Summary
Gli espianti di blastoderma Zebrafish sono generati isolando cellule embrionali da centri di segnalazione endogeni all'interno dell'embrione precoce, producendo cluster cellulari relativamente ingenui facilmente manipolati e coltivati ex vivo. Questo articolo fornisce istruzioni per effettuare tali espianti e dimostra la loro utilità interrogando i ruoli per la segnalazione nodale durante la gastrulazione.
Abstract
Grazie alla loro chiarezza ottica e al rapido sviluppo, gli embrioni di zebrafish sono un sistema eccellente per esaminare i comportamenti cellulari e i processi di sviluppo. Tuttavia, a causa della complessità e della ridondanza dei segnali embrionali, può essere difficile discernere il ruolo completo di ogni singolo segnale durante l'embriogenesi precoce. Espiantando la regione animale del blastoderma zebrafish, vengono generati gruppi relativamente ingenui di cellule embrionali che possono essere facilmente coltivate e manipolate ex vivo. Introducendo un gene di interesse mediante iniezione di RNA prima dell'espianto, si può valutare l'effetto di questa molecola sull'espressione genica, sui comportamenti cellulari e su altri processi di sviluppo in relativo isolamento. Inoltre, le cellule di embrioni di diversi genotipi o condizioni possono essere combinate in un unico espianto chimerico per esaminare le interazioni cellula/tessuto e le funzioni geniche tessuto-specifiche. Questo articolo fornisce istruzioni per la generazione di espianti di blastoderma zebrafish e dimostra che una singola molecola di segnalazione - un ligando nodale - è sufficiente per indurre la formazione di strati germinali e la morfogenesi di estensione in tessuti embrionali altrimenti ingenui. Grazie alla loro capacità di ricapitolare i comportamenti delle cellule embrionali, i gradienti morfogeni e i modelli di espressione genica in un sistema ex vivo semplificato, si prevede che questi espianti siano di grande utilità per molti ricercatori di zebrafish.
Introduction
Un obiettivo perenne del campo della biologia dello sviluppo è quello di svelare la complessità dello sviluppo di embrioni per comprendere l'origine della forma e della funzione animale. Anche gli embrioni precoci contengono un complesso miscuglio di molecole di segnalazione, interazioni cellulari e tissutali e forze meccaniche, tutte soggette a una rigida regolazione spaziale e temporale. Per questo motivo, è spesso difficile individuare il ruolo preciso di un particolare segnale in un processo di sviluppo di interesse. Rimuovendo i tessuti embrionali dal loro ambiente endogeno, l'espianto embrionale crea una piattaforma semplificata in cui discernere i ruoli di sviluppo dei singoli tessuti e molecole in relativo isolamento. Le tecniche di espianto sono forse meglio conosciute in Xenopus laevis, dove sono state utilizzate per studiare l'induzione tissutale, la segnalazione cellulare, l'adesione cellulare e la morfogenesi, tra gli altri processi1,2,3,4. I cosiddetti espianti di cappuccio animale, in cui la regione animale degli embrioni di Xenopus allo stadio di blastula viene isolata prima delle interazioni induttive5,6,7, sono una tecnica di espianto diffusa e potente. I cappucci animali non mapolati sono destinati a diventare ectoderma7,8. Tuttavia, sono competenti a rispondere a diversi fattori induttivi, consentendo loro di formare tessuti di tutti e tre gli strati germinali e subire movimenti morfogenetici appropriati ai tessuti9,10,11. Tuttavia, strumenti genetici limitati e idoneità sub-ottimale per l'imaging dal vivo impediscono l'uso di espianti di cappucci animali Xenopus per molti biologi dello sviluppo. Espiantando cellule di blastoderma da embrioni di zebrafish, i ricercatori possono combinare l'utilità del test del cappuccio animale con la chiarezza ottica, l'abbondanza di strumenti genetici e altri vantaggi sperimentali del sistema modello zebrafish.
Ad oggi, i ricercatori hanno fatto uso di due gusti di espianti di zebrafish: i cosiddetti pescoidi e gli espianti di blastoderma. Nel modello pescoide, l'intero blastoderma, compresa la zona marginale, è isolato dal tuorlo e lasciato sviluppare ex vivo senza lo strato sinciziale del tuorlo extraembrionale (YSL)12,13. In questo modo, i pescoidi hanno una notevole somiglianza con gli espianti di Fundulus generati decenni fa da Jane Oppenheimer e J.P. Trinkaus14,15. Questi espianti ricapitolano molti aspetti del pattern embrionale e della morfogenesi12,13. Tuttavia, poiché questi isolati contengono centri di segnalazione endogeni (il margine embrionale), non sono semplificati per quanto riguarda il loro ambiente molecolare. In alternativa, i ricercatori possono generare espianti di blastoderma zebrafish relativamente ingenui escludendo la zona marginale16,17,18,19,20,21. Gli espianti di blastoderma zebrafish non mapolati esprimono alti livelli di morfogeni della proteina morfogenetica ossea (BMP)19 e danno origine a ectoderma non neurale e strato avvolgente (EVL) quando coltivati ex vivo18. Tuttavia, ricapitolano molti aspetti del pattern assiale e della morfogenesi in risposta ai gradienti di segnalazione esogeni19,20,21, simili ai cappucci animali di Xenopus. Per questo motivo, gli espianti di blastoderma sono un modello vantaggioso per studiare il ruolo di un dato morfogeno (o morfogeni) nelle specifiche dello strato germinale, nei movimenti delle cellule morfogenetiche e nei gradienti di segnalazione all'interno di un ambiente di segnalazione semplificato. Inoltre, i blastodermi di embrioni di diversi genotipi o condizioni possono essere combinati in un unico espianto chimerico19,21 per studiare l'autonomia cellula/tessuto e le interazioni induttive.
