Summary
胚発生には、細胞運動の大規模な調整が必要です。2光子励起媒レーザーアブレーションは、深部細胞の大群の空間制御3次元アブレーションを可能にする。さらに、この技術は、生体内で細胞を機械的環境 で 摂動する一括的に遊動する反応をプローブすることができる。
Abstract
形態形成は、組織や器官に細胞を整理するために多くの細胞の動きを伴います。適切な開発のためには、これらすべての動きを緊密に調整する必要があり、証拠を蓄積することは、少なくとも部分的には機械的相互作用を通じてこれが達成されることを示唆している。胚でこれをテストするには、直接的な物理的摂動が必要です。レーザーアブレーションは、機械的な制約を緩和したり、2つの細胞集団を互いに物理的に分離することを可能にする、ますます使用されるオプションです。しかし、多くのアブレーションは、限られた軸解像度と組織の浸透を提供する紫外線(UV)レーザーで行われます。2光子顕微鏡を用いて深く、有意で、空間的に明確に定義された容積を取り下げるための方法をここに記載する。アブレーションは、軸性メセンドームの緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュラインで実証され、上にある外胚葉または下層の黄身細胞に影響を与えることなく軸性の間皮を切断するために使用される。細胞の挙動は、アブレーションの前後のライブイメージングによって監視されます。アブレーションプロトコルは、数ミクロンから100ミクロン以上のスケールで、任意の細胞タイプまたは組織上の異なる発達段階で使用することができます。
Introduction
細胞間相互作用は、開発において重要な役割を果たします。細胞は、直接の隣人、または遠く離れた細胞が知覚できる信号を提供し、それによってその運命および/または行動に影響を与えます。これらの信号の多くは、自然の中で化学的です。例えば、よく特徴付けられる誘導事象では、ある細胞群は、別の細胞集団の運命に影響を与える拡散性分子を生成する1。しかし、他の信号は機械的です。細胞は、隣人が知覚し、2に応答する彼らの隣人に力と制約を発揮します。
生体内での細胞間相互作用の重要性を研究する一つの方法は、細胞を除去し、その後の発達を観察することです。残念ながら、細胞を除去または破壊する利用可能な技術は限られています。細胞は、針または小さなワイヤーを使用して外科的に3,4を除去することができるが、そのような治療は侵襲的であり、あまり正確ではなく、通常は実体顕微鏡下で行われ、顕微鏡下での即時のイメージングを防ぐ。さらに、深部細胞を標的とすることは、上層部の組織に穴を開け、望ましくない摂動を生み出すことも意味します。遺伝的にコード化された光化物は、KillerRedのような、光照明を介して細胞死を誘導するために使用されてきた5。光化剤は、光照射時に活性酸素種を生成するクロモフォアです。彼らの主な制限は、細胞が動いている場合に達成するのが難しいかもしれない長い光のイルミネーション(約15分)を必要とし、即座ではないアポトーシスを通じて細胞死を誘発することです。
最後に、レーザーアブレーションは、過去15年間で開発され、広く使用されています 6,7,8,9,10,11,12.レーザービームは標的細胞/組織に焦点を合わせる。それは加熱、光切除、またはプラズマ誘発アブレーションを通してそのアブレーションを誘発する;関係するプロセスは、電力密度と露光時間13に依存します。ほとんどのアブレーションプロトコルは、高エネルギーにUVレーザーを使用します。しかし、UV光は両方とも生体組織によって吸収され、散乱される。したがって、深部細胞を標的化するには高いレーザーパワーが必要であり、その後、より表面的で平面外の組織に損傷を与える。これは、表面構造にUVレーザーの使用を制限し、その比較的低い軸解像度を説明します。非線形光学(いわゆる2光子顕微鏡)は、非線形の光特性を使用して、赤外線領域内の約半エネルギーの2つの光子を有する蛍光色素を励起する。アブレーションに適用する場合、これには3つの主な利点があります。まず、赤外線は生体組織14によるUV光よりも散乱が少なく、吸収が少なく、必要なレーザーパワーを増加させることなく、より深い構造に到達することを可能にする。第二に、フェムト秒パルスレーザーの使用は、プラズマ誘導を介してアブレーションを作成し、加熱に反して、空間的に拡散しない非常に高い電力密度を提供します15。第3に、プラズマ形成を誘導する電力密度は、焦点のみで到達する。これらの特性のおかげで、2光子レーザーアブレーションは、周囲の組織環境に影響を与えることなく、深部細胞を正確に標的化するために使用することができます。
