Summary
Преходящая ожоговая травма (65 °C ± 0,5 °C, 3 с) одной задней лапы снижает порог (g) к стимуляции нити фон Фрея ипсилатеральной стороны и изменяет рисунок походки. Кроме того, ожоговая травма вызывает депрессивное поведение в тесте на принудительное плавание.
Abstract
Ошпаривание водой является наиболее распространенной причиной ожоговой травмы как у пожилых, так и у молодых людей. Это одна из основных клинических проблем из-за высокой смертности и последствий в странах с низким и средним уровнем дохода. Ожоги часто вызывают сильную спонтанную боль и постоянную аллодинию, а также опасную для жизни проблему. Что еще более важно, чрезмерная боль часто сопровождается депрессией, которая может значительно снизить качество жизни. В этой статье показано, как разработать животную модель для изучения боли, вызванной ожогом, и депрессивного поведения. После анестезии ожоговая травма была вызвана погружением одной задней лапы мыши в горячую воду (65 ° C ± 0,5 ° C) в течение 3 с. Тест фон Фрея и автоматический анализ походки проводились каждые 2 дня после ожоговой травмы. Кроме того, депрессивное поведение было исследовано с использованием теста принудительного плавания, и тест рота-стержня был выполнен для дифференциации аномальной двигательной функции после ожоговой травмы. Основной целью данного исследования является описание разработки животной модели для изучения боли, вызванной ожоговой травмой, и депрессивного поведения у мышей.
Introduction
Повреждение тканей, такое как ожог и травма, как правило, связано с сопутствующим возникновением острой боли. По оценкам, 1 80 000 смертей каждый год вызваны ожогами - подавляющее большинство случаев происходит в странах с низким и средним уровнем дохода от различных типов ожогов1. Согласно всемирному отчету, ожоги распространены у детей и составляют около 40-60% госпитализированных пациентов 2,3. Эти специфические травмы еще более серьезны, так как они могут возникать в повседневной жизни, например, кипячение или купаниеводой 4,5. Хотя острая боль может быть устранена спонтанно после восстановления после повреждения тканей в большинстве случаев, она может стать хронической из-за аномальных изменений в нервной системе 6,7.
Недавно было высказано предположение, что острая боль может вызвать подавленное настроение, а хроническая боль может вызвать беспокойство и депрессию 8,9,10,11. Сосуществование боли и депрессии затрудняет лечение больного. Депрессия также имеет тенденцию увеличивать болевую чувствительность, что, вероятно, вызовет более интенсивную депрессию и боль12. Осложнения боли и депрессии показаны на животных моделях периферического воспаления 13,14,15,16. Подробные механизмы, лежащие в основе депрессии, вызванной болью, не очень хорошо известны до сих пор17. Таким образом, необходимо разработать более эффективные методы лечения ожогов, чтобы облегчить побочные эффекты и симптомы.
Таким образом, настоящее исследование было разработано для разработки животной модели для изучения острой боли, вызванной ожоговой травмой, и депрессивного поведения у мышей. Для этого были измерены аномальная тактильная чувствительность, связанная с ожоговой травмой, измененный характер походки и депрессивное поведение. Кроме того, в этом исследовании предпринимается попытка проверить модель с использованием НПВП.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Национальном университете Чуннам в Южной Корее, а затем проведены на основе этических принципов Международной ассоциации по изучению боли18.
1. Индукция ожоговой травмы задним лапой
- Размещать самцов мышей ICR весом 20-25 г в светлом и температурно-контролируемом помещении (цикл 12/12 ч светло-темный, 22,5 °C ± 2,5 °C) с влажностью 40%-60%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола могут использоваться как самцы, так и самки мышей. - Предоставьте животному свободный доступ к пище и воде и акклиматизируйтесь не менее чем за 1 неделю до начала эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были размещены в группе, чтобы исключить такие переменные, как стресс изоляции. - Назначайте мышей случайным образом в экспериментальную или контрольную группу и проводите слепые эксперименты, используя номера животных в качестве кодов.
- В день индукции ожога обезболивают мышь внутрибрюшинной (в т.п.) инъекцией 300 мкл альфаксалона в дозе 100 мг/кг. Наденьте хирургический халат, перчатки и маску во время выполнения индукции ожога.
