Summary
Eine vorübergehende Verbrühungsverletzung (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) einer Hinterpfote verringert die Schwelle (g) zur Von-Frey-Filamentstimulation der ipsilateralen Seite und verändert das Gangbild. Außerdem induziert eine Brandverletzung ein depressionsähnliches Verhalten im erzwungenen Schwimmtest.
Abstract
Brühendes Wasser ist die häufigste Ursache für Brandverletzungen sowohl bei älteren als auch bei jungen Bevölkerungsgruppen. Es ist eine der größten klinischen Herausforderungen aufgrund der hohen Mortalität und der Folgen in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen. Verbrennungen verursachen häufig intensive spontane Schmerzen und anhaltende Allodynie sowie lebensbedrohliche Probleme. Noch wichtiger ist, dass übermäßige Schmerzen oft von Depressionen begleitet werden, die die Lebensqualität erheblich beeinträchtigen können. Dieser Artikel zeigt, wie man ein Tiermodell für die Untersuchung von verbrennungsinduzierten Schmerzen und depressionsähnlichem Verhalten entwickelt. Nach der Anästhesie wurde eine Brandverletzung induziert, indem eine Hinterpfote der Maus für 3 s in heißes Wasser (65 ° C ± 0,5 ° C) getaucht wurde. Der von Frey Test und die automatisierte Ganganalyse wurden alle 2 Tage nach einer Brandverletzung durchgeführt. Darüber hinaus wurde das depressionsähnliche Verhalten mit dem erzwungenen Schwimmtest untersucht, und der Rota-Rod-Test wurde durchgeführt, um die abnormale motorische Funktion nach einer Brandverletzung zu unterscheiden. Der Hauptzweck dieser Studie ist es, die Entwicklung eines Tiermodells für die Untersuchung von durch Verbrennungsverletzungen verursachten Schmerzen und depressionsähnlichem Verhalten bei Mäusen zu beschreiben.
Introduction
Gewebeschäden wie Verbrennungen und Traumata sind im Allgemeinen mit dem gleichzeitigen Auftreten akuter Schmerzen verbunden. Brandverletzungen und traumabedingte Symptome sind schätzungsweise 1.80.000 Todesfälle pro Jahr, die durch Verbrennungen verursacht werden - die überwiegende Mehrheit tritt in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen durch verschiedene Arten von Verbrennungenauf 1. Laut einem weltweiten Bericht sind Verbrennungen bei Kindern häufig und machen etwa 40% -60% der hospitalisierten Patientenaus 2,3. Diese spezifischen Verletzungen sind noch schwerwiegender, da sie im Alltag auftreten können, wie z.B. kochendes oder badendes Wasser 4,5. Obwohl akute Schmerzen in den meisten Fällen spontan nach der Genesung von Gewebeschäden behoben werden können, kann es möglich sein, aufgrund abnormaler Veränderungen im Nervensystem chronisch zu werden 6,7.
Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass akute Schmerzen eine depressive Stimmung hervorrufen können, und chronische Schmerzen können Angst und Depressionverursachen 8,9,10,11. Die Koexistenz von Schmerz und Depression erschwert die Behandlung des Patienten. Depressionen neigen auch dazu, die Schmerzempfindlichkeit zu erhöhen, was wahrscheinlich zu intensiveren Depressionen und Schmerzen führt12. Komplikationen von Schmerzen und Depressionen werden in Tiermodellen der peripheren Entzündung13,14,15,16 gezeigt. Die detaillierten Mechanismen, die der schmerzinduzierten Depression zugrunde liegen, sind bis jetzt nicht gut bekannt17. Daher ist es notwendig, wirksamere Behandlungen für Verbrennungen zu entwickeln, um die Nebenwirkungen und Symptome zu lindern.
Daher wurde die vorliegende Studie entwickelt, um ein Tiermodell zu entwickeln, um durch Brandverletzungen verursachte akute Schmerzen und depressionsähnliches Verhalten bei Mäusen zu untersuchen. Dazu wurden eine durch Brandverletzungen verursachte abnormale taktile Empfindlichkeit, ein verändertes Gangmuster und ein depressionsähnliches Verhalten gemessen. Darüber hinaus versucht diese Studie, das Modell mithilfe von NSAIDs zu validieren.
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Protocol
Alle experimentellen Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Chungnam National University in Südkorea überprüft und genehmigt und dann auf der Grundlage der ethischen Richtlinien der International Association for the Study of Pain18 durchgeführt.
1. Induktion einer verbrühenden Brandverletzung an der Hinterpfote
- Unterbringung der männlichen ICR-Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g in einem hellen und temperaturkontrollierten Raum (12/12 h Hell-Dunkel-Zyklus, 22,5 °C ± 2,5 °C) mit einer Luftfeuchtigkeit von 40%-60%.
