Summary
Zebrafish blastoderm explant는 초기 배아 내내 내인성 신호 센터에서 배아 세포를 분리하여 생성되며, 상대적으로 순진한 세포 클러스터를 쉽게 조작하고 배양하여 ex vivo를배양한다. 이 문서에서는 이러한 각질에 대한 지침을 제공하고 위장 중에 Nodal 신호에 대한 역할을 심문하여 유용성을 입증합니다.
Abstract
그들의 광학 선명도 및 급속한 발달 때문에, 제브라피쉬 배아는 세포 행동 및 발달 프로세스를 검토하기 위한 훌륭한 시스템입니다. 그러나, 배아 신호의 복잡성 그리고 중복성 때문에, 초기 배아 발생 도중 어떤 단 하나 신호의 완전한 역할을 분별하는 것은 도전적일 수 있습니다. 제브라피시 블라스트덤의 동물 영역을 이식함으로써, 배아 세포의 상대적으로 순진한 클러스터가 생성되어 쉽게 배양하고 조작할 수 있는 전 생체도를 조작할수 있다. 방사 하기 전에 RNA 주입에 의해 관심의 유전자를 도입 하 여, 하나는 유전자 발현에이 분자의 효과 평가할 수 있습니다., 세포 행동, 그리고 상대적 격리에 다른 개발 과정. 더욱이, 상이한 유전자형 또는 조건의 배아에서 세포는 세포/조직 상호 작용 및 조직 특정 유전자 기능을 검토하기 위하여 단 하나 키메라 익스파일에서 결합될 수 있습니다. 이 문서는 제브라피 스블라데스름 근간을 생성하기위한 지침을 제공하고 단일 신호 분자 - 노달 리간드 - 그렇지 않으면 순진한 배아 조직에서 세균 층 형성 및 확장 형태 발생을 유도하기에 충분하다는 것을 보여줍니다. 단순화된 전 생체 시스템에서 배아 세포 행동, 형태근 그라데이션 및 유전자 발현 패턴을 재구성하는 능력으로 인해 이러한 이병은 많은 제브라피시 연구진에게 훌륭한 유용성이 있을 것으로 예상됩니다.
Introduction
발달 생물학 분야의 다년생 목표는 동물의 형태와 기능의 기원을 이해하기 위해 배아 개발의 복잡성을 해명하는 것입니다. 초기 배아조차도 신호 분자, 세포 및 조직 상호 작용 및 기계적 힘의 복잡한 메들리를 포함하며, 모두 엄격한 공간 및 측두체 조절에 따라 다릅니다. 이러한 이유로 개발 과정에서 특정 신호의 정확한 역할을 정확히 파악하는 것은 종종 어려운 일입니다. 배아 조직을 내인성 환경에서 제거함으로써, 배아 농장은 상대적 고립에서 개별 조직 및 분자의 발달 역할을 분별하는 단순화된 플랫폼을 만듭니다. 농장 기술은 아마도 제노푸스 laevis에서가장 잘 알려져 있으며, 조직 유도, 세포 신호, 세포 접착 및 형태 발생을 연구하는 데 사용되었으며 다른 과정중 1,2,3,4. 소위 동물 모자 는 발아 단계 제노푸스 배아의 동물 영역이 유도 상호 작용5,6,7전에 고립되는 소위 동물 모자 각종, 광범위하고 강력한 축출 기술이다. 조작되지 않은 동물 대문자는 자궁 절제술7,8이될 운명이다. 여전히, 그(것)들은 3개의 세균 층의 조직을 형성하고 조직적당한 형태유전학 운동을9,10,11를겪을 수 있도록 몇몇 유도요인에 반응하는 유능합니다. 그러나, 제한된 유전 도구와 라이브 이미징에 대한 최적 이하의 적합성은 많은 발달 생물학자를위한 제노푸스 동물 모자 의 사용을 방지합니다. 제브라피시 배아에서 blastoderm 세포를 발췌함으로써, 연구원은 제브라피시 모형 시스템의 광학 선명도, 유전 공구의 풍요로움 및 그밖 실험적인 이점과 동물 모자 분석의 효용성을 결합할 수 있습니다.