- После глубокого обезболивания мыши продезинфицируйте вокруг правой задней лапы 70% этанолом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте отсутствие реакции на стимуляцию защемления, применяемую к задним пальцам ног или хвосту, чтобы подтвердить состояние глубокой анестезии. - Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы после индукции анестезии.
- Погрузите правую заднюю лапу глубоко обезболенной мыши в горячую воду при температуре 65 °C ± 0,5 °C в течение 3 с. Сделайте отметку на лодыжке каждой мыши, прежде чем погружать заднюю лапу в горячую воду, чтобы сохранить консистенцию в обожженной области.
- После индукции ожогов приведите мышей в чистую домашнюю клетку и поместите их на грелку до тех пор, пока животные не восстановятся после анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивающее средство, ацетаминофен (200 мг/кг), вводили внутрибрюшинно один раз в день в течение 7 дней, начиная со дня ожоговой травмы (группа только ожог + ацетаминофен). Группа Burn была обработана физиологическим раствором в качестве управления транспортным средством. Эксперимент проводили по методу, описанному в предыдущем исследовании4.
2. Измерение механической аллодинии
- Приведите мышей в комнату поведенческого тестирования и дайте им акклиматизироваться, по крайней мере, за 30 минут до теста. Наденьте хирургический халат, перчатки и маску во время выполнения теста.
- Поместите мышей в квадратную коробку (диаметр: 13 см, высота: 12 см) на металлический сетчатый пол (размер сетки: 0,7 см х 0,7 см) и дайте им акклиматизироваться не менее 30 минут.
- Оцените механический порог задней лапы с помощью метода восходящего стимула19,20.
- Аккуратно проткните серию нитей фон Фрея с интервалом 5-8 с, чтобы стимулировать заднюю подошвенную. Получите исходные значения за день до индукции ожога.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нити фон Фрея весом 0,16-1,2 г использовались в тесте для измерения порога изъятия лап у всех животных, соответственно. Тест реакции на вывод лапы был начат с наименьшей изгибающей силой нити фон Фрея (0,16 г в этом протоколе). Если ответа не было, то прикладывалась нить накал со следующей изгибающей силой. - Проведите пять испытаний для оценки механических порогов для каждой ипсилатеральной (травмированной) задней лапы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изгибающая сила нити фон Фрея, которая производит ответ более чем в три раза из пяти испытаний у каждого животного, была выражена как порог изъятия лапы (PWT, g). Механические пороги измеряли за сутки до и через 1, 3, 5 и 7 дней после ожоговой травмы. Обезболивающий эффект оценивали через 1 ч после введения ацетаминофена животному.
3. Автоматизированный анализ походки
- Акклиматизируйте мышей в системе анализа походки один раз в день в течение 10-15 мин за 5 дней до ожоговой травмы. Наденьте хирургический халат, перчатки и маску при выполнении анализа походки.
- В день теста приведите мышей в комнату поведенческих тестов и акклиматизируйте их не менее чем за 30 минут до теста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте тесты акклиматизации и анализа походки в темной среде. Задайте условия меню программы следующим образом.- После запуска программы нажмите на меню Создать новый эксперимент , чтобы назначить папку для сохранения данных.
- После обозначения установите максимальное время работы на 5 с и максимально допустимые изменения скорости на 50%.
- Выберите зарегистрированную камеру и установите длину прохода на 30 см на вкладке Настройка программы.
- На вкладке Приобретение в меню программы выберите Команду Открыть приобретение.
- Основываясь на сообщениях о состоянии, нажмите кнопку Snap Background , чтобы получить фоновое изображение пустой дорожки.
- Нажмите кнопку «Начать сбор», а затем поместите мышь на вход в лево-правую проходимую дорожку. Запись начнется автоматически после свободного движения мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если походка животного была успешно записана и все шаги были обнаружены, она будет помечена как Compliant Run с зеленым значком. Если программа не обнаруживает никаких шагов, отображается красный значок, и в этом случае рекомендуется выполнить запись снова. Авторы рекомендуют собирать и анализировать не менее пяти успешных совместимых прогонов, выполненных с одинаковыми скоростями бега. - На вкладке Приобретение меню программы выберите Классифицировать запуски.