HINWEIS: Für dieses Protokoll können sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet werden. - Erlauben Sie dem Tier freien Zugang zu Nahrung und Wasser und akklimatisieren Sie sich für mindestens 1 Woche, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
HINWEIS: Alle Tiere wurden in Gruppen untergebracht, um Variablen wie Isolationsstress auszuschließen. - Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip der Versuchs- oder Kontrollgruppe zu und führen Sie blinde Experimente mit Tiernummern als Codes durch.
- Am Tag der Verbrennungsinduktion die Maus durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von 300 μL Alfaxalone in einer Dosis von 100 mg/kg betäuben. Tragen Sie ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske, während Sie die Verbrennungsinduktion durchführen.
- Nach der Tiefenbetäubung der Maus um die rechte Hinterpfote mit 70% Ethanol desinfizieren.
HINWEIS: Überprüfen Sie die mangelnde Reaktion auf die Pinch-Stimulation an den Hinterzehen oder am Schwanz, um den Zustand der Tiefenanästhesie zu bestätigen. - Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut nach der Induktion der Anästhesie zu verhindern.
- Tauchen Sie die rechte Hinterpfote der tiefbetäubten Maus in heißes Wasser bei 65 °C ± 0,5 °C für 3 s. Markieren Sie den Knöchel jeder Maus, bevor Sie die Hinterpfote in heißes Wasser tauchen, um die Konsistenz im verbrannten Bereich aufrechtzuerhalten.
- Nach der Induktion von Verbrennungen bringen Sie die Mäuse in einen sauberen Hauskäfig und legen Sie sie auf ein Heizkissen, bis sich die Tiere von der Narkose erholen.
HINWEIS: Das Analgetikum, Paracetamol (200 mg/kg), wurde intraperitoneal einmal täglich für 7 Tage ab dem Tag der Brandverletzung verabreicht (nur Burn + Acetaminophen-Gruppe). Die Burn-Gruppe wurde mit Kochsalzlösung als Fahrzeugkontrolle behandelt. Das Experiment wurde nach der in einer früheren Studiebeschriebenen Methode durchgeführt 4.
2. Messung der mechanischen Allodynie
- Bringen Sie die Mäuse in den Verhaltenstestraum und lassen Sie sie sich vor dem Test mindestens 30 Minuten lang akklimatisieren. Tragen Sie während der Durchführung des Tests ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske.
- Legen Sie die Mäuse in eine quadratische Box (Durchmesser: 13 cm, Höhe: 12 cm) auf einem Metallgitterboden (Maschenweite: 0,7 cm x 0,7 cm) und lassen Sie sie für mindestens 30 min akklimatisieren.
- Beurteilen Sie die mechanische Schwelle der Hinterpfote mit der aufsteigenden Reizmethode19,20.
- Stechen Sie vorsichtig eine Reihe von Von-Frey-Filamenten mit 5-8 s Intervallen, um den hinteren Plantar zu stimulieren. Rufen Sie die Basiswerte am Tag vor der Brandinduktion ab.
HINWEIS: Die 0,16-1,2 g von Frey-Filamente wurden im Test verwendet, um die Pfotenentzugsschwelle bei allen Tieren zu messen. Der Pfotenentzugstest wurde mit der niedrigsten Biegekraft von Frey-Filament (0,16 g in diesem Protokoll) gestartet. Wenn es keine Reaktion gab, wurde ein Filament mit der nächsten Biegekraft angelegt. - Führen Sie fünf Versuche durch, um mechanische Schwellenwerte für jede ipsilaterale (verletzte) Hinterpfote zu bewerten.
HINWEIS: Die Biegekraft des von-Frey-Filaments, die mehr als das Dreifache der fünf Versuche bei jedem Tier eine Reaktion hervorruft, wurde als Pfotenentzugsschwelle (PWT, g) ausgedrückt. Mechanische Schwellenwerte wurden einen Tag vor und bei 1, 3, 5 und 7 Tagen nach der Brandverletzung gemessen. Die analgetische Wirkung wurde 1 h nach Verabreichung des Paracetamol beim Tier beurteilt.
3. Automatisierte Ganganalyse
- Akklimatisieren Sie die Mäuse im Ganganalysesystem einmal täglich für 10-15 Minuten ab 5 Tagen vor der Brandverletzung. Tragen Sie ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske, während Sie eine Ganganalyse durchführen.
- Bringen Sie die Mäuse am Tag des Tests in den Verhaltenstestraum und akklimatisieren Sie sie mindestens 30 Minuten vor dem Test.
