gewünschte Stadium (bestimmt aus intakten Geschwistern) erreicht ist.
HINWEIS: Bei der Behandlung von Explantaten mit einer Verbindung, z. B. einem niedermolekularen Inhibitor, kann die gewünschte Konzentration zu den gewünschten Zeitpunkten direkt in das explantierte Medium innerhalb der Vertiefungen gegeben werden. Denken Sie daran, das Volumen von Agarose bei der Berechnung der Konzentrationen einzubeziehen. (Beispiel: 1 mL Agarose + 4 mL explantierte Medien = 5 mL Gesamtvolumen pro Vertiefung).
5 Chimäre Explantate vorbereiten
- Anstelle einer normalen, mit Agarose beschichteten Platte chimäre Explantate in eine Schale schneiden, in der Agarose mit 1 mm Glasperlen in zwölf kleine, flache Vertiefungen geformt wird (Abschnitt 1.2.4). Füllen Sie diesen Teller mit 3x Danieaus Lösung.
HINWEIS: Chimäre Explantate werden aus Blastodermzellen von zwei Embryonen unterschiedlicher Genotypen oder Bedingungen erzeugt. Stellen Sie sicher, dass diese Bedingungen durch die Expression transgener oder injizierter fluoreszierender Marker voneinander unterschieden werden können.- Bereiten Sie sich vor, indem Sie zwölf Embryonen eines Genotyps / Zustands auf der linken Seite der Platte und zwölf Embryonen des anderen Genotyps / Zustands auf der rechten Seite der Platte hinzufügen.
- Bewegen Sie einen Embryo jeder Erkrankung in die Mitte der Platte, in der Nähe einer der 12 Vertiefungen.
- Schneiden Sie mit einer Pinzette aus jedem Embryo eine Explantate ab, wie für einzelne Embryo-Explantate beschrieben (Schritt 4.3).
- Drücken Sie schnell die Schnittkanten der beiden Explantaten innerhalb des flachen Brunnens mit einer Pinzette zusammen, damit die beiden Hälften zusammen zu einer einzigen Explantation heilen können.
- Fahren Sie mit den verbleibenden elf Vertiefungen innerhalb der Platte fort. Sobald die Expflanzen verheilt sind, geben Sie sie in den Brunnen einer 6-Well-Platte, die mit Agarose beschichtet und mit 4 ml Explantatmedien gefüllt ist. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Expflanzen erreicht ist.
6 Kultur und/oder Bild der fixierten Expflanzen
- Die Kultur explantiert sich im 28,5 °C-Inkubator, bis intakte Geschwisterembryonen das gewünschte Stadium erreicht haben.
- Live-Explantate können für kontinuierliche Zeitrafferaufnahmen montiert, während der gesamten Kulturperiode periodisch abgebildet oder live am experimentellen Endpunkt abgebildet werden.
- Reparieren Sie die Explantate, falls gewünscht. Sobald die Explantate den gewünschten Endpunkt erreicht haben, notieren Sie sich das Stadium der intakten Embryo-Geschwister und legen Sie die Explantate in eine Glasszintillationsfläschchen mit 1 ml 4% Paraformaldehyd in PBS. Über Nacht auf einem Shaker bei 4 °C fixieren.
VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig. Tragen Sie beim Umgang mit dieser Chemikalie Handschuhe und entsorgen Sie sie mit methodengeprüften Methoden, die von jeder Institution zugelassen sind.- Nach der Fixierung die Explantate sechsmal, jeweils 15 Min. mit PBS + 0,1% Tween-20, ausspülen und allmählich zu Methanol dehydrieren. Lagern Sie explantierte Pflanzen bei -20 °C für eine spätere Analyse durch die Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung, Immunfluoreszenzfärbung usw.