Gli espianti di blastoderma Zebrafish possono essere utilizzati per studiare il ruolo dei segnali embrionali (ad esempio, Nodal) nella morfogenesi e nella specificazione dei tessuti durante la gastrulazione. Iniettando RNA ndr2 sintetico (che codifica un ligando nodale) allo stadio unicellulare, la segnalazione nodale viene attivata in tutto il blastoderma dell'embrione. Gli espianti da questi embrioni generano gradienti di segnalazione nodale, formano tutti e tre gli strati germinali e subiscono movimenti di gastrulazione di convergenza ed estensione (C & E) come si vede negli embrioni intatti20. Inoltre, gli espianti chimerici sono usati per illustrare la capacità dei tessuti mesodermici di indurre neuroectoderma da blastoderma non iniettato (naïve). Questo protocollo fornisce istruzioni per la creazione di espianti di blastoderma zebrafish e dimostra la loro utilità nel definire il ruolo della segnalazione nodale nell'induzione e nella morfogenesi dei tessuti.
Protocol
1 Preparare i reagenti e le forniture
- Preparazione del reagente
- Preparare 500 ml di 3x soluzione di Danieau (Soluzione 1, Tabella 1).
- Preparare 1 L di acqua d'uovo (Soluzione 2, Tabella 1).
- Preparare una soluzione all'1,2% di agarose in acqua di uova. Sciogliere completamente l'agarose nel microonde e quindi raffreddare a 55 °C a bagnomaria.
- Preparare 4 mL di mezzi di espianto (Soluzione 3, Tabella 1, leggermente modificati da19,21)per condizione sperimentale.
NOTA: Ricordarsi di tenere conto di almeno un pozzo di espianti da embrioni non iniettati (o iniettati di controllo) nel calcolo del volume richiesto.- Sanificare lo spazio di lavoro con il 70% di etanolo.
- Rimuovere i mezzi di coltura cellulare da 4 °C e spruzzare/pulire con etanolo al 70%.
- Fare mezzi di espianto e metterli nell'incubatrice a 28,5 °C per riscaldare mentre gli embrioni vengono iniettati.
NOTA: includere sempre embrioni fratelli intatti e di pari età per scopi di stadiazione. Decoionare questi embrioni e farli colturare su piastre rivestite di agarose in soluzione di Danieau 0,3x (Soluzione 4, Tabella 1).
- Rimuovere le aliquote di pronasi (1 mL a 20 mg/mL) da -20 °C e lasciare scongelare sul ghiaccio. Scongelare un'aliquota di 1 mL per ogni tre condizioni sperimentali.
- Preparare piatti di agarose
- Fare le piastre di iniezione.
- Riempire una capsula di Petri di plastica da 100 mm x 15 mm a metà strada con agarose fuso in acqua di uova.
- Posizionare delicatamente lo stampo a iniezione sopra l'agarose fuso con un angolo di 45 ° e abbassarlo gradualmente nell'agarose, assicurandosi che nessuna bolla sia intrappolata sotto. Lasciare raffreddare completamente.
- Rimuovere lo stampo. Utilizzare la piastra immediatamente o conservare per un secondo momento aggiungendo 2 ml di acqua di uova, avvolgendo la piastra e conservandola a 4 °C. Riscaldare la piastra per 15-30 minuti nell'incubatrice a 28,5 °C prima dell'iniezione.
- Realizzare piatti da taglio di espianto.
- Aggiungere 3 ml di acarosio fuso all'1,2% in acqua di uovo a una piastra di Petri da 60 mm x 15 mm, assicurandosi che l'intero fondo del pozzo sia rivestito. Lasciare raffreddare completamente.
- Rivestire le piastre di coltura con agarose.
- Per ogni condizione sperimentale, erogare 1 mL di agarosio fuso all'1,2% in acqua di uovo in un pozzo di una piastra a 6 pozzetti, assicurando che l'intero fondo del pozzo sia rivestito. Lasciare raffreddare completamente.