ПРИМЕЧАНИЕ: После выбора данных, полученных в результате успешного выполнения соответствия выше, перейдите на экран видеоанализа, где были записаны паттерны походки мышей. - Выберите прогон для анализа и нажмите кнопку Автоклассификация .
- После выполнения автоматической классификации удалите нос, распознавание гениталий и неправильное распознавание лап мусорными данными в каждом прогоне, а затем проанализируйте данные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все статистические параметры автоматически анализируются и сохраняются в программе, а необработанные значения данных можно найти в меню анализа экспериментатора. Автоматический анализ походки проводился до и через 1, 3, 5 и 7 дней после ожоговой травмы. Оценку проводили через 30 мин после введения ацетаминофена в группе Ожог + Ацетаминофен и через 30 мин после лечения физиологическим раствором в группе Ожога. Этот эксперимент проводили по методу, описанному в предыдущих исследованиях 4,21,22.
4. Измерение депрессивного поведения
ПРИМЕЧАНИЕ: Поведение, основанное на отчаянии, время неподвижности в воде измерялось тестом на принудительное плавание.
- Приведите мышей в комнату поведенческих тестов и акклиматизируйте их не менее чем за 30 минут до теста. Наденьте хирургический халат, перчатки и маску во время выполнения теста на принудительное плавание.
- Поместите мышь в прозрачный цилиндр из плексигласа (10 см х 25 см), содержащий 15 см воды (25 °C ± 0,5 °C) в течение 15 минут.
- Через 24 ч поместите мышь в цилиндр тех же условий и измерьте время неподвижности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время неподвижности измерялось в течение 5 минут тестового времени, и было зарегистрировано время, когда мыши переставали лазать или плавать и просто плавали, чтобы держать голову над поверхностью воды. Тест на принудительное плавание был выполнен на 7 день после ожоговой травмы. Оценку проводили через 1 ч после введения ацетаминофена в группе Ожог + Ацетаминофен и 1 ч после лечения физиологическим раствором в группе Ожога. Эксперимент проводили по методу, описанному в предыдущих исследованиях23,24.
5. Измерение нормальной двигательной функции
ПРИМЕЧАНИЕ: Тест рота-стержня был проведен для дифференциации аномальной двигательной функции после ожоговой травмы.
- Приведите мышей в комнату поведенческих тестов и акклиматизируйте их не менее чем за 30 минут до теста. Наденьте хирургический халат, перчатки и маску во время выполнения теста на принудительное плавание.
- Поместите животных на прокатную цилиндрическую платформу (ширина 5,7 см; диаметр 3 см), подвешенную на 16 см выше дна аппарата.
- Позвольте каждому животному тренироваться один раз в день на рота-стержне в течение не менее 5 дней до индукции ожоговой травмы.
- Выполняйте рота-стержневой тест каждые 20 мин в течение 2 ч после введения препарата. Установите время отсечки равным 2 мин.
- Измерьте продолжительность времени, в течение которого мышь работает на вращающемся стержне с постоянной скоростью 15 оборотов в минуту без падения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рота-стержневой тест проводился через 7 дней после индукции ожоговой травмы. Оценка проводилась сразу после введения ацетаминофена в группе Ожог + Ацетаминофен и после физиологического раствора в группе Ожога. Альфаксалон использовался в качестве положительного контроля для экспериментально обработанных препаратов в этом тесте. Во время теста ротарода измеряется продолжительность времени, в течение которого мышь работает на вращающемся стержне без падения. Эксперимент проводили по методу, описанному в предыдущих исследованиях22,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшить количество животных, используемых в соответствии с руководящими принципами трех R (замена, сокращение и уточнение), это исследование было разработано с минимальным количеством животных для сбора значительных данных, установленных в ходе предварительного эксперимента. В этом исследовании поведенческие эксперименты проводились независимо дважды следующим образом. Анализ походки, механической аллодинии и депрессивного поведения проводились с группами Control (n = 5), Burn (n = 7; управление транспортным средством; физиологический раствор) и Burn + Acetaminophen (n = 7). В тесте на рота-стержень контроль (n = 3), ожог (n = 4; управление транспортным средством; физиологический раствор), ожог + ацетаминофен (n = 4), положительный контроль (n = 4; Были разработаны группы Alfaxalone). Альфаксалон - это тип нейроактивного стероида и анестетика, который в настоящее время используется в ветеринарии в качестве инъекционного общего анестетика. В этом исследовании альфаксалон использовался в анестезии животных для индукции ожогов и использовался в качестве положительного контрольного препарата для двигательных нарушений в тесте рота-стержня.
