Summary
פציעה צרובה חולפת (65 °C (65 °C (65 °C ( 65 °C ( 65 °C (65 ° C ± 0 .5 °C (0 °C (5 °F, 3 °F) של כף רגל אחורית אחת מקטין את הסף (ז) לגירוי חוט פון פריי של הצד ipsilateral ומשנה את דפוס ההליכה. חוץ מזה, פציעת כוויות גורמת להתנהגות דמוית דיכאון במבחן השחייה הכפוי.
Abstract
מים רותחים הם הגורם הנפוץ ביותר לפגיעה בכוויות הן באוכלוסיות קשישים והן באוכלוסיות צעירות. זהו אחד האתגרים הקליניים העיקריים בגלל התמותה הגבוהה וההמשך במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית. כוויות לעתים קרובות לגרום לכאב ספונטני אינטנסיבי אלודיניה מתמשכת, כמו גם בעיה מסכנת חיים. חשוב מכך, כאב מוגזם מלווה לעתים קרובות בדיכאון, אשר עשוי להפחית באופן משמעותי את איכות החיים. מאמר זה מראה כיצד לפתח מודל בעלי חיים לחקר כאב כתוצאה מכוויות והתנהגות דמוית דיכאון. לאחר הרדמה, פציעת כוויות נגרמה על ידי טבילת כף אחורית אחת של העכבר לתוך מים חמים (65 °C (65 °C (65 °F ± 0.5 °F) עבור 3 s. בדיקת פון פריי וניתוח ההליכה האוטומטי בוצעו כל יומיים לאחר פציעת כוויות. בנוסף, נבדקה התנהגות דמוית דיכאון באמצעות מבחן השחייה הכפוי, ובדיקת מוט הרוטציה בוצעה כדי להבדיל בין התפקוד המוטורי החריג לאחר פציעת כוויות. המטרה העיקרית של מחקר זה היא לתאר את הפיתוח של מודל בעלי חיים לחקר כאב שנגרם על ידי כוויות והתנהגות דמוית דיכאון בעכברים.
Introduction
נזק לרקמות, כגון כוויות וטראומה, קשור בדרך כלל עם התרחשות משותפת של כאב חריף. פציעות כוויות ותסמינים הקשורים לטראומה הם כ -1,80,000 מקרי מוות מדי שנה נגרמים על ידי כוויות - הרוב המכריע מתרחשים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית מסוגים שונים של כוויות1. על פי דו"ח עולמי, כוויות שכיחות בילדים ומהוות כ-40%-60% מהחולים המאושפזים 2,3. פציעות ספציפיות אלה חמורות עוד יותר כפי שהן יכולות להתרחש בחיי היומיום, כגון מים רותחים או רחצה 4,5. למרות כאב חריף ניתן לפתור באופן ספונטני לאחר התאוששות מנזק לרקמות ברוב המקרים, ייתכן שניתן יהיה להיות כרוני עקב שינויים חריגים במערכת העצבים 6,7.
לאחרונה, הוצע כי כאב חריף יכול לגרום למצב רוח מדוכא, וכאב כרוני יכול לגרום חרדה ודיכאון 8,9,10,11. הדו-קיום של כאב ודיכאון מקשה על הטיפול בחולה. דיכאון גם נוטה להגביר את הרגישות לכאב, אשר עשוי לגרום לדיכאון אינטנסיבי יותר וכאב12. סיבוכים של כאב ודיכאון מוצגים במודלים של בעלי חיים של דלקת היקפית 13,14,15,16. המנגנונים המפורטים שבבסיס הדיכאון שנגרם מכאב אינם ידועים עד כה17. לכן, יש צורך לפתח טיפולים יעילים יותר עבור כוויות כדי להקל על תופעות הלוואי והתסמינים.
לפיכך, המחקר הנוכחי נועד לפתח מודל של בעלי חיים כדי לחקור כאב חריף שנגרם מפציעות כוויות והתנהגות דמוית דיכאון בעכברים. לשם כך נמדדו רגישות מוחשית חריגה הקשורה לפציעות כוויות, דפוס הליכה שונה והתנהגות דמוית דיכאון. בנוסף, מחקר זה מנסה לאמת את המודל באמצעות NSAIDs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים הניסיוניים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה הלאומית צ'ונגנאם בדרום קוריאה, ולאחר מכן נערכו על סמך ההנחיות האתיות של האגודה הבינלאומית לחקר הכאב18.
1. אינדוקציה של פציעת כוויות צורבות על כף הרגל האחורית
- בית עכברי ICR זכר במשקל 20-25 גרם בחדר אור ומבוקר טמפרטורה (12/12 שעות מחזור כהה בהיר, 22°C (22 °C (5 °F) ± 2.5 °C (5 °F) עם לחות של 40%-60%.
הערה: ניתן להשתמש בעכברים זכרים ונקבות עבור פרוטוקול זה. - אפשרו לבעל החיים גישה חופשית למזון ומים, והתאקלמו לפחות שבוע לפני תחילת הניסוי.
הערה: כל בעלי החיים שוכנו בקבוצה כדי לא לכלול משתנים כגון מתח בידוד. - הקצה את העכברים באופן אקראי לקבוצת הניסוי או הבקרה וערוך ניסויים עיוורים באמצעות מספרי בעלי חיים כקודים.
