Summary
Este trabajo documenta un método simple para crear controles de antígenos sintéticos para la inmunohistoquímica. La técnica es adaptable a una variedad de antígenos en una amplia gama de concentraciones. Las muestras proporcionan una referencia con la que evaluar el rendimiento y la reproducibilidad intra e interensayo.
Abstract
Los ensayos de inmunohistoquímica (IHC) proporcionan información valiosa sobre los patrones de expresión de proteínas, cuya interpretación confiable requiere muestras de control positivas y negativas bien caracterizadas. Debido a que los controles apropiados de tejido o línea celular no siempre están disponibles, un método simple para crear controles sintéticos de IHC puede ser beneficioso. Tal método se describe aquí. Es adaptable a varios tipos de antígenos, incluyendo proteínas, péptidos u oligonucleótidos, en una amplia gama de concentraciones. Este protocolo explica los pasos necesarios para crear controles de antígenos sintéticos, utilizando como ejemplo un péptido del dominio intracelular (ICD) del oncogén eritroblástico humano B2 (ERBB2 / HER2) reconocido por una variedad de anticuerpos relevantes para el diagnóstico. Las diluciones seriadas del péptido HER2 ICD en solución de albúmina sérica bovina (BSA) se mezclan con formaldehído y se calientan durante 10 min a 85 °C para solidificar y reticular la mezcla de péptido/BSA. El gel resultante puede ser procesado, seccionado y teñido como un tejido, produciendo una serie de muestras de concentraciones conocidas de antígenos que abarcan una amplia gama de intensidades de tinción.
Este protocolo simple es consistente con los procedimientos rutinarios del laboratorio de histología. El método solo requiere que el usuario tenga una cantidad suficiente del antígeno deseado. Las proteínas recombinantes, los dominios proteicos o los péptidos lineales que codifican epítopos relevantes pueden sintetizarse local o comercialmente. Los laboratorios que generan anticuerpos internos pueden reservar alícuotas del antígeno inmunizante como objetivo de control sintético. La oportunidad de crear controles positivos bien definidos en una amplia gama de concentraciones permite a los usuarios evaluar el rendimiento de los ensayos intra e interlaboratorios, obtener información sobre el rango dinámico y la linealidad de sus ensayos y optimizar las condiciones de ensayo para sus objetivos experimentales particulares.
Introduction
La inmunohistoquímica (IHC) permite la detección sensible y específica y espacialmente precisa de antígenos diana en secciones de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina (FFPE). Sin embargo, los resultados de la tinción de IHC pueden verse afectados por múltiples variables, incluido el tiempo de isquemia caliente y fría, la fijación tisular, el pretratamiento tisular, la reactividad y concentración de anticuerpos, la química de detección de ensayos y los tiempos de reacción1. En consecuencia, el rendimiento reproducible y la interpretación de las reacciones de IHC requieren un control riguroso de estas variables y el uso de muestras de control positivas y negativas bien caracterizadas. Los controles de uso frecuente incluyen tejidos incrustados en parafina o líneas celulares cultivadas conocidas por análisis independientes para expresar el antígeno de interés, pero tales muestras no siempre están disponibles1. Además, los niveles de expresión de los antígenos diana en tejidos y controles de líneas celulares generalmente se entienden solo cualitativamente y pueden ser variables. Los controles que contienen concentraciones reproducibles y conocidas con precisión de antígeno objetivo pueden ayudar a optimizar las condiciones de reacción de la IHC. Los autores han descrito un método general, adaptable a una variedad de tipos de antígenos en un rango de concentraciones fisiológicamente relevante para crear muestras sintéticas de control de IHC2. Aquí se proporciona un protocolo detallado para la creación y el uso de este tipo de estándar.
Los controles adecuados son esenciales para la interpretación válida de los ensayos de IHC 1,3,4. Los tejidos, las células cultivadas y los sustratos recubiertos de péptidos se han empleado como controles de IHC de acuerdo con las necesidades específicas de los investigadores. Las ventajas y limitaciones inherentes al uso de tejidos como controles de IHC han sido ampliamente discutidas 1,4. Para muchos anticuerpos, se pueden elegir controles apropiados de tejidos normales seleccionados que contienen poblaciones celulares que expresan el antígeno objetivo en un amplio rango dinámico. Los controles tisulares son menos adecuados cuando el antígeno objetivo no está bien caracterizado en cuanto al sitio de expresión o la abundancia, o cuando los antígenos potencialmente de reacción cruzada se coexpresan en las mismas células o sitios tisulares. En estos contextos, los bloques de líneas celulares cultivadas que expresan el antígeno de interés pueden ser útiles. Para proporcionar más evidencia de la especificidad del objetivo, las líneas celulares pueden diseñarse para sobreexpresar o subexpresar los antígenos objetivo. Por ejemplo, este enfoque se utilizó recientemente para evaluar una variedad de ensayos anti-PD-L1 utilizando un microarray tisular de líneas celulares isogénicas que expresan un rango de antígenoPD-L1 5. Las limitaciones prácticas para el uso rutinario de bloques de líneas celulares incluyen el costo y el tiempo necesarios para producir un número suficiente de células y el hecho de que la expresión de algunos antígenos puede no ser confiablemente consistente, incluso dentro de las líneas celulares clonales6. Los péptidos sintéticos son una tercera opción para los controles de IHC para anticuerpos que reconocen epítopos lineales cortos. Steven Bogen y sus colegas han publicado extensamente sobre el uso de péptidos acoplados a la superficie de los portaobjetos de vidrio 7,8 y las perlas de vidrio9. Un estudio realizado por este grupo demostró que el análisis cuantitativo de los controles de IHC basados en péptidos podría detectar la variación del proceso de tinción omitida por la evaluación cualitativa de los controles tisulares analizados en paralelo10. Si bien los estándares que utilizan antígenos basados en cuentas podrían ser ampliamente aplicables, muchos detalles son propiedad de los autores, lo que limita la adopción generalizada.