集団移動は、細胞と細胞の相互作用が基本的な発達過程の優れた例である。集合的な移行は、隣接するセルが 1 つの cell16 の動作に影響を与えるセル移動として定義されます。これらの相互作用の性質(化学的または機械的)およびそれらが細胞の移動に与える影響は大きく異なり、多くの場合、完全には理解されていません。細胞を除去し、これが他の人にどのような影響を与えるかを観察する能力は、これらの集合的なプロセスをさらに解明する上で重要です。数年前、ゼブラフィッシュの胃の中でポルスターの移動が集団移住であることを、外科的アプローチを用いて確立しました17。ポルスターは、胚18の後側の第1の内在化細胞を構成する細胞群である。 Tg(gsc:GFP) トランスジェニックラインで緑色に標識されたこれらの細胞は、胚の深部、エピブラスト細胞のいくつかの層の下に位置する。胃の間、このグループは軸性中胚の延長を導き、胚の形成者から動物の極19、20、21、22、23 に移動する(図1A)。私たちは、細胞が動物の極の方向に彼らの移動を向けるために彼らの隣人との接触を必要とすることを確立しました。しかし、この集団移動の細胞および分子塩基をよりよく理解するには、いくつかの細胞を除去して、これが残りの細胞にどのような影響を与えるかを確認する必要があります。そこで、2光子顕微鏡を用いて大体積と深いボリュームのアブレーションを開発しました。ここでは、このプロトコルを使用して、その真ん中にポルスターを切断し、Histone2B-mCherryで標識された核を追跡することによって細胞移動の結果を観察することを実証する。
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Protocol
すべての動物の仕事は、倫理委員会N 59とミニステア・ド・レヒスメント・ナショナル、ド・ランセワニエメント・スペリエール・エ・ド・ラ・レシェルシュのファイル番号APAFIS#15859-2018051710341011v3によって承認されました。以下に説明する手順の一部は、当社の機器とソフトウェアに固有のものですが、さまざまな機器に簡単に適応することができます。
1. 注射準備
- 胚培地(EM)で1%アガロース溶液の75 mLを調製します。
- 90 mm ペトリ皿に注入金型を入れ、約 50 mL のアガロースを注ぎ、金型が浮くのに十分です。アガロースを固め、注入型を取り除きましょう。
- アガロースを30mmペトリ皿に1mL入れ、アガロースコーティングした料理を用意します。
- RNaseフリー水でストック溶液を希釈し、氷の上に保つことによって、30 ng /μLヒストン2B-mCherry mRNA溶液の4 μLを調製します。
注:RNase媒介性の劣化を避けるためにmRNAを操作しながら手袋を着用するように注意してください。 - マイクロピペットプーラーを使用して毛細血管から注射針を引っ張ります。
2. 胚の準備
- 魚が卵を産んだら、EMで90mmのペトリ皿に収穫し、収集し、すすべり、収穫します。胚を28.5°Cインキュベーターに入れる。
- 最初のセルが見えるように 20 分待ちます。
- 30個の胚をEMで満たされた注入プレートに移す。わずかに鈍い鉗子を使用して溝の中の胚を絞り、動物のポールを上に向けます。
- マイクロローダーチップを使用して、注射針に2 μLのmRNA溶液を充填します。ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブに接続されたマイクロマニピュレータに入れたキャピラリーホルダーに針をエアインジェクタに挿入します。
- 実体顕微鏡の下で、針の先端を慎重に折ります。
- 細胞に針を挿入して、1細胞段階の胚にmRNA溶液を注入する。
メモ:注入される容積はセル容積の約3分の1である。 - 28.5°Cインキュベーターに戻って注入された胚を入れる。
3. 二光子顕微鏡の作製
注: このプロトコルでは、2 つのレーザーが使用されています。1 つは、GFP (920 nm) をイメージし、アブレーション (820 nm) を実行するために使用されます。グリーン/アブレーションレーザーと呼ばれます。もう一つは、mCherryをイメージするために1160 nmで使用されます。赤レーザーと呼ばれます。
- 緑/アブレーションレーザーを820 nm(アブレーション波長)に、赤色レーザーを1160 nm(mCherry励起)に設定します。
- 光路上の可動ミラーを使用して、スキャンヘッドの入り口と出口の両方で緑色/アブレーションと赤のレーザービームを整列させます。
注: これにより、レーザービームの焦点が増加し、励起とアブレーションの焦点量が最小限に抑えられます。 - 目標の下で820 nmでグリーン/アブレーションレーザーの最大電力を測定します。そのためには、目的の下にパワーメーターを置き、黒い部屋を閉じ、緑/アブレーションレーザーパワーを100%に設定し、シャッターを開きます。300 mW に達するために必要なレーザーパワーの割合を計算します。
- グリーン/アブレーションレーザーを920 nm(GFP励起)に戻し、レーザーパワーを7%に設定します。赤いレーザーパワーを15%に設定します。
- 緑と赤の線のためのエピフォトマルチプライヤチューブ(PMT)検出器をアクティブにします。65 に緑と赤の線 PMT 感度を設定します。
