Summary
تؤدي الإصابة العابرة (65 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية ، 3 ثوان) من مخلب خلفي واحد إلى تقليل العتبة (ز) إلى تحفيز خيوط فون فراي للجانب الجانبي وتغير نمط المشية. إلى جانب ذلك ، تحفز إصابة الحروق سلوكا يشبه الاكتئاب في اختبار السباحة القسري.
Abstract
مياه السمط هي السبب الأكثر شيوعا لإصابة الحروق في كل من السكان المسنين والشباب. وهو أحد التحديات السريرية الرئيسية بسبب ارتفاع معدل الوفيات والعواقب في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل. غالبا ما تحفز الحروق ألما عفويا شديدا وألودينيا مستمرة بالإضافة إلى مشكلة تهدد الحياة. الأهم من ذلك ، غالبا ما يكون الألم المفرط مصحوبا بالاكتئاب ، مما قد يقلل بشكل كبير من نوعية الحياة. توضح هذه المقالة كيفية تطوير نموذج حيواني لدراسة الألم الناجم عن الحروق والسلوك الشبيه بالاكتئاب. بعد التخدير ، تم إحداث إصابة الحروق عن طريق غمس مخلب خلفي واحد من الماوس في الماء الساخن (65 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية) لمدة 3 ثوان. تم إجراء اختبار فون فراي وتحليل المشية الآلي كل 2 أيام بعد إصابة الحرق. بالإضافة إلى ذلك ، تم فحص السلوك الشبيه بالاكتئاب باستخدام اختبار السباحة القسري ، وتم إجراء اختبار قضيب الروتا للتمييز بين الوظيفة الحركية غير الطبيعية بعد إصابة الحرق. الغرض الرئيسي من هذه الدراسة هو وصف تطوير نموذج حيواني لدراسة الألم الناجم عن إصابة الحروق والسلوك الشبيه بالاكتئاب في الفئران.
Introduction
يرتبط تلف الأنسجة ، مثل الحروق والصدمات ، بشكل عام بتكرار حدوث الألم الحاد. إصابات الحروق والأعراض المرتبطة بالصدمات هي ما يقدر بنحو 1,80,000 حالة وفاة كل عام ناجمة عن الحروق - تحدث الغالبية العظمى في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل من أنواع مختلفة من الحروق1. وفقا لتقرير عالمي ، فإن الحروق شائعة عند الأطفال وتمثل حوالي 40٪ -60٪ من المرضى في المستشفى 2,3. هذه الإصابات المحددة أكثر خطورة لأنها يمكن أن تحدث في الحياة اليومية ، مثل غليان أو مياه الاستحمام 4,5. على الرغم من أنه يمكن حل الألم الحاد تلقائيا بعد الشفاء من تلف الأنسجة في معظم الحالات ، فقد يكون من الممكن أن يصبح مزمنا بسبب التغيرات غير الطبيعية في الجهاز العصبي 6,7.
في الآونة الأخيرة ، اقترح أن الألم الحاد يمكن أن يحفز مزاج الاكتئاب ، والألم المزمن يمكن أن يسبب القلق والاكتئاب8،9،10،11. التعايش بين الألم والاكتئاب يجعل من الصعب علاج المريض. يميل الاكتئاب أيضا إلى زيادة حساسية الألم ، والتي من المرجح أن تحفز الاكتئاب والألم الأكثر حدة12. تظهر مضاعفات الألم والاكتئاب في النماذج الحيوانية للالتهابات الطرفية 13،14،15،16. الآليات التفصيلية الكامنة وراء الاكتئاب الناجم عن الألم ليست معروفة جيدا حتى الآن17. وبالتالي ، من الضروري تطوير علاجات أكثر فعالية للحروق للتخفيف من الآثار الجانبية والأعراض.
وهكذا ، تم تصميم هذه الدراسة لتطوير نموذج حيواني لدراسة الألم الحاد الناجم عن إصابات الحروق والسلوك الشبيه بالاكتئاب في الفئران. لهذا ، تم قياس حساسية اللمس غير الطبيعية المرتبطة بإصابات الحروق ، ونمط المشي المتغير ، والسلوك الشبيه بالاكتئاب. بالإضافة إلى ذلك ، تحاول هذه الدراسة التحقق من صحة النموذج باستخدام مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة جميع البروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة تشونغنام الوطنية في كوريا الجنوبية ، ثم أجريت بناء على المبادئ التوجيهية الأخلاقية للجمعية الدولية لدراسة الألم18.
1. تحريض إصابة حرق السمط على مخلب الخلفية
- قم بإيواء ذكور الفئران ICR التي تزن 20-25 جم في غرفة خفيفة يتم التحكم في درجة حرارتها (12/12 ساعة دورة الضوء والظلام ، 22.5 درجة مئوية ± 2.5 درجة مئوية) مع رطوبة 40٪ -60٪.
ملاحظة: يمكن استخدام كل من الفئران الذكور والإناث لهذا البروتوكول. - السماح للحيوان بحرية الوصول إلى الطعام والماء ، والتأقلم لمدة 1 أسبوع على الأقل قبل بدء التجربة.