- ביום של אינדוקציה לשרוף, להרדים את העכבר על ידי הזרקת intraperitoneal (i.p.) של 300 μL של אלפקסלון במינון של 100 מ"ג/ק"ג. ללבוש שמלה כירורגית, כפפות, ומסכה בעת ביצוע אינדוקציה כוויות.
- לאחר מרדים עמוקות את העכבר, לחטא סביב הכף האחורית הימנית עם 70% אתנול.
הערה: בדוק את חוסר התגובה לגירוי צביטה להחיל על הבהונות האחוריות או הזנב כדי לאשר את מצב של הרדמה עמוקה. - החל משחה עיניים על העיניים כדי למנוע ייבוש הקרנית לאחר אינדוקציה של הרדמה.
- טבול את הכף האחורית הימנית של העכבר מורדם עמוק במים חמים ב 65 °C (65 °F) ± 0.5 °C (5 °F) עבור 3 שניות. להטביע חותם על הקרסול של כל עכבר לפני טבילת כף היד האחורית במים חמים כדי לשמור על עקביות באזור השרוף.
- לאחר אינדוקציה של כוויות, להביא את העכברים בכלוב ביתי נקי ולהניח אותם על כרית חימום עד בעלי החיים להתאושש מהרדמה.
הערה: חומר משכך כאבים, פרצטמול (200 מ"ג/ק"ג), היה מנוהל תוך-אפריטוני פעם ביום במשך 7 ימים החל מיום פציעת כוויות (רק לשרוף + קבוצת Acetaminophen). קבוצת הכוויות טופלה בתמיסת מלח כבקרה לרכב. הניסוי בוצע על פי השיטה המתוארת במחקר קודם4.
2. מדידת אלודיניה מכנית
- הביאו את העכברים לחדר הבדיקות ההתנהגותיות ותנו להם להתאקלם לפחות 30 דקות לפני הבדיקה. יש ללבוש שמלה כירורגית, כפפות ומסכה בעת ביצוע הבדיקה.
- מניחים את העכברים בתוך תיבה מרובעת (קוטר: 13 ס"מ, גובה: 12 ס"מ) על רצפת רשת מתכת (גודל רשת: 0.7 ס"מ x 0.7 ס"מ) ולתת להם להתאקלם לפחות 30 דקות.
- להעריך את הסף המכני של כף היד האחורית באמצעות שיטת הגירוי העולה19,20.
- בעדינות לתקוע סדרה של חוטי פון פריי עם מרווחי 5-8 s כדי לעורר את plantar האחורי. השג את הערכים הבסיסיים ביום שלפני אינדוקציה צריבה.
הערה: 0.16-1.2 גרם חוטי פון פריי שימשו במבחן כדי למדוד את סף גמילה הכפות בכל בעלי החיים, בהתאמה. מבחן התגובה לגמילה מכפות הרגליים החל עם כוח הכיפוף הנמוך ביותר של חוט פון פריי (0.16 גרם בפרוטוקול זה). אם לא הייתה תגובה, אז חוט עם כוח הכיפוף הבא הופעל. - בצע חמישה ניסויים כדי להעריך סף מכני עבור כל כף אחורית ipsilateral (פצועה).
הערה: כוח הכיפוף של חוט פון פריי המייצר תגובה יותר משלוש פעמים מתוך חמשת הניסויים בכל בעל חיים התבטא סף נסיגת כפה (PWT, g). סף מכני נמדד יום לפני וב 1, 3, 5, ו 7 ימים לאחר פציעת כוויות. אפקט משכך כאבים הוערך 1 שעות לאחר מתן האצטומופן בחיה.
3. ניתוח הליכה אוטומטי
- התאקלם את העכברים במערכת ניתוח ההליכה פעם ביום במשך 10-15 דקות מ 5 ימים לפני פציעת הכוויה. יש ללבוש שמלה כירורגית, כפפות ומסכה בעת ביצוע ניתוח ההליכה.
- ביום הבחינה, להביא את העכברים לחדר הבדיקה ההתנהגותית ולהתאקלם לפחות 30 דקות לפני הבדיקה.
הערה: בצע בדיקות התאקלמות וניתוח הליכה בסביבה חשוכה. הגדר את התנאים של תפריט התוכנית באופן הבא.- לאחר הפעלת התוכנית, לחץ על תפריט צור ניסוי חדש כדי לייעד את התיקיה לשמירת הנתונים.
- לאחר הייעוד, הגדר את זמן הריצה המרבי ל- 5 s ואת וריאציות המהירות המרביות המותרות ל- 50%.
- בחר מצלמה רשומה והגדר את אורך המסלול ל- 30 ס"מ בכרטיסיה התקנה של התוכנית.
- בכרטיסיה רכישה של תפריט התוכנית, בחר פתח רכישה.
- בהתבסס על הודעות המצב, לחץ על לחצן הצמד רקע כדי לקבל תמונת רקע של שביל ריק.
- לחץ על לחצן התחל רכישה ולאחר מכן מקם את העכבר בכניסה לשביל החצייה השמאלי-ימינה. ההקלטה תתחיל באופן אוטומטי בעקבות התנועה החופשית של העכבר.