Данные были выражены в виде среднего ± S.E.M. Кроме того, экспериментальные данные, полученные в разное время, анализировались самостоятельно. Поведенческие реакции боли были рассчитаны как площадь под кривой (AUC). Были проведены двусторонние повторные измерения ANOVA для определения различий в данных механического теста на аллодинию, анализа походки и теста рота-стержня с течением времени. Тест Даннетта был использован для пост-специального анализа для определения P-значения среди экспериментальных групп. Значения P менее 0,05 были признаны значительными. Программное обеспечение GraphPad Prism 6.0 использовалось для анализа этой статистической достоверности. Все процедуры статистического анализа выполнялись вслепую по отношению к условиям эксперимента. Рисунок, иллюстрирующий повреждение тканей, вызванное ожоговой травмой, показан на дополнительном рисунке 1.
Временные изменения в пороге снятия лапы (PWT, g) после ожоговой травмы показаны на рисунке 1. PWT (g) мышей, вызванных ожоговой травмой, был снижен через 1 день после индукции ожога и поддерживался в течение 7 дней по сравнению с контрольной группой. Введение ацетаминофена (200 мг/кг, т.п., один раз в сутки в течение 7 дней, начиная со дня ожоговой индукции) значительно уменьшало вызванное ожогом снижение PWT (рисунок 1A, ** p < 0,01 по сравнению с burn group). Кроме того, анализ AUC (в течение 7 дней) показал, что введение ацетаминофена значительно уменьшало механическую аллодинию, вызванную ожоговой травмой (Рисунок 1B, *** p < 0,001 по сравнению с контрольной группой, ** p < 0,01 по сравнению с группой Ожога).
Изменения в области отпечатка задней лапы после ожоговой травмы с течением времени показаны на рисунке 2. Ожоговая травма значительно уменьшала площадь отпечатка ипсилатеральной задней лапы со дня после индукции и сохранялась в течение 7 дней. Область отпечатка задней лапы была значительно улучшена путем введения ацетаминофена (200 мг/кг, т.п., один раз в день в течение 7 дней, начиная со дня сжигания-индукции) по сравнению с группой, получавшей транспортное средство (рисунок 2A,B, * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой Ожога).
Изменения временного хода в одном положении после ожоговой травмы показаны на рисунке 3. Ожоговая травма уменьшила одиночное положение (%) ипсилатеральной задней лапы через 1 день после ожога-индукции, и это снижение сохранялось в течение 7 дней. Одиночное положение задней лапы было улучшено путем введения ацетаминофена (200 мг/кг, т.п., один раз в день в течение 7 дней, начиная со дня ожог-индукции) по сравнению с группой, получавшей лечение транспортным средством (рисунок 3A, B, * p < 0,05 по сравнению с группой Ожога).
Изменения времени неподвижности, полученные в результате теста на принудительное плавание, показаны на рисунке 4. Время неподвижности мышей, вызванных ожоговой травмой, было увеличено через 7 дней после индукции ожога по сравнению с контрольной группой. У мышей, вызванных ожоговой травмой, введение ацетаминофена (200 мг/кг, т.е. один раз в день в течение 7 дней, начиная со дня индукции ожога) значительно уменьшало вызванное ожоговой травмой увеличение времени неподвижности (** p < 0,01 и *** p < 0,001 по сравнению с ожоговой группой).