ملاحظة: تم إيواء جميع الحيوانات في مجموعات لاستبعاد متغيرات مثل إجهاد العزل. - قم بتعيين الفئران عشوائيا إلى المجموعة التجريبية أو الضابطة وإجراء تجارب عمياء باستخدام أرقام الحيوانات كرموز.
- في يوم تحريض الحرق ، قم بتخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p) من 300 ميكرولتر من alfaxalone بجرعة 100 مجم / كجم. ارتد ثوبا جراحيا وقفازات وقناعا أثناء إجراء تحريض الحروق.
- بعد تخدير الماوس بعمق ، قم بتطهير حول المخلب الخلفي الأيمن باستخدام 70٪ من الإيثانول.
ملاحظة: تحقق من عدم الاستجابة لتحفيز قرصة المطبقة على أصابع القدم الخلفية أو الذيل لتأكيد حالة التخدير العميق. - ضع مرهما للعيون على العينين لمنع تجفيف القرنية بعد تحريض التخدير.
- اغمر المخلب الخلفي الأيمن للماوس المخدر بعمق في الماء الساخن عند 65 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية لمدة 3 ثوان. ضع علامة على كاحل كل ماوس قبل غمر المخلب الخلفي في الماء الساخن للحفاظ على الاتساق في المنطقة المحروقة.
- بعد تحريض الحروق ، أحضر الفئران في قفص منزلي نظيف وضعها على وسادة تدفئة حتى تتعافى الحيوانات من التخدير.
ملاحظة: تم إعطاء العامل المسكن ، الأسيتامينوفين (200 مجم / كجم) ، داخل الصفاق مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام بدءا من يوم إصابة الحروق (فقط حرق + مجموعة الأسيتامينوفين). تم التعامل مع مجموعة Burn بمحلول ملحي كعنصر تحكم في السيارة. تم إجراء التجربة وفقا للطريقة الموضحة في دراسة سابقة4.
2. قياس ألودينيا الميكانيكية
- أحضر الفئران إلى غرفة الاختبار السلوكي واتركها تتأقلم لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاختبار. ارتد ثوبا جراحيا وقفازات وقناعا أثناء إجراء الاختبار.
- ضع الفئران في صندوق مربع (قطره: 13 سم ، ارتفاعه: 12 سم) على أرضية شبكية معدنية (حجم الشبكة: 0.7 سم × 0.7 سم) واتركها تتأقلم لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- تقييم العتبة الميكانيكية للمخلب الخلفي باستخدام طريقة التحفيز التصاعدي19,20.
- كز بلطف سلسلة من خيوط فون فراي مع فترات 5-8 ثانية لتحفيز الأخمص الخلفي. احصل على قيم خط الأساس في اليوم السابق لتحريض الحرق.
ملاحظة: تم استخدام خيوط فون فراي 0.16-1.2 جم في الاختبار لقياس عتبة سحب المخلب في جميع الحيوانات ، على التوالي. بدأ اختبار استجابة سحب المخلب بأقل قوة انحناء لخيوط فون فراي (0.16 جم في هذا البروتوكول). إذا لم تكن هناك استجابة ، تطبيق خيط بقوة الانحناء التالية. - قم بإجراء خمس تجارب لتقييم العتبات الميكانيكية لكل مخلب خلفي (مصاب).
ملاحظة: تم التعبير عن قوة الانحناء لخيوط فون فراي التي تنتج استجابة أكثر من ثلاثة أضعاف التجارب الخمس في كل كعتبة انسحاب مخلب (PWT، g). تم قياس العتبات الميكانيكية قبل يوم واحد وفي 1 و 3 و 5 و 7 أيام بعد إصابة الحروق. تم تقييم تأثير مسكن 1 ساعة بعد إعطاء الأسيتامينوفين في الحيوان.
3. تحليل المشية الآلي
- تأقلم الفئران في نظام تحليل المشية مرة واحدة يوميا لمدة 10-15 دقيقة من 5 أيام قبل إصابة الحرق. ارتد ثوبا جراحيا وقفازات وقناعا أثناء إجراء تحليل المشي.
- في يوم الاختبار ، أحضر الفئران إلى غرفة الاختبار السلوكية وتأقلم معها لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاختبار.
ملاحظة: قم بإجراء اختبارات التأقلم وتحليل المشي في بيئة مظلمة. قم بتعيين شروط قائمة البرنامج على النحو التالي.- بعد تشغيل البرنامج ، انقر فوق القائمة إنشاء تجربة جديدة لتعيين المجلد لحفظ البيانات.
- بعد التعيين ، اضبط الحد الأقصى لوقت التشغيل على 5 ثوان والحد الأقصى المسموح به لتغيرات السرعة إلى 50٪.
- حدد كاميرا مسجلة واضبط طول الممر على 30 سم في علامة التبويب إعداد في البرنامج.
- في علامة التبويب اكتساب من قائمة البرنامج، حدد فتح اكتساب.
- استنادا إلى رسائل الحالة ، انقر فوق الزر Snap Background للحصول على صورة خلفية لممر فارغ.
- انقر فوق الزر " بدء الاستحواذ" ، ثم ضع الماوس عند مدخل الممر القابل للعبور من اليسار إلى اليمين. سيبدأ التسجيل تلقائيا بعد الحركة الحرة للماوس.
