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Developmental Biology

जेब्राफिश भ्रूण से भोले ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट की पीढ़ी

Published: July 30, 2021 doi: 10.3791/62797
Automatic Translation
1, 1
1Center for Precision Environmental Health and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट शुरुआती भ्रूण के भीतर अंतर्जात संकेत केंद्रों से भ्रूण कोशिकाओं को अलग करके उत्पन्न होते हैं, अपेक्षाकृत भोले कोशिका समूहों को आसानी से हेरफेर और सुसंस्कृत पूर्व वीवोका उत्पादन करते हैं। यह लेख इस तरह के एक्सप्लांट बनाने के लिए निर्देश प्रदान करता है और गैस्ट्रेशन के दौरान नोडल सिग्नलिंग के लिए भूमिकाओं से पूछताछ करके उनकी उपयोगिता को दर्शाता है।

Abstract

उनकी ऑप्टिकल स्पष्टता और तेजी से विकास के कारण, जेब्राफिश भ्रूण सेल व्यवहार और विकास प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली है। हालांकि, भ्रूणीय संकेतों की जटिलता और अतिरेक के कारण, प्रारंभिक भ्रूणजेने की बीमारी के दौरान किसी भी एक संकेत की पूरी भूमिका को समझना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म के पशु क्षेत्र को बाहर निकालकर, भ्रूणीय कोशिकाओं के अपेक्षाकृत भोले समूह उत्पन्न होते हैं जिन्हें आसानी से सुसंस्कृत और पूर्व वीवोमें हेरफेर किया जा सकता है। निष्कासन से पहले आरएनए इंजेक्शन द्वारा ब्याज की एक जीन शुरू करके, एक जीन अभिव्यक्ति, सेल व्यवहार, और सापेक्ष अलगाव में अन्य विकास प्रक्रियाओं पर इस अणु के प्रभाव का आकलन कर सकते हैं। इसके अलावा, विभिन्न जीनोटाइप या स्थितियों के भ्रूण से कोशिकाओं को कोशिका/ऊतक बातचीत और ऊतक-विशिष्ट जीन कार्यों की जांच करने के लिए एक ही चिमेरिक एक्सप्लांट में जोड़ा जा सकता है । यह लेख जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट पैदा करने के लिए निर्देश प्रदान करता है और यह दर्शाता है कि एक ही सिग्नलिंग अणु - एक नोडल लिगांड - अन्यथा भोले भ्रूणीय ऊतकों में रोगाणु परत गठन और विस्तार मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। एक सरलीकृत पूर्व वीवो प्रणाली में भ्रूण कोशिका व्यवहार, मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट, और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को फिर से काटना करने की उनकी क्षमता के कारण, इन एक्सप्लांट्स को कई जेब्राफिश शोधकर्ताओं के लिए महान उपयोगिता होने का अनुमान है।

Introduction

विकासात्मक जीव विज्ञान क्षेत्र का एक बारहमासी लक्ष्य पशु रूप और समारोह की उत्पत्ति को समझने के लिए भ्रूण के विकास की जटिलता को सुलझाना है। यहां तक कि शुरुआती भ्रूण में संकेत अणुओं, कोशिका और ऊतक बातचीत, और यांत्रिक बलों का एक जटिल मिश्रण होता है, जो सभी सख्त स्थानिक और लौकिक विनियमन के अधीन होते हैं। इस कारण से, यह अक्सर ब्याज की एक विकास प्रक्रिया में एक विशेष संकेत की सटीक भूमिका तुच्छ चुनौतीपूर्ण है । भ्रूण के ऊतकों को उनके अंतर्जात वातावरण से हटाकर, भ्रूण निष्कासन एक सरलीकृत मंच बनाता है जिसमें सापेक्ष अलगाव में व्यक्तिगत ऊतकों और अणुओं की विकासात्मक भूमिकाओं को समझने के लिए। एक्सोपेशन तकनीकों को शायद ज़ेनोपस लेविसमें जाना जाता है, जहां उनका उपयोग ऊतक प्रेरण, कोशिका संकेत, कोशिका आसंजन और मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए किया गया है, अन्य प्रक्रियाओं के बीच1,2,3,4। तथाकथित पशु टोपी एक्सप्लांट, जिसमें ब्लास्टुला चरण ज़ेनोपस भ्रूण के पशु क्षेत्र को प्रेरक बातचीत से पहले अलग किया जाता है5,6,7,एक व्यापक और शक्तिशाली एक्सप्लांट तकनीक हैं। बिना किसी जानवर की टोपियां 7 ,8ectodermबननेके लिएवसाितहैं । फिर भी, वे कई प्रेरक कारकों का जवाब देने में सक्षम हैं, जिससे वे तीनों रोगाणु परतों के ऊतकों का निर्माण कर सकते हैं और ऊतक-उपयुक्त मॉर्फोजेनेटिक आंदोलनों9,10,11से गुजरना करसकतेहैं। हालांकि, लाइव इमेजिंग के लिए सीमित आनुवंशिक उपकरण और उप-इष्टतम उपयुक्तता कई विकासात्मक जीवविज्ञानियों के लिए ज़ेनोपस पशु कैप एक्सप्लांट के उपयोग को रोकती है। जेब्राफिश भ्रूण से ब्लास्टोडर्म कोशिकाओं को हटाकर, शोधकर्ता ऑप्टिकल स्पष्टता, आनुवंशिक उपकरणों की बहुतायत, और जेब्राफिश मॉडल प्रणाली के अन्य प्रयोगात्मक लाभों के साथ पशु टोपी परख की उपयोगिता को जोड़ सकते हैं।

आज तक, शोधकर्ताओं ने जेब्राफिश एक्सप्लांट के दो जायके का उपयोग किया है: तथाकथित पेस्कोइड और ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट। पेस्कोइड मॉडल में, सीमांत क्षेत्र सहित पूरे ब्लास्टोडर्म को जर्दी से अलग किया जाता है और एक्स वीवो को एक्स वीवो विकसित करने की अनुमति दी जाती है, बिना एक्स एम्ब्रेनिक जर्दी सिंकाइटियाल लेयर (वाईएसएल)12,13। इस तरह, पेस्कोइड जेन ओपेनहाइमर और जेपी ट्रिंकौस14, 15द्वारा दशकों पहले उत्पन्न फंडुलस एक्सप्लांट्स के लिए एक उल्लेखनीय समानता को सहन करते हैं। ये पौधे भ्रूणीय पैटर्निंग और मॉर्फोजेनेसिस12,13के कई पहलुओं को फिर से ढिंढाकरतेहैं . हालांकि, क्योंकि इन आइसोलेट में अंतर्जात संकेत केंद्र (भ्रूणीय मार्जिन) होते हैं, उन्हें उनके आणविक परिवेश के संबंध में सरल नहीं किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, शोधकर्ता सीमांत क्षेत्र 16 , 17 ,18, 19, 20,21को छोड़कर अपेक्षाकृत भोले जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट उत्पन्न करसकतेहैं। अनमैनीप्ड जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट्स बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) मॉर्फोजेन्स19 के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं और पूर्व वीवो18को संस्कारित होने पर गैर-तंत्रिका ectoderm और घेर परत (ईवीएल) को जन्म देते हैं। हालांकि, वे एक्सोजेनस सिग्नलिंग ग्रेडिएंट्स19,20, 21केजवाब में एक्सियल पैटर्निंग और मॉर्फोजेनेसिस के कई पहलुओं को फिर से पहचानते हैं, जो ज़ेनोपस एनिमल कैप्स के समान हैं। इस कारण से, ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट एक सरलीकृत सिग्नलिंग वातावरण के भीतर रोगाणु परत विनिर्देश, मॉर्फोजेनेटिक सेल आंदोलनों और सिग्नलिंग ग्रेडिएंट्स में दिए गए मॉर्फोजेन (या मॉर्फोजन) की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद मॉडल हैं। इसके अलावा, विभिन्न जीनोटाइप या स्थितियों के भ्रूण से ब्लास्टोडर्म को सेल/ऊतक स्वायत्तता और प्रेरक बातचीत की जांच करने के लिए एक ही चिमेरिक एक्सप्लांट19,21 में जोड़ा जा सकता है ।

जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट्स का उपयोग गैस्ट्रुलेशन के दौरान मॉर्फोजेनेसिस और ऊतक विनिर्देश में भ्रूणीय संकेतों (उदाहरण के लिए, नोडल) की भूमिका की जांच करने के लिए किया जा सकता है। एकल कोशिका चरण में सिंथेटिक ndr2 आरएनए (एक नोडल लिगामेंट) इंजेक्शन द्वारा, नोडल सिग्नलिंग भ्रूण के ब्लास्टोडर्म भर में सक्रिय है। इन भ्रूणों से निकाले गए पौधे नोडल सिग्नलिंग ग्रेडिएंट उत्पन्न करते हैं, सभी तीन रोगाणु परतों का निर्माण करते हैं, और अक्षुण्ण भ्रूण20में देखे गए अभिसरण और विस्तार (सीएंडई) गैस्ट्रुलेशन आंदोलनों से गुजरते हैं। इसके अतिरिक्त, चिमेरिक एक्सप्लांट का उपयोग मेसोडर्म ऊतकों की क्षमता को स्पष्ट करने के लिए किया जाता है ताकि यूनिजेनेक्टेड (भोली) ब्लास्टोडर्म से न्यूरोेक्टोडर्म को प्रेरित किया जा सके। यह प्रोटोकॉल जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट बनाने के लिए निर्देश प्रदान करता है और ऊतक प्रेरण और मॉर्फोजेनेसिस में नोडल सिग्नलिंग की भूमिका को परिभाषित करने में उनकी उपयोगिता को दर्शाता है।

Protocol

1 रिएजेंट्स और सप्लाई तैयार करें

  1. रिएजेंट तैयारी
    1. 3x Danieau के समाधान के 500 एमएल तैयार (समाधान 1, तालिका 1)।
    2. अंडे के पानी के 1 एल तैयार (समाधान 2, तालिका 1)।
    3. अंडे के पानी में एगरेड का 1.2% समाधान तैयार करें। पूरी तरह से माइक्रोवेव में एगर उठे पिघलाएं, और फिर पानी के स्नान में 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    4. 4 एमएल एक्सप्लांट मीडिया (समाधान 3, तालिका 1, 19सेथोड़ासंशोधित,21)प्रति प्रायोगिक स्थिति तैयार करें।
      नोट: आवश्यक मात्रा की गणना करते समय यूनिजेनेक्टेड (या इंजेक्शन को नियंत्रित करने) से कम से कम एक अच्छी तरह से एक्सप्लांट ्स का ध्यान रखना याद रखें।
      1. 70% इथेनॉल के साथ कार्यक्षेत्र को साफ करें।
      2. सेल कल्चर मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस से हटाएं और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे/वाइप करें।
      3. भ्रूण इंजेक्शन हैं, जबकि गर्म करने के लिए गर्म करने के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक्सप्लांट मीडिया और जगह बनाओ।
        नोट: हमेशा मंचन प्रयोजनों के लिए उंर मिलान, बरकरार भाई भ्रूण शामिल हैं । इन भ्रूणों को डिकोरोनेट करें और उन्हें 0.3x डैनियू के समाधान (समाधान 4, तालिका 1)में एगरैद-लेपित प्लेटों पर संस्कृति दें।
    5. -20 डिग्री सेल्सियस से प्रोनेज एलिकोट्स (20 मिलीग्राम/एमएल पर 1 एमएल) निकालें और बर्फ पर गल जाने दें। हर तीन प्रायोगिक स्थितियों के लिए एक 1 1 एमएल aliquot गल।
  2. एगरेग्यास प्लेट्स तैयार करें
    1. इंजेक्शन प्लेटें बनाएं।
      1. अंडे के पानी में पिघला हुआ एग्राट के साथ 100 एमएम एक्स 15 एमएम प्लास्टिक पेट्री डिश हाफ-वे भरें।
      2. धीरे-धीरे पिघले हुए एग्राम के शीर्ष पर इंजेक्शन मोल्ड रखें और इसे धीरे-धीरे एगर उठे में कम करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई बुलबुले नीचे फंसे हुए हैं। इसे पूरी तरह ठंडा होने दें।
      3. सांचे को हटा दें। तुरंत प्लेट का उपयोग करें या बाद में अंडे के पानी के 2 एमएल जोड़कर, प्लेट को लपेटकर, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करके बचाएं। इंजेक्शन से पहले 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 15-30 मिनट के लिए प्लेट गर्म करें।
    2. एक्सप्लांट कटिंग प्लेट्स बनाएं।
      1. 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में अंडे के पानी में पिघला हुआ 1.2% एगर उठी के 3 एमएल जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कुएं का पूरा नीचे लेपित है। इसे पूरी तरह ठंडा होने दें।
    3. एगर उठे के साथ कोट संस्कृति प्लेटें।
      1. प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए, 6-अच्छी प्लेट के एक कुएं में अंडे के पानी में पिघला हुआ 1.2% एग्रामी के 1 एमएल को वितरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कुएं का पूरा नीचे लेपित है। इसे पूरी तरह ठंडा होने दें।
    4. चिमरिक एक्सप्लांट बनाने के लिए, 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में पिघला हुआ एग्राम में बारह 1 मिमी ग्लास मोतियों को जोड़कर छोटे कुओं के साथ एक एक्सप्लांट कटिंग डिश बनाएं। एक बार एगर उठी पूरी तरह से ठंडा हो जाने के बाद संदंश के साथ मोतियों को हटा दें।