Нормальная двигательная функция оценивалась на основе изменений времени работы на рота-стержне, как показано на рисунке 5. Продолжительность работы мышей, вызванных ожоговой травмой, не изменилась через 7 дней после индукции ожога по сравнению с контрольной группой. Напротив, время работы мышей, получавших альфаксалон (положительный контроль), было значительно уменьшено в течение примерно 60 минут. Этот результат указывает на то, что ожоговая травма, используемая в этом исследовании, не вызывает двигательных нарушений (*** p < 0,001 по сравнению с группой Burn).
Рисунок 1: Механическая аллодиния, оцененная с помощью теста фон Фрея у мышей, вызванных ожоговой травмой. (A) Порог изъятия лапы (PWT, g) в ипсилатеральной задней лапе мышей был снижен через 1 день после ожоговой травмы и сохранялся в течение 7 дней по сравнению с контрольной группой. Введение ацетаминофена (200 мг/кг, т.п., один раз в сутки в течение 7 дней, начиная со дня индукции ожога) значительно уменьшало механическую аллодинию, вызванную ожоговой травмой. (B) PWT был проанализирован как площадь под кривой (AUC). Стрелки указывают день приема препарата. p < 0,001 по сравнению с контрольной группой, ** p < 0,01 по сравнению с группой Burn. Были проведены двусторонние повторные измерения ANOVA для определения общих эффектов во временном ходе теста фон Фрея. Пост-специальный анализ проводился с использованием теста Даннетта для определения P-значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Область отпечатка лапы, полученная в результате автоматизированного анализа походки у мышей, вызванных ожоговой травмой. (A) Репрезентативные изображения как ипсилатеральных, так и контралатеральных задних лап мышей были захвачены программным обеспечением для анализа походки. Контактный размер лапы уменьшается после ожоговой травмы по сравнению с контрольной группой. Это снижение было частично восстановлено путем введения ацетаминофена (200 мг / кг, т.е. один раз в день в течение 7 дней, начиная со дня индукции ожога). Белые прямоугольники указывают на задние лапы, проанализированные программным обеспечением, (B) график показывает изменения временного хода в области отпечатка лапы (%). Данные рассчитываются как процент изменений в области печати между ипсилатеральной (правой) и контралатеральной (слева) задними лапами (например, значение 50% указывает на одинаковые области отпечатка лапы в правой и левой задних лапах). Стрелки указывают день приема препарата. * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой Burn. Были проведены двухсторонние повторные измерения ANOVA для определения общего влияния во временном ходе печатной области на анализ походки. Пост-специальный анализ проводился с использованием теста Даннетта для определения P-значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Одиночная стойка, полученная из автоматизированного анализа походки у мышей, вызванных ожоговыми травмами. (A) Репрезентативные изображения одной стойки были получены программным обеспечением для анализа походки. Разные цвета обозначали стойку каждой лапы: синяя, правая передняя лапа; розовая, правая задняя лапа; желтая, левая передняя лапа; зеленая, левая задняя лапа. Одиночная стойка ипсилатеральной задней лапы была укорочена после ожоговой травмы. Это изменение было частично восстановлено путем введения ацетаминофена (200 мг / кг, т.е. один раз в день в течение 7 дней, начиная со дня индукции ожога). (B) График показывает изменения во времени в одной позиции (%). Данные суммируются в виде линейного графика после вычисления процента изменений в одиночной позиции между ипсилатеральной (правой) и контралатеральной (слева) задними лапами (например, значение 50% указывает на одну и ту же одиночную стойку в правой и левой задних лапах). Стрелки указывают день приема препарата. * p < 0,05 по сравнению с группой Burn. Были проведены двухсторонние повторные измерения ANOVA для определения общих эффектов во временном ходе анализа одиночной позиции на аллюре. Пост-специальный анализ проводился с использованием теста Даннетта для определения P-значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Время неподвижности теста принудительного плавания у мышей, вызванных ожоговой травмой. Время неподвижности мышей, вызванных ожоговой травмой, было увеличено через 7 дней после индукции ожога по сравнению с контрольной группой. У мышей, вызванных ожоговой травмой, введение ацетаминофена (200 мг/кг, т.