ملاحظة: إذا تم تسجيل مشية الحيوان بنجاح وتم اكتشاف جميع الخطوات، وضع علامة عليها على أنها تشغيل متوافق مع رمز أخضر. إذا لم يكتشف البرنامج أي خطوات ، عرض رمز أحمر ، وفي هذه الحالة يوصى بإجراء التسجيل مرة أخرى. يوصي المؤلفون بجمع وتحليل ما لا يقل عن خمسة عمليات تشغيل متوافقة ناجحة يتم تنفيذها بسرعات تشغيل مماثلة. - في علامة التبويب اكتساب من قائمة البرنامج، حدد تصنيف عمليات التشغيل.
ملاحظة: بعد تحديد البيانات التي تم الحصول عليها من تشغيل الامتثال الناجح أعلاه، انتقل إلى شاشة تحليل الفيديو حيث تم تسجيل أنماط مشي الفئران. - حدد التشغيل المراد تحليله وانقر فوق الزر تصنيف تلقائي .
- بعد إجراء التصنيف التلقائي ، قم بإزالة الأنف والتعرف على الأعضاء التناسلية والتعرف الخاطئ على الكفوف إلى البيانات غير المرغوب فيها في كل تشغيل ، ثم قم بتحليل البيانات.
ملاحظة: يتم تحليل جميع المعلمات الإحصائية وحفظها تلقائيا في البرنامج، ويمكن العثور على قيم البيانات الخام في قائمة تحليل المجرب. تم إجراء تحليل المشي التلقائي قبل وفي 1 و 3 و 5 و 7 أيام بعد إصابة الحرق. تم إجراء التقييم بعد 30 دقيقة من إعطاء الأسيتامينوفين في مجموعة Burn + Acetaminophen و 30 دقيقة بعد العلاج الملحي في مجموعة Burn. تم إجراء هذه التجربة وفقا للطريقة الموضحة في الدراسات السابقة 4,21,22.
4. قياس السلوك الشبيه بالاكتئاب
ملاحظة: تم قياس السلوك القائم على اليأس ، ووقت الجمود في الماء من خلال اختبار السباحة القسري.
- أحضر الفئران إلى غرفة الاختبار السلوكي وتأقلم معها لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاختبار. ارتد ثوبا جراحيا وقفازات وقناعا أثناء إجراء اختبار السباحة القسري.
- ضع الماوس في أسطوانة زجاجية شبكية شفافة (10 سم × 25 سم) تحتوي على 15 سم من الماء (25 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة.
- بعد 24 ساعة ، ضع الماوس في الأسطوانة من نفس الظروف وقم بقياس وقت الجمود.
ملاحظة: تم قياس وقت عدم الحركة لمدة 5 دقائق من وقت الاختبار ، وتم تسجيل الوقت الذي توقفت فيه الفئران عن التسلق أو السباحة وطفت فقط للحفاظ على رأسها فوق سطح الماء. تم إجراء اختبار السباحة القسري في اليوم 7 بعد إصابة الحرق. تم إجراء التقييم بعد 1 ساعة من إعطاء الأسيتامينوفين في مجموعة Burn + Acetaminophen ، و 1 ساعة بعد العلاج الملحي في مجموعة Burn. تم إجراء التجربة وفقا للطريقة الموضحة في الدراسات السابقة23,24.
5. قياس الوظيفة الحركية العادية
ملاحظة: تم إجراء اختبار قضيب الروتا للتمييز بين الوظيفة الحركية غير الطبيعية بعد إصابة الحرق.
- أحضر الفئران إلى غرفة الاختبار السلوكي وتأقلم معها لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاختبار. ارتد ثوبا جراحيا وقفازات وقناعا أثناء إجراء اختبار السباحة القسري.
- ضع الحيوانات على منصة أسطوانية متداولة (بعرض 5.7 سم ؛ قطر 3 سم) معلقة على ارتفاع 16 سم فوق الجزء السفلي من الجهاز.
- اسمح لكل بالتدريب مرة واحدة في اليوم على قضيب روتا لمدة 5 أيام على الأقل قبل تحريض إصابة الحروق.
- قم بإجراء اختبار قضيب الروتا كل 20 دقيقة لمدة 2 ساعة بعد تناول الدواء. اضبط وقت القطع على 2 دقيقة.
- قم بقياس المدة الزمنية التي يعمل فيها الماوس على قضيب دوار بسرعة ثابتة تبلغ 15 دورة في الدقيقة دون سقوط.
