Summary
Embryonal utveckling kräver storskalig samordning av cellrörelser. Två-foton excitation medierad laserablation möjliggör rumsligt kontrollerad 3-dimensionell ablation av stora grupper av djupa celler. Dessutom kan denna teknik undersöka reaktionen av kollektivt migrerande celler in vivo till stör i sin mekaniska miljö.
Abstract
Morphogenes innebär många cellrörelser för att organisera celler i vävnader och organ. För korrekt utveckling måste alla dessa rörelser vara tätt samordnade, och ackumulerande bevis tyder på att detta uppnås, åtminstone delvis, genom mekaniska interaktioner. Att testa detta i embryot kräver direkta fysiska störningar. Laserablationer är ett allt mer använt alternativ som gör det möjligt att lindra mekaniska begränsningar eller fysiskt isolera två cellpopulationer från varandra. Många ablationer utförs dock med en ultraviolett (UV) laser, som erbjuder begränsad axiell upplösning och vävnadspenetration. En metod beskrivs här för att ablatera djupa, signifikanta och rumsligt väldefinierade volymer med hjälp av ett tvåfotonmikroskop. Ablationer visas i en transgen zebrafish linje uttrycker det gröna fluorescerande proteinet i axial mesendoderm och används för att skära axiell mesendoderm utan att påverka den överlyvliga ectoderm eller den underliggande äggula cellen. Cellbeteende övervakas av liveavbildning före och efter ablationen. Ablationsprotokollet kan användas i olika utvecklingsstadier, på alla celltyper eller vävnader, i skalor som sträcker sig från några mikron till mer än hundra mikron.
Introduction
Cell-cellinteraktioner spelar viktiga roller i utvecklingen. Celler ger signaler som deras direkta grannar, eller celler längre bort, kan uppfatta och därmed påverka deras öde och / eller beteende. Många av dessa signaler är kemiska till sin natur. Till exempel, i de väl karakteriserade induktionshändelserna producerar en cellgrupp diffusibla molekyler som påverkar ödet för en annan cellpopulation1. Andra signaler är dock mekaniska; celler utövar krafter och begränsningar på sina grannar, som grannarna uppfattar och svarar på2.
Ett sätt att studera vikten av dessa cell-cell interaktioner in vivo är att eliminera vissa celler och observera efterföljande utveckling. Tyvärr är tillgängliga tekniker för att ta bort eller förstöra celler begränsade. Celler kan avlägsnas kirurgiskt3,4 med nålar eller små ledningar, men sådana behandlingar är invasiva, inte särskilt exakta, och utförs vanligtvis under ett stereomikroskop, vilket förhindrar omedelbar avbildning under ett mikroskop. Att rikta in sig på djupa celler innebär dessutom att man genomborrar ett hål i övergående vävnader, vilket skapar oönskade stör. Genetiskt kodade ljuskänsliga medel, såsom KillerRed, har använts för att inducera celldöd via ljusbelysning5. Ljuskänsliga medel är kromoforer som genererar reaktiva syrearter vid ljusbestrålning. Deras huvudsakliga begränsning är att de kräver långa ljusbelysningar (cirka 15 min), vilket kan vara svårt att uppnå om celler rör sig, och att de inducerar celldöd genom apoptos, vilket inte är omedelbart.
Slutligen har laserablationer utvecklats och använts i stor utsträckning under de senaste 15 åren6,7,8,9,10,11,12. En laserstråle är fokuserad på den riktade cellen/vävnaden. Det inducerar dess ablation genom uppvärmning, fotoablation eller plasmainducerad ablation; den berörda processen beror på effekttätheten och exponeringstiden13. De flesta ablationsprotokoll använder UV-lasrar för sin höga energi. UV-ljus absorberas och sprids dock av biologiska vävnader. Således kräver inriktning på djupa celler en hög lasereffekt, vilket sedan inducerar skador i mer ytliga, out-of-plane vävnader. Detta begränsar användningen av UV-lasrar till ytliga strukturer och förklarar deras relativt låga axiella upplösning. Icke-linjär optik (så kallad tvåfotonmikroskopi) använder icke-linjära egenskaper hos ljus för att excitera en fluorofor med två fotoner av ungefär halvenergi i den infraröda domänen. När det tillämpas på ablationer har detta tre huvudsakliga fördelar. För det första är det infraröda ljuset mindre spridda och mindre absorberat än UV-ljus av biologiska vävnader14, vilket gör det möjligt att nå djupare strukturer utan att öka den nödvändiga laserkraften. För det andra ger användningen av en femtosekundspulsad laser mycket hög effekttäthet, vilket skapar en ablation genom plasmainduktion, som i motsats till uppvärmning inte sprider rumsligt15. För det tredje uppnås endast effektdensitetseffekten som inducerar plasmabildning vid brännpunkten. Tack vare dessa egenskaper kan tvåfotonlaserblationer användas för att exakt rikta in sig på djupa celler utan att påverka den omgivande vävnadsmiljön.