הערה: אם ההליכה של החיה נרשמה בהצלחה וכל הצעדים זוהו, היא תסומן כ-Compliant Run עם סמל ירוק. אם התוכנה אינה מזהה צעדים כלשהם, מוצג סמל אדום, ובמקרה זה מומלץ לבצע את ההקלטה שוב. המחברים ממליצים לאסוף ולנתח לפחות חמש ריצות תואמות מוצלחות המבוצעות במהירויות ריצה דומות. - בכרטיסיה רכישה של תפריט התוכנית, בחר סיווג הפעלות.
הערה: לאחר בחירת הנתונים שהושגו מהתאימות המוצלחת למעלה, עבור אל מסך ניתוח הווידאו שבו נרשמו דפוסי ההליכה של העכברים. - בחר את הריצה שיש לנתח ולחץ על לחצן סיווג אוטומטי .
- לאחר ביצוע סיווג אוטומטי, הסר אף, זיהוי איברי מין וזיהוי שגוי של כפות רגליים לנתוני זבל בכל ריצה ולאחר מכן נתח את הנתונים.
הערה: כל הפרמטרים הסטטיסטיים מנותחים ונשמרים באופן אוטומטי בתוכנית, וניתן למצוא ערכי נתונים גולמיים בתפריט הניתוח של הנסיין. ניתוח הליכה אוטומטי בוצע לפני וב 1, 3, 5, ו 7 ימים לאחר פציעת כוויות. ההערכה בוצעה 30 דקות לאחר ניהול פרצטמול בקבוצת Burn + Acetaminophen ו 30 דקות לאחר טיפול מלוחים בקבוצת כוויות. ניסוי זה בוצע על פי השיטה המתוארת במחקרים הקודמים 4,21,22.
4. מדידה של התנהגות דמוית דיכאון
הערה: התנהגות מבוססת ייאוש, זמן חוסר תנועה במים נמדד על ידי מבחן השחייה הכפוי.
- הביאו את העכברים לחדר הבדיקות ההתנהגותי והתאקלמו לפחות 30 דקות לפני הבדיקה. יש ללבוש שמלה כירורגית, כפפות ומסכה בעת ביצוע מבחן השחייה הכפוי.
- שים את העכבר לתוך גליל זכוכית פלסטית ברורה (10 ס"מ x 25 ס"מ) המכיל 15 ס"מ של מים (25 °C (25 °C (25 °C (25 °C (25 °C (25 °C (25 °C (25 °C (25 °C (25 °C ± 0.5 °C (0.5 °F) במשך 15 דקות.
- לאחר 24 שעות, לשים את העכבר לתוך הגליל של אותם תנאים ולמדוד את זמן חוסר התנועה.
הערה: זמן חוסר תנועה נמדד במשך 5 דקות של זמן בדיקה, והזמן בכל פעם שעכברים הפסיקו לטפס או לשחות ופשוט צף כדי לשמור על ראשם מעל פני המים נרשם. מבחן השחייה הכפוי בוצע ביום השביעי לאחר פציעת הכוויות. ההערכה בוצעה 1 שעות לאחר ניהול פרצטמול בקבוצת Burn + Acetaminophen, ו 1 שעות לאחר טיפול מלוחים בקבוצת כוויות. הניסוי בוצע על פי השיטה המתוארת במחקרים קודמים23,24.
5. מדידה של תפקוד מוטורי רגיל
הערה: בדיקת מוט הרוטציה בוצעה כדי להבדיל בין התפקוד המוטורי החריג לאחר פציעת כוויות.
- הביאו את העכברים לחדר הבדיקות ההתנהגותי והתאקלמו לפחות 30 דקות לפני הבדיקה. יש ללבוש שמלה כירורגית, כפפות ומסכה בעת ביצוע מבחן השחייה הכפוי.
- מניחים את החיות על פלטפורמה גלילית מתגלגלת (רוחב 5.7 ס"מ; קוטר 3 ס"מ) תלוי 16 ס"מ מעל החלק התחתון של המנגנון.
- אפשר לכל בעל חיים להתאמן פעם ביום על מוט רוטציה לפחות 5 ימים לפני אינדוקציה של פגיעת כוויות.
- בצע את בדיקת מוט הרוטציה כל 20 דקות במשך 2 שעות לאחר מתן התרופה. הגדר את זמן הניתוק ל -2 דקות.
- מדוד את משך הזמן שהעכבר פועל על מוט מסתובב במהירות קבועה של 15 סיבובים לדקה מבלי ליפול.