ملاحظة: تم إجراء اختبار قضيب الروتا بعد 7 أيام من تحريض إصابة الحروق. تم إجراء التقييم مباشرة بعد إعطاء الأسيتامينوفين في مجموعة Burn + Acetaminophen وبعد العلاج الملحي في مجموعة Burn. تم استخدام Alfaxalone كعنصر تحكم إيجابي للأدوية المعالجة تجريبيا في هذا الاختبار. أثناء اختبار الروتارود ، يتم قياس المدة الزمنية التي يعمل فيها الماوس على القضيب الدوار دون السقوط. تم إجراء التجربة وفقا للطريقة الموضحة في الدراسات السابقة22,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل تقليل معاناة الحيوانات وتقليل عدد الحيوانات المستخدمة وفقا لإرشادات Three Rs (الاستبدال والتخفيض والصقل) ، تم تصميم هذه الدراسة بأقل عدد ممكن من الحيوانات لجمع البيانات المهمة التي تم إنشاؤها من خلال التجربة الأولية. في هذه الدراسة ، أجريت التجارب السلوكية بشكل مستقل مرتين على النحو التالي. تم إجراء تحليل المشية ، والألودينيا الميكانيكية ، واختبارات السلوك الشبيهة بالاكتئاب مع مجموعات التحكم (n = 5) ، و Burn (n = 7 ؛ التحكم في السيارة ؛ المالحة) ، و Burn + Acetaminophen (n = 7). في اختبار قضيب الروتا ، التحكم (n = 3) ، الحرق (n = 4 ؛ التحكم في السيارة ؛ المالحة) ، الحرق + الأسيتامينوفين (n = 4) ، التحكم الإيجابي (n = 4 ؛ Alfaxalone) تم تصميم المجموعات. Alfaxalone هو نوع من الستيرويد العصبي والتخدير الذي يستخدم حاليا في الطب البيطري كمحفز مخدر عام عن طريق الحقن. في هذه الدراسة ، تم استخدام alfaxalone في تخدير الحيوانات لتحريض الحروق واستخدم كدواء تحكم إيجابي للعاهات الحركية في اختبار قضيب الروتا.
تم التعبير عن البيانات على أنها متوسطة ± S.E.M. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها في أوقات مختلفة بشكل مستقل. تم حساب الاستجابات السلوكية للألم على أنها المنطقة تحت المنحنى (AUC). تم إجراء قياسات متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA لتحديد الاختلافات في البيانات من اختبار allodynia الميكانيكي ، وتحليل المشي ، واختبار قضيب الروتا بمرور الوقت. تم استخدام اختبار دونيت للتحليل اللاحق لتحديد قيمة P بين المجموعات التجريبية. واعتبرت قيم P أقل من 0.05 كبيرة. تم استخدام برنامج GraphPad Prism 6.0 لتحليل هذه الصلاحية الإحصائية. تم تنفيذ جميع إجراءات التحليل الإحصائي بشكل أعمى فيما يتعلق بالظروف التجريبية. ويبين الشكل التكميلي 1 شكلا يوضح تلف الأنسجة الناجم عن إصابة الحروق.
يوضح الشكل 1 التغييرات الزمنية في عتبة انسحاب المخلب (PWT، g) بعد إصابة الحرق. تم تخفيض PWT (ز) من الفئران الناجمة عن إصابة الحروق 1 يوم بعد تحريض الحرق واستمرت لمدة 7 أيام مقارنة مع تلك الخاصة بالمجموعة الضابطة. إدارة الأسيتامينوفين (200 مغ / كغم ، أي بي ، مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام بدءا من يوم تحريض الحرق) قللت بشكل كبير من الانخفاض الناجم عن الحرق في PWT (الشكل 1A ، ** p < 0.01 مقابل مجموعة Burn). بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل AUC (لمدة 7 أيام) أن إدارة الأسيتامينوفين قللت بشكل كبير من الألودينيا الميكانيكية الناجمة عن إصابة الحروق (الشكل 1B ، *** p < 0.001 مقابل المجموعة الضابطة ، ** p < 0.01 مقابل مجموعة Burn).
يوضح الشكل 2 التغييرات في منطقة طباعة المخلب الخلفي بعد إصابة الحروق بمرور الوقت. خفضت إصابة الحروق بشكل كبير منطقة طباعة مخلب الخلفية من اليوم التالي للحث واستمرت لمدة 7 أيام. تم تحسين منطقة طباعة المخلب الخلفي بشكل كبير من خلال إعطاء الأسيتامينوفين (200 مغ / كغ ، أي أي ، مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام بدءا من يوم تحريض الحرق) مقارنة بالمجموعة المعالجة بالمركبة (الشكل 2A و B و * p < 0.05 و ** p < 0.01 مقابل مجموعة Burn).
يظهر الشكل 3 تغييرات المسار الزمني في موقف واحد بعد إصابة الحروق. خفضت إصابة الحروق الموقف الفردي (٪) من مخلب الخلفية ipsilateral 1 يوم بعد تحريض الحرق ، وتم الحفاظ على هذا الانخفاض لمدة 7 أيام. تم تحسين الموقف الأحادي للمخلب الخلفي عن طريق إعطاء الأسيتامينوفين (200 مغ / كغ ، أي ، مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام بدءا من يوم تحريض الحرق) مقارنة بالمجموعة المعالجة بالسيارة (الشكل 3A ، B ، * p < 0.05 مقابل مجموعة Burn).