HINWEIS: Führen Sie Akklimatisierungs- und Ganganalysetests in einer dunklen Umgebung durch. Legen Sie die Bedingungen des Programmmenüs wie folgt fest.- Klicken Sie nach dem Ausführen des Programms auf das Menü Neues Experiment erstellen , um den Ordner zum Speichern der Daten festzulegen.
- Stellen Sie nach der Benennung die maximale Laufzeit auf 5 s und die maximal zulässigen Geschwindigkeitsschwankungen auf 50 % ein.
- Wählen Sie eine registrierte Kamera aus und stellen Sie die Gehweglänge auf 30 cm auf der Registerkarte Setup des Programms ein.
- Wählen Sie im Programmmenü auf der Registerkarte Erwerben die Option Erfassung öffnen aus.
- Klicken Sie basierend auf den Statusmeldungen auf die Schaltfläche Hintergrund ausrichten , um ein Hintergrundbild eines leeren Gehwegs zu erhalten.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassung starten , und platzieren Sie die Maus am Eingang des von links nach rechts befahrbaren Gehwegs. Die Aufzeichnung beginnt automatisch nach der freien Bewegung der Maus.
HINWEIS: Wenn der Gang des Tieres erfolgreich aufgezeichnet wurde und alle Schritte erkannt wurden, wird er mit einem grünen Symbol als Compliant Run markiert. Wenn die Software keine Schritte erkennt, wird ein rotes Symbol angezeigt, in diesem Fall wird empfohlen, die Aufnahme erneut durchzuführen. Die Autoren empfehlen, mindestens fünf erfolgreiche konforme Läufe mit ähnlichen Laufgeschwindigkeiten zu sammeln und zu analysieren. - Wählen Sie im Programmmenü auf der Registerkarte Erwerben die Option Läufe klassifizieren aus.
HINWEIS: Nachdem Sie die Daten aus dem oben genannten erfolgreichen Compliance-Lauf ausgewählt haben, gehen Sie zum Videoanalysebildschirm, auf dem die Gangmuster der Mäuse aufgezeichnet wurden. - Wählen Sie den zu analysierenden Lauf aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Automatisch klassifizieren .
- Entfernen Sie nach der automatischen Klassifizierung die Nase, die Genitalerkennung und die Fehlerkennung von Pfoten, um Daten in jedem Durchlauf zu verwerfen, und analysieren Sie dann die Daten.
HINWEIS: Alle statistischen Parameter werden automatisch analysiert und im Programm gespeichert, und Rohdatenwerte finden Sie im Analysemenü des Experimentators. Die automatische Ganganalyse wurde vor und nach 1, 3, 5 und 7 Tagen nach der Brandverletzung durchgeführt. Die Bewertung wurde 30 Minuten nach der Verabreichung von Paracetamol in der Gruppe Burn + Acetaminophen und 30 Minuten nach der Kochsalzbehandlung in der Gruppe Burn durchgeführt. Dieses Experiment wurde nach der in den vorangegangenen Studien beschriebenen Methodedurchgeführt 4,21,22.
4. Messung von depressionsähnlichem Verhalten
HINWEIS: Verzweiflungsbasiertes Verhalten, Immobilitätszeit im Wasser wurde durch den erzwungenen Schwimmtest gemessen.
- Bringen Sie die Mäuse in den Verhaltenstestraum und akklimatisieren Sie sie mindestens 30 Minuten vor dem Test. Tragen Sie ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske, während Sie den erzwungenen Schwimmtest durchführen.
- Legen Sie die Maus für 15 min in einen durchsichtigen Plexiglaszylinder (10 cm x 25 cm) mit 15 cm Wasser (25 °C ± 0,5 °C).
- Nach 24 h setzen Sie die Maus in den Zylinder der gleichen Bedingungen und messen die Immobilitätszeit.
HINWEIS: Die Immobilitätszeit wurde für 5 Minuten Testzeit gemessen, und die Zeit, in der Mäuse aufhörten zu klettern oder zu schwimmen und nur schwammen, um ihren Kopf über der Wasseroberfläche zu halten, wurde aufgezeichnet. Der erzwungene Schwimmtest wurde am 7. Tag nach der Brandverletzung durchgeführt. Die Bewertung wurde 1 h nach der Verabreichung von Paracetamol in der Gruppe Burn + Acetaminophen und 1 h nach der Kochsalzbehandlung in der Burn-Gruppe durchgeführt. Das Experiment wurde nach der in früheren Studien beschriebenen Methodedurchgeführt 23,24.
5. Messung der normalen Motorfunktion
HINWEIS: Der Rota-Rod-Test wurde durchgeführt, um die abnormale motorische Funktion nach einer Brandverletzung zu unterscheiden.