הערה: בדיקת מוט הרוטציה בוצעה 7 ימים לאחר אינדוקציה של פציעת כוויות. ההערכה בוצעה מיד לאחר ניהול פרצטמול בקבוצת Burn + Acetaminophen ולאחר טיפול מלוחים בקבוצת Burn. Alfaxalone שימשה שליטה חיובית עבור תרופות שטופלו באופן ניסיוני בבדיקה זו. במהלך מבחן הרוטרוד, נמדד משך הזמן שבו העכבר פועל על המוט המסתובב מבלי ליפול. הניסוי בוצע על פי השיטה המתוארת במחקרים קודמים22,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על מנת למזער את סבלם של בעלי החיים ולהפחית את מספר בעלי החיים המשמשים לפי הנחיות שלושת הר' (החלפה, צמצום ועידון), מחקר זה תוכנן עם המספר המינימלי של בעלי חיים לאיסוף נתונים משמעותיים שנקבעו באמצעות ניסוי ראשוני. במחקר זה, ניסויים התנהגותיים נערכו באופן עצמאי פעמיים כדלקמן. ניתוח ההליכה, אלודיניה מכנית ובדיקות התנהגות דמויות דיכאון נערכו עם קבוצות בקרה (n = 5), Burn (n = 7; בקרת רכב; מלוחים), ולשרוף + Acetaminophen (n = 7) קבוצות. במבחן מוט הרוטציה, בקרה (n = 3), לשרוף (n = 4; בקרת רכב; מלוחים), לשרוף + Acetaminophen (n = 4), שליטה חיובית (n = 4; אלפקסלון) קבוצות תוכננו. Alfaxalone הוא סוג של סטרואידים נוירואקטיביים והרדמה המשמש כיום ברפואה וטרינרית כמו ממריץ הרדמה כללי להזרקה. במחקר זה, alfaxalone שימש בהרדמה לבעלי חיים עבור אינדוקציה כוויות ושימש כסם שליטה חיובית עבור ליקויים מוטוריים במבחן מוט רוטציה.
הנתונים באו לידי ביטוי כ± ממוצעים ± S.E.E.M. בנוסף, נתונים ניסיוניים שהתקבלו בזמנים שונים נותחו באופן עצמאי. תגובות התנהגותיות כאב חושבו כאזור מתחת לעקומה (AUC). צעדים חוזרים ונשנים דו כיווניים ANOVA בוצע כדי לקבוע את ההבדלים בנתונים מבדיקת אלודיניה מכנית, ניתוח הליכה, ובדיקת מוט רוטציה לאורך זמן. הבדיקה של דאנט שימשה לניתוח פוסט-הוק כדי לקבוע את ערך ה-P בקרב קבוצות הניסוי. ערכי P פחות מ- 0.05 נחשבו משמעותיים. תוכנת GraphPad Prism 6.0 שימשה לניתוח תוקף סטטיסטי זה. כל הליכי הניתוח הסטטיסטי בוצעו באופן עיוור ביחס לתנאי הניסוי. איור משלים הממחיש את הנזק שנגרם כתוצאה מפגיעת כוויות ברקמות מוצג באיור המשלים 1.
באיור 1 מוצגים שינויים במסלול הזמן בסף נסיגת הכפות (PWT, g) לאחר פציעת כוויות. PWT (ז) של עכברים הנגרמים מפציעות כוויות ירד יום אחד לאחר אינדוקציה שריפה ונמשך במשך 7 ימים לעומת זה של קבוצת הביקורת. ניהול פרצטמול (200 מ"ג/ק"ג, כלומר, פעם ביום במשך 7 ימים החל מיום השריפה אינדוקציה) הפחית באופן משמעותי את הירידה הנגרמת על ידי שריפה ב- PWT (איור 1A, ** p < 0.01 לעומת קבוצת כוויות). בנוסף, ניתוח AUC (במשך 7 ימים) הראה כי ניהול acetaminophen הפחית באופן משמעותי את האלודיניה המכנית הנגרמת על ידי כוויות (איור 1B, *** p < 0.001 לעומת קבוצת בקרה, ** p < 0.01 לעומת קבוצת כוויות).
באיור 2 מוצגים שינויים באזור ההדפסה האחורי של כף הרגל לאחר פציעת צריבה לאורך זמן. פציעת כוויות הפחיתה באופן משמעותי את אזור ההדפסה האחורית של כף הרגל מהיום שלאחר האינדוקציה ונמשכה 7 ימים. אזור ההדפסה האחורי של כף הרגל השתפר משמעותית על ידי מתן פרצטמול (200 מ"ג/ק"ג, כלומר, פעם ביום במשך 7 ימים החל מיום השריפה אינדוקציה) בהשוואה לקבוצה שטופלו ברכב (איור 2A,B, * p < 0.05 ו ** p < 0.01 לעומת קבוצת Burn).
שינויים בקורס הזמן בתנוחה אחת לאחר פציעת כוויות מוצגים באיור 3. פציעת כוויות הפחיתה את העמדה היחידה (%) של כף הרגל האחורית ipsilateral 1 יום לאחר השריפה אינדוקציה, וירידה זו נשמרה במשך 7 ימים. תנוחת כף הרגל האחורית השתפרה על ידי ניהול פרצטמול (200 מ"ג/ק"ג, כלומר, פעם ביום במשך 7 ימים החל מיום השריפה אינדוקציה) בהשוואה לקבוצה שטופלו ברכב (איור 3A,B, * p < 0.05 לעומת קבוצת Burn).