يوضح الشكل 4 التغيرات في وقت الجمود الذي تم الحصول عليه من اختبار السباحة القسري. تم زيادة وقت الجمود للفئران الناجمة عن إصابة الحروق بعد 7 أيام من تحريض الحرق مقارنة بالمجموعة الضابطة. في الفئران الناجمة عن إصابة الحروق ، فإن إعطاء الأسيتامينوفين (200 مغ / كغ ، أي ، مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام بدءا من يوم تحريض الحرق) قلل بشكل كبير من الزيادة الناجمة عن إصابة الحرق في وقت الجمود (** p < 0.01 و *** p < 0.001 مقابل مجموعة Burn).
تم تقييم وظيفة المحرك العادية بناء على التغيرات في وقت التشغيل على قضيب الروتا ، كما هو موضح في الشكل 5. لم يتغير وقت تشغيل الفئران الناجمة عن إصابة الحروق في 7 أيام بعد تحريض الحرق مقارنة بالمجموعة الضابطة. على النقيض من ذلك ، انخفض وقت تشغيل الفئران المعالجة بالفاكسون (التحكم الإيجابي) بشكل كبير خلال حوالي 60 دقيقة. تشير هذه النتيجة إلى أن إصابة الحروق المستخدمة في هذه الدراسة لا تسبب ضعفا حركيا (*** p < 0.001 مقابل مجموعة Burn).
الشكل 1: الألودينيا الميكانيكية التي تم تقييمها بواسطة اختبار فون فراي في الفئران الناجمة عن إصابة الحروق. (أ) تم تخفيض عتبة انسحاب المخلب (PWT ، g) في المخلب الخلفي الجانبي للفئران بعد يوم واحد من إصابة الحروق واستمرت لمدة 7 أيام مقارنة بالمجموعة الضابطة. إدارة الأسيتامينوفين (200 مغ / كغم ، أي ، مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام بدءا من يوم تحريض الحرق) قللت بشكل كبير من الألودينيا الميكانيكية الناجمة عن إصابة الحروق. (ب) تم تحليل PWT على أنها المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC). تشير الأسهم إلى يوم إعطاء الدواء. p < 0.001 مقابل المجموعة الضابطة، ** p < 0.01 مقابل مجموعة Burn. تم إجراء قياسات متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA لتحديد الآثار الإجمالية في المسار الزمني لاختبار فون فراي. تم إجراء التحليل اللاحق باستخدام اختبار دونيت من أجل تحديد قيمة P. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: منطقة طباعة المخلب التي تم الحصول عليها من التحليل الآلي للمشي في الفئران الناجمة عن إصابات الحروق . (أ) تم التقاط صور تمثيلية لكل من الكفوف الخلفية الجانبية والمقابلة للفئران بواسطة برنامج تحليل المشية. يتم تقليل حجم الاتصال للمخلب بعد إصابة الحرق مقارنة بالمجموعة الضابطة. وقد تعافى هذا الانخفاض جزئيا عن طريق إعطاء الأسيتامينوفين (200 مغ/كغ، أي أي مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام ابتداء من يوم تحريض الحرق). تشير المستطيلات البيضاء إلى الكفوف الخلفية التي تم تحليلها بواسطة البرنامج ، (B) يوضح الرسم البياني تغيرات المسار الزمني في منطقة طباعة المخلب (٪). يتم حساب البيانات كنسبة مئوية من التغييرات في منطقة الطباعة بين الكفوف الخلفية ipsilateral (يمين) و contralateral (يسار) (على سبيل المثال ، تشير قيمة 50٪ إلى نفس مناطق طباعة المخلب في الكفوف الخلفية اليمنى واليسرى). تشير الأسهم إلى يوم إعطاء الدواء. * p < 0.05 و ** p < 0.01 مقابل مجموعة Burn. تم إجراء قياسات متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA لتحديد التأثيرات الإجمالية في المسار الزمني لمنطقة الطباعة على تحليل المشي. تم إجراء التحليل اللاحق باستخدام اختبار دونيت من أجل تحديد قيمة P. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: موقف واحد تم الحصول عليه من التحليل الآلي للمشي في الفئران الناجمة عن إصابة الحروق . (أ) تم التقاط صور تمثيلية لموقف واحد بواسطة برنامج تحليل المشي. أشارت ألوان مختلفة إلى موقف كل مخلب: أزرق ، مخلب أمامي أيمن. الوردي ، مخلب الخلفية اليمنى. الأصفر ، مخلب الجبهة اليسرى. الأخضر ، مخلب الخلفية اليسار. تم تقصير الموقف الوحيد للمخلب الخلفي الجانبي بعد إصابة الحرق. تم استرداد هذا التغيير جزئيا عن طريق إعطاء الأسيتامينوفين (200 مغ / كغم ، أي ، مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام بدءا من يوم تحريض الحرق). (ب) رسم بياني يوضح التغيرات الزمنية في الموقف الفردي (٪). يتم تلخيص البيانات كرسم بياني خطي بعد حساب النسبة المئوية للتغيرات في الموقف الفردي بين الكفوف الخلفية (يمين) والمقابلة (يسار) (على سبيل المثال ، تشير قيمة 50٪ إلى نفس الموقف الفردي في الكفوف الخلفية اليمنى واليسرى). تشير الأسهم إلى يوم إعطاء الدواء. * p < 0.05 مقابل مجموعة Burn. تم إجراء قياسات متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA لتحديد الآثار الإجمالية في المسار الزمني للموقف الفردي على تحليل المشي. تم إجراء التحليل اللاحق باستخدام اختبار دونيت من أجل تحديد قيمة P. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: وقت الجمود لاختبار السباحة القسري في الفئران الناجمة عن إصابات الحروق. تم زيادة وقت عدم الحركة للفئران الناجمة عن إصابة الحروق بعد 7 أيام من تحريض الحرق مقارنة بالمجموعة الضابطة. في الفئران الناجمة عن إصابة الحروق ، خفف إعطاء الأسيتامينوفين (200 مجم / كجم ، أي ، مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام بدءا من يوم تحريض الحرق) بشكل كبير من وقت الجمود المعزز الناجم عن إصابة الحروق. p < 0.001 مقابل المجموعة الضابطة، ** p < 0.01 مقابل مجموعة Burn. تم إجراء قياسات متكررة أحادية الاتجاه ANOVA لتحديد الآثار الإجمالية في المسار الزمني لاختبار السباحة القسري. تم إجراء التحليل اللاحق باستخدام اختبار دونيت من أجل تحديد قيمة P. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تقييم الوظيفة الحركية العادية استنادا إلى التغيرات في وقت تشغيل اختبار قضيب الروتا في الفئران الناجمة عن إصابة الحروق. لم يكن هناك أي تغيير في وقت تشغيل الفئران الناجمة عن إصابة الحروق في 7 أيام بعد تحريض الحروق مقارنة بمجموعات إصابات الحروق المعالجة بالأسيتامينوفين. ومع ذلك ، انخفض وقت تشغيل الفئران المعالجة بالفاكسون (التحكم الإيجابي) بشكل كبير إلى ~ 60 ثانية. تشير هذه النتيجة إلى أن إصابة الحروق المستخدمة في هذه الدراسة لا تسبب ضعفا حركيا. p < 0.001 مقابل مجموعة Burn. تم إجراء قياسات متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA لتحديد الآثار الإجمالية في المسار الزمني لاختبار قضيب الروتا. تم إجراء التحليل اللاحق باستخدام اختبار دونيت من أجل تحديد قيمة P. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: التغيرات في تلف الأنسجة بمرور الوقت بعد تحريض الحروق. بعد تحريض حرق السمط ، لوحظ تلف كبير في الأنسجة ، والذي زاد تدريجيا بمرور الوقت. في هذه الدراسة ، أظهر الأسيتامينوفين ، المستخدم كدواء تحكم إيجابي ، تأثيرا وقائيا على تلف الأنسجة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حرق السمط هو نوع من الحرق الحراري الذي تسببه السوائل الساخنة. وقد اقترح أن حروق الدرجة الأولى أو الثانية تحدث في معظم الحالات ، ولكن الاتصال طويل الأجل مع مصادر الحرارة يمكن أن يسبب حروق من الدرجة الثالثة26. في هذه الدراسة ، تم إحداث إصابة الحروق عن طريق تعريض المخلب الخلفي الأيمن للفئران في الماء الساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 3 ثوان 4,26. تم الكشف عن تلف الأنسجة في المخلب المصاب بالحروق ، والذي يظهر أعراضا شائعة للحروق مثل الاحمرار وتقشير الجلد والتورم (الشكل التكميلي 1)4.
قياس ألودينيا الميكانيكي هو طريقة شائعة الاستخدام لتحديد استجابة الألم في نماذج الألم الحيوانية وتم قياسها باستخدام خيوط فون فراي في هذه الدراسة. يتم استخدام طريقة التحفيز التصاعدي مع خيوط فون فراي لتحديد العتبة الميكانيكية المطلوبة للحث على استجابة انسحاب مخلب الحيوان19,20. بدأت التجربة بالخيوط ذات التحفيز الأقل. تم الحصول على قوة الانحناء للخيوط التي تستجيب لعدد محدد (ثلاث مرات في هذا البروتوكول) كقيمة عتبة سحب مخلب.