2 आरएनए के साथ भ्रूण इंजेक्ट

  1. दस्ताने पहने हुए, -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से सिंथेटिक ndr2 mRNA का एक aliquot हटा दें और तुरंत इसे बर्फ पर रखें।
  2. इंजेक्शन सुई तैयार करें।
    1. आरएनए के साथ एक खींचा ग्लास केशिका सुई भरें। भरी हुई सुई को माइक्रो मैनिपुलेटर में रखें और संदंश के साथ सुई की नोक को तोड़ें।
    2. खनिज तेल की एक बूंद के साथ एक मंच माइक्रोमीटर का उपयोग कर इंजेक्शन की मात्रा, इंजेक्शन समय और वायवीय इंजेक्टर पर दबाव को समायोजित करने के लिए वांछित आकार के एक बोलस को प्राप्त करने के लिए । 120 माइक्रोन के व्यास वाले बोलस में 1 एन एल की मात्रा होती है।
      नोट: बोलस की वांछित मात्रा आरएनए की एकाग्रता और प्रति भ्रूण वांछित खुराक पर निर्भर करेगी। उदाहरण के लिए, यदि आरएनए को 10 एनजी/माइक्रोन पर अलीकोटक किया जाता है, तो 10 पीजी की अंतिम राशि प्राप्त करने के लिए 1 एनएल इंजेक्ट करें ।
      1. आरएनए सुई टिप को इंजेक्शन लगाने के लिए तैयार होने तक तेल में डूबे रहें।
  3. भ्रूण लोड और सुई।
    1. प्रजनन टैंक में डिवाइडर खींचो, मछली 10-15 मिनट के लिए अंडे के लिए अनुमति देते हैं, और एक चाय छलनी का उपयोग कर भ्रूण इकट्ठा ।
    2. एक पाश्चर पिपेट और पिपेट पंप का उपयोग करके इंजेक्शन प्लेट में भ्रूण लोड करें, और फिर अंडे को धीरे-धीरे गर्त में दबाने के लिए एक दस्ताने उंगली का उपयोग करें।
    3. एकल कोशिका भ्रूण की जर्दी में 10 pg ndr2 आरएनए सुई जब तक भ्रूण की वांछित संख्या तक पहुंच जाता है या जब तक भ्रूण को विभाजित करने के लिए शुरू करते हैं ।
      नोट: भ्रूण भर में आरएनए का वितरण सुनिश्चित करने के लिए एकल कोशिका चरण के बाद इंजेक्शन न दें।
    4. एक निचोड़ बोतल से अंडे के पानी की एक कोमल धारा के साथ एक लेबल १०० मिमी x 15 मिमी पेट्री पकवान में इंजेक्शन प्लेट से बाहर भ्रूण धोलें ।
      नोट: हमेशा आयु मिलान, uninjected भाई बहन के एक समूह को नियंत्रण के रूप में रखें ।
    5. भ्रूण को 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में तब तक रखें जब तक कि वे 128-सेल चरण तक न पहुंच जाएं। डिश से अनिषेचित अंडे और मृत भ्रूण निकालें।

3 भ्रूण को डिकोरीनेट करें

  1. एक बार भ्रूण १२८-सेल चरण तक पहुंच गए हैं, उन्हें लेबल ग्लास पेट्री व्यंजन में रखें और उनसे जितना संभव हो उतना अंडे का पानी डिकंट करें।
  2. लेबल ग्लास प्रयोगशाला टेप के साथ व्यंजन क्रिस्टलाइज (छोटे पकवान नाम के अनुरूप) और अंडे के पानी के साथ रास्ते के 2/3 भरें । इन व्यंजनों को त्वरित पहुंच के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप के बगल में रखें।
  3. 50 एमएल शंकु नली में 3x डैनियू के समाधान के 15 एमएल में 1 एमएल प्रोनेस स्टॉक (20 मिलीग्राम/एमएल, बर्फ पर गल) जोड़ें।
    नोट: यह राशि तीन प्रायोगिक स्थितियों के लिए पर्याप्त है। अतिरिक्त एक्सप्लांट स्थितियों के लिए सर्व और 3x दानीउ के समाधान की मात्रा बढ़ाएं।
    सावधानी: Pronase एक अड़चन है; इसलिए हैंडलिंग करते समय दस्ताने पहनें।
  4. भ्रूण युक्त प्रत्येक ग्लास पेट्री डिश के लिए कम से कम 5 एमएल प्रोन्स समाधान जोड़ें।
  5. एक परिपत्र गति में कांच के व्यंजनों को उत्तेजित करें, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत लगातार डिकोरियोनेशन की प्रगति की निगरानी करें।
  6. एक बार कोशन शिकन शुरू और 1-2 भ्रूण उनके chorions से बाहर हैं, ध्यान से कांच पेट्री प्रोन्स युक्त पकवान डुबो देना और इसी गिलास सघन अंडे के पानी युक्त पकवान में भ्रूण ।
  7. डिकेरियोनेटेड भ्रूण को धो लें।
    1. भ्रूण को अंडे के पानी से तीन बार धीरे-धीरे जोड़कर धोएं और फिर डिश से अंडे के पानी को डिकंटिंग करें ।
    2. तीसरा और अंतिम धोने 0.3x Danieau समाधान के साथ है ।
      नोट: यदि भ्रूण धोने के बाद अभी भी chorions है, धीरे से भ्रूण पाइप जब तक chorions हटा रहे है या उंहें धोने में बैठने (अंडा पानी या 0.3x है Danieau समाधान) एक या दो मिनट के लिए और धीरे परिपत्र गति के साथ आंदोलन ।
  8. पेट्री डिश के ढक्कन के साथ डिकेरियोनेटेड भ्रूण को कवर करें और उन्हें इनक्यूबेटर (28.5 डिग्री सेल्सियस) पर तब तक वापस करें जब तक कि वे 256-सेल चरण तक न पहुंच जाएं।