- Per realizzare espianti chimerici, creare un piatto da taglio di espianto con piccoli pozzetto aggiungendo dodici perle di vetro da 1 mm all'agarose fuso in una piastra di Petri da 60 mm x 15 mm. Rimuovere le pere con una pinciva una volta che l'agarose si raffredda completamente.
- Fare le piastre di iniezione.
2 Iniettare embrioni con RNA
- Indossando i guanti, rimuovere un'aliquota di mRNA sintetico ndr2 dalla conservazione a -80 °C e metterla immediatamente sul ghiaccio.
- Preparare l'ago per iniezione.
- Riempire un ago capillare di vetro tirato con RNA. Posizionare l'ago riempito in un micropolatore e rompere la punta dell'ago con una pinna.
- Calibrare il volume di iniezione utilizzando un micrometro di stadio con una goccia di olio minerale, regolando il tempo di iniezione e la pressione sull'iniettore pneumatico per ottenere un bolo della dimensione desiderata. Un bolo con un diametro di 120 μm ha un volume di 1 nL.
NOTA: Il volume desiderato del bolo dipenderà dalla concentrazione dell'RNA e dalla dose desiderata per embrione. Ad esempio, se l'RNA è aliquotato a 10 ng/μL, iniettare 1 nL per ottenere una quantità finale di 10 pg.- Tenere la punta dell'ago di RNA immersa nell'olio fino al momento dell'iniezione.
- Caricare gli embrioni e iniettare.
- Tirare i divisori nelle vasche di riproduzione, consentire ai pesci di deporre le uova per 10-15 minuti e raccogliere gli embrioni usando un colino da tè.
- Caricare gli embrioni nella piastra di iniezione usando una pipetta Pasteur e una pompa a pipetta, quindi utilizzare un dito guantato per premere delicatamente le uova negli abbeveratoi.
- Iniettare 10 pg ndr2 RNA nel tuorlo degli embrioni unicellulari fino a raggiungere il numero desiderato di embrioni o fino a quando gli embrioni iniziano a dividersi.
NOTA: Non iniettare dopo lo stadio monocellulare per garantire una distribuzione uniforme dell'RNA in tutto l'embrione. - Lavare gli embrioni dalla piastra di iniezione in una capsula di Petri etichettata 100 mm x 15 mm con un leggero flusso di acqua per uova da una bottiglia di spremiture.
NOTA: tenere sempre come controllo un gruppo di fratelli non iniettati e di pari età. - Posizionare gli embrioni nell'incubatrice a 28,5 °C fino a raggiungere lo stadio a 128 cellule. Rimuovere le uova non fecondate e gli embrioni morti dal piatto.
3 Decoionare gli embrioni
- Una volta che gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di 128 cellule, metterli in piastre di Petri di vetro etichettate e decantare quanta più acqua di uova possibile da loro.
- Etichettare i piatti cristallizzanti in vetro con nastro da laboratorio (corrispondenti ai nomi dei piccoli piatti) e riempire 2/3 del percorso con acqua all'uovo. Posiziona questi piatti accanto al microscopio di dissezione per una rapida accessibilità.
- Aggiungere 1 mL di pronasi (20 mg/mL, scongelato su ghiaccio) a 15 mL di 3x soluzione di Danieau in un tubo conico da 50 mL.
NOTA: questa quantità è sufficiente per un massimo di tre condizioni sperimentali. Aumentare il volume di pronasi e 3x soluzione di Danieau per ulteriori condizioni di espianto.
ATTENZIONE: La pronasi è irritante; quindi indossare guanti durante la manipolazione. - Aggiungere almeno 5 ml di soluzione di pronasi a ciascuna capsula di Petri di vetro contenente embrioni.
- Agitare le stoviglie di vetro con un movimento circolare, monitorando costantemente l'andamento della deconionezione al microscopio sezionante.
- Una volta che i cori iniziano a raggrinzirsi e 1-2 embrioni sono fuori dai loro cori, immergere con cura la capsula di Vetro di Petri contenente pronasi e gli embrioni nel corrispondente piatto cristallizzante di vetro contenente acqua di uovo.
- Lavare gli embrioni decorionati.
- Lavare gli embrioni tre volte con acqua di uova aggiungendo delicatamente e poi decantando l'acqua dell'uovo dal piatto.
- Il terzo e ultimo lavaggio è con la soluzione di Danieau 0,3x.
NOTA: Se gli embrioni hanno ancora cori dopo il lavaggio, pipettare delicatamente gli embrioni fino a quando i cori non vengono rimossi o lasciarli riposare nel lavaggio (acqua dell'uovo o soluzione di Danieau 0,3x) per un minuto o due e agitare delicatamente con movimenti circolari.
- Coprire gli embrioni decorionati con un coperchio della capsula di Petri e riportarli all'incubatrice (28,5 °C) fino a raggiungere lo stadio a 256 cellule.