Otro enfoque para los estándares de IHC incorpora antígenos objetivo en geles de proteínas creados artificialmente. Este concepto fue demostrado por primera vez por Per Brandtzaeg en 1972 en un estudio en el que el suero normal de conejo se polimerizó utilizando glutaraldehído11. Pequeños bloques del gel resultante se remojaron durante 1-4 semanas en soluciones que contenían los antígenos de inmunoglobulina de interés en varias concentraciones. Después de la fijación de alcohol y la incrustación de parafina, se demostró que las secciones de los controles resultantes se tiñen con intensidades correspondientes al logaritmo de las soluciones de antígenos en las que se habían empapado. Posteriormente, los investigadores prepararon conjugados de glutaraldehído de aminoácidos específicos en soluciones diluidas de BSA u homogeneizados cerebrales como controles positivos en estudios de microscopía inmunoelectrónica12,13. Trabajos más recientes investigaron el uso de geles hechos de soluciones proteicas fijadas con formaldehído como sustitutos para el tejido FFPE en el análisis de espectrometría de masas14. Otro trabajo reciente investigó la estructura y las propiedades de los geles formados por el calentamiento de soluciones de albúmina sérica humana o bovina a diversas concentraciones y pH15. Estos autores encontraron que la albúmina sérica forma tres tipos de geles que difieren en elasticidad mecánica, preservación de la estructura secundaria y capacidad de unión a ácidos grasos dependiendo de las condiciones experimentales. Juntos, estos documentos demuestran la viabilidad general del enfoque empleado aquí. Las soluciones proteicas de composición definida crean geles similares a los tejidos que se pueden procesar, seccionar y teñir utilizando métodos histológicos de rutina.
Este protocolo describe la formación de un control sintético de IHC hecho de albúmina sérica bovina (BSA) polimerizada con calor y formaldehído. Los geles pueden incorporar una amplia variedad de antígenos, incluyendo proteínas de longitud completa, dominios proteicos y péptidos lineales, así como antígenos no proteicos incluyendo oligonucleótidos2. Esta demostración utiliza un antígeno de ejemplo, un péptido lineal que codifica los aminoácidos C-terminal 16 de la proteína humana ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (ver Tabla de Materiales). Esta secuencia incluye los epítopos reconocidos por tres anticuerpos disponibles comercialmente y relevantes para el diagnóstico, incluidos el reactivo policlonal Herceptest (ENPEYLGLDVP) y los anticuerpos monoclonales CB11 (AENPEYL) y 4B5 (TAENPEYLGL) (ver Tabla de Materiales)16.
El método demostrado aquí emplea reactivos fácilmente disponibles utilizando procesos y técnicas familiares para cualquier laboratorio de histología practicante. La limitación más importante es la necesidad de identificar y comprar los antígenos objetivo, lo que se puede lograr en muchos casos a un costo relativamente modesto. Debido a que estos controles sintéticos son de composición totalmente definida y están hechos con métodos simples, se pueden implementar en muchos laboratorios con resultados reproducibles. Su uso puede facilitar la evaluación objetiva y cuantificable de los resultados de tinción de IHC y permitir una mayor reproducibilidad intra e interlaboratorio.
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Protocol
1. Preparación de soluciones de stock y herramientas
- Preparar 20 ml de una solución de BSA al 25% p/v mezclando 5 g de polvo de BSA en 14 ml de PBS, pH 7,2 en un tubo cónico de 50 ml hasta que se disperse uniformemente. Vórtice según sea necesario para dispersar el polvo de BSA.
- Mantenga la solución durante la noche a 4 °C para permitir la disolución completa. Ajuste el volumen final a 20 ml con PBS para hacer una solución de stock al 25% p/v.
- Preparar 20 ml de una solución de BSA al 31,3% p/v mezclando 6,26 g de polvo de BSA en 13 ml de PBS, pH 7,2 en un tubo cónico de 50 ml hasta que se disperse uniformemente. Mantenga la solución durante la noche a 4 °C para permitir la disolución completa. Ajuste el volumen final a 20 ml con PBS para hacer una solución de stock de 31.3% p/v.
- Precaliente un bloque de calor a 85 °C.
NOTA: El siguiente protocolo crea geles de péptidos/BSA con volúmenes de 1.26-1.4 mL formados en tubos de microcentrífuga de 1.5 mL. Para usar volúmenes más pequeños, por ejemplo, cuando las existencias de antígenos están limitándose, prepare los geles en tubos de PCR y use un termociclador ajustado a 85 ° C como bloque de calor. - Pruebe que la mezcla de BSA / formaldehído forma un gel como se esperaba mezclando 700 μL de solución de BSA al 25% con 700 μL de formaldehído al 37%. Mezclar bien mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5 veces dentro de 5-10 s. Evite crear burbujas de aire.