4 कट एक्सप्लांट्स

  1. 3x डैनियू के घोल के साथ एगरग्रेटेड 60 एमएम एक्स 15 एमएम पेट्री डिश भरें।
  2. एक बार भ्रूण २५६-सेल चरण में हैं, उन्हें 3x Danieau समाधान युक्त agarose-लेपित थाली में स्थानांतरित, उन्हें अस्तर पकवान के केंद्र के साथ।
  3. संदंश(चित्रा 1)का उपयोग करके एक्सप्लांट काटें।
    1. भ्रूण को स्थिर करने के लिए बंद किए गए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें और दूसरे का उपयोग अपनी ऊंचाई के लगभग आधे हिस्से (मार्जिन से पशु ध्रुव तक)(चित्रा 1A)पर ब्लास्टोडर्म के माध्यम से काटने के लिए करें।
    2. काटने के लिए, धीरे-धीरे ब्लास्टोडर्म कोशिकाओं को एक जोड़ी संदंश के साथ निचोड़ें। फिर, स्थिर संदंश लें और उन्हें अन्य संदंश के साथ चलाएं ताकि ब्लास्टोडर्म(चित्रा 1B)में लगभग आधे रास्ते का टुकड़ा हो सके।
    3. भ्रूण को घुमाएं, संदंश को मौजूदा कट में रखकर, और फिर शेष ब्लास्टोडर्म ऑर्थोगोनल को पहले कट(चित्रा 1C)में तोड़ ें।
  4. कम से कम 5 मिनट के लिए 3x डैनिएउ के समाधान में एक्सप्लांट रखें, फिर उन्हें एगर उठे और एक्सप्लांट मीडिया के 4 एमएल से भरे 6-अच्छी प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें।
    नोट: नकारात्मक नियंत्रण के रूप में यूनिजेनेक्टेड (या इंजेक्शन को नियंत्रित) से एक्सप्लांट काटें। यदि एक्सप्लांट सही ढंग से किए जाते हैं, तो ये एक्सप्लांट न तो एंडोडर्म, मेसोडर्म या न्यूरोेक्टोडर्म के मार्कर का विस्तार करेंगे और न ही व्यक्त करेंगे।
  5. वांछित समय बिंदु/चरण (बरकरार भाई बहन से निर्धारित) तक पहुंचने तक 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक्सप्लांट संस्कृति प्लेटों रखें।
    नोट: यदि एक यौगिक के साथ एक्सप्लांट का इलाज, जैसे कि एक छोटा सा अणु अवरोधक, वांछित एकाग्रता को वांछित समय बिंदुओं पर कुओं के भीतर सीधे एक्सप्लांट मीडिया में जोड़ा जा सकता है। सांद्रता की गणना करते समय एगर उठे की मात्रा को शामिल करना याद रखें। (उदाहरण: 1 एमएल एगर उठे + 4 एमएल एक्सप्लांट मीडिया = 5 एमएल कुल मात्रा प्रति अच्छी तरह से)।

5 चिमरिक एक्सप्लांट तैयार करें

  1. एक नियमित एगरेग्याटेड प्लेट के स्थान पर, 1 मिमी ग्लास मोतियों (धारा 1.2.4) का उपयोग करके बारह छोटे, उथले कुओं में ढाला गया एक डिश में चिमरिक एक्सप्लांट काट दें। इस प्लेट को 3x डैनिएउ के समाधान से भरें।
    नोट: चिमेरिक एक्सप्लांट विभिन्न जीनोटाइप या स्थितियों के दो भ्रूणों की ब्लास्टोडर्म कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं। सुनिश्चित करें कि इन स्थितियों को ट्रांसजेनिक या इंजेक्शन फ्लोरोसेंट मार्कर की अभिव्यक्ति से एक दूसरे से अलग किया जा सकता है।
    1. प्लेट के बाईं ओर एक जीनोटाइप/कंडीशन के बारह भ्रूण और प्लेट के दाईं ओर दूसरे जीनोटाइप/कंडीशन के बारह भ्रूण जोड़कर तैयार करें ।
    2. 12 कुओं में से एक के पास, थाली के केंद्र में प्रत्येक हालत के एक भ्रूण ले जाएँ।
    3. संदंश का उपयोग करना, प्रत्येक भ्रूण से एक एक्सप्लांट काटें जैसा कि एकल भ्रूण एक्सप्लांट (चरण 4.3) के लिए वर्णित है।
    4. दो हिस्सों को एक ही एक्सप्लांट में एक साथ ठीक करने की अनुमति देने के लिए छिछोरे कुएं का उपयोग करके उथले अच्छी तरह से के भीतर दो एक्सप्लांट के कट किनारों को जल्दी से दबाएं।
    5. थाली के भीतर शेष ग्यारह कुओं के साथ जारी रखें। एक बार एक्सप्लांट ठीक हो जाने के बाद, उन्हें एगर उठे के साथ लेपित 6-अच्छी प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें और एक्सप्लांट मीडिया के 4 एमएल से भरा हुआ है। जब तक एक्सप्लांट की वांछित संख्या प्राप्त नहीं हो जाती तब तक दोहराएं।

6 संस्कृति और/या छवि तय किया explants

  1. संस्कृति 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जब तक बरकरार भाई भ्रूण वांछित चरण तक पहुँचने।
  2. लाइव एक्सप्लांट्स को निरंतर समय-चूक इमेजिंग के लिए रखा जा सकता है, संस्कृति अवधि के दौरान समय-समय पर इमेज किया जा सकता है, या प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर लाइव इमेज्ड किया जा सकता है।
  3. यदि वांछित हो तो एक्सप्लांट को ठीक करें। एक बार जब एक्सप्लांट वांछित अंत बिंदु तक पहुंच जाते हैं, तो अक्षुण्ण भ्रूण भाई बहन के चरण पर ध्यान दें और एक्सप्लांट्स को पीबीएस में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के 1 एमसीएल के साथ ग्लास प्रस्फुटित शीशी में रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर पर रात भर ठीक करें।
    सावधानी: पैराफॉर्मल्डिहाइड विषाक्त है। इस रसायन को संभालते समय दस्ताने पहनें और प्रत्येक संस्थान द्वारा अनुमोदित तरीकों के माध्यम से इसका निपटान करें।
    1. निर्धारण के बाद, छह बार एक्सप्लांट कुल्ला, पीबीएस + 0.1% ट्वीन-20 के साथ प्रत्येक 15 मिनट, और मेथनॉल में धीरे-धीरे निर्जलित। सीटू संकरण, इम्यूनोफ्लोरेसेंट स्टेनिंग आदि में पूरे माउंट द्वारा बाद में विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर एक्सप्लांट्स।

Representative Results

नोडल लिगामेंट्स ड्राइव रोगाणु परत गठन और जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट के सीएंडई
यूनिजेनेक्टेड वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) भ्रूण या 50 स्नातकोत्तर एमआरएनए एन्कोडिंग ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ इंजेक्ट किए गए नियंत्रण प्रत्यारोपण संस्कृति अवधि(चित्रा 2A-सी)में गोल रहे और मेसोडर्म, एंडोडर्म, या न्यूरोेक्टोड(चित्रा 3सी)20के मार्कर व्यक्त करने में विफल रहे। साथ में, ये मॉर्फोजेनेसिस और रोगाणु परत गठन की अनुपस्थिति का संकेत देते हैं जो कशेरुकी गैस्ट्रुलेशन की विशेषता है। हालांकि, ndr2 mRNA के 10 स्नातकोत्तर के साथ इंजेक्शन भ्रूण से कटौती किया explants संस्कृति में 8-9 घंटे के बाद अत्यधिक विस्तारित हो गया(चित्रा 2D)। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी द्वारा इन एक्सप्लांट्स की लाइव टाइम-लैप्स इमेजिंग से पता चला है कि विस्तार की शुरुआत 8 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ)(चित्रा 2F)पर या उसके आसपास होती है, उसी समय सी एंड ई मॉर्फोजेनेसिस बरकरार जेब्राफिश भ्रूण22में शुरू होता है । एमजेडओईपी-/-भ्रूणसे काटे गए एक्सप्लांट, जिसमें आवश्यक टीडीजीएफ1 नोडल सह-रिसेप्टर23की कमी है, nDR2 इंजेक्शन(चित्रा 2E)के जवाब में विस्तार करने में विफल रहा, यह प्रदर्शित करता है कि नोडल गतिविधि इस पूर्व वीवो मॉर्फोजेनेसिस के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, सीटू संकरण में पूरे माउंट ने आगे दिखाया कि एनडीआर2-एक्सप्रेसप्लांट्स न्यूरोेक्टोडर्म(sox2)और कई मेसोडर्म उप-प्रकार(टीबीएक्सटीए, नोटो, टीबीएक्स16)(चित्रा 2जी),साथ ही एंडोडर्म और भ्रूणीय आयोजक20के अंक व्यक्त करते हैं।