Representative Results
Knotenliganden treiben keimschichtbildung und C&E von Zebrafisch-Blastodermen-Explantaten voran
Kontrollexplantate, die aus nicht injizierten Wildtyp-Embryonen (WT) oder solchen, denen 50 pg mRNA-kodierendes grün fluoreszierendes Protein (GFP) injiziert wurden, blieben während des gesamten Kulturzeitraums gerundet(Abbildung 2A-C)und konnten keine Marker für Mesoderm, Endoderm oder Neuroektoderm exprimieren ( Abbildung3C)20. Zusammen weisen diese auf ein Fehlen der Morphogenese und Keimschichtbildung hin, die die Gastrulation von Wirbeltieren charakterisieren. Explantate, die aus Embryonen geschnitten wurden, denen 10 pg ndr2 mRNA injiziert wurden, wurden jedoch nach 8-9 h in Kultur stark verlängert (Abbildung 2D). Die Live-Zeitrafferbildgebung dieser Explantaten durch differentielle interferierende Kontraste (DIC)-Mikroskopie ergab, dass die Extension bei oder um 8 h nach der Befruchtung (hpf) einsetzt(Abbildung 2F),zur gleichen Zeit, zu der die C&E-Morphogenese in intakten Zebrafischembryonen beginnt22. Explantate, die aus MZoep-/- Embryonen geschnitten wurden, denen der essentielle tdgf1-Knoten-Co-Rezeptor 23fehlt, konnten als Reaktion auf die ndr2-Injektion nicht verlängert werden (Abbildung 2E), was zeigt, dass die Knotenaktivität für diese Ex-vivo-Morphogenese entscheidend ist. Darüber hinaus zeigte die Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung weiterhin, dass ndr2-exprimierendeExplantaten Marker des Neuroektoderms (sox2) und mehrerer Mesoderm-Subtypen (tbxta, noto, tbx16) (Abbildung 2G) sowie endoderm und des embryonalen Organizers 20exprimieren.
Für die Neuroektoderm-Induktion durch Mesoderm ist keine Knotensignalisierung erforderlich
Die Knotensignalaktivität ist für die Induktion von Endodermen und den meisten Mesodermen unerlässlich, ist aber für die Neuroektodermspezifikation innerhalb der Zebrafischgastrulae23,24entbehrlich. Während nicht injizierte Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten nicht in Neuroektoderm differenzierten(Abbildung 3C18),zeigten Explantaten aus Embryonen, denen 10 pg ndr2 injiziert wurde, eine robuste Expression des Neuroektoderm-Markers sox2 in verschiedenen Streifen entlang der Längsachse des Explantats (Abbildung 2G), was darauf hindeutet, dass für die Neuroektodermbildung ex vivoeine Knotenaktivität erforderlich ist. Es ist seit langem bekannt, dass mesodermales Gewebe Nervengewebe25,26 ,27,28,29, einschließlich in Zebrafisch Blastoderm Explantate17. Es ist jedoch unklar, ob die Neuroektodermbildung in diesem Explantatsystem eine Nodalsignalisierung direkt erfordert oder ob exogene Knotenliganden Mesoderm induzieren, das dann sekundär neuronale Gewebe induziert.
Chimäre Explantate, die prospektive Mesoderm- und Neuroektodermanteile aus zwei verschiedenen Embryonen enthielten, wurden erzeugt, um zu testen, ob eine Knotensignalisierung gewebeautonom für die Neuroektodermspezifikation ex vivoerforderlich ist. Der Mesodermanteil jeder Explantat wurde aus einem ansonsten WT-Embryo geschnitten, der einen mesodermspezifischen transgenen GFP-Reporter, Tg[lhx1a:eGFP]30,exprimiert, injiziert mit einer hohen Dosis (100 pg) ndr2 (Abbildung 3A). Der mutmaßliche Neuroektoderm-Anteil jedes Explantats wurde entweder aus einem Kontroll-WT-Embryo oder einem Nodal-Signal-defizienten MZoep-/- Embryo geschnitten, dem nur mRNA injiziert wurde, die für den fluoreszierenden Kernmarker H2B-RFP kodiert (Abbildung 3A). Jedes chimäre Explantat wurde durch Kombination eines Blastoderms aus jeder dieser beiden Bedingungen erzeugt, die für die Expression von gewebespezifischen Markern durch Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung bei 12 hpf untersucht wurden.