PRECAUCIÓN: El formaldehído concentrado es tóxico; usar con las precauciones de seguridad adecuadas. - Inmediatamente después de mezclar las soluciones de BSA y formaldehído, coloque el tubo de microcentrífuga cerrado en un bloque de calor a 85 °C durante 10 min. Retire el tubo del bloque de calor y deje que se enfríe. Confirme que el gel se ha formado como se esperaba.
2. Preparación y dilución de péptidos
- Obtener 5-20 mg de péptido liofilizado de la secuencia deseada.
NOTA: Los aminoácidos C-terminal 16 del dominio intracelular humano ERBB2 reconocido por 4B5 es TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.- Agregue 4 aminoácidos al N-terminal, acetil-YGSG y C-terminal, GSGC-amida para facilitar la reticulación del péptido a BSA y proporcionar espaciamiento entre la molécula de BSA y el epítopo peptídico.
NOTA: La secuencia completa es: acetil-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amida. - Si lo desea, use otras secuencias de aminoácidos N- y C-terminales para extender el epítopo peptídico central.
NOTA: El impacto de diferentes secuencias varía con diferentes combinaciones de anticuerpos/epítopos. La adición del péptido C-terminal reduce la unión de algunos anticuerpos a los epítopos C-terminales. En tales casos, omita esta secuencia. - Confirme que los péptidos de fuentes comerciales se suministran con una pureza del >95%, cuya composición se confirma mediante HPLC y análisis de espectrometría de masas.
- Agregue 4 aminoácidos al N-terminal, acetil-YGSG y C-terminal, GSGC-amida para facilitar la reticulación del péptido a BSA y proporcionar espaciamiento entre la molécula de BSA y el epítopo peptídico.
- Calcule los volúmenes necesarios para las soluciones de stock de péptidos 5x (1.25 E-2 M). Refiriéndose a la Tabla 1, columnas C-E, ingrese los valores para el peso molecular del antígeno (g / mol), el porcentaje de pureza del antígeno (0-100) y la masa del antígeno (mg).
NOTA: El volumen de disolvente (en μL) para resuspendir la muestra para lograr una solución madre de 1,25 E-2 M es de 800 x peso molecular del antígeno x porcentaje de pureza del antígeno / masa del antígeno.- Prepare y etiquete claramente ocho tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: Los tubos contendrán 5x cepas peptídicas en un disolvente, 1x cepa peptídica en un disolvente, cinco diluciones en serie 10x de 2,5 E-4 M a 2,5 E-8 M péptido/BSA/gel de formaldehído, y un gel de control negativo que contiene BSA/formaldehído sin antígeno añadido. Todas las muestras de gel se ven idénticas. Al preparar múltiples conjuntos de diluciones peptídicas a la vez, tenga cuidado de etiquetar e identificar todos los tubos y casetes de procesamiento correctamente. Use tubos de microcentrífuga codificados por colores y casetes de procesamiento siempre que sea posible para minimizar la identificación errónea.
- Prepare y etiquete claramente ocho tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Preparar una solución madre peptídica 5x a 1,25 E-2 M resuspiendo toda la masa de péptido liofilizado (20 mg para los péptidos ERBB2) en 60 μL del disolvente apropiado.
NOTA: En este ejemplo, la dimetilformamida (DMF) se agregó directamente al contenedor del proveedor.- Inspeccione la solución para asegurarse de que el péptido esté completamente disuelto. Si es necesario, añadir disolvente adicional y/o sonicar la muestra hasta que el péptido esté completamente disuelto, teniendo cuidado de no exceder el volumen calculado en la Tabla 1 para el stock de péptidos 5x.
PRECAUCIÓN: DmF es tóxico; usar con la precaución adecuada.
NOTA: Dependiendo de la secuencia de aminoácidos, y la hidrofobicidad y carga correspondientes, los péptidos pueden ser solubles en DMF, dimetilsulfóxido (DMSO), agua pura o soluciones diluidas de ácido acético, ácido fórmico o bicarbonato de amonio. Las características peptídicas se pueden calcular utilizando una variedad de herramientas en línea17. Algunos proveedores de péptidos pueden sugerir disolventes apropiados para secuencias específicas. - Añadir disolvente según sea necesario para llevar el volumen del péptido 5x al volumen final calculado en la Tabla 1. Vórtice para 5 s y centrífuga a temperatura ambiente a 5000 x g para 5 s. Las soluciones madre de péptidos se pueden almacenar a -80 °C.
- Inspeccione la solución para asegurarse de que el péptido esté completamente disuelto. Si es necesario, añadir disolvente adicional y/o sonicar la muestra hasta que el péptido esté completamente disuelto, teniendo cuidado de no exceder el volumen calculado en la Tabla 1 para el stock de péptidos 5x.
- Refiriéndose a la Tabla 2, Columna C, preparar 150 μL de 1 solución madre peptídica 1x (2,5 E-3 M) diluyendo 30 μL de la cepa peptídica 5x en 120 μL de disolvente (DMF este ejemplo). Vórtice para 5 s y centrífuga a temperatura ambiente a 5000 x g para 5 s.
- Refiriéndose a la Tabla 2, Columna D, preparar 700 μL de 5 péptidos E-4 M/solución de BSA (Dilución 1) diluyendo 140 μL de 1x cepa de péptidos en 560 μL de 31,3% BSA/PBS, pH 7,2. Vórtice para 5 s y centrífuga a temperatura ambiente a 5000 x g para 5 s.