현재까지 연구자들은 제브라피시 의 두 가지 맛을 사용했습니다: 소위 페스코이드와 블라스트롬 이축. 페스코이드 모델에서, 전체 blastoderm, 한계 영역을 포함하는, 노른자로부터 분리하고 외화 노른자 싱크층없이 전 생체 내을 개발할 수 (YSL)12,13. 이런 식으로, 페스코이드는 제인 오펜하이머와 J.P. Trinkaus14,15에의해 수십 년 전에 생성 된 Fundulus 이출에 주목할만한 유사성을 부담한다. 이러한 각종은 배아 패터닝 및형태발생(12,13)의많은 측면을 재구성한다. 그러나, 이들 격리에는 내인성 신호 센터(배아 마진)가 포함되어 있기 때문에 분자 밀리우와 관련하여 단순화되지 않습니다. 대안적으로, 연구자들은 한계 영역16,17,18,19,20, 20,21을제외하여 상대적으로 순진한 제브라피 스블라데스름 을 생성할 수 있다. 조작되지 않은 제브라피스 블라스트롬 은19의 높은 수준의 뼈 형태유전학 단백질(BMP) 모포겐을 발현하고 비신경이포더름및 포위층(EVL)을 배양할 때 발생한다. 그러나, 제노푸스 동물 대수와 유사한 외인성 신호 그라데이션19,20,21에반응하여 축 패터닝 및 형태발생의 많은 측면을 재구성한다. 이러한 이유로, blastoderm 각종은 단순화된 신호 환경 내에서 생식층 사양, 형태유전학 세포 운동 및 신호 그라데이션에서 주어진 형태겐(또는 모르포겐)의 역할을 연구하는 유리한 모델이다. 더욱이, 상이한 유전자형 또는 조건의 배아로부터의 배반은 세포/조직 자율성 및 유도성 상호작용을 조사하기 위하여 단 하나 키메라 박면19,21에서 결합될 수 있다.
Zebrafish blastoderm 각출소는 위장 중 형태 발생 및 조직 사양에서 배아 신호(예: Nodal)의 역할을 조사하는 데 사용될 수 있다. 단일 세포 단계에서 합성 ndr2 RNA(Nodal ligand)를 주입함으로써, 노달 신호는 배아의 폭발성 전체에 걸쳐 활성화된다. 이 배아에서 각출은 Nodal 신호 그라데이션을 생성하고, 세 배아 층을 모두 형성하며, 그대로배아(20)에서볼 수 있는 수렴 및 확장(C&E) 위화 운동을 겪는다. 추가적으로, 키메라 이출은 주입되지 않은 (순진한) blastoderm에서 신경 절제술을 유도하는 중피 조직의 능력을 설명하기 위하여 이용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피스 폭발성 근간을 만들기 위한 지침을 제공하고 조직 유도 및 형태 발생에서 Nodal 신호의 역할을 정의하는 데 유용성을 입증합니다.
Protocol
1 시약 및 소모품 준비
- 시약 준비
- 3배 다니오의 솔루션 500mL준비(솔루션 1, 표 1).
- 달걀 물 1 L을 준비합니다 (용액 2, 표 1).
- 달걀 물에 아가로즈 1.2% 용액을 준비합니다. 아가로즈를 전자레인지에 완전히 녹인 다음 수조에서 55°C로 식힙니다.
- 실험 조건당 4mL 엑셀미디어(솔루션 3, 표 1,19,21에서약간 수정)를 준비한다.
참고: 필요한 부피를 계산할 때 주입되지 않은 배아(또는 주입된 대조군)에서 적어도 하나의 우물을 고려해야 합니다.- 70%의 에탄올로 작업 공간을 소독합니다.
- 세포 배양 매체를 4°C에서 제거하고 70% 에탄올로 분무/닦아냅니다.
- 배아가 주입되는 동안 따뜻하게 28.5 °C 인큐베이터에 엑스플랜트 매체와 장소를 만듭니다.
참고: 준비 목적으로 연령 일치, 그대로 형제 배아를 항상 포함합니다. 이러한 배아를 dechorionate 하 고 0.3 x Danieau의 용액에 아가로즈 코팅 플레이트에 그들을 문화 (솔루션 4, 표 1).
- pronase 알리코 (20 mg/mL에서 1 mL)를 -20 °C에서 제거하고 얼음에 해동 할 수 있습니다. 3개의 실험 조건에 대해 1mL 알리쿼트 1개를 해동합니다.
- 아가로즈 플레이트 준비
- 사출 플레이트를 만드십시오.
- 달걀 물에 녹은 아가로즈와 함께 100mm x 15mm 플라스틱 페트리 접시 반웨이를 채웁니다.
- 용융 아가로즈 위에 45° 각도로 사출 몰드를 부드럽게 놓고 점차적으로 아가로즈로 낮추어 거품이 아래에 갇히지 않도록 합니다. 완전히 식힙니다.
- 금형을 제거합니다. 접시를 즉시 사용하거나 계란 물 2mL를 추가하고 접시를 감싸고 4 °C로 보관하여 나중에 저장하십시오. 주사 전에 28.5 °C 인큐베이터에서 15-30 분 동안 플레이트를 데우습니다.
- 절삭 판을 식재하십시오.
- 달걀 물에 녹은 1.2% 아가로즈 3mL을 60mm x 15mm 페트리 접시에 추가하여 우물의 전체 바닥을 코팅합니다. 완전히 식힙니다.
- 아가로즈가 있는 코트 컬쳐 플레이트.
- 각 실험 조건에 대해 달걀 물에 1mL의 용융 1.2 %의 아가로즈를 6 웰 플레이트의 한 우물에 분배하여 우물의 전체 바닥이 코팅되도록합니다. 완전히 식힙니다.