يستخدم تحليل المشية للقوارض أثناء المشي الحر لدراسة مرض باركنسون أو حركات الأطراف وتغيرات الوضع في نماذج الإعاقة الحسية الحركية ، بما في ذلك إصابة الحبل الشوكي والسكتة الدماغية27,28. يقوم نظام تحليل المشية تلقائيا بتحليل معلمات المشية المختلفة ، بما في ذلك كثافة المخلب ، وطباعة المخلب ، ومرحلة الوقوف ، وما إلى ذلك. يمكن استخدام تعديلات المعلمات التي يمكن لنظام تحليل المشية تحليلها كمؤشرات متعلقة بالألم في تحليل المشية لنماذج الألم. لذلك ، يمكن استخدام تحليل المشية كطريقة تجريبية لتحديد الألم التلقائي بشكل غير جراحي في النماذج الحيوانية4،21،22. استنادا إلى النتائج السابقة التي تفيد بأن معلمات المشية قد انخفضت على الجانب الناجم عن الألم في النماذج الحيوانية للألم21,22 ، حدد هذا البروتوكول المقدم كميا كل معلمة مشية كنسبة للجانب الجانبي والمقابل الناجم عن الحرق. في هذا البروتوكول ، تم تحويل منطقة طباعة المخلب وبيانات الموقف الفردي إلى معدل التغيرات بين الكفوف الخلفية (المصابة) والمقابلة (غير المصابة). تعني قيمة 50٪ أن حجم طباعة المخلب والوقت اللازم للوصول إلى الأرض هما نفسهما في كل من ipsilateral و contralateral ، في حين أن القيمة الأقل من 50٪ تشير إلى أن هذه المعلمات تنخفض في المخلب الخلفي الناجم عن الحرق. تم استخدام النسبة المئوية للتغيرات بين الكفوف الخلفية ipsilateral و contralateral للحصول على جميع البيانات (أي أن الفئران العادية أظهرت ~ 50٪ ، مما يعني أن النسبة المتناقضة: كانت 50:50). في الحيوانات العادية ، تظهر المعلمات المتعلقة بكل طرف خلفي على كلا الجانبين عند المشي بحرية. ومع ذلك ، يركز تحليل هذا البروتوكول على حقيقة أن المعلمات على الجانب الجانبي تنخفض بعد تحريض الألم. بالإضافة إلى ذلك ، هناك اختلاف فردي في كل. قد لا يتم الحصول على بيانات دقيقة عند تحليل البيانات الخام كما هي. لذلك ، تم تحويل كل قيمة معلمة مشية إلى نسبة للحصول على نتائج أكثر دقة أثناء التحليل. وقد أظهرت هذه الدراسة أن حجم منطقة الطباعة ووقت الوقوف الفردي للمخلب الخلفي الجانبي قد انخفض بعد إصابة الحروق ، وتم استعادة هذا الانخفاض عن طريق الإدارة المتكررة للأسيتامينوفين داخل الصفاق. تزامنت هذه التغييرات مع نمط مماثل من التغييرات في المسار الزمني في سلوكيات الألم بعد إصابة الحروق وإعطاء الدواء.
على الرغم من أنه مثير للجدل ، إلا أن اختبار السباحة القسري هو الطريقة الأكثر استخداما لدراسة سلوك القوارض المكتئبة. تحاول الحيوانات الهروب من الحاوية المليئة بالماء ولكنها في النهاية لا تتحرك ، مما يؤدي إلى اليأس29. ومع ذلك ، يقال إن الجمود يصعب تقييمه كمقياس للاكتئاب لأن هذا الاختبار يرتبط بالتحمل وكذلك مشاعر اليأس. لدعم نتائج تجربة السباحة القسرية ، يمكن اعتبار طرق أخرى لتقييم الاكتئاب ، مثل اختبار تعليق الذيل ، واختبار التغذية المكبوتة حديثا ، واختبار استهلاك السكروز ،30,31. في هذه الدراسة ، تم زيادة وقت التجميد بعد إصابة الحروق ، وتم استعادة هذه الزيادة عن طريق إدارة الأسيتامينوفين.
تم تصميم بروتوكولات هذه الدراسة لإنشاء نموذج للألم الحاد المصاحب للسلوك الشبيه بالاكتئاب بعد إصابة الحروق. قد يكون السلوك الشبيه بالاكتئاب في هذه الدراسة هو الآثار الثانوية للضعف البدني والتغيرات في الحساسية الحرارية بعد إصابة الحروق15،32،33. يمكن أن تشير النتائج إلى أن الفئران التي تعاني من ألم حاد مستحث بعد إصابة الحروق أظهرت سلوكا يشبه الاكتئاب. وقد ثبت أنه يحسن الاستجابة للألم وما يترتب على ذلك من سلوكيات تشبه الاكتئاب من خلال الأدوية المعالجة تجريبيا.
اختبار قضيب الروتا هو اختبار أداء يعتمد على الحمل الدوراني الذي يتم تطبيقه بشكل عام بالقوة على القوارض ذات النشاط الرياضي. يقيس الاختبار معلمات مثل وقت التشغيل والقدرة على التحمل. تتضمن بعض ميزات الاختبار ، من بين أمور أخرى ، آثار دواء تجريبي أو توازن الموضوعات في نموذج ألم الأعصاب ، وقوة القبضة ، وتقييم التنسيق الحركي22،25،34. كما هو موضح في نتائج هذه الدراسة ، لم يكن هناك أي تغيير في وقت تشغيل قضيب الروتا بعد إصابة الحروق أو علاج الأسيتامينوفين مقارنة بالمجموعة الضابطة.
توضح هذه الدراسة تطوير نموذج حيواني لدراسة الألم الناجم عن إصابات الحروق والسلوك الشبيه بالاكتئاب في الفئران. في هذا الصدد ، أظهرت هذه الدراسة أن إصابات حرق السمط تسببت في الألودينيا الميكانيكية ، وتغيرات في معلمات المشي ، والسلوك الشبيه بالاكتئاب مثل وقت الجمود. هذا النموذج مناسب للبحث في مختلف جوانب ونتائج آلام الحروق وعلاجها ومن المتوقع أن يجلب معلومات مهمة إلى هذا المجال البحثي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من قبل جامعة تشونغنام الوطنية ومنحة المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من حكومة كوريا (NRF-2019R1A6A3A01093963 و NRF-2021R1F1A1062509).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
References
- Peck, M. D. Epidemiology of burns throughout the World. Part II: intentional burns in adults. Burns. 38 (5), 630-637 (2012).