Kollektiva migreringar är ett utmärkt exempel på utvecklingsprocesser där cell-cellinteraktioner är grundläggande. Kollektiva migreringar definieras som cellmigreringar där närliggande celler påverkar beteendet hos en cell16. Arten av dessa interaktioner (kemiska eller mekaniska) och hur de påverkar cellmigration kan variera kraftigt och är ofta inte helt förstådd. Förmågan att ta bort celler och observera hur detta påverkar de andra är avgörande för att ytterligare riva upp dessa kollektiva processer. För några år sedan konstaterade vi – med kirurgiska metoder – att polsters migration under zebrafiskgastrulation är en kollektiv migration17. Polster är en grupp celler som utgör de första internaliserande cellerna på embryots dorsala sida18. Dessa celler, märkta i grönt i den transgena linjen Tg(gsc:GFP), ligger djupt i embryot, under flera lager av epiblastceller. Under gastrulation leder denna grupp förlängningen av den axiella mesodermen och migrerar från den embryonala organisatören till djurpolen19,20,21,22,23 (figur 1A). Vi konstaterade att celler kräver kontakt med sina grannar för att orientera sin migration i riktning mot djurpolen. Men bättre förståelse för de cellulära och molekylära grunderna för denna kollektiva migration innebär att ta bort vissa celler för att se hur detta påverkar de återstående. Vi utvecklade därför ablationer av stora och djupa volymer med hjälp av en två-foton mikroskopi setup. Här visar vi användningen av detta protokoll för att skära polster i mitten och observera konsekvenserna för cellmigrering genom att spåra kärnor märkta med Histone2B-mCherry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt djurarbete godkändes av etikkommittén N 59 och Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche under ärendenummer APAFIS#15859-2018051710341011v3. Några av stegen som beskrivs nedan är specifika för vår utrustning och programvara men kan enkelt anpassas till olika utrustningar.
1. Injektionspreparat
- Förbered 75 ml 1% agaroslösning i embryomedium (EM).
- Placera den injicerande formen i en 90 mm Petri-skål och häll cirka 50 ml agaros, tillräckligt för att formen ska flyta. Låt agarosen stelna och ta bort den injicerande formen.
- Förbered en agarosebelagd maträtt genom att hälla 1 ml agaros i en 30 mm Petri-maträtt.
- Förbered 4 μL av 30 ng/μL Histone2B-mCherry mRNA-lösning genom att späda ut stamlösningen i RNase-fritt vatten och förvara på is.
OBS: Var noga med att använda handskar när du manipulerar mRNA för att undvika RNase-medierad nedbrytning. - Dra en injektionsnål från en kapillär med hjälp av mikropipettdragaren.
2. Embryoberedning
- När fiskar har lagt ägg, samla, skölj och skörda i en 90 mm Petri-maträtt i EM. Placera embryona i en inkubator på 28,5 °C.
- Vänta 20 minuter tills den första cellen blir synlig.
- Överför 30 embryon till injektionsplattan fylld med EM. Pressa embryon i spåren med något trubbiga tångar och orientera dem med djurstången upp.
- Fyll en injektionsnål med en injektionsnål med 2 μL mRNA-lösning med hjälp av en mikrolastarspets. Sätt in nålen i kapillärhållaren placerad i en mikromanipulatör ansluten med polytetrafluoretylen (PTFE) slang till en luftinjektor.
- Under stereomikroskopet bryter du försiktigt nålens spets.
- Injicera mRNA-lösningen i embryona i 1-cellsstadiet genom att sätta in nålen i cellen.
OBS: Den injicerade volymen är ungefär en tredjedel av cellvolymen. - Placera tillbaka injicerade embryon i inkubatorn 28,5 °C.
3. Förberedelse av tvåfotonmikroskopet
OBS: Två lasrar används i detta protokoll. En används för att avbilda GFP (vid 920 nm) och utföra ablationer (vid 820 nm). Det kommer att kallas den gröna /ablationslasern. Den andra används vid 1160 nm för att avbilda mCherry. Det kommer att kallas den röda lasern.
- Ställ in den gröna/ablationslasern på 820 nm (ablationsvåglängd) och den röda lasern på 1160 nm (mCherry excitation).
- Använd rörliga speglar på den optiska banan och rikta in gröna/ablations- och röda laserstrålar både vid ingången och utgången av skanningshuvudet.