- 키메라 이출을 위해 60mm x 15mm 페트리 접시에 아가로즈를 녹여 12 mm 유리 구슬을 추가하여 작은 우물이 있는 절삭 접시를 만듭니다. 아가로즈가 완전히 식으면 집게로 구슬을 제거합니다.
- 사출 플레이트를 만드십시오.
2 RNA로 배아 주입
- 장갑을 착용하고 -80 °C의 저장에서 합성 ndr2 mRNA의 알리쿼트를 제거하고 즉시 얼음에 놓습니다.
- 주사 바늘을 준비합니다.
- 끌어당겨진 유리 모세관 바늘을 RNA로 채웁니다. 채워진 바늘을 마이크로 조작기에 넣고 바늘 끝을 집게로 부수습니다.
- 미네랄 오일 한 방울을 가진 단계 마이크로미터를 사용하여 사출 부피를 보정하고, 공압 인젝터에 대한 주입 시간과 압력을 조정하여 원하는 크기의 볼러스를 달성합니다. 직경 120 μm의 볼루스는 1nL의 부피를 갖는다.
참고: 볼루스의 원하는 부피는 RNA의 농도와 배아당 원하는 용량에 따라 달라집니다. 예를 들어, RNA가 10 ng/μL에서 알리인용되는 경우 1nL을 주입하여 최종 금액10 pg를 달성하십시오.- RNA 바늘 팁은 주입할 준비가 될 때까지 오일에 잠긴 상태로 유지합니다.
- 배아를 적재하고 주입하십시오.
- 사육 탱크에서 칸막이를 당기고, 물고기가 10-15 분 동안 생성되도록하고, 차 여과기를 사용하여 배아를 수집합니다.
- 파스퇴르 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 배아를 사출 판에 넣은 다음 장갑을 낀 손가락을 사용하여 계란을 통틀로 부드럽게 누릅니다.
- 원하는 수의 배아가 도달할 때까지 또는 배아가 분열되기 시작할 때까지 10 pg ndr2 RNA를 단일 세포 배아의 노른자에 주입하십시오.
참고: 배아 전체에 RNA의 분포를 보장하기 위해 단세포 단계 후에 주입하지 마십시오. - 배아를 사출 판에서 100mm x 15mm 페트리 접시에 넣고 짜내기 병에서 달걀물을 부드럽게 흘려 넣습니다.
참고: 항상 연령일치의 주입되지 않은 형제 그룹을 컨트롤로 유지합니다. - 배아를 128세포 단계에 도달할 때까지 28.5°C 인큐베이터에 넣습니다. 요리에서 수정되지 않은 계란과 죽은 배아를 제거합니다.
3 배아를 데초리오네이트
- 배아가 128 세포 단계에 도달하면 라벨이 붙은 유리 페트리 접시에 넣고 가능한 한 많은 달걀 물을 데수합니다.
- 실험실 테이프 (작은 접시 이름에 해당)로 요리를 결정 유리 라벨과 계란 물로 방법의 2/3을 채우기. 이러한 요리는 해부 현미경 옆에 배치하여 빠른 접근성을 위해 합니다.
- 50mL 원물 튜브에 3배 다니오용 15mL에 pronase 스톡 1mL(20 mg/mL, 얼음 에 해동)을 추가합니다.
참고: 이 양은 최대 3개의 실험 조건에 충분합니다. 추가 적인 절제 조건에 대 한 pronase 및 3 배 Danieau의 솔루션의 볼륨을 증가.
주의: 프라나제는 자극제입니다. 따라서 취급 할 때 장갑을 착용하십시오. - 배아를 함유한 각 유리 페트리 접시에 pronase 용액을 최소 5mL 이상 추가합니다.
- 유리 접시를 원형 운동으로 양시하여 해부 현미경으로 지속적으로 점초의 진행 상황을 모니터링합니다.
- 코리온이 주름이 생기기 시작하고 1-2 배아가 그들의 chorions에서 나오면, pronase와 배아를 포함하는 유리 페트리 접시를 계란 물을 포함하는 해당 유리 결정화 접시에 조심스럽게 덩크합니다.
- 비반향배아를 씻으시다.
- 접시에서 달걀 물을 부드럽게 첨가한 다음 탈유하여 배아를 달걀 물로 세 번 씻으십시오.
- 세 번째이자 마지막 세척은 0.3배 의 다니오용액입니다.
참고: 배아가 세척 후에도 여전히 치리온이 있는 경우, 축고가 제거될 때까지 배아를 부드럽게 피펫하거나 1~2분 동안 세척(달걀 물 또는 0.3배 다니오의 용액)에 앉게 하고 원형 운동으로 부드럽게 동요하게 합니다.
- 페트리 접시 뚜껑을 사용하여 비반향된 배아를 덮고 256세포 단계에 도달할 때까지 인큐베이터(28.5°C)로 돌려보라고 한다.
4 컷 익스
- 아가로즈 코팅 60mm x 15mm 페트리 접시에 3배 다니오의 액액을 채우게 해줍니다.