NOTA: La concentración final de BSA de esta solución es del 25% (p/v). - Refiriéndose a la Tabla 2, Columnas E-H, preparar cuatro diluciones sucesivas en serie 10x del 5 péptido E-4 M/cepa de BSA añadiendo 70 μL de solución peptídica/BSA a 630 μL de 25% BSA/PBS, pH 7.2. Vórtice para 5 s y centrífuga a temperatura ambiente a 5000 x g para 5 s.
NOTA: Después de este paso, habrá cinco diluciones seriadas de 10 veces de péptido (5 E-4 M a 5 E-8 M) en 25% BSA / PBS, pH 7.2. Las primeras cuatro muestras contendrán 630 μL. La última muestra contendrá 700 μL. - Refiriéndose a la Tabla 2, Columna I, preparar una muestra de BSA de control negativo que contenga 700 μL de BSA/PBS al 25%, pH 7.2 (Figura 1A).
3. Preparación de geles de péptidos BSA
- Confirme que el bloque de calor o el termociclador son estables a 85 °C.
- Consulte la Tabla 3, Columnas B a E. Trabajando una muestra a la vez, agregue a la primera muestra de BSA / péptido al 25% (Dilución 1) 630 μL de formaldehído al 37%. Mezclar bien mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5 veces dentro de 5-10 s. Evite crear burbujas de aire.
PRECAUCIÓN: El formaldehído concentrado es tóxico; usar con las precauciones de seguridad adecuadas.- Después de mezclar las soluciones de péptido/BSA y formaldehído, coloque el tubo de microcentrífuga cerrado en un bloque de calor a 85 °C durante 10 min.
NOTA: Mezcle bien la solución de péptido BSA y el formaldehído, pero no pase más de 10 s pipeteando la mezcla antes de colocar la muestra en calor. Dado que la reticulación de formaldehído comienza inmediatamente, el gel puede formarse de manera diferente si el procedimiento varía para diferentes muestras. La concentración final de BSA en estos geles es del 12,5% (p/v). Las concentraciones finales de BSA inferiores al 10% pueden producir geles que no se solidifican; Las concentraciones finales de BSA superiores al 16% pueden producir geles más frágiles y difíciles de sesionar después del procesamiento. - Repita los pasos 3.2 y 3.2.1 para cada una de las diluciones 2-4.
- Repita los pasos 3.2 y 3.2.1 para la dilución 5, pero agregue 700 μL de formaldehído al 37%, un volumen igual a los 700 μL de solución de antígeno BSA.
- Consulte la columna G de la columna de la Tabla 3 ; repita los pasos 3.2 y 3.2.1 para la muestra de control negativo, añadiendo 700 μL de formaldehído al 37%, un volumen igual a los 700 μL de solución de BSA de control negativo.
- Después de mezclar las soluciones de péptido/BSA y formaldehído, coloque el tubo de microcentrífuga cerrado en un bloque de calor a 85 °C durante 10 min.
- Retire los tubos del bloque de calor después de 10-12 min. El tiempo de calentamiento debe ser lo más consistente posible para cada muestra. Deje que los geles se enfríen en la mesa de trabajo durante 5-10 min (Figura 1B).
- Usando una espátula de laboratorio desechable limpia y flexible, retire la muestra de gel en una pieza del tubo de la microcentrífuga y colóquela en un recipiente sellado que contenga al menos 15 ml de formalina tamponada neutra (NBF), utilizando un recipiente separado de NBF para cada muestra.
- Alternativamente, corte la parte inferior del tubo de la microcentrífuga con una nueva cuchilla de afeitar de un solo borde y empuje el gel desde el fondo con aire o una sonda adecuada (Figura 1C-G).
NOTA: Los geles solidificados de formaldehído/BSA pueden permanecer en los tubos de la microcentrífuga a temperatura ambiente hasta 24 h. Dejar los geles en el tubo de la microcentrífuga durante más de 24 h puede hacer que se vuelvan quebradizos y más difíciles de procesar y sesionar.
- Alternativamente, corte la parte inferior del tubo de la microcentrífuga con una nueva cuchilla de afeitar de un solo borde y empuje el gel desde el fondo con aire o una sonda adecuada (Figura 1C-G).
4. Recorte, procesamiento e incrustación de geles BSA
- Recorte el cono de gel en discos cilíndricos de aproximadamente 5 mm de espesor con una maquinilla de afeitar limpia de un solo borde (Figura 1H, I). Envuelva los discos en una envoltura de biopsia, colocando un disco de gel más grande en un cassette (que se utilizará en el estudio piloto en el paso 5), y los discos de gel restantes juntos en un segundo cassette (Figura 2A, E) para su uso en la construcción de microarrays de tejido (TMA) en el paso 6. Coloque los discos de gel envueltos en casetes de procesamiento de tejidos claramente etiquetados.
- Coloque los geles caseteados en al menos 15 ml de NBF al 10% por muestra de gel antes del procesamiento, utilizando un recipiente separado de NBF para cada muestra. Los geles pueden permanecer en 10% NBF durante 6-48 h.