- Bringen Sie die Mäuse in den Verhaltenstestraum und akklimatisieren Sie sie mindestens 30 Minuten vor dem Test. Tragen Sie ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske, während Sie den erzwungenen Schwimmtest durchführen.
- Stellen Sie die Tiere auf eine rollende zylindrische Plattform (5,7 cm breit; 3 cm Durchmesser), die 16 cm über dem Boden des Geräts aufgehängt ist.
- Erlauben Sie jedem Tier, mindestens 5 Tage lang einmal täglich an einer Rota-Stange zu trainieren, bevor eine Verbrennungsverletzung auftritt.
- Führen Sie den Rota-Rod-Test alle 20 Minuten für 2 Stunden nach der Verabreichung des Arzneimittels durch. Stellen Sie die Cut-off-Zeit auf 2 Minuten ein.
- Messen Sie die Zeitdauer, die die Maus auf einem rotierenden Stab mit der konstanten Geschwindigkeit von 15 Umdrehungen pro Minute läuft, ohne zu fallen.
HINWEIS: Der Rota-Rod-Test wurde 7 Tage nach der Induktion der Verbrennungsverletzung durchgeführt. Die Bewertung wurde unmittelbar nach der Verabreichung von Paracetamol in der Gruppe Burn + Acetaminophen und nach der Behandlung mit Kochsalzlösung in der Gruppe Burn durchgeführt. Alfaxalone wurde in diesem Test als Positivkontrolle für experimentell behandelte Medikamente verwendet. Während des Rotarod-Tests wird die Dauer gemessen, die die Maus auf dem rotierenden Stab läuft, ohne zu fallen. Das Experiment wurde nach der in früheren Studien beschriebenen Methodedurchgeführt 22,25.
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Representative Results
Um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der Tiere zu reduzieren, die gemäß den Three Rs (Replacement, Reduction, and Refinement) -Richtlinien verwendet werden, wurde diese Studie mit der Mindestanzahl von Tieren für die Erhebung signifikanter Daten konzipiert, die durch vorläufige Experimente ermittelt wurden. In dieser Studie wurden Verhaltensexperimente unabhängig voneinander zweimal wie folgt durchgeführt. Die Ganganalyse, mechanische Allodynie und depressionsähnliche Verhaltenstests wurden mit den Gruppen Control (n = 5), Burn (n = 7; Fahrzeugkontrolle; Kochsalzlösung) und Burn + Acetaminophen (n = 7) durchgeführt. Im Rota-Rod-Test werden Kontrolle (n = 3), Burn (n = 4; Fahrzeugkontrolle; Kochsalzlösung), Burn + Acetaminophen (n = 4), Positivkontrolle (n = 4; Alfaxalone) wurden Gruppen entworfen. Alfaxalone ist eine Art neuroaktives Steroid und Anästhetikum, das derzeit in der Veterinärmedizin als injizierbarer Vollnarkoseinduktor verwendet wird. In dieser Studie wurde alfaxalone in der Tieranästhesie zur Verbrennungsinduktion eingesetzt und als Positivkontrollmedikament bei motorischen Beeinträchtigungen im Rota-Rod-Test eingesetzt.
Die Daten wurden als Mittelwert ± S.E.M. ausgedrückt. Darüber hinaus wurden experimentelle Daten, die zu verschiedenen Zeiten erhalten wurden, unabhängig voneinander analysiert. Schmerzverhaltensreaktionen wurden als die Fläche unter der Kurve (AUC) berechnet. Zwei-Wege-Wiederholungsmessungen ANOVA wurde durchgeführt, um Unterschiede in den Daten aus dem mechanischen Allodynie-Test, der Ganganalyse und dem Rota-Rod-Test im Laufe der Zeit zu bestimmen. Dunnetts Test wurde für die Post-hoc-Analyse verwendet, um den P-Wert unter den experimentellen Gruppen zu bestimmen. P-Werte unter 0,05 wurden als signifikant eingestuft. GraphPad Prism 6.0 Software wurde verwendet, um diese statistische Gültigkeit zu analysieren. Alle statistischen Analyseverfahren wurden blind in Bezug auf die experimentellen Bedingungen durchgeführt. Eine Abbildung, die die durch Verbrennungsverletzungen verursachten Gewebeschäden veranschaulicht, ist in ergänzender Abbildung 1 dargestellt.