Die Mehrheit der Einzelembryo-Explantate aus Embryonen, denen 100 pg ndr2 injiziert wurden, exprimierte wenig oder keinen Sox2und exprimierte Marker des Mesoderms, einschließlich tbxta und des lhx1a:gfp-Reporters, während der gesamten Explantation (Abbildung 3B,G). Uninjiziertes WT-Blastoderm (von dem Typ, der den prospektiven Neuroektodermanteil chimärer Explantaten umfasst) exprimierte weder Mesodermmarker noch sox2, wenn es als einzelne Explantat kultiviert wurde, was auf einen Mangel an Neuroektoderm- und Mesodermspezifikation hinweist (Abbildung 3C,H). Einzelembryo-Explantate aus MZoep-/- Embryonen fehlten ebenfalls die Expression von Neuroektoderm- und Mesodermmarkern, selbst wenn sie mit ndr2 injiziert wurden (Abbildung 3D). Wenn jedoch nicht injizierte WT-Blastodermen mit Mesodermen kombiniert wurden, die durch hohe Dosen von Knotenliganden induziert wurden, exprimierten diese chimären Explantate sowohl Mesodermmarker als auch sox2 robust (Abbildung 3E,I). Diese Ergebnisse zeigen, dass, wie zuvorbeobachtet, 17,26,27,29, Mesoderm neuronales Schicksal in Zellen induzieren kann, die sonst zu einem nicht-neuralen Ektoderm werden würden. Um zu testen, ob eine Knotensignalisierung direkt innerhalb des prospektiven Neuroektodermenanteils dieser Explantate für ihre neuronale Induktion erforderlich ist, wurden chimäre Explantate aus WT-Blastodermen, die mit 100 pg ndr2 injiziert wurden, und Blastodermen aus MZoep-/- Embryonen hergestellt (Abbildung 3J). Trotz ihrer Unfähigkeit, Knotensignale aus dem benachbarten mesodermalen Teil zu empfangen, exprimierten diese Explantate sox2 in einem ähnlichen Maße wie WT-Kontrollchimären (Abbildung 3F). Dieses Ergebnis zeigt, dass im Einklang mit intakten Embryonen, in denen neuronale Gewebe in Abwesenheit von Knotenaktivität spezifiziert sind, Nodalsignalisierung nicht gewebeautonom für die Neuroektoderm-Induktion ex vivoerforderlich ist.
Abbildung 1: Verfahren für die Explantation von Zebrafischen blastodermen (Schritt 4.3). (A) Halten Sie die Pinzette in der nicht dominanten Hand (orange) gegen das Eigelb geschlossen, um den Embryo zu stabilisieren, während Sie den Blastoderm auf etwa 1/2 seiner Höhe mit der Pinzette in der dominanten Hand (blau) einklemmen. (B) Führen Sie die orangefarbene Pinzette entlang des Randes der blauen Pinzette, um den Embryo zu greifen, um durch das Blastoderm zu schneiden, so dass der erste Schnitt ungefähr die Hälfte des Blastoderms erreicht. (C) Drehen Sie den Embryo um 90 °, legen Sie dann die blaue Pinzette in den ursprünglichen Schnitt (aber orthogonal zu) und drücken Sie, um das verbleibende Blastoderm zu durchtrennen. (D) Lassen Sie explantierte Blastodermzellen in 3x Danieaus Lösung für ca. 5 min heilen, bevor sie in explantierte Medien übergehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 (modifiziert von20):Knotenliganden fördern die C&E-Morphogenese und keimschichtbildung in Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten. (A) Diagramm der Injektion und Explantation von Zebrafischembryonen. (B-E) Repräsentative Hellfeldaufnahmen von lebenden Blastodermenexplantaten der angegebenen Bedingungen/Genotypen im Äquivalent des 2-4-Somite-Stadiums. N = Anzahl der Explantaten aus zwei bis vier unabhängigen Versuchen. (F) Zeitraffer-DIC-Serie eines repräsentativen Explantats aus einem WT-Embryo, dem 10 pg ndr2 RNA injiziert wurde. G) Repräsentative Bilder der Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung für die Transkripte, die in Explantaten von WT-Embryonen angegeben sind, denen 10 pg ndr2 RNA injiziert wurde. Maßstabsbalken sind 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3 (modifiziert von31):Chimäre Explantate zeigen, dass die Neuroektodermspezifikation keine gewebeautonome Knotensignalisierung ex vivoerfordert. (A) Diagramm des Verfahrens zur Erzeugung