Summary
يوثق هذا العمل طريقة بسيطة لإنشاء ضوابط مستضدات اصطناعية للكيمياء النسيجية المناعية. هذه التقنية قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من المستضدات في مجموعة واسعة من التركيزات. وتوفر العينات مرجعا لتقييم الأداء وقابلية التكرار داخل وبين المقايسة.
Abstract
توفر اختبارات الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) رؤى قيمة حول أنماط التعبير عن البروتين ، والتي يتطلب تفسيرها الموثوق به عينات تحكم إيجابية وسلبية مميزة بشكل جيد. نظرا لأن عناصر التحكم المناسبة في الأنسجة أو خطوط الخلايا ليست متوفرة دائما، فقد تكون هناك طريقة بسيطة لإنشاء عناصر تحكم اصطناعية في المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مفيدة. يتم وصف هذه الطريقة هنا. وهو قابل للتكيف مع أنواع المستضدات المختلفة ، بما في ذلك البروتينات أو الببتيدات أو oligonucleotides ، في مجموعة واسعة من التركيزات. يشرح هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لإنشاء ضوابط مستضدات اصطناعية ، باستخدام كمثال على ذلك الببتيد من المجال الورمي البشري B2 (ERBB2 / HER2) داخل الخلايا (ICD) المعترف به من قبل مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة ذات الصلة تشخيصيا. يتم خلط التخفيفات التسلسلية لببتيد HER2 ICD في محلول ألبومين مصل البقر (BSA) مع الفورمالديهايد وتسخينه لمدة 10 دقائق عند 85 درجة مئوية لتصلب وربط خليط الببتيد / BSA. يمكن معالجة الجل الناتج وتقسيمه وتلوينه مثل الأنسجة ، مما ينتج عنه سلسلة من العينات من تركيزات المستضدات المعروفة التي تغطي مجموعة واسعة من شدة التلطيخ.
يتوافق هذا البروتوكول البسيط مع إجراءات مختبر الأنسجة الروتينية. تتطلب الطريقة فقط أن يكون لدى المستخدم كمية كافية من المستضد المطلوب. يمكن تصنيع البروتينات المؤتلفة أو مجالات البروتين أو الببتيدات الخطية التي تشفر الظواهر ذات الصلة محليا أو تجاريا. يمكن للمختبرات التي تولد أجساما مضادة داخلية أن تحتفظ بحصص من مستضد التحصين كهدف للتحكم الاصطناعي. تتيح فرصة إنشاء ضوابط إيجابية محددة جيدا عبر مجموعة واسعة من التركيزات للمستخدمين تقييم أداء الفحص داخل المختبر وفيما بينه ، واكتساب نظرة ثاقبة على النطاق الديناميكي والخطية لمقايساتهم ، وتحسين ظروف الفحص لأهدافهم التجريبية الخاصة.
Introduction
تسمح الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) بالكشف الحساس والمحدد والدقيق مكانيا عن المستضدات المستهدفة في أقسام الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين (FFPE). ومع ذلك ، قد تتأثر نتائج تلطيخ IHC بمتغيرات متعددة ، بما في ذلك وقت نقص التروية الدافئ والبارد ، وتثبيت الأنسجة ، والمعالجة المسبقة للأنسجة ، وتفاعل الأجسام المضادة وتركيزها ، وكيمياء الكشف عن المقايسة ، وأوقات التفاعل1. وبناء على ذلك، يتطلب الأداء والتفسير القابلان للتكرار لتفاعلات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية رقابة صارمة على هذه المتغيرات واستخدام عينات تحكم إيجابية وسلبية مميزة بشكل جيد. تشمل عناصر التحكم المستخدمة بشكل متكرر الأنسجة المضمنة في البارافين أو خطوط الخلايا المستزرعة المعروفة من التحليلات المستقلة للتعبير عن المستضد المثير للاهتمام ، ولكن هذه العينات ليست متاحة دائما1. علاوة على ذلك ، فإن مستويات التعبير عن المستضدات المستهدفة في الأنسجة وضوابط خط الخلية مفهومة بشكل عام نوعيا فقط وقد تكون متغيرة. يمكن أن تساعد الضوابط التي تحتوي على تركيزات قابلة للتكرار ومعروفة بدقة من المستضد المستهدف في تحسين ظروف تفاعل المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. وقد وصف المؤلفون2 طريقة عامة قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من أنواع المستضدات في مجموعة من التركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لإنشاء عينات تحكم اصطناعية من المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. يتم توفير بروتوكول مفصل هنا لإنشاء واستخدام هذا النوع من المعايير.