- 배아가 256세포 단계에 있으면 3배 다니오의 용액이 들어 있는 아가로즈 코팅 판으로 옮기고 접시의 중심을 따라 일렬로 세워줍니다.
- 집게(도1)를사용하여 이식을 잘라냅니다.
- 닫힌 채 유지된 집게 한 쌍을 사용하여 배아를 안정화하고 다른 한 쌍을 사용하여 높이의 약 절반(여백에서 동물 극까지)에서 blastoderm을 절단합니다(그림1A).
- 잘라내기 위해, 부드럽게 집게 한 쌍으로 blastoderm 세포를 짜내. 그런 다음 안정화 집게를 가져 가서 다른 집게를 따라 실행하여 blastoderm(도 1B)을가로 질러 약 절반을 슬라이스합니다.
- 배아를 회전시키고, 기존의 절단에 집게를 배치한 다음, 나머지 blastoderm 직교를 첫 번째절단(도 1C)으로절단한다.
- 3x Danieau의 솔루션에 3배 이상 이식하여 치유한 다음 아가로즈로 코팅되어 4mL의 엑스미디어로 채워진 6웰 플레이트의 웰로 옮겨 보세요.
참고: 주입되지 않은(또는 주입된 제어) 형제에서 제외 컨트롤로 절단합니다. 이 절제가 올바르게 수행되는 경우, 이러한 이 절제는 엔도름, 중소포 또는 신경 절제술의 마커를 연장하거나 표현하지 않습니다. - 원하는 타임포인트/스테이지(그대로 형제에게서 결정된)에 도달할 때까지 배양 판을 28.5°C 인큐베이터에 넣습니다.
참고: 소분자 억제제와 같은 화합물과 함께 이식하는 경우 원하는 농도를 원하는 시점 내에 있는 우물 내의 절제 된 미디어에 직접 첨가할 수 있다. 농도를 계산할 때 아가로즈의 부피를 포함해야 합니다. (예: 1 mL 아가로즈 + 4 mL 엑셀미디어 = 웰당 5mL 총 부피).
5 키메라 이출 준비
- 일반 아가로즈 코팅 플레이트 대신, 1mm 유리 구슬 (섹션 1.2.4)을 사용하여 12 개의 작고 얕은 우물로 성형 된 아가로즈가있는 접시에 키메라 이출을 자른다. 이 접시에 3배 다니오의 용액을 채우게 하십시오.
참고: 키메라 박종은 다른 유전자형 또는 조건의 2개의 배아의 blastoderm 세포에서 생성됩니다. 이러한 조건이 형질전환 또는 주입형광마커의 발현에 의해 서로 구별될 수 있는지 확인하십시오.- 플레이트의 왼쪽에 1개의 유전자형/상태의 12개의 배아와 플레이트의 오른쪽에 다른 유전자형/상태의 12개의 배아를 추가하여 준비한다.
- 12개의 우물 중 하나 근처에서 각 상태의 배아를 플레이트 의 중심으로 이동합니다.
- 집게를 사용하여 단일 배아 각경 (단계 4.3)에 대해 설명 된 바와 같이 각 배아에서 각 배아에서 각출자를 자른다.
- 두 개의 절단 된 가장자리를 빠르게 눌러 두 반쪽이 하나의 절개로 함께 치유 할 수 있도록 집게를 사용하여 얕은 우물 내에서 함께 흥분.
- 플레이트 안에 나머지 열한 우물을 계속. 이출이 치유되면 아가로즈로 코팅되어 4mL의 절제 된 미디어로 채워진 6 웰 플레이트의 우물로 옮겨 보입니다. 원하는 수의 이절이 이루어질 때까지 반복합니다.
6 고정 된 이식 문화 및 / 또는 이미지
- 배양은 그대로 형제 배아가 원하는 단계에 도달할 때까지 28.5°C 인큐베이터에서 이배합니다.
- 라이브 이식은 연속적인 타임랩스 이미징을 위해 장착할 수 있으며, 배양 기간 동안 주기적으로 이미지화되거나 실험적인 엔드포인트에서 실시간으로 이미지화될 수 있다.
- 원하는 경우 이식을 수정합니다. 일단 소멸이 원하는 끝점에 도달하면, 그대로 태아 형제의 단계를 기록하고 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 1 mL와 유리 신경병 유리 바이알에 이출을 배치합니다. 4 °C에서 셰이커에 하룻밤 을 수정합니다.
주의: 파라포름알데히드는 독성이 있습니다. 이 화학 물질을 취급할 때 장갑을 착용하고 각 기관에서 승인한 방법을 통해 폐기하십시오.- 고정 후, 헹구는 것은 PBS + 0.1% Tween-20으로 각각 6번, 15분씩 이발하고, 메탄올로 점차적으로 탈수합니다. 시투 혼성화, 면역형광 염색 등에서 전체 마운트에 의해 나중에 분석을 위해 -20°C에 저장하십시오.