chimärer Zebrafisch-Explantaten. (B-F) Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung für den Mesoderm-Marker tbxta (oben) und den Neuroektoderm-Marker sox2 (unten) in Explantaten aus WT-Embryonen, die mit 100 pg ndr2 RNA (B) injiziert wurden , nicht injizierte WT-Kontrollen (C), MZoep-/- injiziert mit 10 pg ndr2 (D) und chimären Explantaten, die Neuroektodermanteile aus WT (E) oder MZoepenthalten -/- (F ) Embryonen im Äquivalent des 2-4-Somite-Stadiums. Brüche geben die Anzahl der Explantaten an, wobei der Phänotyp über die Gesamtzahl der untersuchten Expflanzen angezeigt wird. (G-J) Repräsentative Bilder von lebenden Tg[lhx1a:gfp] Explantraten aus einem einzelnen Embryo (G-H) oder kombiniert mit H2B-exprimierenden Blastodermen (I-J, Magenta) der Bedingungen, die im Äquivalent des 2-4 Somite-Stadiums angegeben sind. N = Anzahl der Explantaten aus drei unabhängigen Versuchen. Maßstabsbalken sind 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Lösung 1 | Lösung 2 | Lösung 3 | Lösung 4 | |
| Lösung | 3x Danieau's | Ei-Wasser | Explantierte Medien | 0,3x Danieau's |
| Zutaten | 174 mM NaCl | 60 μg/mL Meersalze | DMEM/F12 + 2,5 mM L-Glutamin und 15 mM HEPES | 17,4 mM NaCl |
| 2,1 mM KCl | 1 L destilliertes Wasser | 3% Gesamtvolumen von Newborn Calf Serum oder Fetal Bovine Serum | 0,21 mM KCl | |
| 1,2 mM MgSO4. 7H2O | 1:200 Penicillin (50 Einheiten/ml)-Streptomycin (50 μg/ml) | 0,12 mM MgSO4•7H2O | ||
| 1,8 mM Ca(NO3)2 •4H2O | 0,18 mM Ca(NO3)2 •4H2O | |||
| 15 mM HEPES | Beispiel: | 1,5 mM HEPES | ||
| Destilliertes Wasser | 4 ml/Zustand x 9 Bedingungen = 36 ml | Destilliertes Wasser | ||
| 1,08 ml Newborn Calf Serum (NCS, aliquoted in -20 °C (3%) | ||||
| 0,18 ml 200x Pen-Strep (PS, aliquoted in -20 °C) (1:200) | ||||
| 35 ml DMEM/F12 |
Tabelle 1.
Discussion
Dieser Artikel hat beschrieben, wie Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten erzeugt werden können, und zwei praktische Anwendungen dieser Explantaten diskutiert, um die Rolle der Knotenmorphogensignalisierung bei der Gastrulation anzugehen. Diese Methode des Schneidens und Kultivierens von Explantaten liefert ein unbeschriebenes Blatt naiver Zellen, die mit RNA-Injektionen und der Behandlung mit niedermolekularen Verbindungen manipuliert werden können, um einen molekularen Weg von Interesse zu untersuchen.
Kritische Schritte
Es gibt vier Schritte in diesem Protokoll, die für seinen Erfolg besonders entscheidend sind. Die erste besteht darin, den Embryonen die entsprechende Menge Nodal zu injizieren. Dieses Protokoll empfiehlt 10 pg ndr2 RNA, und obwohl eine Reihe von Dosen die Erweiterung fördert, verhindert zu viel oder zu wenig Nodal eine optimale Explantatverlängerung20. Der zweite Schritt ist die Dekreionierung der Embryonen. Wenn die Embryonen zu lange in der Pronase bleiben, platzt das Eigelb und die Embryonen können nicht geschnitten werden. Wenn sie nicht lange genug in der Pronase sind, werden die Chorionen durch das Waschen nicht gelockert und erfordern stattdessen eine zeitaufwendige manuelle Dekationierung. Der dritte kritische Schritt ist das Schneiden der Explantate. Das Einschneiden in 3x Danieaus Lösung wird empfohlen, da der niedrigere Salzgehalt von 0,3x Danieaus Lösung oder Eiwasser die Heilung und das Überleben von Explantaten nicht fördert.
Zusätzlich müssen die Explantate in etwa halber Höhe des Blastoderms geschnitten werden, um die Naivität der Zellen zu gewährleisten. Wenn sie zu nahe am Eigelb geschnitten werden, enthalten sie Signale vom Rand (einschließlich endogener Knoten), die die Gewebespezifikation und Morphogenese fördern. Der vierte und letzte kritische Schritt ist die Heilung von chimären Explantaten. Zwei Expflanzen verschmelzen nicht zu Chimären, es sei denn, ihre Schnittkanten werden unmittelbar nach dem Schneiden vorsichtig zusammengedrückt.