е. один раз в день в течение 7 дней, начиная со дня индукции ожога) значительно облегчало время повышенной неподвижности, вызванной ожоговой травмой. p < 0,001 по сравнению с контрольной группой, ** p < 0,01 по сравнению с группой Burn. Односторонние повторные измерения ANOVA были выполнены для определения общих эффектов во временном ходе теста на принудительное плавание. Пост-специальный анализ проводился с использованием теста Даннетта для определения P-значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Оценка нормальной двигательной функции на основе изменений времени выполнения теста рота-стержня у мышей, вызванных ожоговой травмой. Не было никаких изменений во времени работы мышей, вызванных ожоговой травмой, через 7 дней после индукции ожога по сравнению с группами контрольных и ацетаминофеновых ожоговых травм. Тем не менее, время работы мышей, получавших альфаксалон (положительный контроль), было значительно уменьшено до ~ 60 с. Этот результат указывает на то, что ожоговая травма, используемая в этом исследовании, не вызывает двигательных нарушений. p < 0,001 по сравнению с группой Burn. Были проведены двухсторонние повторные измерения ANOVA для определения общих эффектов во временном ходе теста рота-стержня. Пост-специальный анализ проводился с использованием теста Даннетта для определения P-значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Изменения повреждения тканей с течением времени после индукции ожогов. После индукции ожога наблюдалось значительное повреждение тканей, которое постепенно увеличивалось с течением времени. В этом исследовании ацетаминофен, используемый в качестве положительного контрольного препарата, показал защитное действие на повреждения тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ожог ожога – это разновидность термического ожога, который вызывается нагретыми жидкостями. Было высказано предположение, что ожоги первой или второй степени возникают в большинстве случаев, но длительный контакт с источниками тепла может вызвать ожоги третьей степени26. В настоящем исследовании ожоговая травма была вызвана воздействием правой задней лапы мышей в горячую воду при 65 ° C в течение 3 с 4,26. Повреждение тканей было обнаружено в поврежденной ожогом лапе, что показывает общие симптомы ожогов, такие как покраснение, шелушение кожи и отек (Дополнительный рисунок 1)4.
Механическое измерение аллодинии является широко используемым методом идентификации болевой реакции в моделях боли у животных и было измерено с использованием нитей фон-Фрея в этом исследовании. Метод восходящего стимула с нитями фон Фрея используется для определения механического порога, необходимого для индуцирования реакции отвода лапы животного19,20. Эксперимент начался с нити с наименьшим раздражителем. Сила изгиба нити накала, реагирующая на заданное число (три раза в этом протоколе), была получена в виде порогового значения вывода лапы.
Анализ походки грызунов во время свободной ходьбы используется для изучения болезни Паркинсона или движений конечностей и изменения положения в моделях сенсорно-моторных нарушений, включая травму спинного мозга и инсульт27,28. Система анализа походки автоматически анализирует различные параметры походки, включая интенсивность лапы, отпечаток лапы, фазу стойки и т. Д. Изменения параметров, которые может анализировать система анализа походки, могут быть использованы в качестве индикаторов, связанных с болью, при анализе походки на животных моделях боли. Поэтому анализ походки может быть использован в качестве экспериментального метода для неинвазивной количественной оценки спонтанной боли на животных моделях 4,21,22. Основываясь на предыдущих выводах о том, что параметры походки были снижены на стороне, вызванной болью, на животных моделях боли 21,22, этот представленный протокол количественно определял каждый параметр походки как соотношение ипсилатеральной и контралатеральной стороны, вызванной ожогом. В этом протоколе данные о площади отпечатка лап и одной позиции были преобразованы в скорость изменений между ипсилатеральными (травмированными) и контралатеральными (не травмированными) задними лапами. Значение 50% означает, что размер отпечатка лапы и время достижения пола одинаковы как в ипсилатеральной, так и в контралатеральной, в то время как значение менее 50% указывает на то, что эти параметры уменьшаются в индуцированной ожогом ипсилатеральной задней лапе. Для получения всех данных использовались процентные изменения между ипсилатеральными и контралатеральными задними лапами (т.е. нормальные мыши показали ~50%, что означает, что соотношение ипсилатераль: контралатераль составило 50:50). У нормальных животных параметры, связанные с каждой задней конечностью, кажутся одинаковыми с обеих сторон при свободном хождении. Однако анализ этого протокола ориентирован на то, что параметры на ипсилатеральной стороне снижаются после индукции боли. Кроме того, существует индивидуальная вариация у каждого животного; точные данные не могут быть получены, когда необработанные данные анализируются как есть. Поэтому каждое значение параметра походки преобразовывалось в соотношение для получения более точных результатов в ходе анализа. Настоящее исследование показало, что размер области печати и время одиночного положения ипсилатеральной задней лапы были уменьшены после ожоговой травмы, и это снижение было восстановлено повторным введением внутрибрюшинного ацетаминофена. Эти изменения совпали с аналогичной картиной изменений во временном ходе в болевом поведении после ожоговой травмы и введения лекарств.