Representative Results
노달 리간드 드라이브 세균 층 형성 및 제브라피시 blastoderm 파종의 C&E
주입되지 않은 야생형(WT) 배아또는 50pg의 mRNA 인코딩 그린 형광단백질(GFP)으로 주입된 대조군 각질은 배양 기간 내내 반올림된 상태로 유지되었으며(도2A-C)메소더름, 내도, 또는 신경 절제술(도3C)20의마커를 발현하지 못했다. 이들은 함께 척추동물 위형성을 특징으로 하는 형태발생 및 세균 층 형성의 부재를 나타낸다. 그러나, ndr2 mRNA의 10 pg로 주입된 배아로부터 절단된 박은 배양(도2D)에서8-9h 후에 높게 길어졌다. 이러한 이분야의 실시간 시간 경과 영상(DIC) 현미경 검사법은 C&E 형태발생이 그대로 제브라피시배아(22)에서시작되는 것과 동시에 8h 전후 수정(hpf)(그림 2F)에서또는 약 8h의 확장 개시가 있음을 밝혔다. MZoep-/--배아로부터 절단된 배아, 이는 필수적인 tdgf1 Nodal 공동수용체(23)가결여되어 ndr2 주입(도2E)에대한 응답으로 확장되지 못했고, 이는 이러한 전 생체 형태발생에 대한 노달 활성이 중요하다는 것을 입증한다. 또한, 시투 혼성화의 전산은 ndr2-발현-엑설토데름(sox2)및 여러 중음절 서브타입(tbxta, noto, tbx16)(도 2G)및 엔도름 및 배아주최자(20)의발현마커를 더 보여주었다.
중수에 의한 신경 절제술 유도에 대한 무달 신호는 필요하지 않습니다.
Nodal 신호 활동은 내막 및 대부분의 중구의 유도에 필수적이지만 제브라피시 가스trulae23,24내에서 신경 절제술 사양에 대한 분배된다. 주입되지 않은 제브라피쉬 blastoderm 파축은 신경절제술(도 3C18)으로분화하지 않았지만, 10pg ndr2를 주입한 배아로부터 의 외동하여 각축의 긴 축을 따라 뚜렷한 줄무늬로 신경 절제술 마커 sox2의 강력한 발현을 나타내며(도2G),신경절제술형성에 노달 활성이 요구됨을 나타낸다. 중진조직이신경조직(25,26,27,28,29)을유도할 수 있는 것으로 오랫동안 알려져 왔으며, 제브라피시 배반각(17)을 포함한다. 그러나, 이 절제 계통에 있는 신경 절제술 형성이 직접 Nodal 신호가 필요하는지 또는 외인성 Nodal 리간드가 신경 조직을 두 번째로 유도하는 중구를 유도하는지 여부는 불분명합니다.
두 개의 상이한 배아로부터장성 중구및 신경절제술을 함유한 키메라 식은 노달 신호가 신경 절제술 사양 ex vivo에대해 조직-자율적으로 요구되는지 여부를 테스트하기 위해 생성되었다. 각 축출물의 중피부는 중질형 형질전환GFP 기자,Tg[lhx1a:eGFP]30, ndr2의 고용량(100pg)으로 주입된 다른 WT 배아로부터 절단하였다(도 3A). 각 축출물의 putative neuroectoderm 부분은 형광 핵 마커 H2B-RFP(도 3A)를코딩하는 mRNA로만 주입된 제어 WT 배아 또는 Nodal 신호 결핍 MZ oep-/-배아로부터 절단되었다. 각 키메라 파종은 이들 두 가지 조건각각에서 하나의 blastoderm을 결합하여 생성되었으며, 이는 12hpf에서 현장에서 전체 마운트에 의한 조직 특이적 마커의 발현을 위해 분석되었다.
100 pg ndr2로 주입된 배아로부터 의 단일 배아 의 대부분은 소스2를거의 또는 전혀 표현하지 않으며, tbxta 및 lhx1a:gfp 리포터-전체 엑씨(도3B,G)를포함하는 중구의 마커를 발현하였다. 주입되지 않은 WT blastoderm (키메라 파종의 예비 신경 절제술 부분을 포함하는 유형)은 단일 절제로 배양 할 때 중피 마커나 sox2를 발현하지 않았으며 신경 절제술 및 중피 사양(도 3C,H)의부족을 나타냅니다. MZ oep-/-배아로부터 단일 배아 를 이식하는 것은 마찬가지로 ndr2 (도 3D)로주입된 경우에도 신경 절제술과 중피 마커 모두의 발현이 부족합니다. 그러나, 주입되지 않은 WT blastoderms가 노달 리간드의 고용량에 의해 유도된 중피와 결합되었을 때, 이러한 키메라 이질은 중도형 마커와 sox2를 강력하게 표현하였다(도3E,I). 이러한 결과는 이전에 관찰된 바와 같이,17,26,27,29,중음이 그렇지 않으면 비신경 외형이 될 세포에서 신경 운명을 유도할 수 있음을 보여준다. Nodal 신호가 신경 유도를 위해 이들 엑씨절의 예비 신경 절제술 부분 내에서 직접 필요한지 여부를 테스트하기 위해, 키메라 이질은 MZ oep-/-embryos(그림3J)로부터100 pg ndr2 및 blastoderms를 주입한 WT blastoderms에서 생성되었다. 이웃 중추 부로부터 노달 신호를 수신할 수 없음에도 불구하고, 이러한 이 종종은 WT 제어 키메라(그림3F)와유사한 정도로 sox2를 발현하였다. 이 결과는 신경 조직이 Nodal 활동의 부재에서 지정된 그대로 태아와 일치한다는 것을 보여줍니다, Nodal 신호는 신경 절제술 유도 ex vivo를위해 조직 자율적으로 필요하지 않다.