- Procese los geles en un procesador de tejidos histológicos automatizado, siguiendo un gran programa de tejidos con presión y vacío. Cada paso dura 1 h: 10% NBF, 70% etanol, 95% etanol (repetir dos veces), 100% etanol (repetir dos veces), xilenos (repetir tres veces), parafina a 60 °C (repetir tres veces).
NOTA: Para los investigadores que eligen procesar muestras manualmente, siga la misma secuencia de reactivos y tiempos. - Cuando se complete el procesamiento de la muestra, retire los casetes del procesador de tejidos y muévalos al centro de incrustación de parafina.
- Desenvuelva los geles de la envoltura de la biopsia e incruste los geles en parafina. Para cada muestra, incruste un disco de gel en un molde pequeño de 15 mm x 15 mm (Figura 2B-D), y los discos de gel restantes juntos en un segundo molde más grande (Figura 2F-H). El primer bloque con una muestra se utilizará para probar el gel peptídico en un estudio piloto. El segundo bloque se puede utilizar para la construcción de TMA.
5. Evaluación piloto de la serie de dilución peptídica
- Para cada serie de dilución de péptidos, planee crear dos portaobjetos de vidrio que contengan un total de 6 secciones separadas: una sección de cada una de las cinco muestras de la serie de dilución, más una sección de la muestra de control negativo solo para BSA.
- En el primer portaobjetos de vidrio, corte una sección de 4 μm de espesor de cada uno de los bloques más pequeños que contienen un disco de gel con las tres concentraciones más altas de péptidos (2.5 E-4 M a 2.5 E-6 M).
- En una segunda diapositiva, corte una sección de 4 μm de espesor de cada bloque con las dos concentraciones de péptidos más bajas (2.5 E-7 M y 2.5 E-8 M) y una sección del bloque de control solo BSA. Registre el orden de las muestras en las diapositivas.
NOTA: Espere que los geles incrustados en parafina se corten suavemente, produciendo secciones uniformes sin fragmentación, desgarro o artefacto parlanchín. Si las muestras particulares de gel incrustado en parafina son difíciles de seccionar, remoje brevemente la cara del bloque en agua destilada helada antes de seccionar. Si es necesario, experimente con diferentes tiempos de remojo o con diferentes soluciones (por ejemplo, agua de amoníaco). - Después de la sección, seque los toboganes a temperatura ambiente (aproximadamente 23 ° C) durante 24 h seguido de 60 ° C durante 30 min.
- Manche las dos diapositivas preparadas para cada péptido con el anticuerpo deseado de acuerdo con los protocolos estándar de IHC.
NOTA: La concentración primaria de anticuerpos en el portaobjetos utilizada para el monoclonal de conejo 4B5 en esta demostración fue de 1,5 ug/ml.- Espere ver una señal relativamente uniforme dentro de cada sección de gel, con las diferentes muestras de gel mostrando un rango de intensidad de señal correspondiente a las diluciones peptídicas.
- Si los resultados del estudio piloto son satisfactorios, construya un TMA a partir de los bloques donantes de gel que contengan diferentes concentraciones de antígeno peptídico, como se describe en los siguientes pasos del protocolo.
6. Construcción de BSA gel TMA
- Construir un microarray tisular que contenga núcleos duplicados de 1 mm de diámetro a partir de bloques de donantes que contengan gel BSA solo y geles BSA que contengan las cinco diluciones del péptido ERBB2.
NOTA: Si lo desea, incluya geles BSA que contengan las mismas cinco diluciones de un péptido no objetivo como controles negativos adicionales. Si lo desea, incluya núcleos de líneas celulares representativas que expresan ERBB2 como controles positivos. - Cortar secciones de 4 μm de espesor de la TMA y teñir con 1,5 ug/mL de anti-ERBB2/HER2/neu monoclonal de conejo 4B5 (ver Tabla de Materiales) según protocolos estándar de laboratorio.
- Evaluar la intensidad de la mancha resultante cualitativamente mediante inspección o cuantitativamente mediante escaneo y análisis de imágenes digitales (Figura 3A, B).
NOTA: Como el análisis de imágenes digitales no es el enfoque de este protocolo, estos pasos se dejan para que el lector los realice de acuerdo con sus preferencias.
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Representative Results
Los péptidos deben disolverse completamente en un disolvente apropiado a temperatura ambiente para formar una solución ópticamente transparente. Si el material particulado visible todavía está presente después de 30-60 min, puede ser útil agregar volúmenes adicionales del disolvente original o un disolvente alternativo que no exceda el volumen previsto de la solución de 5x péptido calculada en la Tabla 1. Del mismo modo, la solución combinada de péptido/BSA debe permanecer translúcida (Figura 1A).
Las muestras de gel peptídico/BSA deben formar una masa gomosa opaca después del calentamiento con formaldehído al 37% (Figura 1B-I). La fracturación menor de las muestras de gel puede ocurrir durante la extracción de los tubos de la microcentrífuga (Figura 3A). Estos no deben interferir con los pasos posteriores. Las muestras de gel incrustadas en parafina deben seccionarse suavemente sin rasgar ni parlotear. Los geles que muestran desgarros irregulares (Figura 3B) pueden beneficiarse de un bloqueo menos agresivo y /o un breve remojo en agua helada o agua de amoníaco. Las áreas de señal reducida de forma variable en un patrón de marca de agua pueden ocurrir cuando la distribución de uno o más reactivos de tinción es desigual (Figura 3C). La señal macroscópica aumentada focalmente se puede ver si hay atrapamiento de reactivos debajo de las secciones de gel en cualquier etapa del proceso de tinción (Figura 3C). El uso de portaobjetos de vidrio cargados positivamente y el secado cuidadoso de los portaobjetos después de la sección pueden reducir este artefacto. Las áreas microscópicas de la señal reducida pueden ocurrir si hay una distribución desigual del antígeno en la matriz del gel o si la variación en la estructura local del gel limita la interacción anticuerpo-antígeno (Figura 3D). La disolución incompleta del péptido puede dar lugar a áreas dispersas de señal focalmente intensa en un fondo de baja intensidad (Figura 3E).