- 視野を400 x 400 μmに、画像解像度を512 x 512ピクセルに設定し、スキャン周波数を800 Hzに設定します。
- [3D タイムラプス イメージング モード]を選択します。次に、フォルダを作成し、取得後にデータの自動保存を有効にします。
- 加熱室を組み立て、28°Cに設定します。 チャンバーと目的が暖かくなるのに少なくとも10分待ちます。
4. 胚の取り付け
- 蛍光体型顕微鏡の下で、GFPを発現する70%のエピボリーで胚を同定する。
注:より良いイメージング品質のための軸中胚および背景蛍光のない明るい信号を有する胚を選択する。 - プラスチック製のパスツールピペットを使用してアガロースコーティング皿(ステップ1.3)で3〜4個の選択した胚を移し、細かい鉗子を使用して慎重にデコリオネートします。
注意:デコリオネート胚は非常に繊細であり、空気またはプラスチックと接触すると破裂します。 - 小さなガラスバイアルに1xペニシリンストレプトマイシンEMで0.2%アガロースの1 mLを注ぎます。バイアルを予熱した42°Cのドライブロックヒーターに入れる。
注:アガロースが設定される前に胚の向きを可能にするために、次の手順を迅速に実行する必要があります。 - 火で磨いたガラスピペットを使用して、0.2%のアガロースガラスバイアルでデコリオネート胚を移す。アガロースにEMを加えすぎないように注意して、希釈しないように注意してください。残りのEMをピペットから捨て、胚がピペットから落ちる前にガラス底皿のスライドを覆うのに十分なアガロースと一緒に胚を吸引する。
- アガロースと胚を皿のガラススライドで吹きます。胚が空気や皿のプラスチック側に触れないように注意してください。次に、ガラススライドの周りのチャンバーをアガロースで満たします。
- まつげを使用して、ターゲット領域が上部になるように胚の向きを指定します(図1B)。
注:胚の配向時には、非常に壊れやすい黄身ではなく、ブラトデベルムだけに触れるのに注意してください。アガロースは室温に応じて約1分で設定されます。 - アガロースが完全に設定されるまで〜5分待ってから、ペニシリンストレプトマイシンEMを数滴加えます。
5. 胚の位置とアブレーション前のイメージング
- 熱い部屋の目的の下にガラス底皿を置きます。ペニシリンストレプトマイシンEMに目的を浸し、加熱されたチャンバーを閉じます。
- スライダを動かして、光のパスをオキュラーに設定します。次に、眼、蛍光灯、およびステージコントロールを使用して、胚を見つけ、胚の表面に焦点を当てる。
- 蛍光灯を消し、PMTへの光路を設定し、黒い部屋を閉じます。
注:PMTが損傷する可能性があるため、黒い部屋のすべての光源をオフにするように注意してください。 - ライブイメージングを開始し、軸中軸を見つけます。グリーン/アブレーションと赤レーザーのパワーを調整して、良好な信号を得ます(GFP表現領域の場合、ピクセルあたり1,000~20,000光子)。赤いチャネルを使用して、ステージを胚の最上部に移動し、この位置を Z = 0 に設定します。
- 1分の時間ステップと2μmのZステップを選択してください。110 μmのZコースは、ポルスター全体を包含するのに十分であり、これらの設定で1分未満で獲得されます。軸中隔の上に15μmの最初のスライスをセットします(より表面的な外視)。
注:ポルスターは曲線に沿って移動するので、Zスタックの底部のスライスは、タイムラプスイメージング中の動きに対応するために、最も深い位置を30μm深く設定する必要があります(図1E)。 - アブレーション前の映画の記録10-15分。
図1:レーザーアブレーションの成功した結果.(A)後視で70%のエピボリーでの胃切れ胚のスキーム。pAM: 後軸中隔;黒い矢印はポルスター移行の方向を示します。黒い四角は、ポルターのアブレーションの典型的な視野を示します。(B)ポルスター断絶のための胚取付のスキーム。横表示。胚は、ポルスターの平面が光軸に対して垂直になるように取り付けられる。(C)生存および(D)受精後24時間での対照およびアブレート胚の形態。スケールバーはヒストン2B-mCherryを発現するTg(gsc:GFP)胚のポルスターにおけるレーザーアブレーションからの時間配列です。緑のチャンネルのみで表示されるビューは、最大投影です。クローズアップは、細胞の破片を含むアブレート領域を表示します。緑と赤(マゼンタとして表示)チャンネルを持つビューは、アブレーションの前後に XY と XZ スライスです(緑色の稲妻はアブレーションを表します)。XZスライスは、上にある組織(GFP発現のないマゼンタ核)が基礎構造のアブレーションの影響を受けないことを示しています。黄色の破線ボックスは、レーザーアブレーション処理のために選択されたROIに対応します。スケールバーは、大きなビューで50μm、クローズアップで25μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
6. ターゲット位置とレーザーアブレーション