OBS: Detta ökar laserstrålens fokus och minimerar brännvolymen för excitation och ablation. - Mät den maximala effekten av den gröna/ablationslasern vid 820 nm enligt målet. För att göra det, placera effektmätaren under målet, stäng den svarta kammaren, ställ in grön / ablationslasereffekt på 100% och öppna fönsterluckorna. Beräkna den procentandel lasereffekt som behövs för att nå 300 mW.
- Sätt tillbaka den gröna/ablationslasern till 920 nm (GFP-excitation) och ställ in lasereffekten på 7 %. Ställ in den röda lasereffekten på 15 %.
- Aktivera epi-PhotoMultiplier Tubes (PMT) detektorer för gröna och röda linjer; grön och röd linje PMT känslighet till 65.
- Ställ in synfältet på 400 x 400 μm, bildupplösningen till 512 x 512 pixlar och skanningsfrekvensen till 800 Hz.
- Välj 3D Timelapse Imaging-läge . Skapa sedan en mapp och aktivera Autosave för data efter varje förvärv.
- Montera värmekammaren och ställ in den på 28 °C. Vänta minst 10 min på kammaren och målet att värma.
4. Montering av embryot
- Identifiera embryon vid 70% epiboly som uttrycker GFP under ett fluorescensstereomikroskop.
OBS: Välj embryon med en ljus signal i axiell mesoderm och ingen bakgrundfluorescens för bättre bildkvalitet. - Överför tre till fyra utvalda embryon i den agarosbelagda skålen (steg 1.3) med en pasteurpipeett av plast och dechorionate dem försiktigt med fina tångar.
OBS: Dekonrionerade embryon är mycket känsliga och spricker vid kontakt med luft eller plast. - Häll 1 ml 0,2% agaros i 1x penicillin-streptomycin EM i en liten glasflaska. Placera injektionsflaskan i en förvärmd 42 °C torr blockvärmare.
OBS: Följande steg måste utföras snabbt för att tillåta embryoorientering före agarosuppsättningar. - Överför ett dechorionerat embryo i 0,2% agaroseglasflaska med en brandpolerad glaspipett. Var försiktig så att du inte lägger till för mycket EM i agaroset för att undvika att späda ut det. Kassera den återstående EM från pipetten och aspirera tillbaka embryot tillsammans med tillräckligt med agaros för att täcka glasbottenskålen innan embryot faller ut ur pipetten.
- Blås agaros och embryot på glasrutschbanan i skålen. Var försiktig så att inte embryot vidrör luften eller plastsidan av skålen. Fyll sedan kammaren runt glasrutschbanan med agaros.
- Använd en ögonfrans för att orientera embryot så att den riktade regionen är högst upp (figur 1B).
OBS: När du orienterar embryon, var noga med att bara röra blastoderm, inte den mycket bräckliga äggulan. Agarose kommer att sätta i cirka 1 min, beroende på rumstemperatur. - Vänta ~ 5 min tills agaroset ska sättas helt och tillsätt sedan några droppar penicillin-streptomycin EM.
5. Lokalisera embryot och avbildning före ablation
- Placera glasbottenskålen under målet i den uppvärmda kammaren. Fördjupa målet i penicillin-streptomycin EM och stäng den uppvärmda kammaren.
- Flytta skjutreglaget för att ställa in ljusbanan på okulär. Sedan, med hjälp av okulär, fluorescerande lampor och stegkontroll, hitta ett embryo och ställ in fokus på embryots yta.
- Stäng av fluorescenslampan, ställ in ljusvägen på PMT och stäng den svarta kammaren.
OBS: Var noga med att stänga av alla ljuskällor i den svarta kammaren eftersom det kan skada PMTs. - Starta direktavbildning och hitta axiell mesoderm. Justera de gröna/ablations- och röda laserkrafterna för att få en bra signal (dvs. mellan 1 000 och 20 000 fotoner per pixel för GFP-uttrycksområden). Använd den röda kanalen för att flytta scenen till toppen av embryot och ställ in denna position som Z = 0.
- Välj ett tidssteg på 1 min och ett Z-steg på 2 μm. En Z-kurs på 110 μm är tillräcklig för att omfatta hela poltern och förvärvas på mindre än 1 min med dessa inställningar. Ställ in den första skivan 15 μm ovanför den axiella mesodermen (i den mer ytliga ektodermen).
OBS: Poltern rör sig längs en böjd linje så att Z-stackens nedre del ska ställas in 30 μm djupare än polsterns djupaste position för att rymma dess rörelse under tidsfördröjningsavbildningen (figur 1E). - Spela in 10-15 min av pre-ablation film.