Несмотря на споры, тест на принудительное плавание является наиболее часто используемым методом изучения поведения депрессивных грызунов. Животные пытаются вырваться из контейнера, полного воды, но в конечном итоге не двигаются, вызывая отчаяние29. Тем не менее, утверждается, что неподвижность трудно оценить как меру депрессии, потому что этот тест связан с выносливостью, а также с чувством отчаяния. Чтобы поддержать результаты эксперимента по принудительному плаванию, другие методы оценки депрессии, такие как тест на хвостовую подвеску, тест на кормление с подавленной новизной и тест на потребление сахарозы, могут считаться30,31. В настоящем исследовании время иммобилизации было увеличено после ожоговой травмы, и это увеличение было восстановлено введением ацетаминофена.
Протоколы этого исследования были разработаны для установления модели острой боли, сопровождающей депрессивное поведение после ожоговой травмы. Депрессивное поведение в этом исследовании может быть вторичным эффектом физических нарушений и изменений тепловой чувствительности после ожоговой травмы 15,32,33. Результаты могут свидетельствовать о том, что мыши с индуцированной острой болью после ожоговой травмы демонстрировали депрессивное поведение. Было показано, что он улучшает болевую реакцию и последующее депрессивное поведение с помощью экспериментально обработанных препаратов.
Тест на рота-стержень - это тест производительности, основанный на вращательной нагрузке, которая обычно принудительно применяется к грызунам со спортивной активностью. Тест измеряет такие параметры, как время работы и выносливость. Некоторые из характеристик теста включают, среди прочего, эффекты экспериментального препарата или баланс субъектов в модели невропатической боли, силу захвата и оценку координации движений 22,25,34. Как показано в результатах этого исследования, не было никаких изменений во времени работы рота-стержня после ожоговой травмы или лечения ацетаминофеном по сравнению с контрольной группой.
Это исследование демонстрирует разработку животной модели для изучения боли, вызванной ожоговой травмой, и депрессивного поведения у мышей. В связи с этим исследование показало, что ожоговые травмы вызывали механическую аллодинию, изменения параметров походки и депрессивное поведение, такое как время неподвижности. Эта модель подходит для исследований различных аспектов и результатов ожоговой боли и ее лечения и, как ожидается, принесет важную информацию в эту область исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным университетом Чуннама и грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (NRF-2019R1A6A3A01093963 и NRF-2021R1F1A1062509).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
References
- Peck, M. D. Epidemiology of burns throughout the World. Part II: intentional burns in adults. Burns. 38 (5), 630-637 (2012).
- Tracy, L. M., Cleland, H. Pain assessment following burn injury in Australia and New Zealand: Variation in practice and its association on in-hospital outcomes. Australasian Emergency Care. 24 (1), 73-79 (2021).
- Montgomery, R. K.
- Kang, D. W., Choi, J. G. Bee venom reduces burn-induced pain via the suppression of peripheral and central substance P expression in mice. Journal of Veterinary Science. 22 (1), 9 (2021).
- Abdi, S., Zhou, Y.
- Ullrich, P. M., Askay, S. W. Pain, depression, and physical functioning following burn injury. Rehabilitation Psychology. 54 (2), 211-216 (2009).
- Patwa, S., Benson, C. A. Spinal cord motor neuron plasticity accompanies second-degree burn injury and chronic pain. Physiological Reports. 7 (23), 14288 (2019).