- ライブイメージングでポルター輪郭を見つけ、電気光学変調器の関心領域(EOM ROI)ツールを使用して、ポルスターの幅にまたがる20ピクセル(15 μm)の大きな長方形を描きます。この長方形をポルスターの中央に配置します(図1E)。
- ポルテル セルを含む最も高い平面と最も低い平面の軸方向の位置に注意してください。アブレーションは、これら2つの平面の間で10μmごとに行われます。ROI がこれらの平面の卵黄セルに重ならないように注意してください。
- 間隔の最も低い Z 位置にステージを配置します。アブレーションは、破片が光を吸収するので、ボトムアップを実行する必要があります。
- 緑/アブレーションレーザー波長を820 nmに設定し、 出力の割合 を設定して300 mWの出力電力を得ます(ステップ3.3)。
- イメージング周波数を200 Hzに設定します。
- 緑/アブレーションレーザーイメージングEOMを0に設定し、 ROI-Treatモードを 選択します。
- EOMをオンにし、(0フレーム後)すぐに処理を開始するように設定します。
- イメージングモードをタイムラプスに設定し、自動保存を解除します。
- [タイム ステップ]を[高速]モードに設定します。
- [処理フレーム数] と [フレーム数] を、対象の深さに対応する値に設定します(表 1)。
| 深さ(μm) | 治療フレーム |
| -30 | 1 |
| -35 | 1-2 |
| -40 | 1-2 |
| -45 | 2 |
| -50 | 2-3 |
| -55 | 3 |
| -60 | 3-4 |
| -65 | 4 |
| -70 | 4 |
| -75 | 4-5 |
| -80 | 4-5 |
| -85 | 5 |
| -90 | 5 |
| -95 | 5-6 |
| -100 | 6 |
| -105 | 6 |
表1:胚における標的細胞深度の関数としてのレーザー処理フレーム数の提案(0は胚の表面である)。
- イメージングを開始します。EOM治療中にPMTへのシャッターが閉じると、取得は黒になります。
- ステージをリストの次の Z 位置に上げる (ステップ 6.2)。
- ステップ 6.10 ~ 6.12 を繰り返して、ポールスターの上部に到達します。
7. アブレーション後の検証とイメージング
- グリーン/アブレーションレーザーを920 nmおよび5%の電力に設定します。緑/アブレーションレーザーイメージングEOMを100に設定し、 フルフィールド モードを選択します。
- イメージング周波数を800 Hzに設定し、EOMをオフにします。
- すべてのプレーンがアブレートされているかどうかを確認するために、ライブモードでスタック全体を通過します。この場合は、手順 6.2 に戻ります。
注: アブレーションは、Zスタックを再定義しなければならないように、隣接する組織の垂直シフトを誘発することがあります。 - イメージングモードを3D Timelapseに設定し、自動保存を再びアクティブにします。アブレーション後の映画の記録40-60分。
- アブレーション後のムービーで、標的細胞が効果的に失われたかどうかを確認します。蛍光回復、または領域を占有し、フォロワー細胞が通過するのを妨げる標的細胞は、標的細胞が光漂白されただけで、アブレートされないことを示す(図1Eおよび図2A)。
図2:レーザーアブレーションの負の結果(A)レーザーアブレーションにおける潜在的な故障の典型的な例。大きな XY ビューは最大投影であり、XZ ビューは再構築された断面です。レーザー処理領域は、2つの白い矢印の間にあります。3 つの焦点平面が再構築されたセクションでハイライト表示され、右側に表示されます。これらは、3 種類の障害に対応します。平面1は、ポルスターの上の細胞がアブレートされたことを示しています。これは、ポルスターの上のこの焦点面(クローズアップを参照)に自己蛍光破片が存在することによって識別することができます(再構築されたセクションの平面1の位置を参照してください)。これは、省略する領域の定義が正しくないことが原因である可能性があります。平面 2 は、漂白されたが、アブレートされていない細胞を示しています。それらは低い蛍光シグナルとして識別することができるが、それでも無傷の細胞輪郭を明らかにする(クローズアップ参照)。平面3は、レーザー処理によってほとんど漂白されていない無傷の細胞を表示します。これは、アブレートされる領域の誤った定義または貧しい治療から生じる可能性があります。平面2および3に描かれた状況では、アブレーション処理を非アブレート対象細胞に再適用することができる。スケールバーは、大きなビューで50 μm、クローズアップで20 μmです。(B)あまりにも激しいレーザー処理のためにキャビテーションによって形成された気泡(白いアスタリスクでマークされる)の典型的な例。このような気泡はZ面に限らず、時にはポルスターの全高にまたがって隣接組織を変形させることもある。スケールバーは50 μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