Figur 1: Framgångsrikt resultat av laserablationer. (A) System för ett gastrullerande embryo vid 70% epiboly i dorsalvy; pAM: bakre axiell mesoderm; svart pil markerar riktningen för polstermigration; svart ruta anger ett typiskt synfält för ablationer i polstern. B) System för embryomontering för polstersevering. Sidovy. Embryot är monterat så att polsterplanet är vinkelrätt mot den optiska axeln. C) Överlevnad och D) morfologi för kontroll och ablerade embryon vid 24 timmar efter befruktning. Skalstången är 300 μm. (E) Tidssekvens från laserablation i polstern på ett Tg(gsc:GFP) embryo som uttrycker Histone2B-mCherry. Endast vyer med den gröna kanalen är maximala projektioner. Närbild visar det ablerade området som innehåller cellrester. Vyer med gröna och röda (visas som magenta) kanaler är XY- och XZ-segment före och efter ablation (den gröna blixten representerar ablation). XZ-skivor visar att de övergående vävnaderna (magentakärnor utan GFP-uttryck) inte har påverkats av ablationen av underliggande strukturer. Den gula streckade rutan motsvarar den ROI som valts för laserablationsbehandling. Skalstången är 50 μm i stora vyer och 25 μm i närbild. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
6. Målplats och laserablation
- Leta reda på polsterkonturen på live-avbildning och rita en stor rektangel på 20 pixlar (15 μm) som sträcker sig över polsterens bredd med hjälp av verktyget Electro-Optic Modulator Region of Interest (EOM ROI). Placera rektangeln i mitten av poltern (bild 1E).
- Observera axiell position för de högsta och lägsta planen som innehåller polsterceller. Ablationer kommer att utföras var 10:e μm mellan dessa två plan. Se till att avkastningen inte överlappar äggulacellen på något av dessa plan.
- Placera scenen i intervallets lägsta Z-läge. Ablationer måste utföras nedifrån och upp eftersom skräp absorberar ljus.
- Ställ in den gröna/ablationslaservåglängden på 820 nm och ställ in effektprocenten för att erhålla en utgångseffekt på 300 mW (steg 3.3).
- Ställ in bildfrekvensen på 200 Hz.
- Ställ in EOM för grön/ablationslaseravbildning på 0 och välj ROI-Treat-läge .
- Slå på EOM och ställ in behandlingen så att den startar omedelbart (efter 0 ram).
- Ställ in bildläget på Timelapse och avaktivera Autosave.
- Ställ in tidssteget till snabbt läge.
- Ange antalet behandlingsramar och antal bildrutor till det värde som motsvarar det riktade djupet (tabell 1).
| Djup (μm) | Behandlingsramar |
| -30 | 1 |
| -35 | 1-2 |
| -40 | 1-2 |
| -45 | 2 |
| -50 | 2-3 |
| -55 | 3 |
| -60 | 3-4 |
| -65 | 4 |
| -70 | 4 |
| -75 | 4-5 |
| -80 | 4-5 |
| -85 | 5 |
| -90 | 5 |
| -95 | 5-6 |
| -100 | 6 |
| -105 | 6 |
Tabell 1: Föreslaget antal laserbehandlingsramar som en funktion av riktat celldjup i embryot (0 är embryots yta).
- Börja avbildningen. Förvärvet är svart då slutaren till PMT stängs under EOM-behandlingen.
- Flytta upp scenen till nästa Z-position i listan (steg 6.2).
- Upprepa steg 6.10 till 6.12 tills toppen av poltern har nåtts.
7. Verifiering och avbildning efter ablation
- Ställ in den gröna/ablationslasern på 920 nm och 5 % effekt. Ställ in den gröna/ablationslaseravbildnings-EOM på 100 och välj Fullfield-läget .
- Ställ in bildfrekvensen på 800 Hz. Stäng av EOM.
- Gå igenom hela stacken i live-läge för att kontrollera om varje plan har ablerats. Om så inte är fallet, gå tillbaka till steg 6.2.
OBS: Ablation inducerar ibland en vertikal förskjutning av närliggande vävnader så att Z-stacken kan behöva omdefinieras. - Ställ in bildläget på 3D-timelapse och aktivera Autosave igen. Spela in 40-60 min av post-ablation film.
- Kontrollera om de riktade cellerna i filmen efter ablationen verkligen har ablerats. Fluorescensåterhämtning, eller riktade celler som upptar utrymme och hindrar följarceller från att röra sig igenom, indikerar att riktade celler endast var fotobleached och inte ablated (figur 1E och figur 2A).