मेसोडर्म द्वारा न्यूरोेक्टोडर्म इंडक्शन के लिए नोडल सिग्नलिंग की आवश्यकता नहीं है
एंडोडर्म और अधिकांश मेसोडर्म को शामिल करने के लिए नोडल सिग्नलिंग गतिविधि आवश्यक है, लेकिन जेब्राफिश गैस्ट्रूल23,24के भीतर न्यूरोेक्टोडर्म विनिर्देश के लिए अपरिहार्य है। जबकि यूनिजेनेक्टेड जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट्स ने न्यूरोेक्टोडर्म(चित्रा 3सी18)में अंतर नहीं किया, 10 पीजी एनडीआर2 के साथ इंजेक्शन वाले भ्रूणों से एक्सप्लांट्स ने एक्सप्लांट(चित्रा 2 जी)की लंबी धुरी के साथ अलग धारियों में न्यूरोेक्टोडर्म मार्कर sox2 की मजबूत अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया, यह दर्शाता है कि न्यूरोेक्टोडेरम एक्स गठन एक्स वीवोके लिए नोडल गतिविधि की आवश्यकता है। यह लंबे समय से ज्ञात है कि मेसोडर्मल ऊतक तंत्रिका ऊतक 25 ,26,27,28,29को प्रेरित कर सकते हैं, जिसमें जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट17शामिल हैं । हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि इस एक्सप्लांट सिस्टम में न्यूरोेक्टोडर्म गठन के लिए सीधे नोडल सिग्नलिंग की आवश्यकता होती है या क्या एक्सोजेनस नोडल लिगामेंट मेसोडर्म को प्रेरित करते हैं जो तब तंत्रिका ऊतकों को माध्यमिक रूप से प्रेरित करता है।

दो अलग-अलग भ्रूणों से संभावित मेसोडर्म और न्यूरोेक्टोडर्म भागों वाले चिमेरिक एक्सप्लांट्स को यह परीक्षण करने के लिए उत्पन्न किया गया था कि क्या न्यूरोेक्टोडर्म विनिर्देश पूर्व वीवोके लिए नोडल सिग्नलिंग की आवश्यकता ऊतक-स्वायत्त रूप से है या नहीं। प्रत्येक एक्सप्लांट के मेसोडर्म भाग को एक अन्यथा डब्ल्यूटी भ्रूण से काटा गया था, जिसमें मेसोडर्म-विशिष्ट ट्रांसजेनिक जीएफपी रिपोर्टर, टीजी[एलएचएक्स1ए: ईजीएफपी]30, एनडीआर2 (चित्रा 3 ए)की उच्च खुराक (100 स्नातकोत्तर) के साथ इंजेक्शन दिया गया था। प्रत्येक एक्सप्लांट के ख्यात न्यूरोेक्टोडर्म भाग को या तो एक नियंत्रणडब्ल्यूटी भ्रूण या नोडल सिग्नलिंग कमी एमजेड ओईपी-/-भ्रूण इंजेक्शन से काटा गया था, जिसमें केवल फ्लोरासेंट परमाणु मार्कर एच2बी-आरएफपी(चित्रा 3 ए)को एन्कोडिंग किया गया था । प्रत्येक चिमेरिक एक्सप्लांट इन दो स्थितियों में से प्रत्येक से एक ब्लास्टोडर्म के संयोजन से उत्पन्न किया गया था, जिसे 12 एचपीएफ में सीटू संकरण में पूरे माउंट द्वारा ऊतक-विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए परख किया गया था।

100 पीजी एनडीआर2 के साथ इंजेक्शन भ्रूण से एकल भ्रूण के अधिकांश पौधों ने कम या कोई sox2व्यक्त किया, और मेसोडर्म के मार्कर व्यक्त किए, जिनमें टीबीएक्स्टा और lhx1a: gfp रिपोर्टर-पूरे एक्सप्लांट(चित्रा 3B,जी)शामिल हैं। यूनिजेनेक्टेड डब्ल्यूटी ब्लास्टोडर्म (जिस प्रकार में चिमेरिक एक्सप्लांट्स का संभावित न्यूरोेक्टोडर्म हिस्सा शामिल है) ने न तो मेसोडर्म मार्कर और न ही सोक्स 2 को एक एकल एक्सप्लांट के रूप में सुसंस्कृत किया, जो न्यूरोेक्टोडर्म और मेसोडर्म विनिर्देश(चित्रा 3C,एच)की कमी का संकेत देता है। एमजेडओईपीसे एकल भ्रूण के एक्सप्लांट्स-/-भ्रूण इसी तरह न्यूरोेक्टोडर्म और मेसोडर्म मार्कर दोनों की अभिव्यक्ति का अभाव था, यहां तक कि जब ndr2 (चित्रा 3 डी)के साथ इंजेक्शन दिया जाता है । हालांकि, जब यूनिकेक्टेड डब्ल्यूटी ब्लास्टोडर्म को नोडल लिगामेंट्स की उच्च खुराक से प्रेरित मेसोडर्म के साथ जोड़ा गया था, तो इन चिमेरिक एक्सप्लांट्स ने मेसोडर्म मार्कर और सोक्स 2 दोनों को मजबूती से व्यक्त किया(चित्रा 3E,I)। इन परिणामों से यह प्रदर्शित होता है कि, जैसा कि पहले17,26,27,29देखा गया था, मेसोडर्म उन कोशिकाओं में तंत्रिका भाग्य को प्रेरित कर सकता है जो अन्यथा गैर-तंत्रिका ectoderm बन जाएंगे। यह परीक्षण करने के लिए कि क्या नोडल सिग्नलिंग सीधे इन प्रत्यारोपों के संभावित न्यूरोेक्टोडर्म हिस्से के भीतर उनके तंत्रिका प्रेरण के लिए आवश्यक है, 100पीजी एनडीआर2 और ब्लास्टोडर्म के साथ 100 पीजी एनडीआर2 और ब्लास्टोडर्म के साथ इंजेक्ट किए गए WT ब्लास्टोडर्म्स से चिमरिक एक्सप्लांट बनाए गएथे। पड़ोसी मेसोडर्मल हिस्से से नोडल सिग्नल प्राप्त करने में असमर्थता के बावजूद, इन एक्सप्लांट्स ने sox2 को डब्ल्यूटी कंट्रोल कल्पना(चित्रा 3F)के समान डिग्री तक व्यक्त किया। यह परिणाम दर्शाता है कि अक्षुण्ण भ्रूण के अनुरूप जिसमें नोडल गतिविधि के अभाव में तंत्रिका ऊतकों को निर्दिष्ट किया जाता है, न्यूरोेक्टोडेर्म प्रेरण पूर्व वीवोके लिए नोडल सिग्नलिंग की आवश्यकता ऊतक-स्वायत्त रूप से नहीं होती है।