4 Espianti tagliati
- Riempire la capsula di Petri rivestita di agarose 60 mm x 15 mm con 3x soluzione di Danieau.
- Una volta che gli embrioni sono allo stadio di 256 cellule, trasferiscili nella piastra rivestita di agarose contenente 3x soluzione di Danieau, allineandoli lungo il centro del piatto.
- Tagliare gli espianti usando una pinna di forza (Figura 1).
- Utilizzare un paio di pinci, tenuti chiusi, per stabilizzare l'embrione e utilizzare l'altro per tagliare il blastoderma a circa la metà della sua altezza (dal margine al polo animale) (Figura 1A).
- Per tagliare, spremere delicatamente le cellule di blastoderma con un paio di pinci. Quindi, prendere la pinzante stabilizzatrice e farle scorrere lungo le altre pinze per affettarle approssimativamente a metà del blastoderma (Figura 1B).
- Ruotare l'embrione, posizionando la pinca nel taglio esistente, quindi tagliare il blastoderma ortogonale rimanente al primo taglio (Figura 1C).
- Conservare gli espianti in 3x soluzione di Danieau per almeno 5 minuti per guarire, quindi trasferirli nel pozzo di un piatto a 6 pozzetti rivestito di agarose e riempito con 4 ml di mezzi di espianto.
NOTA: tagliare gli espianti da fratelli non iniettati (o iniettati di controllo) come controlli negativi. Se gli espianti vengono eseguiti correttamente, questi espianti non estenderanno né esprimeranno marcatori di endoderma, mesoderma o neuroectoderma. - Posizionare le piastre di coltura di espianto nell'incubatore a 28,5 °C fino a raggiungere il punto temporale/stadio desiderato (determinato da fratelli intatti).
NOTA: Se si trattano espianti con un composto, come un inibitore di piccole molecole, la concentrazione desiderata può essere aggiunta direttamente al mezzo di espianto all'interno dei pozzetti nei punti temporali desiderati. Ricorda di includere il volume di agarose quando calcoli le concentrazioni. (Esempio: 1 mL di agarose + 4 mL di mezzi di espianto = 5 mL di volume totale per pozzedo).
5 Preparare espianti chimerici
- Al posto di un normale piatto rivestito di agarose, tagliare gli espianti chimerici in un piatto con agarose modellato in dodici piccoli pozzetti poco profondi usando perle di vetro da 1 mm (punto 1.2.4). Riempi questo piatto con 3x soluzione di Danieau.
NOTA: Gli espianti chimerici sono generati da cellule blastodermiche di due embrioni di genotipi o condizioni diverse. Assicurarsi che queste condizioni possano essere distinte l'una dall'altra dall'espressione di marcatori fluorescenti transgenici o iniettati.- Preparare aggiungendo dodici embrioni di un genotipo/condizione sul lato sinistro della piastra e dodici embrioni dell'altro genotipo/condizione sul lato destro della piastra.
- Sposta un embrione di ogni condizione al centro della piastra, vicino a uno dei 12 pozzi.
- Usando una pinna, tagliare un espianto da ciascun embrione come descritto per gli espianti di un singolo embrione (fase 4.3).
- Premere rapidamente i bordi tagliati dei due espianti insieme all'interno del pozzo poco profondo usando una pinna per consentire alle due metà di guarire insieme in un unico espianto.
- Continuare con i restanti undici pozzi all'interno del piatto. Una volta che gli espianti sono guariti, trasferirli nel pozzo di un piatto a 6 pozzetti rivestito di agarose e riempito con 4 ml di mezzi di espianto. Ripetere fino a raggiungere il numero desiderato di espianti.
6 Coltura e/o immagine degli espianti fissi
- La coltura espianta nell'incubatrice a 28,5 °C fino a quando gli embrioni fratelli intatti raggiungono lo stadio desiderato.
- Gli espianti vivi possono essere montati per l'imaging time-lapse continuo, ripresi periodicamente durante il periodo di coltura o ripresi dal vivo all'endpoint sperimentale.
- Fissare gli espianti se lo si desidera. Una volta che gli espianti raggiungono l'endpoint desiderato, notare lo stadio dei fratelli embrionali intatti e posizionare gli espianti in una fiala di scintillazione di vetro con 1 mL di paraformaldeide al 4% in PBS. Fissare durante la notte su uno shaker a 4 °C.
ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica. Indossare guanti quando si maneggia questa sostanza chimica e smaltirla con metodi approvati da ciascuna istituzione.- Dopo la fissazione, risciacquare gli espianti sei volte, 15 minuti ciascuno con PBS + 0,1% Tween-20 e disidratare gradualmente in metanolo. Conservare gli espianti a -20 °C per una successiva analisi mediante ibridazione in situ a montaggio intero, colorazione immunofluorescente, ecc.