도 1: 제브라피쉬 블라스트데름 퇴치(Step 4.3)에 대한 절차(A) 노른자에 대해 닫힌 논우적 손(주황색)에서 포셉을 잡고 배아를 안정화시키면서 우세한 손(blue)의 집게를 사용하여 약 1/2높이로 배아를 안정화한다. (B)첫 번째 컷이 blastoderm을 가로 질러 약 중간에 도달하도록 배아를 잡는 파란색 집게의 가장자리를 따라 주황색 집게를 실행합니다. (C)배아를 90°로 회전한 다음 파란색 집게를 내부에 놓고 원래 절단(하지만 직교)을 넣고 나머지 blastoderm을 절단합니다. (D)이식된 blastoderm 세포가 약 5분 동안 3배 다니오의 용액으로 치유되도록 허용한 후 축축한 매체로 이송한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 (20에서수정): 노달 리간드제는 제브라피시 배아의 주입 및 절제의 다이어그램에서 C&E 형태 발생 및 세균 층 형성을 촉진합니다. (B-E) 2-4 소미트 스테이지에 상응하는 조건/유전자형의 라이브 blastoderm 의 대표적인 밝은 필드 이미지가 발산됩니다. N = 2~4개의 독립적인 시험에서 이의를 제거합니다. (F)10 pg ndr2 RNA를 주입한 WT 배아로부터 대표적인 절제물의 타임랩스 DIC 시리즈. (G) 10 pg ndr2 RNA를 주입한 WT 배아로부터 의 외동에 나타난 전사체에 대한 시투 혼성화에서 전체 마운트의 대표적인 이미지. 스케일 바는 200 μm입니다.
도 3 (31에서수정): 키메라 이절은 신경 절제균 사양이 조직 자율 노달 신호 전 생체 권을필요로하지 않는다는 것을 밝혀 . (A) 키메라 제브라피 익스베닉을 생성하는 절차의 다이어그램. (B-F) 100 pg ndr2 RNA(B)로주입 된 WT 배아로부터 의 외동에서 중피 형질 마커 tbxta (상단) 및 신경 엑토데름 마커 삭스2 (아래)에 대한 정시 혼성화의 전탈 WT 대조군(C),MZoep-/- 10 pg ndr2 (D)및 WT(E)또는 MZoep-/-에서신경 절제술 부분을 포함하는 키메라 이축주입(F) ) 2-4 소미트 단계와 동등한 배아. 분수는 검사된 총 식극수에 도시된 표현형과 함께 이식 횟수를 나타낸다. (G-J) 라이브Tg[lhx1a:gfp]의대표적인 이미지는 단일 배아(G-H)로부터 이산하거나 2-4 소미트 스테이지에 상응하는 조건의 H2B 발현 발아발아(I-J, 마젠타)와 결합한다. N = 세 가지 독립적 인 시험에서 이의 의 수. 스케일 바는 200 μm입니다.
| 솔루션 1 | 솔루션 2 | 솔루션 3 | 솔루션 4 | |
| 용액 | 3x 다니오의 | 달걀 물 | 엑스플랜트 미디어 | 0.3x 다니오의 |
| 재료 | 174 mM 나Cl | 60 μg/mL 바다 소금 | DMEM/F12 + 2.5mM L-글루타민 및 15m HEPES | 17.4 mM NaCl |
| 2.1 mM KCl | 증류수 1L | 신생아 송아지 세럼 또는 태아 소 세럼의 총 3 % 볼륨 | 0.21 mM KCl | |
| 1.2 mM MgSO4. 7H2O | 1:200 페니실린 (50 단위 / mL)-연쇄 상미신 (50 μg / mL) | 0.12 mM MgSO4•7H2O | ||
| 1.8 mM Ca (NO3)2 • 4H2O | 0.18 mM Ca (NO3)2 •4H2O | |||
| 15 mM 헤페 | 본보기: | 1.5 mM 헤페스 | ||
| 증류수 | 4 mL/조건 x 9 조건 = 36 mL | 증류수 | ||
| 1.08 mL 신생아 종아리 세럼 (NCS, -20 °C (3%)에서 알리인용 | ||||
| 0.18 mL 200x 펜 스트렙 (PS, -20 °C에서 알리인용) (1:200) | ||||
| 35 mL DMEM/F12 |
표 1.