Figure 1
चित्रा 1:जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांटेशन (चरण 4.3) के लिए प्रक्रिया। (ए)प्रमुख हाथ (नीले) में संदंश का उपयोग करके अपनी ऊंचाई के लगभग 1/2 पर ब्लास्टोडर्म को चुटकी लेते हुए भ्रूण को स्थिर करने के लिए जर्दी के खिलाफ बंद गैर-प्रमुख हाथ (नारंगी) में संदंश पकड़ो। (ख)भ्रूण को ब्लास्टोडर्म के माध्यम से टुकड़ा करने के लिए मनोरंजक नीले संदंश के किनारे के साथ नारंगी संदंश चलाएं ताकि पहली कटौती ब्लास्टोडर्म के पार लगभग आधे रास्ते तक पहुंच जाए। (ग)भ्रूण 90 ° घुमाएं, फिर नीले संदंश को अंदर रखें (लेकिन ऑर्थोगोनल करने के लिए) मूल कट और चुटकी शेष ब्लास्टोडर्म को तोड़ने के लिए। (घ)एक्सप्लांट मीडिया में स्थानांतरित करने से पहले लगभग 5 मिनट के लिए 3x डैनियू के समाधान में ठीक होने के लिए एक्सप्लांट ब्लास्टोडर्म कोशिकाओं की अनुमति दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2 (20सेसंशोधित): नोडल लिगामेंट्स जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट्स में सीएंडई मॉर्फोजेनेसिस और जर्म लेयर फॉर्मेशन को बढ़ावा देते हैं ।(ए)इंजेक्शन का आरेख और जेब्राफिश भ्रूण का प्रत्यारोपण । (B-ई) 2-4 सोमाइट चरण के समकक्ष संकेतित स्थितियों/जीनोटाइप के लाइव ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट्स की प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां। N = दो से चार स्वतंत्र परीक्षणों से एक्सप्लांट की संख्या। (F)10 पीजी ndr2 आरएनए के साथ इंजेक्शन एक डब्ल्यूटी भ्रूण से एक प्रतिनिधि explant की समय चूक डीआईसी श्रृंखला । (जी) 10 स्नातकोत्तर ndr2 आरएनए के साथ इंजेक्शन WT भ्रूण से explants में संकेत टेप के लिए सीटू संकरण में पूरे माउंट के प्रतिनिधि छवियों । स्केल बार 200 माइक्रोन हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3 (31सेसंशोधित): चिमेरिक एक्सप्लांट से पता चलता है कि न्यूरोेक्टोडर्म विनिर्देश के लिए ऊतक-स्वायत्त नोडल सिग्नलिंग पूर्व वीवो की आवश्यकता नहीं होती है ।(ए)प्रक्रिया के आरेख चिमरिक जेब्राफिश एक्सप्लांट उत्पन्न करने के लिए । (B-F) 100 पीजी ndr2 आरएनए(बी),यूनिजेनेक्ट के साथ इंजेक्शन डब्ल्यूटी भ्रूण से एक्सप्लांट में मेसोडर्म मार्कर टीबीएक्सटा (शीर्ष) और न्यूरोेक्टोडर्म मार्कर sox2 (नीचे) के लिए सीटू संकरण में पूरे माउंट WT नियंत्रण(सी),MZ oep-/-10 pg ndr2 (D)के साथ इंजेक्शन, और WT(ई)या MZoepसे न्यूरोेक्टोडर्म भागों युक्त चिमेरिकexplants-/-(एफ ) 2-4 सोमाइट चरण के बराबर भ्रूण। अंश ों की जांच की कुल संख्या पर दिखाया फेनोटाइप के साथ explants की संख्या का संकेत मिलता है । (जी-जम्मू) लाइव टीजी[lhx1a:gfp]की प्रतिनिधि छवियां एक ही भ्रूण(जी-एच)से प्राप्त होती हैं या 2-4 सोमाइट चरण के बराबर दर्शाई गई शर्तों के एच2बी-व्यक्त ब्लास्टोडर्म(आई-जे,मैजेंटा) के साथ संयुक्त होती हैं। N = तीन स्वतंत्र परीक्षणों से एक्सप्लांट की संख्या। स्केल बार 200 माइक्रोन हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समाधान 1 समाधान 2 समाधान 3 समाधान 4
घोल 3x दानीउ अंडे का पानी एक्सप्लांट मीडिया 0.3x दानीउ
सामग्री 174 एमएमएल एनएसीएल 60 μg/mL समुद्री लवण DMEM/F12 + 2.5 mM एल-ग्लूटामाइन और 15 mM HEPES 17.4 एमएमएल एनएसीएल
2.1 एमएमएम केसीएल 1 एल आसुत पानी नवजात बछड़े सीरम या भ्रूण गोजातीय सीरम की कुल मात्रा 3% 0.21 एमएमएल केसीएल
1.2 MM MgSO4. 7H2O 1:200 पेनिसिलिन (50 इकाइयां/एमएल) -स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 μg/mL) 0.12 mM MgSO4 •7H2O
1.8 mM Ca (NO3)2 •4H2O 0.18 mM Ca (NO3)2 •4H2O
15 एमएम एचईपी उदाहरण: 1.5 m HEPES
आसुत जल 4 एमएल/कंडीशन एक्स 9 शर्तें = 36 एमएल आसुत जल
1.08 एमएल नवजात बछड़ा सीरम (एनसीएस, -20 डिग्री सेल्सियस (3%)
0.18 एमसीएल 200x पेन-स्ट्रीप (पीएस, -20 डिग्री सेल्सियस में एलिकोटेड) (1:200)
35 एमएल डीएमईएम/एफ 12

तालिका 1.