Bild 2: Negativa resultat av laserablationer. (A) Typiska exempel på potentiella fel i laserablation. Stora XY-vyer är maximala projektioner, XZ-vyn är ett rekonstruerat avsnitt. Laserbehandlat område ligger mellan de två vita pilspetsarna. Tre fokalplan markeras i den rekonstruerade delen och visas till höger. De motsvarar tre olika typer av misslyckanden. Plan 1 visar att cellerna ovanför polstern har ablerats. Detta kan identifieras genom närvaron av autofluorescent skräp på detta fokala plan (se närbild) ovanför polster (se position för plan 1 på den rekonstruerade sektionen). Detta beror sannolikt på en felaktig definition av den region som ska ableras. Plan 2 visar celler som har blekts men inte ablated. De kan identifieras som den låga fluorescenssignalen avslöjar fortfarande intakta cellkonturer (se närbild). Plan 3 visar intakta celler, som knappast har blekts genom laserbehandling. Detta kan bero på en felaktig definition av den region som ska ableras eller av dålig behandling. I de situationer som avbildas i plan 2 och 3 är det möjligt att åter tillämpa ablationsbehandlingen på de icke-ablerade riktade cellerna. Skalstången är 50 μm i storvy och 20 μm i närbilder. (B) Ett typiskt exempel på bubblor (markerade med vita asterisker) som bildas genom kavitation på grund av en alltför intensiv laserbehandling. Sådana bubblor är inte begränsade till ett Z-plan, ibland till och med spänner över polsterns fulla höjd och deformerar närliggande vävnader. Skalstrecket är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
8. Dataanalys
- Öppna timelapse-serien med bildanalysprogramvaran och ange rätt pixelstorlek.
- I funktionen Dekor anger du objektstorleken till 10 μm, eftersom detta är den genomsnittliga kärnstorleken under gastrulation. Kör sedan funktionen Spot för att upptäcka och spåra kärnorna.
OBS: Detektionen kan förbättras något med tanke på den nedre axiella upplösningen, som passar en 12 μm lång ellipsoidal form längs Z-axeln. - Använd filter för att ta bort falska positiva identifieringar. På linjen Tg(Gsc:GFP) är celler från den embryonala axeln och vissa endodermala celler märkta i grönt. Filtrering på grön intensitet möjliggör därför en snabb markering av dessa celler (figur 3A).
- Ställ in det maximala avståndet mellan på varandra följande punkter till ett värde som är kompatibelt med cellernas hastighet.
OBS: Var noga med att överväga tidsintervallet mellan två bildrutor. Polsterceller migrerar vid 2,8 ± 0,8 μm/min. Att tillåta 4 μm maximal deplacement under ett tidssteg på 1 min tar därför bort de flesta artefaktiska spår. - Att tillåta luckor över en eller två tidspunkter ger längre kontinuerliga spår men kan medföra spårningsfel. Om en kärna inte identifieras korrekt vid en engångspunkt bör du överväga att köra om identifieringen av dekor med olika parametrar/filter.
- Kontrollera spåren visuellt och korrigera dem vid behov.
- Exportera resultaten som en .xlsx fil. Bearbeta filen med hjälp av publicerade kalkylbladsrutiner24 (bild 3B) och anpassade rutiner på dataanalysprogramvara (tillgänglig på begäran).
Figur 3: Isolering av den främre halvan av polstern påverkar cellens riktning. (A) 3D-rekonstruktioner ett Tg(gsc:GFP) embryo som uttrycker Histone2B-mCherry (visas i magenta), före och efter en laserablation som skar polstern i mitten. Kärnor som tillhör den främre halvan av polstern markeras med en magenta prick och spåras över tiden före och efter ablation (se Film S1). Skalstången är 50 μm. (B) Som ett mått på migrationsbeständighet, riktning automatisk korrelation av celler som tillhör den främre delen av poltern före och efter ablation. Celler visar en kontinuerlig rörelse före ablation, som drastiskt minskar efter ablation, vilket indikerar förlust av kollektivorienterad migrering. Riktning auto-korrelation mättes också på celler som bildar den främre halvan av polster av ett icke-ablated embryo, som en kontroll. Diagramkuverten anger standardfel. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att skära polstern i mitten monterades ett Tg(gsc:GFP) embryo, injicerat med Histone2B-mCherry mRNAs på 70% epiboly stadium, som beskrivs i steg 4. Polster identifierades av GFP uttryck, och embryot monterades så att polster plan är vinkelrätt mot den optiska axeln (figur 1B). Att luta embryot bort från denna position kommer att komplicera proceduren. Ljuset måste gå igenom fler vävnader för att nå ablationsplan, och ablationsplan kommer att lutas i förhållande till embryonala axlar. Efter att ha verifierat att alla cellkärnor är korrekt märkta, registrerades en 10 min pre-ablation time-lapse för att fånga cellrörelser före ablation (figur 1E och figur 3A, film S1).