8. データ分析
- 画像解析ソフトウェアでタイムラプスシリーズを開き、正しいピクセルサイズを設定します。
- スポット関数で、オブジェクトサイズを 10 μm に設定します(これは、ガストルレーション中の平均核サイズ)。次に、スポット関数を実行して、核を検出して追跡します。
注: 検出は、Z軸に沿って長さ12μmの楕円体形状を合わせ、下軸分解能を考慮することで若干改善される場合があります。 - フィルターを使用して、誤検出を削除します。 Tg(Gsc:GFP) 線では、胚軸の細胞と一部の内皮細胞は緑色で標識されます。したがって、緑色の強度でフィルタリングすると、これらのセルを素早く選択できます(図3A)。
- 連続する点の最大距離を、セルの速度と互換性のある値に設定します。
注: 2 つのフレーム間の時間間隔を考慮するように注意してください。ポルスター細胞は2.8±0.8 μm/minで移動します。したがって、1分の時間ステップで最大変位の4 μmを許可すると、ほとんどのアーテフ実測のトラックが削除されます。 - 1 つまたは 2 つのタイム ポイントにギャップを許容すると、連続したトラックが長くなりますが、トラッキング エラーが発生する可能性があります。1 回限りのポイントで核が正しく検出されない場合は、異なるパラメータ/フィルタでスポット検出を再実行することを検討してください。
- トラックを視覚的にチェックし、必要に応じて修正します。
- 結果を.xlsxファイルとしてエクスポートします。公開されたスプレッドシートルーチン24 (図3B)とデータ分析ソフトウェアのカスタムルーチン(要求に応じて利用可能)を使用してファイルを処理します。
図3:ポルスターの前半分の分離は細胞の方向性に影響を与える。 (A)3D再構成は、ヒストン2B-mCherry(マゼンタに表示される )を発現するTg(gsc:GFP) 胚を、その真ん中にポルスターを切断する前後に起こる。ポルスターの前半分に属する核はマゼンタドットでマークされ、アブレーションの前後に時間をかけて追跡されます( Movie S1を参照)。スケールバーは50μm(B)移動持続性の尺度として、アブレーション前後のポルスターの前部に属する細胞の方向自動相関である。細胞はアブレーション前の連続運動を示し、アブレーション後に大幅に減少し、集合指向の移動の喪失を示します。方向自己相関はまた、コントロールとして非アブレート胚のポルスターの前半分を形成する細胞についても測定した。グラフエンベロープは標準誤差を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
その途中でポルスターを切断するために、ヒストン2B-mCherry mRNAを注入した Tg(gsc:GFP) 胚を、ステップ4で説明したように70%エピボリー段階に取り付けた。このポルスターはGFPの発現により同定され、その胚は、ポルスターの平面が光軸に対して垂直になるように取り付けた(図1B)。胚をこの位置から離すと、手順が複雑になります。光はアブレーション平面に到達するためにより多くの組織を通過する必要があり、アブレーション平面は胚軸に対して傾きます。すべての細胞核が正しく標識されていることを確認した後、10分前アブレーションタイムラプスを記録し、アブレーション前の細胞の動きを捕捉した(図1E および 図3A、 ムービーS1)。
ポルスターは形態学的に同定され、その真ん中に位置する15μm x 200 μmの長方形領域は、ポルスターの全深部を断ち切るために5つの焦点面でアブレーションされた(図1E、Movie S1)。イメージングはアブレーション直後に再開され、手順の効率を監視するために使用されました。成功した場合、アブレーションは、アブレートされたボリュームが信号フリーボリュームとして表示されるように、すべての細胞構造とGFPとmCherry蛍光を排除します。ただし、いくつかの破片が作成される可能性があります。この破片は、緑と赤の両方のチャネルで、自己蛍光であり、通常、アブレーションの方向に平行に不規則な細長い形状を表示します(図1E)。あまりにも激しい治療は、障害物や摂動細胞の行動として機能する可能性のある大量の破片を形成します。より強い治療は、組織の気泡の形成によって特徴付けられたキャビテーションを誘発することさえある(図2B)。キャビテーションは、組織で伝播する機械的衝撃波に関連しており、標的となるボリューム13,15から損傷を引き起こす可能性があります。キャビテーション気泡を持つ胚は廃棄されるべきであり、治療はより少ない処置フレームを行うことによって調整されるべきである。