- Tracy, L. M., Cleland, H. Pain assessment following burn injury in Australia and New Zealand: Variation in practice and its association on in-hospital outcomes. Australasian Emergency Care. 24 (1), 73-79 (2021).
- Montgomery, R. K.
- Kang, D. W., Choi, J. G. Bee venom reduces burn-induced pain via the suppression of peripheral and central substance P expression in mice. Journal of Veterinary Science. 22 (1), 9 (2021).
- Abdi, S., Zhou, Y.
- Ullrich, P. M., Askay, S. W. Pain, depression, and physical functioning following burn injury. Rehabilitation Psychology. 54 (2), 211-216 (2009).
- Patwa, S., Benson, C. A. Spinal cord motor neuron plasticity accompanies second-degree burn injury and chronic pain. Physiological Reports. 7 (23), 14288 (2019).
- Michaelides, A., Zis, P. Depression, anxiety and acute pain: links and management challenges. Postgraduate Medicine. 131 (7), 438-444 (2019).
- Doan, L., Manders, T., Wang, J. Neuroplasticity underlying the comorbidity of pain and depression. Neural Plasticity. 2015, 504691 (2015).
- Vachon-Presseau, E., Centeno, M. V. The emotional brain as a predictor and amplifier of chronic pain. Journal of Dental Research. 95 (6), 605-612 (2016).
- Apkarian, A. V., Baliki, M. N. Predicting transition to chronic pain. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 360-367 (2013).
- Yin, W., Mei, L. A Central amygdala-ventrolateral periaqueductal gray matter pathway for pain in a mouse model of depression-like behavior. Anesthesiology. 132 (5), 1175-1196 (2020).
- Deng, Y. T., Zhao, M. G., Xu, T. J. Gentiopicroside abrogates lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice through tryptophan-degrading pathway. Metabolic Brain Disease. 33 (5), 1413-1420 (2018).
- Zhang, G. F., Wang, J. Acute single dose of ketamine relieves mechanical allodynia and consequent depression-like behaviors in a rat model. Neuroscience Letters. 631, 7-12 (2016).
- Edwards, R. R., Smith, M. T. Symptoms of depression and anxiety as unique predictors of pain-related outcomes following burn injury. Annals of Behavioral Medicine. 34 (3), 313-322 (2007).
- Pincus, T., Vlaeyen, J. W. Cognitive-behavioral therapy and psychosocial factors in low back pain: directions for the future. Spine. 27 (5), 133-138 (2002).
- Laumet, G., Edralin, J. D. CD3(+) T cells are critical for the resolution of comorbid inflammatory pain and depression-like behavior. Neurobiology of Pain. 7, 100043 (2020).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Scholz, J., Broom, D. C. Blocking caspase activity prevents transsynaptic neuronal apoptosis and the loss of inhibition in lamina II of the dorsal horn after peripheral nerve injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (32), 7317-7323 (2005).
- Kang, D. W., Choi, J. G. Automated gait analysis in mice with chronic constriction injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56402 (2017).
- Kang, D. W., Moon, J. Y. Antinociceptive profile of levo-tetrahydropalmatine in acute and chronic pain mice models: Role of spinal sigma-1 receptor. Scientific Reports. 6, 37850 (2016).
- Huang, W., Chen, Z. Piperine potentiates the antidepressant-like effect of trans-resveratrol: involvement of monoaminergic system. Metabolic Brain Disease. 28 (4), 585-595 (2013).
- Can, A., Dao, D. T. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Choi, J. G., Kang, S. Y. Antinociceptive effect of Cyperi rhizoma and Corydalis tuber extracts on neuropathic pain in rats. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 16 (6), 387-392 (2012).
- Mosby's. Mosby's Dictionary of Medicine, Nursing & Health Professions - Seventh edition, Nursing Standard. 20 (22), RCN Publishing Company Ltd. 36 (2006).
- Vandeputte, C., Taymans, J. M. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Isvoranu, G., Manole, E. Gait analysis using animal models of peripheral nerve and spinal cord injuries. Biomedicines. 9 (8), 1050 (2021).
- Yankelevitch-Yahav, R., Franko, M. The forced swim test as a model of depressive-like behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52587 (2015).
- Yan, H. C., Cao, X.
- Papp, M., Willner, P. An animal model of anhedonia: attenuation of sucrose consumption and place preference conditioning by chronic unpredictable mild stress. Psychopharmacology. 104 (2), 255-259 (1991).
- Seminowicz, D. A., Laferriere, A. L. MRI structural brain changes associated with sensory and emotional function in a rat model of long-term neuropathic pain. Neuroimage. 47 (3), 1007-1014 (2009).
- Yalcin, I., Barthas, F. Emotional consequences of neuropathic pain: insight from preclinical studies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 47, 154-164 (2014).
- Choi, J. W., Kang, S. Y. Analgesic effect of electroacupuncture on paclitaxel-induced neuropathic pain via spinal opioidergic and adrenergic mechanisms in mice. American Journal of Chinese Medicine. 43 (1), 57-70 (2015).