Polster identifierades morfologiskt, och ett rektangulärt område på 15 μm x 200 μm, beläget i mitten, ablateds på fem fokala plan för att säkerställa avskiljning på hela djupet av polster (Figur 1E, Movie S1). Imaging startades om direkt efter ablation och används för att övervaka effektiviteten i förfarandet. Om det lyckas kommer ablationen att ha eliminerat alla cellulära strukturer och GFP och mCherry fluorescens så att den ablerade volymen ska visas som en signalfri volym. En del skräp kan dock skapas. Detta skräp är autofluorescent, både i de gröna och röda kanalerna, och visar vanligtvis oregelbundna långsträckta former parallellt med ablationsriktningen (figur 1E). En för intensiv behandling kommer att bilda en stor mängd skräp som kan fungera som ett hinder och störa cellbeteende. Starkare behandlingar kommer till och med att inducera kavitation, märkt av bildandet av bubblor i vävnaden (figur 2B). Kavitation är associerad med en mekanisk chockvåg som förökar sig i vävnader och kan orsaka skador från den riktade volymen13,15. Embryon med kavitationsbubblor ska kasseras och behandlingen bör finjusteras genom att färre behandlingsramar utförs.
Omvänt kan för lite behandling fotobleach fluoroforer utan att inducera plasmabildning, därav utan att brinna (figur 2A). Ofullständig fotoblekning kan lätt upptäckas genom närvaron av dim fluorescens med en karakteristisk cellulär form (figur 2A). Sådana embryon bör kasseras eller behandlas igen och utföra fler behandlingsramar. Fullständig fotobleaching är mer utmanande att skilja från framgångsrik ablation, eftersom båda skulle resultera i en signalfri volym. Fotobleaching kan dock identifieras efterhand, eftersom fluorescens gradvis kommer att återhämta sig under loppet av efter-ablation imaging. Detta innebär dock att icke-ablerade embryon avbildas i minst en halvtimme, vilket är tidskrävande. Vi föreslår därför att justera behandlingsintensiteten (genom att öka antalet behandlingar) för att inducera bildandet av få synliga skräp, vilket inte kommer att påverka cellbeteendet utan omedelbart bekräfta effektiv ablation. Slutligen bör frånvaron av skador i celler som omger ablationsvolymen kontrolleras på de första bilderna efter ablationen (figur 2A). När laserbehandlingen är korrekt inställd (bildandet av få skräp), är det osannolikt att skador i närliggande vävnader är resultatet av den rumsliga spridningen av ablationen, som är mycket väl rumsligt definierad, utan snarare resultatet av felaktigt urval av regionen som ska ableras och / eller vävnadsrörelser i tiden mellan målval och ablation. Embryon med drabbade närliggande vävnader ska kasseras.
Efter framgångsrik ablation fångades Z-staplar varje minut i 40 minuter och registrerade både GFP-cytoplasmiska signalen och mCherry-kärnsignalen. Atomkärnor spårades sedan, och deras rörelse användes som en proxy för cellrörelser. Spår som motsvarar polsterceller identifierades på deras starka GFP-signal (Figur 3A, Movie S1). Cellrörelsens persistens mättes genom beräkning av cellriktningen autokorrelation24. Att fokusera på polsterceller som ligger i den främre halvan av polster visade att avskiljning av polster i mitten, vilket skiljer dessa celler från den bakre delen av polstern, minskade deras riktning autocorrelation (figur 3B), visar att korrekt migration av polsterceller kräver integritet av hela polster, i linje med dess visade kollektiva migration17.
Efter att ha förvärvat efterblationsfilmen kan embryon avmonteras, försiktigt extrahera dem från agarosen med fina tångar och inkuberas vid 28,5 °C tills de når 24 timmar efter befruktning. Embryon bör återigen överleva och bör inte uppvisa någon uppenbar morfologisk defekt (figur 1C,D).