Discussion

इस लेख में बताया गया है कि जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट कैसे उत्पन्न करें और गैस्ट्रुलेशन में नोडल मॉर्फोजेन सिग्नलिंग की भूमिका को संबोधित करने में इन एक्सप्लांट्स के दो व्यावहारिक अनुप्रयोगों पर चर्चा की। काटने और खेती explants की यह विधि भोली कोशिकाओं की एक खाली स्लेट प्रदान करता है कि आरएनए इंजेक्शन और छोटे अणु यौगिकों के साथ उपचार का उपयोग कर हेरफेर किया जा सकता है ब्याज की एक आणविक मार्ग की जांच करने के लिए ।

महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल में चार कदम हैं जो इसकी सफलता के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं । पहले नोडल की उचित राशि के साथ भ्रूण इंजेक्शन है । यह प्रोटोकॉल ndr2 आरएनए के 10 स्नातकोत्तर की सिफारिश करता है, और हालांकि खुराक की एक श्रृंखला विस्तार को बढ़ावा देती है, बहुत अधिक या बहुत कम नोडल इष्टतम एक्सप्लांट एक्सटेंशन20को रोक देगा। दूसरा कदम भ्रूण को डिकोरीटिंग करना है । यदि भ्रूण बहुत लंबे समय तक प्रोन्स में रहते हैं, तो जर्दी फट जाएगी, और भ्रूण काटने के लिए व्यवहार्य नहीं होगा। यदि वे काफी लंबे समय तक प्रोनेस में नहीं हैं, तो कोशन्स को धोने से ढीला नहीं किया जाएगा और इसके बजाय समय लेने वाले मैनुअल डिकेरेशन की आवश्यकता होगी। तीसरा महत्वपूर्ण कदम एक्सप्लांट्स को काट रहा है । 3x डैनिएउ के समाधान में काटने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि 0.3x डैनिएउ के समाधान या अंडे के पानी की कम नमक सामग्री उपचार और एक्सप्लांट के अस्तित्व को बढ़ावा नहीं देती है।

इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं के भोलेपन को सुनिश्चित करने के लिए ब्लास्टोडर्म की लगभग आधी ऊंचाई पर एक्सप्लांट काटे जाने चाहिए। यदि वे जर्दी के बहुत करीब कट जाते हैं, तो उनमें मार्जिन (अंतर्जात नोडल सहित) के संकेत होंगे जो ऊतक विनिर्देश और मॉर्फोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं। चौथा और अंतिम महत्वपूर्ण कदम चिमरिक एक्सप्लांट्स के उपचार में है। दो एक्सप्लांट कल्पना बनाने के लिए फ्यूज नहीं करेंगे जब तक कि उनके कट किनारों को काटने के तुरंत बाद धीरे-धीरे दबाया न जाए।

संशोधन और समस्या निवारण
ऊपर वर्णित महत्वपूर्ण कदम समस्या निवारण के अवसर प्रदान करते हैं। कुछ आम मुद्दे और प्रस्तावित समाधान नीचे प्रस्तुत किए जाते हैं ।

यदि नोडल सिग्नलिंग की उपस्थिति में एक्सप्लांट का विस्तार नहीं किया जा रहा है, तो कुछ संभावित समाधान हैं। (क) एकल कोशिका स्तर पर भ्रूण इंजेक्ट करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आरएनए पूरे भ्रूण में समान रूप से फैलाया जाए । (ख) इंजेक्शन बोलस को मापने के लिए माइक्रोमीटर का उपयोग करके इंजेक्शन की मात्रा सही है, यह सुनिश्चित करके बहुत अधिक नोडल आरएनए इंजेक्शन लगाने से बचें । (ग) यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह अपमानित न हो, इसकी एकाग्रता को मापकर बहुत कम नोडल आरएनए इंजेक्शन लगाने से बचें । (घ) कुछ उम्र से मेल खाने वाले अक्षुण्ण भाई बहनों को एक्सप्लांट के समकक्ष चरण का अनुमान लगाने के लिए रखें । जब अक्षुण्ण भाई बहन 2-5 सोमाइट चरण तक पहुंचते हैं तो एक्सप्लांट अधिकतम विस्तार प्राप्त करते हैं। यदि एक्सप्लांट बहुत जल्दी एकत्र किए जाते हैं, तो इष्टतम विस्तार तक नहीं पहुंचा जाएगा।

यदि जर्दी डिकेरियोशन के बाद फट रहे हैं, और भ्रूण को काटने के लिए व्यवहार्य नहीं हैं, एक बार chorions को कुरकुरा शुरू और 1-2 भ्रूण उनके chorion शेड के बाद उच्चारण समाधान से भ्रूण को हटा दें । इसके बाद अंडे के पानी में तुरंत कुल्ला करें।

यदि एक्सप्लांट किनारों के चारों ओर चुलबुली दिखाई देते हैं, तो कुछ समाधान हैं। (क) विकास की एक विशिष्ट समय सीमा के भीतर ही कट एक्सप्लांट्स । हालांकि 128 से 1000-सेल चरणों तक किसी भी स्तर पर कटौती के पौधे जीवित रह सकते हैं और संस्कृति में विस्तार कर सकते हैं, 256-से 512-सेल चरणों में कटौती करने वाले सबसे मजबूत होते हैं। (ख) यह सुनिश्चित करें कि उचित उपचार सुनिश्चित करने के लिए 3x दानीउ के समाधान में एक्सप्लांट्स में कटौती की जाती है । (ग) सफाई से लेकिन धीरे से एक्सप्लांट काटें । काटने की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को खींचने या खींचने से बचें।

यदि यूनिजेनेक्टेड नियंत्रण एक्सप्लांट का विस्तार हो रहा है, तो एक्सप्लांट जर्दी के बहुत करीब कटौती करने की संभावना थी। बैंगन भोले होने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि कटौती आधी जर्दी और ब्लास्टोडर्म के शीर्ष के बीच की जाती है।

यदि चिमरिक एक्सप्लांट फ्यूज करने में विफल रहते हैं, तो यह संभावना है क्योंकि 3x डैनिएउ के समाधान में एक्सप्लांट की प्रवृत्ति एक बार कटौती करने के लिए गोल और कट किनारे पर ठीक हो जाती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि दोनों ब्लास्टोडर्म खुद के बजाय एक-दूसरे को ठीक करते हैं, उन्हें काटने के तुरंत बाद एक साथ दबाएं। एगर के भीतर नए शामिल ब्लास्टोडर्म पर कोमल दबाव लागू करने के लिए संदंश का उपयोग करें ताकि उन्हें एक साथ ठीक करने के लिए प्रोत्साहित किया जा सके।