Discussion
이 문서는 제브라피 스블라데스름 각출증을 생성하는 방법을 설명하고 위질에서 Nodal morphogen 신호의 역할을 해결하기 위해 이러한 각종의 두 가지 실용적인 응용 프로그램에 대해 논의했습니다. 이 절단 및 배양 식 배양 방법은 관심의 분자 경로를 조사하기 위해 작은 분자 화합물로 RNA 주사 및 치료를 사용하여 조작 할 수있는 순진한 세포의 빈 슬레이트를 제공합니다.
중요한 단계
이 프로토콜에는 성공에 특히 중요한 네 단계가 있습니다. 첫 번째는 적당한 양의 Nodal을 가진 배아를 주입하는 것입니다. 이 프로토콜은 ndr2 RNA의 10 PG를 권장하고, 복용량의 범위는 확장을 촉진하지만, 너무 많거나 너무 작은 Nodal최적의 각축 확장을 방지 할 것이다20. 두 번째 단계는 배아를 비코로 하는 것입니다. 배아가 너무 오랫동안 pronase에 남아 있는 경우에, 노른자는 파열할 것이고, 배아는 절단하기 위하여 실행 가능하지 않을 것입니다. pronase에 오래 있지 않으면 세척으로 인해 chorions가 느슨해지지 않으며 시간이 많이 걸리는 수동 비반향이 필요합니다. 세 번째 중요한 단계는 흥분을 줄이는 것입니다. 3배 의 용액을 자르는 것이 좋습니다.
또한, 세포의 순진함을 보장하기 위해 이병은 blastoderm의 약 절반 높이에서 절단해야합니다. 노른자에 너무 가깝게 절단되는 경우 조직 사양 및 형태 발생을 촉진하는 마진(내인성 Nodal 포함)의 신호를 포함합니다. 네 번째이자 마지막 중요한 단계는 키메라 이절의 치유에 있습니다. 절단 가장자리가 잘려자마자 부드럽게 뭉치지 않는 한 두 개의 이병은 키메라를 형성하기 위해 융합되지 않습니다.
수정 및 문제 해결
위에서 설명한 중요한 단계는 문제 해결의 기회를 제공합니다. 몇 가지 일반적인 문제와 제안된 솔루션은 아래에 나와 있습니다.
Nodal 신호가 있는 경우 이점이 확장되지 않으면 몇 가지 가능한 솔루션이 있습니다. (A) RNA가 전체 배아 전체에 고르게 분산되도록 단세포 단계에서 배아를 주입한다. (b) 주입된 부피가 마이크로미터를 사용하여 올바른지 확인하여 주사 볼러스를 측정함으로써 너무 많은 무달 RNA를 주입하지 마십시오. (C) 분해되지 않았는지 확인하기 위해 농도를 측정하여 너무 적은 무달 RNA를 주입하지 마십시오. (D) 일부 연령 일치 되지 않은 형제 자매를 유지 하 여 동등한 단계를 추론 하 여. 절제는 그대로 형제가 2-5 소미트 단계에 도달하면 최대 확장을 달성합니다. 이축이 너무 일찍 수집되면 최적의 확장에 도달하지 않습니다.
노른자가 비반향 후 파열되고 배아가 절단될 수 없다면, 코오리온이 주름지기 시작하고 1-2 배아가 초리온을 흘리면 pronase 용액에서 배아를 제거하십시오. 그런 다음 계란물에 즉시 헹구습니다.
파기가 가장자리 주위에 거품처럼 보이면 몇 가지 해결책이 있습니다. (A) 특정 개발 기간 내에만 절단합니다. 128-1000 세포 단계에서 어떤 단계에서든 절단된 각질이 생존하고 배양에서 연장될 수 있지만, 256-512 세포 단계에서 절단된 것이 가장 견고한 경향이 있습니다. (B) 적절한 치유를 보장하기 위해 3배 다니오의 솔루션으로 이출을 잘라내도록 한다. (C) 깨끗하지만 부드럽게 잘라냅니다. 절단 과정에서 세포를 스트레칭하거나 분리하지 마십시오.
주입되지 않은 제어 이해가 확장되면, 이발은 노른자에 너무 가깝게 절단 될 가능성이 있었다. 이마가 순진하게 되려면 노른자와 블라스트덤 꼭대기 사이에 상처가 중간쯤이 되도록 하십시오.
키메라 이축이 융합되지 않으면, 한 번 절단 된 3 x Danieau의 솔루션에 흥분하는 경향이 잘라 가장자리 위에 반올림하고 치유하기 때문에 가능성이 높습니다. 두 배반자가 스스로 치유되도록 하기 위해 절단 후 즉시 함께 누릅니다. 집게를 사용하여 아가로즈 내의 새로 합류한 배반에 부드러운 압력을 가하여 함께 치유하도록 격려하십시오.