逆に、あまりにも少ない治療は、血漿形成を誘発することなく蛍光性蛍光体をフォトブリーチする可能性があり、したがって、アブレーションを伴わない(図2A)。不完全な光の漂白は、特徴的な細胞形状を有する薄暗い蛍光の存在によって容易に見分けることができる(図2A)。このような胚は、より多くの治療フレームを行って捨てるか、再び治療すべきである。完全なフォトブリーチングは、両方とも信号のないボリュームをもたらすので、成功したアブレーションと区別するためにより困難です。しかし、蛍光はアブレーション後のイメージングの過程で徐々に回復するので、光漂白は遡及的に同定することができる。しかし、これは、非アブラテッド胚が少なくとも30分間画像化されることを意味し、時間がかかる。したがって、我々は、(治療の数を増やすことによって)細胞の挙動に影響を与えないが、すぐに有効な切除を確認する少数の目に見える破片の形成を誘発するために、治療強度を調整することを提案する。最後に、アブレーションボリュームを取り巻く細胞の損傷がない場合は、アブレーション後の最初の画像で確認する必要があります(図2A)。レーザー処理が正しく調整されると(破片が少ない)、隣接する組織の損傷は、非常によく空間的に定義されているアブレーションの空間的広がりから生じる可能性は低いが、むしろターゲット選択とアブレーションの間の時間の間にアブレートされる領域および/または組織の動きの不正確な選択から生じる。影響を受けた隣接組織を有する胚は廃棄すべきである。
アブレーションに成功した後、Zスタックを毎分40分間捕獲し、GFP細胞質信号とmCherry核信号の両方を記録した。その後、核を追跡し、その動きを細胞の動きの代理として使用しました。ポルスター細胞に対応するトラックは、その強いGFP信号で同定された(図3A、動画S1)。細胞移動の持続性を、セル方向自動相関24を計算することによって測定した。ポルスターの前半分に位置するポルスター細胞に焦点を当てることで、その真ん中にポルスターを切断し、これらの細胞をポルターの後部から分離し、方向自己相関を減少させ(図3B)、ポルスター細胞の適切な移動は、実証された集団移動17に沿って、全体のポルスターの完全性を必要とすることを実証した。
アブレーション後の映画を取得した後、胚を取り外し、微細な鉗子を使用してアガロースから慎重に抽出し、受精後24時間に達するまで28.5°Cでインキュベートすることができます。繰り返しますが、胚は生き残るべきであり、明らかな形態学的欠陥を示すべきではありません(図1C,D)。
ムービーS1:成功したレーザーアブレーション。 ヒストン2B-mCherryを発現する Tg(gsc:GFP) 胚のポルスターの真ん中にレーザーアブレーションを行う。ポルターの前部からの核は時間の経過とともに追跡され、マゼンタの点でマークされます。トラックは時間を色分けしています(図3)。空のフレームはレーザーアブレーションに対応します。 こちらをクリックして、このムービーをダウンロードしてください。
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Discussion
ここでは、非線形光学を使用して深く、空間的に明確に定義されたボリュームアブレーションを実行するプロトコルについて説明します。プロトコルの最も重要なステップは、過度の破片やキャビテーションを避けるために、アブレーションを可能にするのに十分なエネルギーを提供するが、あまりにも多くのエネルギーを提供する治療条件を見つけることです。標的部位での送達エネルギー量は主に依存する:(1)レーザー出口電力、(2)レーザーアライメントの品質、(3)光がアブレーション平面に到達するために通過する組織の性質、(4)アブレーション平面の深さ。したがって、各実験の前に、レーザー出口電力を測定し、基準値(プロトコルでは820 nmで300 mW)に調整し、適切なレーザーアライメントを確保することが重要です。これらの仮定の下で、治療条件は実験日から別の日に再現可能であるべきです。特定のサンプルタイプに最適なパラメータ(レーザーパワーと処理フレーム数)を定義するために、広範なテストを実施することをお勧めします。これらのパラメータは、すべての同様の実験で使用することができます。ここで説明する例(ガストルレーション中のポルターの切断)では、例えば、胚内の異なる深さで切り出しの治療条件を確立し(表1)、実験を行う際にこのチャートに依存しています。注目に、820 nmの波長は、我々のシステム上で、(レーザーおよび光学特性による)最高のピークエネルギーを提供する波長であるとして選択された。システムの特性に応じて、より短いまたは長い波長を使用することができます 6,11,12.標的組織の深さは重要なパラメータであり、誤った取り付けは、光が標的体積に到達するために通過しなければならない組織の厚さを増加させる可能性があるため、胚の取り付けも重要なステップである。
記述されたプロトコルの元の特徴の1つは、異なるフォーカルプレーンで連続したアブレーションを実行することによってボリューム全体をアブレーションすることです。アブレーションは光を吸収する破片を生成するので、我々は最も深い平面でアブレーションを開始し、最も深い平面から最も表面的な平面に順次アブレートすることが重要であることを同定した。