Después de reaccionar con un anticuerpo apropiado, las muestras de gel solo BSA de control negativo deben mostrar una señal mínima (Figura 4A), óptimamente inferior al 2%-3% del rango de ensayo dinámico. En muy raras ocasiones, puede haber una interacción significativa de anticuerpos con el material de gel BSA que carece de antígeno que no se puede eliminar al cambiar las condiciones de reacción. La intensidad de la señal en una muestra de gel individual debe ser relativamente uniforme, con una señal creciente en muestras con concentraciones crecientes de antígenos (Figura 4A, B). La intensidad absoluta de la señal variará dependiendo de la combinación de antígeno-anticuerpo y las condiciones utilizadas para la tinción IHC. Dependiendo de las condiciones de tinción, puede haber una concentración umbral de antígenos por debajo de la cual la señal estará en segundo plano y una concentración de antígeno por encima de la cual la señal se saturará. En algunos ensayos, la señal sobre el fondo puede ser visible en muestras con tan solo 2,5 péptidos E-8 M2. En las tiradas de tinción replicadas, la intensidad de la señal para las secciones cortadas de cada muestra de gel debe ser reproducible de una carrera a otra. En esta aplicación de anticuerpos anti-HER2, los controles de línea celular MDA-175 y SK-BR-3 ampliamente utilizados se tiñeron en el mismo experimento para compararlos con los controles de péptidos. Las líneas celulares muestran la distribución esperada y la intensidad de la señal: >10% de las células MDA-175 (HER2 1+) muestran desmayos (Figura 4C, D), tinción membranosa incompletamente circunferencial, y el >10% de las células SK-BR-3 (HER2 3+) (Figura 4E, F) muestran una intensa tinción membranosa completamente circunferencial.
Las posibles razones de la ausencia de señal incluyen: (1) la secuencia peptídica no es un objetivo funcional para el anticuerpo; (2) el protocolo de tinción no está optimizado para detectar las concentraciones de antígenos presentes en los geles; (3) se tiñó la muestra de péptido incorrecta; (4) error de reactivo o instrumento. Las posibles razones de la señal en muestras donde no se espera incluyen la reactividad inespecífica de anticuerpos primarios o reactivos de detección con el gel BSA o muestras de péptidos que se etiquetaron erróneamente durante la preparación.
Figura 1: Preparación en gel de péptido-BSA. (A) 25% (p/v) BSA (sin péptido añadido) en PBS, pH 7.2. (B) Gel formado mezclando volúmenes iguales de 25% de BSA y 37% de solución de formaldehído y calentando a 85 °C durante 10 min. (C-G) Después de enfriar a temperatura ambiente durante 5-10 min, el gel BSA se puede quitar del tubo de la microcentrífuga utilizando una espátula desechable flexible. (H-I) El gel intacto se corta en discos de ~ 5 mm de espesor en preparación para el procesamiento y la incrustación. Las barras de escala son de 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación de muestras de gel BSA para su procesamiento e incrustación. (A-D) Preparación de un bloque de parafina que contiene un solo disco de gel BSA. (A) El gel de antígeno BSA se envuelve en tejido de biopsia antes del procesamiento. (B) Después de la infiltración de parafina, el disco de gel ahora translúcido se coloca en el centro de incrustación calentado y desenvuelve. (C) El disco de gel simple se coloca en un molde de incrustación de 15 mm x 15 mm que contiene parafina líquida. (D) El bloque de parafina completado está listo para la seccionamiento. (E-H) Preparación de un bloque de parafina que contiene múltiples discos de gel BSA. En cuanto a las Figuras A-D anteriores, las muestras de gel restantes se procesan e incrustan en un bloque para proporcionar material para la construcción de TMA. Las barras de escala son de 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación en gel y artefactos de tinción. (A) Los núcleos pueden mostrar fracturas menores introducidas durante los pasos de procesamiento y/o incrustación; el oscurecimiento focal puede reflejar el atrapamiento del reactivo debajo de la sección. (B) El desprendimiento del material de gel (visto en las secciones manchadas como vacíos irregulares) puede resultar de remojar demasiado o menos el bloque antes de la sección. (C) Los patrones irregulares de tinción de marcas de agua pueden ser causados por una distribución desigual del reactivo en uno o más pasos de tinción. (D) Se puede observar un patrón microscópico de la estructura del péptido BSA, particularmente a concentraciones más altas de péptidos. (E) La disolución incompleta del péptido puede producir un patrón de cielo estrellado con una señal focal en un fondo de baja intensidad. Las barras de escala son de 200 μm (A-C) o 20 μm (D,E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: TMA del péptido ERBB2/HER2 teñido con líneas celulares ERBB2/HER2 1+ y 3+. (A) Replicar núcleos TMA (filas superior e inferior) que no contienen péptido (columna izquierda) o péptido ERBB2 en concentraciones que van desde 2.5 E-8 M a 2.5 E-4 M se tiñeron con anti-HER2 / neu clon 4B5 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los núcleos con concentraciones crecientes de péptidos muestran un aumento gradual en la señal. (B) Los núcleos TMA que se muestran en el panel A se escanearon digitalmente, y se traza la intensidad promedio de píxeles [0.01 x (100 - % transmitancia) x 255] frente a la concentración de péptidos. (C-F) Los controles positivos de líneas celulares que contenían las líneas celulares que expresan ERBB2/HER2 MDA-175 (HER2 1+, C,D) y SK-BR-3 (HER2 3+, E,F) se incluyeron en el TMA que contenía los geles de péptidos BSA para que la intensidad de la señal en las líneas celulares y los geles de péptidos BSA pudieran compararse en la misma diapositiva. Las barras de escala son de 500 μm (A), 250 μm (C, E) y 20 μm (D, F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Un | B | C | D | E | F | G | H | |||