Representative Results
I ligandi nodali guidano la formazione dello strato germinale e il C & E degli espianti di blastoderma zebrafish
Gli espianti di controllo tagliati da embrioni wild-type (WT) non iniettati o quelli iniettati con 50 pg di mRNA che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) sono rimasti arrotondati per tutto il periodo di coltura (Figura 2A-C) e non sono riusciti a esprimere marcatori di mesoderma, endoderma o neuroectoderma (Figura 3C)20. Insieme, questi indicano un'assenza della morfogenesi e della formazione dello strato germinale che caratterizzano la gastrulazione dei vertebrati. Tuttavia, gli espianti tagliati da embrioni iniettati con 10 pg di mRNA ndr2 sono diventati molto allungati dopo 8-9 ore in coltura (Figura 2D). L'imaging time-lapse dal vivo di questi espianti mediante microscopia a contrasto interferente differenziale (DIC) ha rivelato che l'insorgenza dell'estensione a o intorno a 8 ore dopo la fecondazione (hpf) (Figura 2F), nello stesso momento in cui inizia la morfogenesi C & E negli embrioni di zebrafish intatti22. Gli espianti tagliati da embrioni MZoep-/-, che mancano del co-recettore nodale tdgf1 essenziale23, non sono riusciti ad estendersi in risposta all'iniezione di ndr2 (Figura 2E), dimostrando che l'attività nodale è fondamentale per questa morfogenesi ex vivo. Inoltre, l'ibridazione in situ a montaggio intero ha ulteriormente dimostrato che gli espianti che esprimono ndr2esprimono marcatori di neuroectoderma (sox2) e diversi sottotipi di mesoderma (tbxta, noto, tbx16) (Figura 2G), così come l'endoderma e l'organizzatore embrionale20.
La segnalazione nodale non è necessaria per l'induzione del neuroectoderma da parte del mesoderma
L'attività di segnalazione nodale è essenziale per l'induzione dell'endoderma e della maggior parte del mesoderma, ma è indispensabile per le specifiche del neuroectoderma all'interno delle gastrule zebrafish23,24. Mentre gli espianti di blastoderma zebrafish non iniettati non si differenziavano in neuroectoderma (Figura 3C18), gli espianti da embrioni iniettati con 10 pg ndr2 hanno mostrato una robusta espressione del marcatore neuroectoderma sox2 in strisce distinte lungo l'asse lungo dell'espianto (Figura 2G), indicando che l'attività nodale è necessaria per la formazione di neuroectodermi ex vivo. È noto da tempo che i tessuti mesodermici possono indurre il tessuto neurale25,26,27,28,29,anche negli espianti di blastoderma zebrafish17. Tuttavia, non è chiaro se la formazione di neuroectodermi in questo sistema di espianto richieda direttamente la segnalazione nodale o se i ligandi nodali esogeni inducano mesoderma che quindi induce secondariamente i tessuti neurali.
Sono stati generati espianti chimerici contenenti porzioni prospettiche di mesoderma e neuroectoderma da due diversi embrioni per verificare se la segnalazione nodale è richiesta autonomamente tissutale per la specifica del neuroectoderma ex vivo. La porzione di mesoderma di ogni espianto è stata tagliata da un embrione altrimenti WT che esprime un reporter GFP transgenico specifico per il mesoderma, Tg[lhx1a:eGFP]30, iniettato con una dose elevata (100 pg) di ndr2 (Figura 3A). La presunta porzione di neuroectoderma di ogni espianto è stata tagliata da un embrione WT di controllo o da un embrione MZoep-/- carente di segnalazione nodale iniettato solo con mRNA che codifica il marcatore nucleare fluorescente H2B-RFP (Figura 3A). Ogni espianto chimerico è stato generato combinando un blastoderma da ciascuna di queste due condizioni, che sono state analizzate per l'espressione di marcatori tessuto-specifici mediante ibridazione in situ a montaggio intero a 12 hpf.
La maggior parte degli espianti di embrioni singoli da embrioni iniettati con 100 pg ndr2 esprimevano poco o nessun sox2ed esprimevano marcatori di mesoderma, tra cui tbxta e lhx1a:gfp reporter-throughout the explant (Figura 3B,G). Il blastoderma WT non iniettato (del tipo che comprende la porzione prospettica di neuroectoderma degli espianti chimerici) non esprimeva né marcatori mesodermici né sox2 quando coltivato come singolo espianto, indicando una mancanza di specifiche di neuroectoderma e mesoderma (Figura 3C, H). Allo stesso modo, gli espianti di embrionimonoembrida embrioni MZ oep -/- mancavano di espressione di entrambi i marcatori neuroectodermici e mesodermici, anche quando iniettati con ndr2 (Figura 3D). Tuttavia, quando i blastodermi WT non iniettati sono stati combinati con il mesoderma indotto da alte dosi di ligandi nodali, questi espianti chimerici hanno espresso in modo robusto sia i marcatori del mesoderma che sox2 (Figura 3E,I). Questi risultati dimostrano che, come precedentemente osservato17,26,27,29,il mesoderma può indurre il destino neurale in cellule che altrimenti diventerebbero ectoderma non neurale. Per verificare se la segnalazione nodale è necessaria direttamente all'interno della porzione prospettica di neuroectoderma di questi espianti per la loro induzione neurale, sono stati creati espianti chimerici da blastodermi WT iniettati con 100 pg ndr2 e blastodermi da embrioni MZoep-/- (Figura 3J). Nonostante la loro incapacità di ricevere segnali nodali dalla porzione mesodermica vicina, questi espianti esprimevano sox2 in misura simile alle chimere di controllo WT (Figura 3F). Questo risultato dimostra che coerentemente con embrioni intatti in cui i tessuti neurali sono specificati in assenza di attività nodale, la segnalazione nodale non è richiesta tessuto-autonomamente per l'induzione del neuroectoderma ex vivo.