- Michaelides, A., Zis, P. Depression, anxiety and acute pain: links and management challenges. Postgraduate Medicine. 131 (7), 438-444 (2019).
- Doan, L., Manders, T., Wang, J. Neuroplasticity underlying the comorbidity of pain and depression. Neural Plasticity. 2015, 504691 (2015).
- Vachon-Presseau, E., Centeno, M. V. The emotional brain as a predictor and amplifier of chronic pain. Journal of Dental Research. 95 (6), 605-612 (2016).
- Apkarian, A. V., Baliki, M. N. Predicting transition to chronic pain. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 360-367 (2013).
- Yin, W., Mei, L. A Central amygdala-ventrolateral periaqueductal gray matter pathway for pain in a mouse model of depression-like behavior. Anesthesiology. 132 (5), 1175-1196 (2020).
- Deng, Y. T., Zhao, M. G., Xu, T. J. Gentiopicroside abrogates lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice through tryptophan-degrading pathway. Metabolic Brain Disease. 33 (5), 1413-1420 (2018).
- Zhang, G. F., Wang, J. Acute single dose of ketamine relieves mechanical allodynia and consequent depression-like behaviors in a rat model. Neuroscience Letters. 631, 7-12 (2016).
- Edwards, R. R., Smith, M. T. Symptoms of depression and anxiety as unique predictors of pain-related outcomes following burn injury. Annals of Behavioral Medicine. 34 (3), 313-322 (2007).
- Pincus, T., Vlaeyen, J. W. Cognitive-behavioral therapy and psychosocial factors in low back pain: directions for the future. Spine. 27 (5), 133-138 (2002).
- Laumet, G., Edralin, J. D. CD3(+) T cells are critical for the resolution of comorbid inflammatory pain and depression-like behavior. Neurobiology of Pain. 7, 100043 (2020).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Scholz, J., Broom, D. C. Blocking caspase activity prevents transsynaptic neuronal apoptosis and the loss of inhibition in lamina II of the dorsal horn after peripheral nerve injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (32), 7317-7323 (2005).
- Kang, D. W., Choi, J. G. Automated gait analysis in mice with chronic constriction injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56402 (2017).
- Kang, D. W., Moon, J. Y. Antinociceptive profile of levo-tetrahydropalmatine in acute and chronic pain mice models: Role of spinal sigma-1 receptor. Scientific Reports. 6, 37850 (2016).
- Huang, W., Chen, Z. Piperine potentiates the antidepressant-like effect of trans-resveratrol: involvement of monoaminergic system. Metabolic Brain Disease. 28 (4), 585-595 (2013).
- Can, A., Dao, D. T. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Choi, J. G., Kang, S. Y. Antinociceptive effect of Cyperi rhizoma and Corydalis tuber extracts on neuropathic pain in rats. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 16 (6), 387-392 (2012).
- Mosby's. Mosby's Dictionary of Medicine, Nursing & Health Professions - Seventh edition, Nursing Standard. 20 (22), RCN Publishing Company Ltd. 36 (2006).
- Vandeputte, C., Taymans, J. M. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Isvoranu, G., Manole, E. Gait analysis using animal models of peripheral nerve and spinal cord injuries. Biomedicines. 9 (8), 1050 (2021).
- Yankelevitch-Yahav, R., Franko, M. The forced swim test as a model of depressive-like behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52587 (2015).
- Yan, H. C., Cao, X.
- Papp, M., Willner, P. An animal model of anhedonia: attenuation of sucrose consumption and place preference conditioning by chronic unpredictable mild stress. Psychopharmacology. 104 (2), 255-259 (1991).
- Seminowicz, D. A., Laferriere, A. L. MRI structural brain changes associated with sensory and emotional function in a rat model of long-term neuropathic pain. Neuroimage. 47 (3), 1007-1014 (2009).
- Yalcin, I., Barthas, F. Emotional consequences of neuropathic pain: insight from preclinical studies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 47, 154-164 (2014).
- Choi, J. W., Kang, S. Y. Analgesic effect of electroacupuncture on paclitaxel-induced neuropathic pain via spinal opioidergic and adrenergic mechanisms in mice. American Journal of Chinese Medicine. 43 (1), 57-70 (2015).