שינויים בזמן חוסר התנועה המתקבל ממבחן השחייה הכפוי מוצגים באיור 4. זמן חוסר תנועה של עכברים הנגרמים מפציעת כוויות הוגדלו 7 ימים לאחר אינדוקציה כוויות לעומת זה של קבוצת הביקורת. בעכברים הנגרמים מפציעות כוויות, ניהול פרצטמול (200 מ"ג/ק"ג, כלומר, פעם ביום במשך 7 ימים החל מיום אינדוקציה כוויות) הפחית באופן משמעותי את העלייה הנגרמת על ידי פציעת כוויות בזמן חוסר תנועה (** p < 0.01 ו *** p < 0.001 לעומת קבוצת כוויות).
התפקוד המוטורי הרגיל הוערך על סמך השינויים בזמן הריצה על מוט הרוטציה, כפי שמוצג באיור 5. זמן הריצה של העכברים הנגרמים מפציעת כוויות לא השתנה ב 7 ימים לאחר אינדוקציה כוויות לעומת זה של קבוצת הביקורת. לעומת זאת, זמן הריצה של עכברים שטופלו באלפקסלון (שליטה חיובית) הופחת באופן משמעותי במהלך כ -60 דקות. תוצאה זו מצביעה על כך שפציעת כוויות המשמשת במחקר זה אינה גורמת לפגיעה מוטורית (*** p < 0.001 לעומת קבוצת Burn).
איור 1: אלודיניה מכנית המוערכת על ידי בדיקת פון פריי בעכברים הנגרמים מפציעות כוויות. (A) סף נסיגת הכפות (PWT, g) בכף האחורית של העכברים ירד יום אחד לאחר פציעת כוויות ונמשך במשך 7 ימים בהשוואה לקבוצת הביקורת. ניהול פרצטמול (200 מ"ג/ק"ג, כלומר, פעם ביום במשך 7 ימים החל מיום אינדוקציה כוויות) הפחית באופן משמעותי את אלודיניה מכנית הנגרמת על ידי פציעת כוויות. (B) ה- PWT נותח כשטח שמתחת לעקומה (AUC). החצים מציינים את היום של מינהל התרופות. p < 0.001 לעומת קבוצת בקרה, ** p < 0.01 לעומת קבוצת Burn. אמצעים חוזרים ונשנים דו כיווני ANOVA בוצע כדי לקבוע את ההשפעות הכוללות במהלך הזמן של מבחן פון פריי. ניתוח פוסט הוק בוצע באמצעות הבדיקה של Dunnett על מנת לקבוע את ערך P. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אזור ההדפסה של כפות הרגליים שהושג מניתוח הליכה אוטומטי בעכברים הנגרמים מפציעות כוויות. (א) תמונות מייצגות של כפות הרגליים האחוריות של העכברים, הן של כפות הרגליים והן של העכברים הנגדיים, נלכדו על ידי תוכנת ניתוח ההליכה. גודל המגע של כף הרגל מופחת לאחר פציעת כוויות בהשוואה לזה של קבוצת הבקרה. ירידה זו התאוששה חלקית על ידי מתן acetaminophen (200 מ"ג/ק"ג, כלומר, פעם ביום במשך 7 ימים החל מיום אינדוקציה כוויות). מלבנים לבנים מציינים את כפות הרגליים האחוריות שניתחו על ידי התוכנה, (B) גרף מציג את שינויי מסלול הזמן באזור ההדפסה של כפות הרגליים (%). הנתונים מחושבים כאחוז מהשינויים באזור ההדפסה בין כפות הרגליים האחוריות ipsilateral (מימין) וכפות האחוריות הנגדיות (משמאל) (לדוגמה, הערך של 50% מציין את אותם אזורי הדפסת כפות רגליים בכפות האחוריות הימניות והשמאליות). החצים מציינים את היום של מינהל התרופות. * p < 0.05 ו ** p < 0.01 לעומת קבוצת Burn. אמצעים חוזרים ונשנים דו-כיווניים ANOVA בוצע כדי לקבוע את ההשפעות הכוללות במהלך הזמן של אזור ההדפסה על ניתוח ההליכה. ניתוח פוסט הוק בוצע באמצעות הבדיקה של Dunnett על מנת לקבוע את ערך P. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עמדה אחת שהתקבלה מניתוח הליכה אוטומטי בעכברים שנגרמו מפציעות כוויות. (א) תמונות מייצגות של עמדה אחת נתפסו על ידי תוכנת ניתוח ההליכה. צבעים שונים הצביעו על העמידה של כל כף רגל: כחול, כף רגל קדמית ימנית; ורוד, כף רגל אחורית ימנית; צהוב, כף רגל קדמית שמאלית; ירוק, כף רגל אחורית שמאלית. התנוחה היחידה של כף הרגל האחורית ה-IPSIlateral קוצרה לאחר פציעת כוויות. שינוי זה התאושש חלקית על ידי מתן acetaminophen (200 מ"ג/ק"ג, כלומר, פעם ביום במשך 7 ימים החל מיום אינדוקציה כוויות). (B) גרף המציג שינויים בזמן-קורס בתנוחה הבודדת (%). הנתונים מסוכמים כגרף קו לאחר חישוב אחוז השינויים בתנוחה בודדת בין כפות הרגליים האחוריות של ipsilateral (מימין) וכפות האחוריות הנגדיות (משמאל) (לדוגמה, הערך של 50% מציין את אותה עמדה בודדת בכפות האחוריות הימניות והשמאליות). החצים מציינים את היום של מינהל התרופות. * p < 0.05 לעומת קבוצת Burn. אמצעים חוזרים על עצמם דו-כיווניים ANOVA בוצע כדי לקבוע את ההשפעות הכוללות במהלך הזמן של עמדה אחת על ניתוח ההליכה. ניתוח פוסט הוק בוצע באמצעות הבדיקה של Dunnett על מנת לקבוע את ערך P. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זמן חוסר התנועה של מבחן השחייה הכפוי בעכברים הנגרמים מפציעות כוויות. זמן חוסר התנועה של העכברים הנגרמים מפציעת כוויות הוגדלו 7 ימים לאחר אינדוקציה כוויות בהשוואה לזה של קבוצת הביקורת. בעכברים הנגרמים מפציעות כוויות, ניהול פרצטמול (200 מ"ג/ק"ג, כלומר, פעם ביום במשך 7 ימים החל מיום אינדוקציה כוויות) הקלה באופן משמעותי על זמן חוסר התנועה המושרה על ידי פציעת כוויות. p < 0.001 לעומת קבוצת בקרה, ** p < 0.01 לעומת קבוצת Burn. אמצעים חוזרים בכיוון אחד ANOVA בוצע כדי לקבוע את ההשפעות הכוללות במהלך הזמן של מבחן השחייה הכפוי. ניתוח פוסט הוק בוצע באמצעות הבדיקה של Dunnett על מנת לקבוע את ערך P. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הערכת התפקוד המוטורי הרגיל בהתבסס על השינויים בזמן הריצה של בדיקת מוט הרוטציה בעכברים הנגרמים מפציעות כוויות. לא חל שינוי בזמן הריצה של העכברים הנגרמים מפציעות כוויות ב-7 ימים לאחר אינדוקציה של כוויות בהשוואה לאלו של קבוצות פציעת כוויות שטופלו באצטמול. עם זאת, זמן הריצה של עכברים שטופלו אלפקסלון (שליטה חיובית) ירד באופן משמעותי ~ 60 s. תוצאה זו מצביעה על כך שפציעת כוויות המשמשת במחקר זה אינה גורמת לפגיעה מוטורית. p < 0.001 לעומת קבוצת Burn. אמצעים חוזרים ונשנים דו-כיווניים ANOVA בוצע כדי לקבוע את ההשפעות הכוללות במהלך הזמן של בדיקת מוט רוטציה. ניתוח פוסט הוק בוצע באמצעות הבדיקה של Dunnett על מנת לקבוע את ערך P. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: שינויים בנזק לרקמות לאורך זמן לאחר אינדוקציה של כוויות. לאחר אינדוקציה שריפה רותחת, נזק משמעותי לרקמות נצפה, אשר גדל בהדרגה לאורך זמן. במחקר זה, Acetaminophen, המשמש כסם בקרה חיובית, הראה השפעה מגנה על נזקי רקמות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכווייה הלוהטת היא סוג של כווייה תרמית הנגרמת על ידי נוזלים מחוממים. זה כבר הציע כי כוויות מדרגה ראשונה או שנייה להתרחש ברוב המקרים, אבל מגע ארוך טווח עם מקורות חום יכול לגרום לכוויות מדרגה שלישית26. במחקר הנוכחי, פציעת כוויות נגרמה על ידי חשיפת הכף האחורית הימנית של עכברים לתוך מים חמים ב 65 °C (65 °F) עבור 3 s 4,26. נזק לרקמות זוהה בכף הרגל הפגועה, שמראה תסמינים נפוצים של כוויות כגון אדמומיות, קילוף העור ונפיחות (איור משלים 1)4.
מדידת אלודיניה מכנית היא שיטה נפוצה לזיהוי תגובת כאב במודלים של כאב בעלי חיים ונמדדה באמצעות חוטי פון-פריי במחקר זה. שיטת הגירוי העולה עם חוטי פון פריי משמשת לקביעת הסף המכני הנדרש כדי לגרום לתגובת גמילה בכף הרגל של בעל חיים19,20. הניסוי התחיל עם החוט עם הגירוי הנמוך ביותר. כוח הכיפוף של החוט המגיב למספר מוגדר (שלוש פעמים בפרוטוקול זה) הושג כערך סף משיכת כפה.