Figura 1: Procedura per l'espianto di blastoderma zebrafish (fase 4.3). (A) Tenere la pinza nella mano non dominante (arancione) chiusa contro il tuorlo per stabilizzare l'embrione mentre pizzica il blastoderma a circa 1/2 della sua altezza usando la pinza nella mano dominante (blu). (B) Eseguire la pinza arancione lungo il bordo della pinza blu afferrando l'embrione per tagliare il blastoderma in modo che il primo taglio raggiunga approssimativamente la metà del blastoderma. (C) Ruotare l'embrione di 90°, quindi posizionare la pinca blu all'interno (ma ortogonale a) il taglio originale e pizzicare per tagliare il blastoderma rimanente. (D) Lasciare che le cellule di blastoderma espiantate guariscano in 3x soluzione di Danieau per circa 5 minuti prima di trasferirle in mezzi di espianto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 (modificata da20): I ligandi nodali promuovono la morfogenesi C&E e la formazione di strati germinali negli espianti di blastoderma zebrafish. (A) Diagramma di iniezione ed espianto di embrioni di zebrafish. (B-E) Immagini rappresentative in campo luminoso di espianti di blastoderma vivo delle condizioni/genotipi indicati allo stadio equivalente a 2-4 somite. N = numero di espianti da due a quattro prove indipendenti. (F) Serie DIC time-lapse di un espianto rappresentativo da un embrione WT iniettato con 10 pg ndr2 RNA. (G) Immagini rappresentative dell'ibridazione in situ a monte intero per i trascritti indicati in espianti da embrioni WT iniettati con 10 pg ndr2 RNA. Le barre di scala sono 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 (Modificata da31): Gli espianti chimerici rivelano che la specifica del neuroectoderma non richiede la segnalazione nodale autonoma dei tessuti ex vivo. (A) Diagramma della procedura per generare espianti chimerici di zebrafish. (B-F) Ibridazione in situ a montaggio intero per il marcatore mesoderma tbxta (in alto) e il marcatore neuroectoderma sox2 (in basso) in espianti da embrioni WT iniettati con 100 pg ndr2 RNA (B), controlli WT non iniettati (C), MZoep-/- iniettati con 10 pg ndr2 (D), ed espianti chimerici contenenti porzioni di neuroectoderma da WT (E) o MZoep-/- (F ) embrioni all'equivalente dello stadio 2-4 somite. Le frazioni indicano il numero di espianti con il fenotipo mostrato sul numero totale di espianti esaminati. (G-J) Immagini rappresentative di Espianti vivi di Tg[lhx1a:gfp]da un singolo embrione (G-H) o combinati con blastodermi che esprimono H2B (I-J, magenta) delle condizioni indicate all'equivalente dello stadio 2-4 somite. N = numero di espianti da tre studi indipendenti. Le barre di scala sono 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione 1 | Soluzione 2 | Soluzione 3 | Soluzione 4 | |
| Soluzione | 3x Danieau's | Acqua dell'uovo | Explant Media | 0.3x Danieau's |
| Ingredienti | 174 mM NaCl | 60 μg/mL sali marini | DMEM/F12 + 2,5 mM L-Glutammina e 15 mM HEPES | 17,4 mM NaCl |
| 2,1 mM KCl | 1 L di acqua distillata | 3% volume totale di siero per vitello appena nato o siero bovino fetale | 0,21 mM KCl | |
| 1,2 mM MgSO4. 7H2O | 1:200 Penicillina (50 unità/mL)-Streptomicina (50 μg/mL) | 0,12 mM MgSO4•7H2O | ||
| 1,8 mM Ca (NO3)2 • 4H2O | 0,18 mM Ca (NO3)2 • 4H2O | |||
| 15 mM HEPES | Esempio: | 1,5 mM HEPES | ||
| Acqua distillata | 4 mL/condizione x 9 Condizioni = 36 mL | Acqua distillata | ||
| 1,08 ml di siero per vitelli appena nati (NCS, aliquotato a -20 °C (3%) | ||||
| 0,18 mL 200x Pen-Strep (PS, aliquotato in -20 °C) (1:200) | ||||
| 35 ml DMEM/F12 |
Tabella 1.