このプロトコルは、深い容積と大量のアブレーションと、1時間以上のアブレーション後数分以内に隣接する組織応答の記録を記述する。プロトコルの潜在的な制限の1つは、アブレーションを実行し、イメージングを再開するために必要な時間です。この遅延を制限する要因は 2 つあります。最初の1つは、複数の焦点面でアブレーションを実行するために必要な時間です。当社のシステムでは、ポルターの切断は、2-3分で訓練を受けたユーザーによって行われます。これは、ソフトウェアを最適化して異なる平面上のアブレーションを自動化することで削減できます。それでも、総アブレーション時間は、ターゲット領域をスキャンするのに必要な時間に等しく、各焦点面の繰り返し回数を倍にし、焦点面の数を倍にします。細胞の移動速度を考慮すると、これは、一部のセルがアブレーション手順中にターゲット領域に出入りする可能性があることを意味します。私たちのケースでは、これは問題ではないことを証明しませんでしたが、セルターゲティングの絶対的な精度が必要な場合である可能性があります。2つ目の制限要因は、同じレーザーがアブレーション(820 nm)を実行し、緑色の蛍光(920 nm)を励起するために使用されるということです。最後のアブレーションと記録の開始までの遅延は、820 nmから920 nmまでのレーザーの調整に必要な時間(30 s~1分)によって定義されます。
いくつかのケースでは、特に、より小さなアブレーション(単細胞アブレーション、細胞骨格要素などの細胞内成分のアブレーション)のために、細胞/組織の即時応答を記録することは、その機械的状態を推測するために重要である可能性があります25,26,27。このような場合、制限は、別のレーザーでイメージング(例えば、1160 nmレーザーまたは第3のレーザーラインを使用して赤色の信号のみを記録する)、または820 nmで緑色の蛍光方を撮影することによって回避することができます。これは、イメージング(蛍光色素の限られた励起、強い光毒性効果)のための最適な波長ではありませんが、即時組織応答を記録するために短期間で使用することができます。
細胞を排除し、これが胚の残りの部分にどのような影響を与えるかを確認するために利用可能ないくつかの技術があります。2つの主なオプションは、レーザーアブレーションのように、細胞を物理的に除去するか、それらを破壊することです。物理的な除去と比較して、細胞破壊は細胞質含有量を放出し、隣接する細胞に影響を与える可能性がある。これは歴史的に、カエルとウニ胚28のモザイクまたは調節的な発達に関してヴィルヘルム・ルーとハンス・ドリシェによって得られた論争と発散結果によって強調された。最近では、創傷が傷(細胞を破壊する)または挿入物を除去することによって創傷治癒アッセイに違いが見られる。しかし、他の組織に損傷を与えずに細胞を物理的に除去することは、胚の表面の細胞と、隣人にあまり付着していない細胞に対してのみ可能であり、したがってそのようなアプローチの範囲を制限する。その結果、細胞を破壊するためのさまざまな戦略が開発され、レーザーアブレーションが最も採用されています。UVレーザーアブレーションは、特に、小さな表面的なアブレーションを行い、即時組織応答を観察するために、ますます使用されています。
ここでは、より深く、空間的に明確に定義されたアブレーションを実行するための赤外線の使用について説明しました。このプロトコルの主な制限は、赤外線パルスレーザーと2光子イメージング設定の要件です。しかし、このような機器は、イメージングプラットフォームでますます頻繁になっています。さらに、画像内の1つの領域を選択的にアブレーションするためにここで使用されるEOMは、光漂白後の蛍光回復(FRAP)モジュールに置き換えることができる。あまり便利ではありませんが、対象領域10をズームするだけで、EOMやFRAPモジュールなしでプロトコルを実行することさえ可能です。パルス赤外線レーザーを使用すると、ほとんどの古典的なアブレーションプロトコルと比較して2つの主な利点をもたらします。まず、生きている組織に赤外線が効率的に浸透したおかげで、焦点外の損傷を引き起こさないレーザーパワーで深焦点面に到達することができます。これにより、1光子励起プロトコルで手の届かない120μmの深さの細胞を標的にすることができました。第二に、非線形光学の使用は、組織の深さでも、正確に制御された3Dアブレーションを可能にする優れた軸解像度を保証します。これら2つの利点を組み合わせることで、具体的に定義された深い、そして最終的に大量のボリュームの切り立てが可能になります。
我々は、ポルスターを断ち切るために2光子顕微鏡を使用して説明し、我々および他の人が最近行った実験30。しかし、調整が少ない場合、提案されたプロトコルは多くの異なるサンプルに適応することができます。例えば、私たちは、ポールスターの完全なアブレーション、胃の間の横中皮内のアブレーション、または関連する軸索上での個々のシュワン細胞のアブレーションを、軸索に影響を与えることなく正常に使用しました。したがって、このプロトコルは、多くの実験システムにおいて、いくつかの細胞/組織が近隣の構造の挙動と発達に及ぼす影響を分析するのに役立つ価値のある汎用性の高いツールであると考えています。