Film S1: Lyckad laserablation. Laserablation i mitten av polster av ett Tg (gsc:GFP) embryo som uttrycker Histone2B-mCherry. Kärnor från den främre delen av poltern spåras över tid och markeras med magenta prickar. Spåren är tidskodade (bild 3). Tomma ramar motsvarar laserablation. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll som använder icke-linjär optik för att utföra djupa och rumsligt väldefinierade volymablationer. Det mest kritiska steget i protokollet är att hitta behandlingsförhållanden som ger tillräcklig energi för att tillåta ablationer, men inte för mycket energi, för att undvika överdriven skräp eller kavitation. Mängden levererad energi på målplatsen beror huvudsakligen på: (1) laserutgångseffekten, (2) kvaliteten på laserjusteringen, (3) arten av den vävnad genom vilken ljuset passerar för att nå ablationsplanet, (4) ablationsplanets djup. Därför är det före varje experiment viktigt att mäta laserutgångseffekt, justera den till ett referensvärde (300 mW vid 820 nm i vårt protokoll) och säkerställa korrekt laserjustering. Enligt dessa antaganden bör behandlingsförhållandena vara reproducerbara från en experimentell dag till en annan. Vi rekommenderar att du utför omfattande tester för att definiera optimala parametrar (lasereffekt och antal behandlingsramar) för en viss provtyp. Dessa parametrar kan sedan användas i alla liknande experiment. I exemplet som beskrivs här (avskiljning av polstern under gastrulation) har vi till exempel fastställt behandlingsvillkor för ablationer på olika djup i embryot (tabell 1) och förlitar oss nu på detta diagram när vi utför experiment. Observera att våglängden på 820 nm valdes som den är, på vårt system, våglängden som ger de högsta toppenergierna (på grund av laser- och optikegenskaper). Kortare eller längre våglängder kan användas beroende på systemegenskaper6,11,12. Djupet på den riktade vävnaden är en kritisk parameter, embryomontering är också ett avgörande steg, eftersom felaktig montering kan öka vävnadstjockleken som ljuset måste passera igenom för att nå målvolymen.
En av de ursprungliga egenskaperna hos det beskrivna protokollet är att ablatera en hel volym genom att utföra successiva ablationer på olika fokalplan. Eftersom ablationer kommer att generera skräp som absorberar ljus, identifierade vi att det är viktigt att starta ablation på det mest djupgående planet och sekventiellt ablatera från det djupaste till det mest ytliga planet.
Detta protokoll beskriver ablation av djupa och stora volymer och registrering av närliggande vävnad svar inom några minuter efter ablation till över en timme. En av de potentiella begränsningarna i protokollet är den tid som krävs för att utföra ablation och starta om avbildning. Två faktorer begränsar denna försening. Den första är den tid som behövs för att utföra ablationer på flera fokalplan. På vårt system utförs avskiljning av polster av en utbildad användare på 2-3 min. Detta kan minskas genom att optimera programvaran för att automatisera ablationen på olika plan. Ändå kommer den totala ablationstiden att motsvara den tid som krävs för att skanna målregionen, gånger antalet repetitioner på varje fokalplan, gånger antalet fokalplan, vilket under våra förhållanden är ca 1 min. Med tanke på cellmigreringshastigheten innebär detta att vissa celler kan komma in i eller lämna det riktade området under ablationsproceduren. I vårt fall visade det sig inte vara ett problem utan kan vara om en absolut precision i cellinriktning krävs. Den andra begränsande faktorn är att samma laser används för att utföra ablation (vid 820 nm) och excitera grön fluorofor (vid 920 nm). Fördröjningen mellan den senaste ablationen och inspelningsstarten definieras således av den tid som krävs för att justera lasern från 820 nm till 920 nm, från 30 s till 1 min.
I vissa fall, särskilt för mindre ablationer (encellig ablation, ablationer av subcellulära komponenter såsom cytoskeletonelement), kan registrering av cellens/vävnadens omedelbara reaktion vara avgörande för att härleda dess mekaniska tillstånd25,26,27. I sådana fall kan begränsningen kringgås, antingen genom avbildning med en annan laser (här, till exempel, registrera endast röda signaler med 1160 nm laser eller med hjälp av en tredje laserlinje) eller genom att avbilda grön fluorofor vid 820 nm. Detta är inte den optimala våglängden för avbildning (begränsad excitation av fluoroforer, starka fototoxiska effekter) men kan användas under korta perioder för att registrera omedelbar vävnadsrespons.
Få tekniker finns tillgängliga för att eliminera celler och se hur detta påverkar resten av embryot. De två huvudalternativen är att ta bort celler fysiskt eller att förstöra dem, som i laserablationer. Jämfört med fysisk borttagning kan cellförstörelse frigöra cytoplasmiskt innehåll, vilket kan påverka närliggande celler. Detta belystes historiskt av kontroversen och de olika resultaten som Wilhelm Roux och Hans Driesch erhållit när det gäller mosaiken eller den reglerande utvecklingen av grodan och sjöborrembryon28. På senare tid har skillnader observerats i sårläkningsanalyser, beroende på om såret skapas genom repor (som förstör vissa celler) eller tar bort ett inlägg29. Att fysiskt avlägsna celler utan att skada andra vävnader är dock endast möjligt för celler på embryots yta och celler som inte är alltför vidhäftande med sina grannar, vilket begränsar utbudet av sådana tillvägagångssätt. Följaktligen har olika strategier utvecklats för att förstöra celler, laserablationer är de mest använda. UV-laserablationer har använts och används i allt större utsträckning, i synnerhet för att utföra små, ytliga ablationer och observera omedelbar vävnadsrespons.