सीमाओं
जबकि इन explants रिश्तेदार अलगाव में एक दिया मॉर्फोजेन (या ब्याज का एक और अणु) की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं, किसी भी पूर्व वीवो मॉडल में किए गए टिप्पणियों की देखभाल के साथ व्याख्या की जानी चाहिए । एक्सप्लांट सी एंड ई मॉर्फोजेनेसिस प्रदर्शित करते हैं जो वीवो20में देखे गए समान है, लेकिन वे गैस्ट्रुलेशन के सभी पहलुओं को पुन: रीकैपिटल नहीं करते हैं, उदाहरण के लिए, एपिली आंदोलन। वे भी कई अंय नियामक कारकों और संकेत अणुओं कि एक अक्षुण्ण भ्रूण के भीतर मौजूद है की कमी है । हालांकि यह एक्सप्लांट का एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक लाभ है, यह उन निष्कर्षों का भी कारण बन सकता है जो वीवो मेंनहीं हैं। उदाहरण के लिए, चूंकि एक्सोजेनस नोडल लिगामेंट्स प्राप्त नहीं करने वाले एक्सप्लांट न्यूरोेक्टोडर्म मार्कर व्यक्त करने में विफल रहते हैं, इसलिए कोई भी अकेले एक्सप्लांट से निष्कर्ष निकाल सकता है कि न्यूरोेक्टोडर्म विनिर्देश के लिए नोडल सिग्नलिंग की आवश्यकता होती है। तथापि , न्यूरोएक्टोडर्म अक्षुण्ण भ्रूण के भीतर बनता है जिसमें सभी नोडल सिग्नलिंग23,24की कमी होती है , जो तंत्रिका विनिर्देश32में अन्य सिग्नलिंग अणुओं की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन करता है । Explants हमें बता सकते है कि एक मॉर्फोजेन एक अलग वातावरण में क्या करने में सक्षम है । फिर भी, ऐसे सभी निष्कर्षों की पुष्टि की जानी चाहिए/परिणामों के लिए अक्षुण्ण भ्रूण के साथ तुलना में अच्छी तरह से व्याख्या की जानी चाहिए । दूसरे शब्दों में, explants एक विकासशील भ्रूण की जगह नहीं ले जा सकते हैं । इसके बजाय, वे परिवेश के साथ एक मॉर्फोजेन की भूमिका और संबंधों की पहचान करने के लिए एक पूरक उपकरण हैं। इन सीमाओं को ध्यान में रखते हुए, जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट कई शोध प्रश्नों के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
सिंथेटिक भ्रूणविज्ञान में नए सिरे से रुचि के साथ, कई पूर्व वीवो और इन विट्रो दृष्टिकोण नियमित रूप से भ्रूण विकास के मॉडल पहलुओं के लिए नियोजित कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, माउस या मानव भ्रूण/प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से बना 2 और 3 आयामी गैस्ट्रूलॉइड, बहिर्जात संकेत अणुओं के आवेदन के माध्यम से, कुछ पैटर्निंग और/या गैस्ट्रुलेशन, विभाजन, और न्यूरुलेशन33,34,35,36, 37 . हालांकि शक्तिशाली, इन तरीकों को श्रमसाध्य और लंबे समय तक संस्कृति के तरीकों की आवश्यकता होती है ताकि वे लगातार प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को बनाए रख सकें और गैस्ट्रॉयड विकसित करें, जिन्हें गैस्ट्रुलेशन चरणों तक पहुंचने में कई दिन लगते हैं। इसके विपरीत, ज़ेब्राफ़िश एक्सप्लांट्स को स्टेम सेल संस्कृतियों के रखरखाव की आवश्यकता नहीं होती है, क्योंकि भ्रूण बस आवश्यकतानुसार एकत्र किए जाते हैं। वे उत्पन्न करने और घंटे के भीतर गैस्ट्रुलेशन चरणों तक पहुंचने के लिए अपेक्षाकृत सरल हैं, जो जेब्राफिश भ्रूण के समान हैं। यह जेब्राफिश एक्सप्लांट्स, उनकी अक्षुण्ण विकासात्मक घड़ी का एक और लाभ पर प्रकाश डालता है। क्योंकि भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के विकास की उंर चर और अत्यधिक बहस की जा सकती है, भ्रूण explants शायद बेहतर विकास के लौकिक विनियमन की जांच करने के लिए अनुकूल हैं । अंत में, जबकि पेस्कोइड ज़ेब्राफ़िश एक्सप्लांट (जिसमें भ्रूणीय मार्जिन होता है) इसी तरह संस्कृति12,13में विस्तारित होता है, वे एंडोजेनस सिग्नलिंग केंद्रों के जवाब में ऐसा करते हैं। इसके बजाय, यहां वर्णित explants शोधकर्ताओं को इस तरह के भ्रूण संकेतों से अपेक्षाकृत कम हस्तक्षेप के साथ ब्याज के अणुओं की जांच करने के लिए सक्षम ।

संभावित भविष्य के अनुप्रयोग
यहां, एक्सप्लांट का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया था कि सीएंडई मॉर्फोजेनेसिस के लिए नोडल सिग्नलिंग आवश्यक और पर्याप्त है। फिर भी, यह अनुमान है कि वे कर सकते है और कई अंय विकास प्रक्रियाओं में कई अलग अलग अणुओं की भूमिका विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, उदाहरण के लिए, जीन अभिव्यक्ति के विनियमन, ढाल संकेत, और अतिरिक्त morphogenetic कार्यक्रमों । इसके अतिरिक्त, क्योंकि ये एक्सप्लांट कम से कम 24 एचपीएफ19तक व्यवहार्य हैं, यह उम्मीद की जा सकती है कि उनकी उपयोगिता विभाजन और ऑर्गेनोजेनेसिस जैसी प्रक्रियाओं में गैस्ट्रुलेशन से परे होगी, किसी भी प्रक्रिया जिसमें शोधकर्ता एक विकासात्मक खाली स्लेट की इच्छा रखते हैं।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईसीएचडी आर00एचडी091386 द्वारा एमएलकेडब्ल्यू और एनआईएचएस T32ES027801 से एएई को समर्थन दिया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mm glass beads Millipore-Sigma Z250473
4% Paraformaldehyde VWR J19943-K2
6-well plates Fisher FB012927
Agarose Thermo-Fisher 16500500
Ca(NO3)2 .4H2O Thermo-Fisher 12364-36
DMEM/F12 media Gibco 11330032
Dumont #5 watchmakers forceps World Precision Instruments 500341
Embryo injection mold Adaptive Science Tools I-34
Glass crystalizing dishes Fisher 08-741A
Glass Petri dishes Fisher 08-748A
HEPES VWR JT4018-1
Instant Ocean sea salts Instant Ocean SS15-10
KCl VWR BDH9258-500G
Low temperature incubator Fisher 15-015-2632
MgSO4.7H2O VWR 97062-134
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micrometer SPI supplies 02265-AB
Mineral oil VWR MK635704
NaCl VWR BDH9286-500G
Newborn Calf Serum Invitrogen 26010-066
Pasteur pipettes Fisher 13-678-30
Penicillin-Streptomycin Solution Thermo-Fisher 15140122
Pico-pump pneumatic injector World Precision Instruments SYS-PV820
Pipet pump Fisher 13 683C
Plastic Petri dishes 100 mm Fisher FB0875712
Plastic Petri dishes 60 mm Fisher FB0875713A
Plastic wash bottles Fisher 03-409-10E
Pronase Millipore-Sigma 10165921001
Tween-20 VWR 200002-836

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 173
जेब्राफिश भ्रूण से भोले ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट की पीढ़ी
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Alaniz Emig, A., Williams, M. L. K.… More

Alaniz Emig, A., Williams, M. L. K. Generation of Naïve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62797, doi:10.3791/62797 (2021).

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