Zeitliche Veränderungen der Pfotenentzugsschwelle (PWT, g) nach einer Brandverletzung sind in Abbildung 1 dargestellt. Die PWT (g) von durch Verbrennungsverletzungen induzierten Mäusen war 1 Tag nach der Burn-Induktion erniedrigt und dauerte 7 Tage lang im Vergleich zu der der Kontrollgruppe. Die Verabreichung von Acetaminophen (200 mg/kg, i.p., einmal täglich für 7 Tage ab dem Tag der Verbrennungsinduktion) reduzierte signifikant die verbrennungsbedingte Abnahme der PWT (Abbildung 1A, ** p < 0,01 gegenüber der Burn-Gruppe). Darüber hinaus zeigte die AUC-Analyse (für 7 Tage), dass die Verabreichung von Paracetamol die durch Verbrennungsverletzungen induzierte mechanische Allodynie signifikant verringerte (Abbildung 1B, *** p < 0,001 gegenüber der Kontrollgruppe, ** p < 0,01 gegenüber der Burn-Gruppe).
Veränderungen im Hinterpfotenabdruckbereich nach einer Brandverletzung im Laufe der Zeit sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Brandverletzung reduzierte den ipsilateralen Hinterpfotenabdruckbereich ab dem Tag nach der Induktion signifikant und blieb 7 Tage lang bestehen. Der Hinterpfotenabdruckbereich wurde durch die Verabreichung von Paracetamol (200 mg/kg, i.p., einmal täglich für 7 Tage ab dem Tag der Verbrennungsinduktion) im Vergleich zur mit dem Fahrzeug behandelten Gruppe signifikant verbessert (Abbildung 2A, B, * p < 0,05 und ** p < 0,01 gegenüber der Burn-Gruppe).
Zeitverlaufsänderungen in einer einzelnen Haltung nach einer Brandverletzung sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Brandverletzung reduzierte die Einzelhaltung (%) der ipsilateralen Hinterpfote 1 Tag nach der Burn-Induktion, und diese Reduzierung wurde für 7 Tage beibehalten. Die Einzelhaltung der Hinterpfote wurde durch die Verabreichung von Paracetamol (200 mg/kg, i.p., einmal täglich für 7 Tage ab dem Tag der Verbrennungsinduktion) im Vergleich zur mit dem Fahrzeug behandelten Gruppe verbessert (Abbildung 3A,B, * p < 0,05 gegenüber der Verbrennungsgruppe).
Änderungen der Immobilitätszeit, die aus dem erzwungenen Schwimmtest gewonnen wurden, sind in Abbildung 4 dargestellt. Die Immobilitätszeit der durch Verbrennungsverletzungen induzierten Mäuse war 7 Tage nach der Induktion der Verbrennung im Vergleich zu der der Kontrollgruppe erhöht. Bei durch Verbrennungsverletzungen induzierten Mäusen reduzierte die Verabreichung von Paracetamol (200 mg/kg, i.p., einmal täglich für 7 Tage ab dem Tag der Verbrennungsinduktion) signifikant die durch Verbrennungsverletzungen induzierte Zunahme der Immobilitätszeit (** p < 0,01 und *** p < 0,001 gegenüber der Burn-Gruppe).
Die normale motorische Funktion wurde anhand der Änderungen der Laufzeit am Rotationsstab beurteilt, wie in Abbildung 5 dargestellt. Die Laufzeit der durch Verbrennungsverletzungen verursachten Mäuse änderte sich 7 Tage nach der Induktion der Verbrennung nicht im Vergleich zu der der Kontrollgruppe. Im Gegensatz dazu war die Laufzeit der mit alfaxalone behandelten Mäuse (Positivkontrolle) während etwa 60 min signifikant reduziert. Dieses Ergebnis zeigt, dass eine in dieser Studie verwendete Verbrennungsverletzung keine motorische Beeinträchtigung verursacht (*** p < 0,001 versus Burn-Gruppe).