Änderungen und Fehlerbehebung
Die oben beschriebenen kritischen Schritte bieten Möglichkeiten zur Fehlerbehebung. Einige häufige Probleme und Lösungsvorschläge werden im Folgenden vorgestellt.
Wenn sich Explantaten in Gegenwart von Knotensignalisierung nicht ausdehnen, gibt es einige mögliche Lösungen. (A) Injektion von Embryonen im Einzelzellstadium, um sicherzustellen, dass die RNA gleichmäßig über den gesamten Embryo verteilt ist. (B) Vermeiden Sie die Injektion von zu viel Knoten-RNA, indem Sie sicherstellen, dass das injizierte Volumen korrekt ist, indem Sie einen Mikrometer verwenden, um den Injektionsbolus zu messen. (C) Vermeiden Sie es, zu wenig Knoten-RNA zu injizieren, indem Sie ihre Konzentration messen, um sicherzustellen, dass sie nicht abgebaut wurde. (D) Bewahren Sie einige altersangepasste intakte Geschwister auf, um auf das äquivalente Stadium der Expflanzen zu schließen. Explantaten erreichen die maximale Ausdehnung, wenn intakte Geschwister das 2-5-Somite-Stadium erreichen. Wenn die Explantate zu früh gesammelt werden, wird die optimale Ausdehnung nicht erreicht.
Wenn das Eigelb nach der Dekaionierung platzt und die Embryonen nicht schnittbar sind, entfernen Sie die Embryonen aus der Pronaselösung, sobald die Chorionen zu knittern beginnen und 1-2 Embryonen ihr Chorion abwerfen. Dann sofort in Eiwasser abspülen.
Wenn die Explantate an den Rändern sprudelnd erscheinen, gibt es einige Lösungen. (A) Schneiden Sie Expflanzen nur innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens der Entwicklung. Obwohl Explantaten, die in jedem Stadium von 128- bis 1000-Zell-Stadien geschnitten werden, in Kultur überleben und sich ausdehnen können, neigen diejenigen, die in 256- bis 512-Zell-Stadien geschnitten werden, dazu, die robustesten zu sein. (B) Stellen Sie sicher, dass Explantaten in 3x Danieaus Lösung geschnitten werden, um eine ordnungsgemäße Heilung zu gewährleisten. (C) Explantate sauber, aber schonend schneiden. Vermeiden Sie es, die Zellen während des Schneidvorgangs zu dehnen oder auseinander zu ziehen.
Wenn sich die nicht injizierten Kontroll-Explantate ausdehnen, schnitten explantierte Explantate wahrscheinlich zu nahe am Eigelb. Damit Explantate naiv sind, stellen Sie sicher, dass die Schnitte auf halbem Weg zwischen dem Eigelb und der Oberseite des Blastoderms erfolgen.
Wenn die chimären Explantate nicht verschmelzen, liegt dies wahrscheinlich daran, dass die Tendenz von Explantaten in 3x Danieaus Lösung nach dem Schneiden darin besteht, sich über die Schnittkante aufzurunden und zu heilen. Um sicherzustellen, dass die beiden Blastodermen zueinander und nicht zu sich selbst heilen, drücken Sie sie sofort nach dem Schneiden zusammen. Verwenden Sie eine Pinzette, um sanften Druck auf die neu verbundenen Blastodermen im Agarose-Brunnen auszuüben, um sie zur gemeinsamen Heilung zu ermutigen.