제한
이러한 이 분야는 상대적 격리에서 주어진 형태겐(또는 다른 관심 분자)의 역할을 연구하는 귀중한 도구이지만, 모든 전 생체 권 모델에서 이루어진 관찰은 주의하여 해석되어야 합니다. 멸종은 생체 20에서관찰된 것과 매우 유사한 C&E 형태 발생을 나타내지만, 예를 들어, 상피 운동과 같은 모든 위화 측면을 되풀이하지는 않습니다. 그(것)들은 또한 손상되지 않는 태아 안에 존재하는 많은 그밖 규제 요인 및 신호 분자가 부족합니다. 이것은 흥분의 중요한 실험적 이점이지만 생체 내에서보유하지 않는 결론으로 이어질 수도 있습니다. 예를 들어, 외인성 Nodal 리간드를 수신하지 않는 엑자스는 신경 절제술 마커를 발현하지 못하기 때문에, 신경 절제술 사양에 대해 Nodal 신호가 필요하다는 것을 혼자 엑스처에서 결론을 내릴 수 있습니다. 그러나, 신경 절제술은 모든 Nodal 신호23,24가결여된 그대로 배아 내에서 형성되며, 신경사양(32)에서다른 신호 분자의 중요한 역할을 입증한다. 이식은 모포겐이 고립된 환경에서 무엇을 할 수 있는지 알려줄 수 있습니다. 여전히, 모든 사실 인정은 결과를 철저히 해석하기 위하여 손상되지 않은 태아와 비교된/ 또는 비교되어야 합니다. 즉, 이질은 발달 중인 배아의 자리를 대신할 수 없습니다. 대신, 그들은 주변과 모르포겐의 역할과 관계를 식별하는 보조 도구입니다. 이러한 한계를 염두에 두고, 제브라피쉬 폭발성 파종은 많은 연구 질문에 귀중한 도구입니다.
기존 방법에 대한 중요성
합성 배아학에 대한 새로운 관심으로, 몇몇 ex vivo 및 체외 접근은 정기적으로 배아 발달의 양상을 모형하기 위하여 채택됩니다. 예를 들어, 마우스 또는 인간 배아/유도만능 줄기 세포로 구성된 2차원 및 3차원 가스룰로이드는 외인성 신호 분자의 적용을 통해 동축될 수 있으며, 일부 패턴 및/또는 변위 및/또는 변성 의 형태를 재구성하여33,34,35,36, 36, 36, 36, 36, 37, 36,37 . 비록 강력하지만, 이러한 방법은 지속적으로 다능성 줄기 세포를 유지하고 위화 단계에 도달하는 데 며칠이 걸리는 가스룰로이드를 성장시키기 위해 힘들고 장기간의 배양 방법을 필요로합니다. 대조적으로, 제브라피쉬 이질은 배아가 필요에 따라 단순히 수집되기 때문에 줄기 세포 배양의 유지 보수가 필요하지 않습니다. 그(것)들은 제브라피시 배아와 동일하는 시간 안에 위트류 단계를 생성하고 도달하는 것이 상대적으로 간단합니다. 이것은 제브라피시 이병의 또 다른 장점을 강조, 그들의 그대로 개발 시계. 배아와 유도된 만능 줄기 세포의 발달 연령이 가변적이고 높게 토론될 수 있기 때문에, 배아 이질은 아마도 발달의 현세적 조절을 조사하기에 더 적합할 것입니다. 마지막으로, 페스코이드 제브라피쉬(배아 마진 포함)가 문화12,13에서유사하게 확장되지만, 내인성 신호 센터에 대응하여 그렇게 한다. 대신, 여기에서 기술된 이 분야는 연구원이 그러한 배아 신호에서 상대적으로 적은 간섭으로 관심있는 분자를 조사할 수 있게 합니다.
미래의 잠재적 애플리케이션
여기서, 이병은 C&E 형태발생에 노달 신호가 필요하고 충분하다는 것을 보여주기 위하여 이용되었습니다. 여전히, 그것은 그(것)들이 유전자 발현의 규정, 신호 그라데이션 및 추가 형태유전학 프로그램의 많은 다른 발달 프로세스에 있는 많은 다른 분자의 역할을 분별하기 위하여 이용될 것이라는 점을 예상됩니다. 추가적으로, 이 각질은 적어도 24 hpf19까지실행 가능하기 때문에, 그들의 유틸리티는 분할 및 유기 발생과 같은 프로세스로 위화를 넘어 확장될 것이라는 점을 예상할 수 있습니다, 연구원이 발달 빈 슬레이트를 원하는 어떤 프로세스든지.
Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NICHD R00HD091386에서 MLKW, NIEHS T32ES027801에서 AAE에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
| 6-well plates | Fisher | FB012927 | |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
| Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
| DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
| Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
| Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
| Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
| HEPES | VWR | JT4018-1 | |
| Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| KCl | VWR | BDH9258-500G | |
| Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
| MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
| Mineral oil | VWR | MK635704 | |
| NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
| Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
| Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
| Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
| Tween-20 | VWR | 200002-836 |
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