Discussion
Questo articolo ha descritto come generare espianti di blastoderma zebrafish e ha discusso due applicazioni pratiche di questi espianti nell'affrontare il ruolo della segnalazione del morfogeno nodale nella gastrulazione. Questo metodo di taglio e coltura di espianti fornisce una tabula rasa di cellule naïve che possono essere manipolate utilizzando iniezioni di RNA e trattamento con composti di piccole molecole per studiare un percorso molecolare di interesse.
Passaggi critici
Ci sono quattro passaggi in questo protocollo che sono particolarmente critici per il suo successo. Il primo è l'iniezione degli embrioni con la quantità appropriata di Nodal. Questo protocollo raccomanda 10 pg di ndr2 RNA e, sebbene una gamma di dosi promuova l'estensione, troppo o troppo poco Nodal impedirà l'estensione ottimale dell'espianto20. Il secondo passo è la deconionerazione degli embrioni. Se gli embrioni rimangono in pronase per troppo tempo, i tuorli scoppieranno e gli embrioni non saranno vitali da tagliare. Se non sono nella pronasi abbastanza a lungo, i cori non saranno allentati dal lavaggio e richiederanno invece una deconione manuale dispendiosa in termini di tempo. Il terzo passo critico è il taglio degli espianti. Si raccomanda il taglio in 3x soluzione di Danieau, poiché il contenuto di sale inferiore di 0,3x soluzione di Danieau o acqua di uova non promuove la guarigione e la sopravvivenza degli espianti.
Inoltre, gli espianti devono essere tagliati a circa la metà dell'altezza del blastoderma per garantire l'ingenuità delle cellule. Se vengono tagliati troppo vicino al tuorlo, conterranno segnali dal margine (incluso il nodale endogeno) che promuovono la specificazione dei tessuti e la morfogenesi. Il quarto e ultimo passo critico è nella guarigione degli espianti chimerici. Due espianti non si fondono per formare chimere a meno che i loro bordi tagliati non vengano premuti delicatamente insieme immediatamente dopo il taglio.
Modifiche e risoluzione dei problemi
I passaggi critici descritti in precedenza offrono opportunità per la risoluzione dei problemi. Di seguito sono presentati alcuni problemi comuni e le soluzioni proposte.
Se gli espianti non si estendono in presenza di segnalazione nodale, ci sono alcune possibili soluzioni. (A) Iniettare embrioni allo stadio monocellulare per garantire che l'RNA sia uniformemente disperso in tutto l'embrione. (B) Evitare di iniettare troppo RNA nodale assicurandosi che il volume iniettato sia corretto utilizzando un micrometro per misurare il bolo di iniezione. (C) Evitare di iniettare troppo poco RNA l'lendo misurando la sua concentrazione per assicurarsi che non si sia degradato. (D) Mantenere alcuni fratelli intatti di pari età per dedurre lo stadio equivalente degli espianti. Gli espianti raggiungono la massima estensione quando i fratelli intatti raggiungono lo stadio di somite 2-5. Se gli espianti vengono raccolti troppo presto, l'estensione ottimale non verrà raggiunta.
Se i tuorli scoppiano dopo la deconionezione e gli embrioni non sono vitali da tagliare, rimuovere gli embrioni dalla soluzione di pronasi una volta che le cori iniziano a incresparsi e 1-2 embrioni perdono il loro corion. Quindi, risciacquare immediatamente in acqua di uova.
Se gli espianti appaiono frizzante intorno ai bordi, ci sono alcune soluzioni. (A) Tagliare gli espianti solo entro un determinato periodo di tempo di sviluppo. Sebbene gli espianti tagliati in qualsiasi fase da 128 a 1000 cellule possano sopravvivere ed estendersi in coltura, quelli tagliati a stadi da 256 a 512 cellule tendono ad essere i più robusti. (B) Assicurarsi che gli espianti siano tagliati in 3x soluzione di Danieau per garantire una corretta guarigione. (C) Tagliare gli espianti in modo pulito ma delicato. Evitare di allungare o separare le celle durante il processo di taglio.
Se gli espianti di controllo non iniettati si estendono, è probabile che gli espianti taglino troppo vicino al tuorlo. Affinché gli espianti siano ingenui, assicurarsi che i tagli siano fatti a metà strada tra il tuorlo e la parte superiore del blastoderma.
Se gli espianti chimerici non riescono a fondersi, è probabile che la tendenza degli espianti nella soluzione di Danieau 3x una volta tagliati è quella di arrotondare e guarire oltre il bordo tagliato. Per assicurarti che i due blastodermi guariscano l'uno all'altro piuttosto che a se stessi, premili insieme immediatamente dopo il taglio. Usa la pinna per applicare una leggera pressione ai blastodermi appena uniti all'interno del pozzo di agarose per incoraggiarli a guarire insieme.