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Disclosures
著者らは競合する利益を宣言しない。
Acknowledgments
私たちは、魚のケアのためのエミリー・メナント、特にピエール・マホウのポリテクニックバイオイメージング施設に、レギオン・イル・ド・フランス(interDIM)とアジェンス・ナショナル・ド・ラ・レシェルシュ(ANR-11-EQPX-0029モルフォスコープ2、ANR-10-INBS-04フランス)によって部分的にサポートされている機器のライブイメージングの支援に感謝します。この作業は、ANR助成金15-CE13-0016-1によってサポートされました。 18-CE13-0024、20-CE13-0016、およびマリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金契約なし 840201、ミニステア・ド・ランセニュメント・スペリエール・エ・ド・ラ・レシェルシュとセンター・ナショナル・ド・ラ・レヴェンチャーシェ・シフィケの下での欧州連合のホライゾン2020研究とイノベーションプログラム。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Agarose | PanReac AppliChem | A8963,0500 | |
| Data analysis software : Matlab | Math Works | ||
| Electro-optic modulator (EOM) | ConOptics | 350-80LA | |
| Embryo Medium (EM) solution | Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000). | ||
| Environmental chamber chamber | Okolab | H201-T-UNIT-BL | |
| EOM driver | ConOptics | 302RM | |
| Fluorescence source | Lumencor | SOLA | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | 300085 | Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm |
| Glass pipettes | Volac | D810 | Tip should be fire polished |
| Green/ablation laser | Spectra Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| Histone2B-mCherry mRNA | Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012) | ||
| Image analysis software: IMARIS | Bitplane | ||
| ImSpector software | Abberior Instruments Development Team | ||
| Injection mold | Adapative Science Tools | I-34 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140-122 | 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hammamatsu | H7422-40 | |
| PicoPump (Air injector) | World Precision Instrument | PV820 | |
| Red laser | Spectra Physics | OPO/Insight DeepSee | |
| RNAse free water for injection | Sigma | W3500 | |
| Spreadsheet software: Excel | Microsoft | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | |
| Tg(gsc:GFP) zebrafish line | Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002). | ||
| TriM Scope II microscope | La Vision Biotech |
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