ניתוח הליכה של מכרסמים במהלך הליכה חופשית משמש לחקר מחלת פרקינסון או תנועות גפיים ושינויי מיקום במודלים של פגיעה חושית-מוטורית, כולל פגיעה בחוט השדרה ושבץ27,28. מערכת ניתוח ההליכה מנתחת באופן אוטומטי פרמטרי הליכה שונים, כולל עוצמת כף הרגל, הדפסת כף הרגל, שלב העמידה וכו '. שינויים בפרמטרים שמערכת ניתוח ההליכה יכולה לנתח יכולים לשמש כאינדיקטורים הקשורים לכאב בניתוח ההליכה של מודלים של חיות כאב. לכן, ניתוח ההליכה עשוי לשמש כשיטה ניסיונית לכימות לא פולשני של כאב ספונטני במודלים של בעלי חיים 4,21,22. בהתבסס על ממצאים קודמים כי פרמטרי ההליכה ירדו בצד המושרה בכאב במודלים של כאב בעלי חייםשל כאב 21,22, פרוטוקול זה הציג כימת כל פרמטר הליכה כיחס של הצד ipsilateral המושרה בכוויה ונגד. בפרוטוקול זה, אזור הדפסת כפות הרגליים ונתוני עמדה אחת הומרו לקצב השינויים בין כפות אחוריות ipsilateral (פצועות) וכפות אחוריות מנוגדות (שאינן פצועות). הערך של 50% אומר כי גודל ההדפסה כף הרגל ואת הזמן להגיע לרצפה זהים הן ipsilateral ו contralateral, בעוד הערך פחות מ 50% מציין כי פרמטרים אלה יורדים בכף האחורית ipsilateral המושרה לשרוף. השינויים באחוזים בין כפות הרגליים האחוריות ipsilateral ו contralateral שימשו להשגת כל הנתונים (כלומר, עכברים רגילים הראו ~ 50%, כלומר כי ipsilateral: יחס קונטרלטרלי היה 50:50). בבעלי חיים רגילים, הפרמטרים הקשורים לכל איבר אחורי נראים זהים משני הצדדים בעת הליכה חופשית. עם זאת, הניתוח של פרוטוקול זה מתמקד בעובדה כי הפרמטרים בצד ipsilateral להקטין לאחר אינדוקציה כאב. בנוסף, יש שונות אישית בכל בעל חיים; אין אפשרות לקבל נתונים מדויקים כאשר הנתונים הגולמיים מנותחים כפי שהם. לכן, כל ערך פרמטר הליכה הומר ליחס כדי לקבל תוצאות מדויקות יותר במהלך הניתוח. המחקר הנוכחי הראה כי גודל אזור ההדפסה וזמן העמידה הבודדת של כף הרגל האחורית ipsilateral צומצמו לאחר פגיעת כוויות, וירידה זו שוחזרה על ידי ניהול פרצטמול תוך-פריטוני חוזר ונשנה. שינויים אלה עלו בקנה אחד עם דפוס דומה של שינויי מסלול זמן בהתנהגויות כאב לאחר פציעת כוויות ומינהל סמים.
למרות שנוי במחלוקת, מבחן השחייה הכפוי הוא השיטה הנפוצה ביותר ללמוד את ההתנהגות של מכרסמים מדוכאים. בעלי החיים מנסים לברוח מהמכל המלא במים אך בסופו של דבר אינם זזים, מה שגורם לייאוש29. עם זאת, הוא טען כי חוסר תנועה קשה להעריך כמדד של דיכאון כי בדיקה זו קשורה סיבולת, כמו גם תחושות של ייאוש. כדי לתמוך בתוצאות ניסוי השחייה הכפוי, שיטות אחרות להערכת דיכאון, כגון בדיקת השעיית הזנב, בדיקת האכלה מודחקת חידושים, ובדיקת צריכת סוכרוז, עשויות להיחשב30,31. במחקר הנוכחי, זמן immobilization הוגדל לאחר פציעת כוויות, ועלייה זו שוחזרה על ידי ממשל פרצטמול.
הפרוטוקולים של מחקר זה נועדו להקים מודל של כאב חריף המלווה התנהגות דמוית דיכאון לאחר פציעת כוויות. התנהגות דמוית דיכאון במחקר זה עשויה להיות ההשפעות המשניות של פגיעה פיזית ושינויים ברגישות תרמית לאחר פציעת כוויות 15,32,33. התוצאות עשויות להצביע על כך שעכברים עם כאב חריף שנגרם לאחר פציעת כוויות הציגו התנהגות דמוית דיכאון. הוכח לשפר את תגובת הכאב וכתוצאה מכך התנהגויות כמו דיכאון על ידי תרופות שטופלו באופן ניסיוני.
מבחן מוט הרוטציה הוא מבחן ביצועים המבוסס על עומס סיבובי המוחל בדרך כלל בכפייה על מכרסמים עם פעילות אתלטית. הבדיקה מודדת פרמטרים כגון זמן ריצה וסיבולת. חלק מתכונות הבדיקה כוללות, בין היתר, את ההשפעות של תרופה ניסיונית או את מאזן הנבדקים במודל הכאב הנוירופתי, כוח האחיזה והערכת תיאום מוטורי 22,25,34. כפי שניתן לראות בתוצאות של מחקר זה, לא היה שינוי בזמן הריצה מוט רוטציה בעקבות פציעת כוויות או טיפול פרצטמול בהשוואה לזה של קבוצת הביקורת.
מחקר זה מדגים את הפיתוח של מודל בעלי חיים לחקר כאב שנגרם על ידי כוויות והתנהגות דמוית דיכאון בעכברים. בהקשר זה, מחקר זה הראה כי פציעות כוויות צורבות המושרות אלודיניה מכנית, שינויים של פרמטרי הליכה, והתנהגות דמוית דיכאון כגון זמן חוסר תנועה. מודל זה מתאים למחקר על ההיבטים השונים והתוצאות של כאבי כוויות וטיפולו וצפוי להביא מידע חשוב לתחום מחקר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי האוניברסיטה הלאומית צ'ונגנאם ומענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (NRF-2019R1A6A301093963 ו- NRF-2021R1F1A1062509).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
References
- Peck, M. D. Epidemiology of burns throughout the World. Part II: intentional burns in adults. Burns. 38 (5), 630-637 (2012).