| Nombre del péptido | Secuencia peptídica | MW (Da) | Pureza del péptido (%) | Masa peptídica proporcionada (mg) | Moles de péptido en muestra (incluye corrección de pureza) | Volumen (microlitros) de disolvente en el que resuspendir el péptido para obtener 1,25 e-2 M de stock | Solvente | |||
| ERBB2 / HER2 | Ac YGSGTPTAENP EYLGLDVPVGSGC amida |
2424.6 | 95.0 | 20.0 | 7.84E-06 | 626.9 | DMF | |||
Tabla 1: Cálculos para la preparación de stock de péptidos.
| Un | B | C | D | E | F | G | H | Yo |
| Tubo | 5x Stock de péptidos | 1x Stock de péptidos | Dilución 1 | Dilución 2 | Dilución 3 | Dilución 4 | Dilución 5 | Contro l negativo |
| [Péptido] stock (M) | 1.25*10-2 | 2.5*10-3 | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | Ninguno |
| Solución peptídica (en disolvente) |
>30 uL | 30 uL desde 5x (1,25E-2 M) stock de péptidos |
140 uL desde 1x (2,5E-3 M) stock de péptidos |
70 uL desde Dilución 1 |
70 uL desde Dilución 2 |
70 uL desde Dilución 3 |
70 uL desde Dilución 4 |
Ninguno |
| Volumen de disolvente | 120 uL | |||||||
| Péptido final volumen de existencias |
150 uL | |||||||
| 31.3% BSA / PBS volumen |
560 uL 31,3% BSA |
|||||||
| 25% BSA / PBS volumen |
630 uL 25% BSA |
630 uL 25% BSA |
630 uL 25% BSA |
630 uL 25% BSA |
700 uL 25% BSA |
|||
| Volumen de péptido diluido en BSA | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL |
Tabla 2: Cálculos para la preparación de diluciones de péptidos BSA.
| Un | B | C | D | E | F | G |
| Tubo | Dilución 1 | Dilución 2 | Dilución 3 | Dilución 4 | Dilución 5 | Control negativo |
| Volumen restante del péptido en BSA diluida | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 700 uL | 700 uL |
| [Péptido] (M) en BSA diluida | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | Ninguno |
| Volumen de 37% de formaldehído para agregar | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 700 uL | 700 uL |
| Final [Péptido] (M) en gel |
2.5*10-4 | 2.5*10-5 | 2.5*10-6 | 2.5*10-7 | 2.5*10-8 | Ninguno |
Tabla 3: Cálculos para la preparación de geles de BSA-formaldehído.
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Discussion
Este método permite al usuario crear muestras uniformes de composición conocida y concentración de antígenos como estándares en las reacciones de IHC, utilizando materiales y técnicas familiares para la mayoría de los laboratorios de histología. El paso más crucial es identificar el epítopo al que se une el anticuerpo de interés. Este protocolo describe el uso de un antígeno peptídico lineal del ICD ERBB2/HER2. El mismo protocolo se puede utilizar para formar geles BSA que contienen oligonucleótidos, etiquetas fluorescentes, dominios de proteínas o proteínas de longitud completa. Este último enfoque puede ser útil para los anticuerpos que se unen a epítopos conformacionales que no son recreados por una sola secuencia peptídica lineal. Por ejemplo, los estándares de gel BSA que contienen 0,1 mg / ml de IgG ingenua de ratones, ratas y conejos pueden usarse como controles de proceso para confirmar que los pasos secundarios de detección y tinción han funcionado como se esperaba.
El método de gel antígeno-BSA descrito aquí complementa otras técnicas para controlar y estandarizar las reacciones de IHC. Las líneas celulares y las muestras de tejido con niveles de expresión bien caracterizados de antígenos diana han sido esenciales para los protocolos IHC bien controlados 1,3,4. Los péptidos acoplados a la superficie de los portaobjetos de vidrio y las perlas de vidrio se han propuesto como controles cuantitativos 7,8,9. Cada uno de los métodos potenciales tiene ventajas y limitaciones superpuestas. Los geles de antígeno BSA tienen varias ventajas. Son fáciles de hacer y adaptables a diversas composiciones y concentraciones de antígenos. Reproducen parte de la arquitectura tridimensional de las muestras de tejido mientras controlan la heterogeneidad inherente que se encuentra en las muestras biológicas. Debido a que los geles de antígenos sintéticos se pueden hacer con concentraciones de antígenos seleccionables por el usuario que se extienden desde debajo del límite de detección hasta las concentraciones más altas encontradas en muestras biológicas (~ 10-4 M)2, ofrecen oportunidades para calibrar y estandarizar ensayos realizados con técnicas modernas, por ejemplo, AQUA18 y espectrometría de masas por imágenes19 , cuyo rango dinámico supera con creces la IHC cromogénica tradicional. Además, el método permite controles que incorporan más de un antígeno, que se puede utilizar en el desarrollo y estandarización de ensayos multiplex.