Begrenzungen
Während diese Explantate ein wertvolles Werkzeug sind, um die Rolle eines bestimmten Morphogens (oder eines anderen Moleküls von Interesse) in relativer Isolation zu untersuchen, müssen Beobachtungen in jedem Ex-vivo-Modell mit Vorsicht interpretiert werden. Explantate weisen eine C&E-Morphogenese auf, die der in vivo20beobachteten sehr ähnlich ist, aber sie rekapitulieren nicht alle Aspekte der Gastrulation, zum Beispiel Epiboly-Bewegungen. Ihnen fehlen auch viele andere regulatorische Faktoren und Signalmoleküle, die in einem intakten Embryo vorhanden sind. Während dies ein bedeutender experimenteller Vorteil von Explantaten ist, kann es auch zu Schlussfolgerungen führen, die in vivonicht gelten. Da beispielsweise Explantaten, die keine exogenen Nodalliganden erhalten, keine Neuroektodermmarker exprimieren, könnte man allein aus Explantaten schließen, dass die Knotensignalisierung für die Neuroektodermspezifikation erforderlich ist. Neuroektoderm wird jedoch in intakten Embryonen gebildet, denen alle Knotensignale fehlen23,24, was die lebenswichtige Rolle anderer Signalmoleküle in der neuronalen Spezifikation32zeigt. Explantate können uns sagen, wozu ein Morphogen in einer isolierten Umgebung fähig ist. Dennoch sollten alle diese Befunde in intakten Embryonen bestätigt / verglichen werden, damit die Ergebnisse gründlich interpretiert werden können. Mit anderen Worten, Explantaten können nicht den Platz eines sich entwickelnden Embryos einnehmen. Stattdessen sind sie ein ergänzendes Werkzeug, um die Rolle und Beziehung eines Morphogens mit der Umgebung zu identifizieren. Vor diesem Hintergrund sind Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten ein wertvolles Werkzeug für viele Forschungsfragen.
Bedeutung gegenüber bestehenden Methoden
Mit dem erneuten Interesse an der synthetischen Embryologie werden regelmäßig verschiedene ex vivo- und in vitro-Ansätze eingesetzt, um Aspekte der Embryonalentwicklung zu modellieren. Zum Beispiel können 2- und 3-dimensionale Gastruloide, die aus embryonalen / induzierten pluripotenten Stammzellen der Maus oder des Menschen bestehen, durch die Anwendung exogener Signalmoleküle dazu gebracht werden, einige der Muster- und / oder morphogenetischen Ereignisse der Gastrulation, Segmentierung und Neurulation zu rekapitulieren33,34,35,36,37 . Obwohl diese Methoden leistungsfähig sind, erfordern sie mühsame und verlängerte Kulturmethoden, um sowohl pluripotente Stammzellen kontinuierlich zu erhalten als auch Gastruloiden zu züchten, die viele Tage benötigen, um Gastrulationsstadien zu erreichen. Im Gegensatz dazu benötigen Zebrafisch-Explantate keine Pflege von Stammzellkulturen, da Embryonen einfach nach Bedarf entnommen werden. Sie sind relativ einfach zu erzeugen und erreichen Gastrulationsstadien innerhalb von Stunden, genau wie Zebrafischembryonen. Dies unterstreicht einen weiteren Vorteil von Zebrafisch-Explantaten, ihre intakte Entwicklungsuhr. Da das Entwicklungsalter embryonaler und induzierter pluripotenter Stammzellen variabel und stark diskutiert sein kann, sind embryonale Explantaten vielleicht besser geeignet, um die zeitliche Regulation der Entwicklung zu untersuchen. Schließlich, während sich Pescoid-Zebrafisch-Expflanzen (die den embryonalen Rand enthalten) in Kultur12,13ähnlich ausdehnen, tun sie dies als Reaktion auf endogene Signalzentren. Stattdessen ermöglichen die hier beschriebenen Explantate den Forschern, Moleküle von Interesse mit relativ wenig Interferenz durch solche embryonalen Signale zu untersuchen.
Mögliche zukünftige Anwendungen
Hier wurden Explantaten verwendet, um zu zeigen, dass die Knotensignalisierung für die C&E-Morphogenese notwendig und ausreichend ist. Es wird jedoch erwartet, dass sie verwendet werden können und werden, um die Rolle vieler verschiedener Moleküle in vielen anderen Entwicklungsprozessen zu erkennen, zum Beispiel bei der Regulation der Genexpression, Signalgradienten und zusätzlichen morphogenetischen Programmen. Da diese Explantate bis mindestens 24 hpf19lebensfähig sind, kann erwartet werden, dass sich ihr Nutzen über die Gastrulation hinaus auf Prozesse wie Segmentierung und Organogenese erstreckt, jeden Prozess, bei dem Forscher ein unbeschriebenes Blatt in der Entwicklung wünschen.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NICHD R00HD091386 an MLKW und an NIEHS T32ES027801 an AAE unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
| 6-well plates | Fisher | FB012927 | |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
| Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
| DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
| Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
| Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
| Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
| HEPES | VWR | JT4018-1 | |
| Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| KCl | VWR | BDH9258-500G | |
| Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
| MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
| Mineral oil | VWR | MK635704 | |
| NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
| Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
| Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
| Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
| Tween-20 | VWR | 200002-836 |
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