- Tracy, L. M., Cleland, H. Pain assessment following burn injury in Australia and New Zealand: Variation in practice and its association on in-hospital outcomes. Australasian Emergency Care. 24 (1), 73-79 (2021).
- Montgomery, R. K.
- Kang, D. W., Choi, J. G. Bee venom reduces burn-induced pain via the suppression of peripheral and central substance P expression in mice. Journal of Veterinary Science. 22 (1), 9 (2021).
- Abdi, S., Zhou, Y.
- Ullrich, P. M., Askay, S. W. Pain, depression, and physical functioning following burn injury. Rehabilitation Psychology. 54 (2), 211-216 (2009).
- Patwa, S., Benson, C. A. Spinal cord motor neuron plasticity accompanies second-degree burn injury and chronic pain. Physiological Reports. 7 (23), 14288 (2019).
- Michaelides, A., Zis, P. Depression, anxiety and acute pain: links and management challenges. Postgraduate Medicine. 131 (7), 438-444 (2019).
- Doan, L., Manders, T., Wang, J. Neuroplasticity underlying the comorbidity of pain and depression. Neural Plasticity. 2015, 504691 (2015).
- Vachon-Presseau, E., Centeno, M. V. The emotional brain as a predictor and amplifier of chronic pain. Journal of Dental Research. 95 (6), 605-612 (2016).
- Apkarian, A. V., Baliki, M. N. Predicting transition to chronic pain. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 360-367 (2013).
- Yin, W., Mei, L. A Central amygdala-ventrolateral periaqueductal gray matter pathway for pain in a mouse model of depression-like behavior. Anesthesiology. 132 (5), 1175-1196 (2020).
- Deng, Y. T., Zhao, M. G., Xu, T. J. Gentiopicroside abrogates lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice through tryptophan-degrading pathway. Metabolic Brain Disease. 33 (5), 1413-1420 (2018).
- Zhang, G. F., Wang, J. Acute single dose of ketamine relieves mechanical allodynia and consequent depression-like behaviors in a rat model. Neuroscience Letters. 631, 7-12 (2016).
- Edwards, R. R., Smith, M. T. Symptoms of depression and anxiety as unique predictors of pain-related outcomes following burn injury. Annals of Behavioral Medicine. 34 (3), 313-322 (2007).
- Pincus, T., Vlaeyen, J. W. Cognitive-behavioral therapy and psychosocial factors in low back pain: directions for the future. Spine. 27 (5), 133-138 (2002).
- Laumet, G., Edralin, J. D. CD3(+) T cells are critical for the resolution of comorbid inflammatory pain and depression-like behavior. Neurobiology of Pain. 7, 100043 (2020).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Scholz, J., Broom, D. C. Blocking caspase activity prevents transsynaptic neuronal apoptosis and the loss of inhibition in lamina II of the dorsal horn after peripheral nerve injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (32), 7317-7323 (2005).
- Kang, D. W., Choi, J. G. Automated gait analysis in mice with chronic constriction injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56402 (2017).
- Kang, D. W., Moon, J. Y. Antinociceptive profile of levo-tetrahydropalmatine in acute and chronic pain mice models: Role of spinal sigma-1 receptor. Scientific Reports. 6, 37850 (2016).
- Huang, W., Chen, Z. Piperine potentiates the antidepressant-like effect of trans-resveratrol: involvement of monoaminergic system. Metabolic Brain Disease. 28 (4), 585-595 (2013).
- Can, A., Dao, D. T. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Choi, J. G., Kang, S. Y. Antinociceptive effect of Cyperi rhizoma and Corydalis tuber extracts on neuropathic pain in rats. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 16 (6), 387-392 (2012).
- Mosby's. Mosby's Dictionary of Medicine, Nursing & Health Professions - Seventh edition, Nursing Standard. 20 (22), RCN Publishing Company Ltd. 36 (2006).
- Vandeputte, C., Taymans, J. M. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Isvoranu, G., Manole, E. Gait analysis using animal models of peripheral nerve and spinal cord injuries. Biomedicines. 9 (8), 1050 (2021).
- Yankelevitch-Yahav, R., Franko, M. The forced swim test as a model of depressive-like behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52587 (2015).
- Yan, H. C., Cao, X.
- Papp, M., Willner, P. An animal model of anhedonia: attenuation of sucrose consumption and place preference conditioning by chronic unpredictable mild stress. Psychopharmacology. 104 (2), 255-259 (1991).
- Seminowicz, D. A., Laferriere, A. L. MRI structural brain changes associated with sensory and emotional function in a rat model of long-term neuropathic pain. Neuroimage. 47 (3), 1007-1014 (2009).
- Yalcin, I., Barthas, F. Emotional consequences of neuropathic pain: insight from preclinical studies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 47, 154-164 (2014).
- Choi, J. W., Kang, S. Y. Analgesic effect of electroacupuncture on paclitaxel-induced neuropathic pain via spinal opioidergic and adrenergic mechanisms in mice. American Journal of Chinese Medicine. 43 (1), 57-70 (2015).