Abbildung 1: Mechanische Allodynie, beurteilt durch Von-Frey-Test bei durch Verbrennungsverletzungen induzierten Mäusen. (A) Die Pfotenentzugsschwelle (PWT, g) in der ipsilateralen Hinterpfote von Mäusen war 1 Tag nach der Brandverletzung erniedrigt und dauerte 7 Tage lang im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Verabreichung von Acetaminophen (200 mg/kg, i.p., einmal täglich für 7 Tage ab dem Tag der Verbrennungsinduktion) reduzierte signifikant die durch Verbrennungsverletzungen induzierte mechanische Allodynie. (B) Das PWT wurde als die Fläche unter der Kurve (AUC) analysiert. Pfeile zeigen den Tag der Arzneimittelverabreichung an. p < 0,001 gegenüber der Kontrollgruppe, ** p < 0,01 gegenüber der Burn-Gruppe. Zwei-Wege-Wiederholungsmessungen ANOVA wurde durchgeführt, um die Gesamteffekte im Zeitverlauf des von Frey-Tests zu bestimmen. Eine Post-hoc-Analyse wurde mit Dunnetts Test durchgeführt, um den P-Wert zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Pfotenabdruckfläche aus automatisierter Ganganalyse bei durch Verbrennungsverletzungen induzierten Mäusen. (A) Repräsentative Bilder sowohl der ipsilateralen als auch der kontralateralen Hinterpfoten von Mäusen wurden von der Ganganalysesoftware aufgenommen. Die Kontaktgröße der Pfote ist nach einer Brandverletzung im Vergleich zu der der Kontrollgruppe reduziert. Diese Reduktion wurde teilweise durch die Verabreichung von Paracetamol (200 mg/kg, i.p., einmal täglich für 7 Tage ab dem Tag der Verbrennungsinduktion) wiederhergestellt. Weiße Rechtecke zeigen die von der Software analysierten Hinterpfoten an, (B) ein Diagramm zeigt die Zeitverlaufsänderungen im Pfotenabdruckbereich (%). Die Daten werden als Prozentsatz der Änderungen im Druckbereich zwischen den ipsilateralen (rechts) und kontralateralen (links) Hinterpfoten berechnet (z. B. zeigt der Wert von 50% die gleichen Pfotenabdruckbereiche in der rechten und linken Hinterpfote an). Pfeile zeigen den Tag der Arzneimittelverabreichung an. * p < 0,05 und ** p < 0,01 gegenüber der Burn-Gruppe. Zwei-Wege-Wiederholungsmessungen ANOVA wurde durchgeführt, um die Gesamteffekte im Zeitverlauf des Druckbereichs bei der Ganganalyse zu bestimmen. Eine Post-hoc-Analyse wurde mit Dunnetts Test durchgeführt, um den P-Wert zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Einzelhaltung aus automatisierter Ganganalyse bei durch Brandverletzungen induzierten Mäusen . (A) Repräsentative Bilder einer einzelnen Haltung wurden von der Ganganalysesoftware aufgenommen. Verschiedene Farben zeigten die Haltung jeder Pfote an: blau, rechte Vorderpfote; rosa, rechte Hinterpfote; gelbe, linke Vorderpfote; Grüne, linke Hinterpfote. Die Einzelhaltung der ipsilateralen Hinterpfote wurde nach einer Brandverletzung verkürzt. Diese Veränderung wurde teilweise durch die Verabreichung von Paracetamol (200 mg/kg, i.p., einmal täglich für 7 Tage ab dem Tag der Verbrennungsinduktion) wiederhergestellt. (B) Ein Schaubild zeigt die Zeitverlaufsänderungen in der einzelnen Haltung (%). Die Daten werden als Liniendiagramm zusammengefasst, nachdem der Prozentsatz der Änderungen der Einzelhaltung zwischen den ipsilateralen (rechts) und kontralateralen (links) Hinterpfoten berechnet wurde (z. B. zeigt der Wert von 50% die gleiche Einzelhaltung in der rechten und linken Hinterpfote an). Pfeile zeigen den Tag der Arzneimittelverabreichung an. * p < 0,05 versus Burn-Gruppe. Zwei-Wege-Wiederholungsmessungen ANOVA wurde durchgeführt, um die Gesamteffekte im Zeitverlauf der Einzelhaltung auf die Ganganalyse zu bestimmen. Eine Post-hoc-Analyse wurde mit Dunnetts Test durchgeführt, um den P-Wert zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Immobilitätszeit des erzwungenen Schwimmtests bei durch Verbrennungsverletzungen induzierten Mäusen. Die Immobilitätszeit der durch Verbrennungsverletzungen verursachten Mäuse war 7 Tage nach der Induktion der Verbrennungen im Vergleich zu der der Kontrollgruppe erhöht. Bei durch Verbrennungsverletzungen induzierten Mäusen verringerte die Verabreichung von Paracetamol (200 mg/kg, i.p., einmal täglich für 7 Tage ab dem Tag der Verbrennungsinduktion) die durch Verbrennungsverletzungen verursachte erhöhte Immobilitätszeit signifikant. p < 0,001 gegenüber der Kontrollgruppe, ** p < 0,01 gegenüber der Burn-Gruppe. Einweg-Wiederholungsmessungen ANOVA wurde durchgeführt, um die Gesamteffekte im Zeitverlauf des erzwungenen Schwimmtests zu bestimmen. Eine Post-hoc-Analyse wurde mit Dunnetts Test durchgeführt, um den P-Wert zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Die normale motorische Funktionsbeurteilung basierend auf den Änderungen der Laufzeit des Rota-Rod-Tests bei durch Verbrennungsverletzungen induzierten Mäusen. Es gab keine Änderung der Laufzeit der durch Verbrennungsverletzungen induzierten Mäuse 7 Tage nach der Induktion der Verbrennungen im Vergleich zu denen der Kontroll- und Paracetamol-behandelten Verbrennungsverletzungsgruppen. Die Laufzeit von alfaxalone-behandelten Mäusen (Positivkontrolle) wurde jedoch signifikant auf ~60 s reduziert. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass eine in dieser Studie verwendete Brandverletzung keine motorischen Beeinträchtigungen verursacht. p < 0,001 versus Burn-Gruppe. Zwei-Wege-Wiederholungsmessungen ANOVA wurde durchgeführt, um die Gesamteffekte im Zeitverlauf des Rota-Rod-Tests zu bestimmen. Eine Post-hoc-Analyse wurde mit Dunnetts Test durchgeführt, um den P-Wert zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Veränderungen der Gewebeschädigung im Laufe der Zeit nach der Induktion von Verbrennungen. Nach der verbrühenden Verbrennungsinduktion wurden signifikante Gewebeschäden beobachtet, die im Laufe der Zeit allmählich zunahmen. In dieser Studie hat Acetaminophen, das als Positivkontrollmedikament verwendet wird, eine schützende Wirkung auf Gewebeschäden gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Verbrühungsverbrennung ist eine Art thermische Verbrennung, die durch erhitzte Flüssigkeiten verursacht wird. Es wurde vermutet, dass in den meisten Fällen Verbrennungen ersten oder zweiten Grades auftreten, aber langfristiger Kontakt mit Wärmequellen kann Verbrennungen dritten Grades verursachen26. In der vorliegenden Studie wurde eine Brandverletzung induziert, indem die rechte Hinterpfote von Mäusen bei 65 °C für 3 s 4,26 in heißes Wasser gesetzt wurde. Gewebeschäden wurden in der verbrannten Pfote festgestellt, die häufige Symptome von Verbrennungen wie Rötung, Abschälen der Haut und Schwellungen zeigt (Ergänzende Abbildung 1)4.
Die mechanische Allodyniemessung ist eine häufig verwendete Schmerzantwort-Identifizierungsmethode in Tierschmerzmodellen und wurde in dieser Studie mit von-Frey-Filamenten gemessen. Die aufsteigende Reizmethode mit den Von-Frey-Filamenten wird verwendet, um die mechanische Schwelle zu bestimmen, die erforderlich ist, um die Pfotenentzugsreaktion eines Tieres zu induzieren19,20. Das Experiment begann mit dem Filament mit dem geringsten Reiz. Die Biegekraft des Filaments, das auf eine festgelegte Zahl reagiert (dreimal in diesem Protokoll), wurde als Pfotenentnahme-Schwellenwert erhalten.
Die Ganganalyse von Nagetieren während des freien Gehens wird verwendet, um die Parkinson-Krankheit oder die Bewegungen der Gliedmaßen und Positionsänderungen in sensorisch-motorischen Beeinträchtigungsmodellen, einschließlich Rückenmarksverletzungen und Schlaganfall, zu untersuchen27,28. Das Ganganalysesystem analysiert automatisch verschiedene Gangparameter, einschließlich Pfotenintensität, Pfotenabdruck, Standphase usw. Änderungen von Parametern, die das Ganganalysesystem analysieren kann, können als schmerzbezogene Indikatoren in der Ganganalyse von Schmerztiermodellen verwendet werden. Daher kann die Ganganalyse als experimentelle Methode zur nicht-invasiven Quantifizierung spontaner Schmerzen in Tiermodellen 4,21,22 verwendet werden. Basierend auf früheren Ergebnissen, dass Gangparameter auf der schmerzinduzierten Seite in Tiermodellen von Schmerzenverringert wurden 21,22, quantifizierte dieses vorgestellte Protokoll jeden Gangparameter als das Verhältnis der verbrennungsinduzierten ipsilateralen und kontralateralen Seite. In diesem Protokoll wurden die Daten der Pfotenabdruckfläche und der Einzelhaltung in die Änderungsrate zwischen ipsilateralen (verletzten) und kontralateralen (nicht verletzten) Hinterpfoten umgerechnet. Der Wert von 50% bedeutet, dass die Pfotenabdruckgröße und die Zeit bis zum Erreichen des Bodens sowohl im ipsilateralen als auch im kontralateralen Bereich gleich sind, während der Wert unter 50% anzeigt, dass diese Parameter in der verbrennungsinduzierten ipsilateralen Hinterpfote verringert sind. Die prozentualen Veränderungen zwischen den ipsilateralen und kontralateralen Hinterpfoten wurden verwendet, um alle Daten zu erhalten (d.h. normale Mäuse zeigten ~ 50%, was bedeutet, dass das ipsilaterale: kontralaterale Verhältnis 50: 50 betrug). Bei normalen Tieren erscheinen die Parameter, die sich auf jedes Hinterglied beziehen, auf beiden Seiten gleich, wenn man frei geht. Die Analyse dieses Protokolls konzentriert sich jedoch auf die Tatsache, dass die Parameter auf der ipsilateralen Seite nach der Schmerzinduktion abnehmen. Darüber hinaus gibt es individuelle Variationen in jedem Tier; Genaue Daten werden möglicherweise nicht erhalten, wenn die Rohdaten so analysiert werden, wie sie sind. Daher wurde jeder Gangparameterwert in ein Verhältnis umgewandelt, um während der Analyse genauere Ergebnisse zu erhalten. Die vorliegende Studie hat gezeigt, dass die Druckflächengröße und die Einzelstandzeit der ipsilateralen Hinterpfote nach einer Brandverletzung reduziert wurden, und diese Verringerung wurde durch wiederholte intraperitoneale Acetaminophen-Verabreichung wiederhergestellt. Diese Veränderungen fielen mit einem ähnlichen Muster von zeitlichen Veränderungen des Schmerzverhaltens nach Verbrennungsverletzungen und der Verabreichung von Medikamenten zusammen.