Vi beskrev här användningen av infrarött ljus för att utföra djupare och rumsligt väldefinierade ablationer. Den huvudsakliga begränsningen av detta protokoll är kravet på en infraröd pulsad laser och en två-foton imaging setup. Sådan utrustning blir dock allt vanligare på bildplattformar. Dessutom kan det EOM som används här för att ablatera en region i bilden selektivt ersättas av en fluorescensåterhämtning efter fotobleachingmodul (FRAP). Även om det är mindre bekvämt kan det till och med vara möjligt att utföra protokollet utan EOM- eller FRAP-moduler genom att helt enkelt zooma på det riktade området10. Att använda en pulserad infraröd laser ger två huvudsakliga fördelar jämfört med de flesta klassiska ablationsprotokoll. För det första, tack vare effektiv penetration av infrarött ljus i levande vävnader, kan djupa fokalplan nås med laserkrafter som inte inducerar skador utanför fokus. Detta gjorde det möjligt för oss att rikta in oss på celler så djupa som 120 μm, utom räckhåll med en-foton excitation protokoll. För det andra säkerställer användningen av icke-linjär optik utmärkt axiell upplösning, vilket möjliggör exakt kontrollerade 3D-ablationer, även på djupet i vävnaden. Genom att kombinera dessa två fördelar kan ablation av specifikt definierade, djupa och så småningom stora volymer.
Vi beskriver att använda ett två-foton mikroskop för att skära polster, ett experiment som vi och andra nyligen utförde30. Med få justeringar skulle det föreslagna protokollet dock kunna anpassas till många olika prover. Vi har till exempel framgångsrikt använt det för att utföra fullständig ablation av polster, ablationer inom laterala mesoderm under gastrulation eller ablationer av enskilda Schwan celler under deras migrering på deras associerade axon, utan att påverka axon. Vi anser därför att detta protokoll är ett värdefullt och mångsidigt verktyg, vilket bör vara till hjälp i många experimentella system för att analysera effekten av vissa celler / vävnader på beteendet och utvecklingen av de närliggande strukturerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Emilie Menant för fiskvård, Polytechnique Bioimaging Facility, särskilt Pierre Mahou, för hjälp med live imaging på deras utrustning som delvis stöds av Région Ile-de-France (interDIM) och Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging). Detta arbete stöddes av ANR-bidragen 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016 och Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 enligt Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 840201, Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Agarose | PanReac AppliChem | A8963,0500 | |
| Data analysis software : Matlab | Math Works | ||
| Electro-optic modulator (EOM) | ConOptics | 350-80LA | |
| Embryo Medium (EM) solution | Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000). | ||
| Environmental chamber chamber | Okolab | H201-T-UNIT-BL | |
| EOM driver | ConOptics | 302RM | |
| Fluorescence source | Lumencor | SOLA | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | 300085 | Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm |
| Glass pipettes | Volac | D810 | Tip should be fire polished |
| Green/ablation laser | Spectra Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| Histone2B-mCherry mRNA | Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012) | ||
| Image analysis software: IMARIS | Bitplane | ||
| ImSpector software | Abberior Instruments Development Team | ||
| Injection mold | Adapative Science Tools | I-34 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140-122 | 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hammamatsu | H7422-40 | |
| PicoPump (Air injector) | World Precision Instrument | PV820 | |
| Red laser | Spectra Physics | OPO/Insight DeepSee | |
| RNAse free water for injection | Sigma | W3500 | |
| Spreadsheet software: Excel | Microsoft | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | |
| Tg(gsc:GFP) zebrafish line | Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002). | ||
| TriM Scope II microscope | La Vision Biotech |
References
- Slack, J. M. W.
- Fernandez-Sanchez, M. -E., Brunet, T., Röper, J. -C., Farge, E. Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Selleck, M. A. J. Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).
- Bulina, M. E., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues. Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).
- Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1189, Clifton, N.J. 219-235 (2015).
- Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
- Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
- Bonnet, I., et al. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).
- Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition - Four Volume Set. , Springer International Publishing. Cham. (2019).
- Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).
- Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).
- Theveneau, E., David, N. B.
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Montero, J. -A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -P. Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells. Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).
- Ulrich, F., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Kai, M., Heisenberg, C. -P., Tada, M. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation. Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).
- Smutny, M., et al. Friction forces position the neural anlage. Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).
- Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear β-Catenin pools. Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Grill, S. W., Howard, J., Schäffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. The distribution of active force generators controls mitotic spindle position. Science. 301 (5632), New York, N.Y. 518-521 (2003).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Farhadifar, R., Röper, J. -C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. Foundations of Experimental Embryology. , Prentice-Hall. Englewood Cliffs. (1964).
- Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).
- Bosze, B., et al. Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).