Limitazioni
Mentre questi espianti sono uno strumento prezioso per studiare il ruolo di un dato morfogeno (o di un'altra molecola di interesse) nell'isolamento relativo, le osservazioni fatte in qualsiasi modello ex vivo devono essere interpretate con cura. Gli espianti mostrano morfogenesi C&E molto simile a quella osservata in vivo20, ma non ricapitolano tutti gli aspetti della gastrulazione, ad esempio i movimenti epiboly. Mancano anche molti altri fattori regolatori e molecole di segnalazione che sono presenti all'interno di un embrione intatto. Mentre questo è un significativo vantaggio sperimentale degli espianti, può anche portare a conclusioni che non reggono in vivo. Ad esempio, poiché gli espianti che non ricevono ligandi nodali esogeni non riescono ad esprimere marcatori neuroectodermico, si potrebbe concludere dai soli espianti che la segnalazione nodale è necessaria per la specifica del neuroectoderma. Tuttavia, il neuroectoderma si forma all'interno di embrioni intatti privi di tutta la segnalazione nodale23,24,dimostrando il ruolo vitale di altre molecole di segnalazione nella specifica neurale32. Gli espianti possono dirci di cosa è capace un morfogeno in un ambiente isolato. Tuttavia, tutti questi risultati dovrebbero essere confermati in / confrontati con embrioni intatti per i risultati da interpretare a fondo. In altre parole, gli espianti non possono prendere il posto di un embrione in via di sviluppo. Invece, sono uno strumento supplementare per identificare il ruolo e la relazione di un morfogeno con l'ambiente circostante. Con queste limitazioni in mente, gli espianti di blastoderma zebrafish sono uno strumento prezioso per molte domande di ricerca.
Importanza rispetto ai metodi esistenti
Con il rinnovato interesse per l'embriologia sintetica, diversi approcci ex vivo e in vitro sono regolarmente impiegati per modellare aspetti dello sviluppo embrionale. Ad esempio, gastruloidi a 2 e 3 dimensioni composti da cellule staminali pluripotenti embrionali / indotte di topo o umane possono essere indotti, attraverso l'applicazione di molecole di segnalazione esogene, a ricapitolare alcuni degli eventi patterning e/o morfogenetici di gastrulazione, segmentazione e neuulazione33,34,35,36,37 . Sebbene potenti, questi metodi richiedono metodi di coltura laboriosi e prolungati sia per mantenere continuamente le cellule staminali pluripotenti che per coltivare gastruloidi, che impiegano molti giorni per raggiungere le fasi di gastrulazione. Al contrario, gli espianti di zebrafish non richiedono il mantenimento di colture di cellule staminali, poiché gli embrioni vengono semplicemente raccolti secondo necessità. Sono relativamente semplici da generare e raggiungere le fasi di gastrulazione in poche ore, le stesse degli embrioni di zebrafish. Ciò evidenzia un altro vantaggio degli espianti di zebrafish, il loro orologio di sviluppo intatto. Poiché l'età evolutiva delle cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte può essere variabile e molto dibattuto, gli espianti embrionali sono forse più adatti per studiare la regolazione temporale dello sviluppo. Infine, mentre gli espianti di pesce zebra pescoide (che contengono il margine embrionale) si estendono allo stesso modo incoltura 12,13, lo fanno in risposta ai centri di segnalazione endogeni. Invece, gli espianti qui descritti consentono ai ricercatori di studiare molecole di interesse con relativamente poca interferenza da tali segnali embrionali.
Potenziali applicazioni future
Qui, gli espianti sono stati usati per dimostrare che la segnalazione nodale è necessaria e sufficiente per la morfogenesi C & E. Tuttavia, si prevede che possano e saranno utilizzati per discernere il ruolo di molte molecole diverse in molti altri processi di sviluppo, ad esempio la regolazione dell'espressione genica, i gradienti di segnalazione e ulteriori programmi morfogenetici. Inoltre, poiché questi espianti sono vitali fino ad almeno 24 hpf19, ci si può aspettare che la loro utilità si estenda oltre la gastrulazione in processi come la segmentazione e l'organogenesi, qualsiasi processo in cui i ricercatori desiderano una tabula rasa di sviluppo.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NICHD R00HD091386 a MLKW e da NIEHS T32ES027801 a AAE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
| 6-well plates | Fisher | FB012927 | |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
| Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
| DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
| Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
| Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
| Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
| HEPES | VWR | JT4018-1 | |
| Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| KCl | VWR | BDH9258-500G | |
| Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
| MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
| Mineral oil | VWR | MK635704 | |
| NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
| Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
| Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
| Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
| Tween-20 | VWR | 200002-836 |
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