Si bien el método requiere que el usuario conozca los epítopos de los anticuerpos de interés, muchos anticuerpos se unen a epítopos lineales bien documentados. Las técnicas de mapeo de epítopos 20,21,22 a menudo pueden identificar epítopos lineales indefinidos, y los péptidos sintéticos, incluidos los epítopos lineales conocidos, se pueden comprar a un costo modesto. Otros anticuerpos se unen a epítopos conformacionales que no son reproducidos por péptidos lineales, sino que se conservan en proteínas enteras o dominios proteicos. Para algunos de estos anticuerpos, las formas recombinantes de los antígenos diana están disponibles comercialmente.
Para crear muestras de control con una uniformidad y reproducibilidad óptimas, el péptido u otro antígeno objetivo debe disolverse completamente y diluirse cuidadosamente en soluciones BSA. También es esencial que se produzca una mezcla eficiente y rápida de la solución BSA/péptido con formaldehído al 37% antes de que la muestra comience a gelificarse, y que la muestra mezclada se coloque rápidamente a 85 °C durante 10 min. Para evitar la fijación excesiva y el procesamiento de artefactos, los geles deben tomarse a través del procesamiento y la incrustación de parafina de acuerdo con el cronograma recomendado.
Las variaciones en el método descrito aquí pueden ser útiles en contextos específicos. Por ejemplo, se pueden utilizar secuencias alternativas de péptidos N y C-terminales para optimizar la detección de péptidos unidos a BSA2. Debe anticiparse que los anticuerpos que reconocen epítopos del extremo C-termini de las proteínas pueden ser sensibles de manera variable a las modificaciones C-terminales de la secuencia nativa. Las muestras de gel peptídico-BSA también pueden formarse calentando a 85 °C durante 10 min sin fijador, y luego prepararse como bloques congelados o posfijados con una variedad de productos químicos2. Además, la conjugación peptídica se puede lograr con química maleimida u otros métodos que los descritos aquí.
Las muestras biológicas como las líneas celulares y los tejidos tienen la ventaja como controles de representar la complejidad de las muchas variables que se encuentran solo en la vida. Por otro lado, debido a que los estándares de tejidos y células son internamente heterogéneos y variables de una muestra a otra, la interpretación de la tinción variable de una carrera a otra es confusa. Además, las concentraciones de antígenos en tejidos y células a menudo se conocen solo cualitativamente, aunque, con el uso creciente de la espectrometría de masas cuantitativa, las concentraciones absolutas de proteínas se informan con mayor frecuencia23. Los controles de antígenos BSA descritos aquí eliminan intencionalmente el contexto espacial y biológico de las proteínas en células y tejidos. Por esta razón, la correlación entre la intensidad de la señal IHC y la concentración de antígenos encontrada en estos controles puede reproducirse imperfectamente de la observada en los tejidos. Los controles sintéticos descritos aquí pueden ser útiles para optimizar y estandarizar algunos aspectos del rendimiento del ensayo IHC. Aún así, no impiden la necesidad del uso adecuado de otras muestras de control. Por ejemplo, la posible tinción inespecífica en un tejido objetivo solo puede evaluarse mediante el uso paralelo de una muestra de control de tejido negativo. Además, los controles de gel de antígeno BSA no reproducen variables preanalíticas específicas del tejido, incluido el tiempo de isquemia caliente y fría, la proteólisis o las condiciones de fijación y procesamiento que pueden afectar el rendimiento de la IHC. En consecuencia, y como se ha discutido en otra parte con más detalle 1,3,4, los investigadores deben hacer un uso cuidadoso de los estándares celulares y tisulares para caracterizar con precisión el rendimiento del sistema IHC.
Los controles de antígenos BSA se pueden utilizar para desarrollar u optimizar protocolos de tinción y servir como muestras de referencia intra e interlaboratorio al evaluar la reproducibilidad de los protocolos establecidos. El acceso a muestras estándar bien definidas debe permitir a los usuarios caracterizar más rigurosamente el comportamiento de reacción de la IHC, identificar la variación en el rendimiento de tinción y optimizar las condiciones de reacción para lograr objetivos específicos.
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Disclosures
Charles A. Havnar, Kathy J. Hötzel, Charles A. Jones, Carmina M. Espiritu, Linda K. Rangell y Franklin V. Peale son empleados y accionistas de Genentech y Roche. Sus afiliados producen reactivos e instrumentos utilizados en este estudio.
Acknowledgments
Los autores agradecen a sus colegas Jeffrey Tom y Aimin Song por la síntesis de péptidos, Nianfeng Ge por la construcción de TMA, Shari Lau por la tinción de IHC, Melissa Edick por el escaneo microscópico digital y Hai Ngu por la cuantificación digital de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
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