Obwohl umstritten, ist der erzwungene Schwimmtest die am häufigsten verwendete Methode, um das Verhalten depressiver Nagetiere zu untersuchen. Die Tiere versuchen, aus dem Behälter voller Wasser zu entkommen, bewegen sich aber schließlich nicht, was zu Verzweiflung29 führt. Es wird jedoch argumentiert, dass Immobilität als Maß für Depressionen schwer zu bewerten ist, da dieser Test sowohl mit Ausdauer als auch mit Gefühlen der Verzweiflung verbunden ist. Um die Ergebnisse des erzwungenen Schwimmexperiments zu unterstützen, können andere Methoden zur Bewertung der Depression, wie der Schwanzaufhängungstest, der neuheitsunterdrückte Fütterungstest und der Saccharoseverbrauchstest,als 30,31 betrachtet werden. In der vorliegenden Studie wurde die Immobilisierungszeit nach einer Brandverletzung erhöht, und dieser Anstieg wurde durch die Verabreichung von Paracetamol wiederhergestellt.
Die Protokolle dieser Studie wurden entwickelt, um ein Modell für akute Schmerzen zu etablieren, die depressionsähnliches Verhalten nach einer Brandverletzung begleiten. Das depressionsähnliche Verhalten in dieser Studie kann die sekundären Auswirkungen von körperlichen Beeinträchtigungen und Veränderungen der thermischen Empfindlichkeit nach einer Verbrennungsverletzungsein 15,32,33. Die Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass Mäuse mit induzierten akuten Schmerzen nach einer Verbrennungsverletzung depressionsähnliches Verhalten zeigten. Es hat sich gezeigt, dass es die Schmerzreaktion und das daraus resultierende depressionsähnliche Verhalten durch experimentell behandelte Medikamente verbessert.
Der Rota-Rod-Test ist ein Leistungstest, der auf einer Rotationsbelastung basiert, die im Allgemeinen gewaltsam auf Nagetiere mit sportlicher Aktivität angewendet wird. Der Test misst Parameter wie Laufzeit und Ausdauer. Einige der Testmerkmale umfassen unter anderem die Auswirkungen eines experimentellen Medikaments oder das Gleichgewicht der Probanden im neuropathischen Schmerzmodell, die Griffstärke und die motorische Koordinationsbewertung22,25,34. Wie in den Ergebnissen dieser Studie gezeigt, gab es keine Veränderung der Rota-Rod-Laufzeit nach einer Verbrennungsverletzung oder Paracetamol-Behandlung im Vergleich zu der der Kontrollgruppe.
Diese Studie zeigt die Entwicklung eines Tiermodells zur Untersuchung von durch Verbrennungsverletzungen verursachten Schmerzen und depressionsähnlichem Verhalten bei Mäusen. In dieser Hinsicht hat diese Studie gezeigt, dass verbrühte Brandverletzungen mechanische Allodynie, Veränderungen der Gangparameter und depressionsähnliches Verhalten wie Immobilitätszeit induzierten. Dieses Modell eignet sich für die Erforschung der verschiedenen Aspekte und Ergebnisse von Verbrennungsschmerzen und deren Behandlung und soll wichtige Informationen in dieses Forschungsfeld einbringen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der Chungnam National University und dem Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, der von der Regierung Koreas finanziert wurde (NRF-2019R1A6A3A01093963 und NRF-2021R1F1A1062509).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
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