الضوابط المناسبة ضرورية للتفسير الصحيح لمقايسات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية1،3،4. تم استخدام الأنسجة والخلايا المستزرعة والركائز المغلفة بالببتيد كضوابط تابعة للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية وفقا للاحتياجات المحددة للمحققين. وقد نوقشت على نطاق واسع المزايا والقيود الكامنة في استخدام الأنسجة كضوابط المدينة العالمية للخدمات الإنسانية 1,4. بالنسبة للعديد من الأجسام المضادة، يمكن اختيار الضوابط المناسبة من أنسجة طبيعية مختارة تحتوي على مجموعات خلايا تعبر عن المستضد المستهدف على نطاق ديناميكي واسع. تكون ضوابط الأنسجة أقل ملاءمة عندما لا يكون المستضد المستهدف مميزا بشكل جيد فيما يتعلق بموقع التعبير أو وفرته ، أو عندما يتم التعبير عن المستضدات التي يحتمل أن تكون متقاطعة التفاعل في نفس الخلايا أو مواقع الأنسجة. في هذه السياقات ، يمكن أن تكون كتل خطوط الخلايا المستزرعة التي تعبر عن مستضد الاهتمام مفيدة. لتوفير مزيد من الأدلة على خصوصية الهدف ، يمكن تصميم خطوط الخلايا على مستضدات الهدف الزائدة أو الناقصة. على سبيل المثال ، تم استخدام هذا النهج مؤخرا لتقييم مجموعة متنوعة من الفحوصات المضادة ل PD-L1 باستخدام مصفوفة دقيقة من الأنسجة من خطوط الخلايا متساوية المنشأ التي تعبر عن مجموعة من مستضد PD-L15. تشمل القيود العملية على الاستخدام الروتيني لكتل خطوط الخلايا التكلفة والوقت اللازمين لإنتاج أعداد كافية من الخلايا وحقيقة أن التعبير عن بعض المستضدات قد لا يكون متسقا بشكل موثوق ، حتى داخل خطوط الخلايا النسيلة6. الببتيدات الاصطناعية هي خيار ثالث لضوابط IHC للأجسام المضادة التي تتعرف على الظواهر الخطية القصيرة. نشر ستيفن بوجين وزملاؤه على نطاق واسع حول استخدام الببتيدات إلى جانب سطح الشرائح الزجاجية 7,8 والخرز الزجاجي9. أظهرت إحدى الدراسات التي أجرتها هذه المجموعة أن التحليل الكمي لضوابط المدينة العالمية للخدمات الإنسانية القائمة على الببتيد يمكن أن يكشف عن تباين عملية التلطيخ الذي غاب عنه التقييم النوعي لضوابط الأنسجة التي تم تحليلها بالتوازيمع 10. في حين أن المعايير التي تستخدم المستضدات القائمة على الخرز يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع ، فإن العديد من التفاصيل مملوكة للمؤلفين ، مما يحد من التبني على نطاق واسع.
وهناك نهج آخر لمعايير المدينة العالمية للخدمات الإنسانية يدمج المستضدات المستهدفة في المواد الهلامية البروتينية المصطنعة. تم إثبات هذا المفهوم لأول مرة من قبل بير براندتزايج في عام 1972 في دراسة تم فيها بلمرة مصل الأرانب الطبيعي باستخدام الجلوتارالدهيد11. ثم تم نقع كتل صغيرة من الجل الناتج لمدة 1-4 أسابيع في محاليل تحتوي على مستضدات الغلوبولين المناعي ذات الأهمية بتركيزات مختلفة. بعد تثبيت الكحول وتضمين البارافين ، تبين أن أجزاء من عناصر التحكم الناتجة تلطخ بكثافة تتوافق مع لوغاريتم محاليل المستضدات التي تم نقعها فيها. في وقت لاحق ، أعد الباحثون اقترانات glutaraldehyde من الأحماض الأمينية المحددة في المحاليل المخففة BSA أو متجانسة الدماغ كضوابط إيجابية في دراسات المجهر الإلكتروني المناعي12,13. بحث عمل أحدث في استخدام المواد الهلامية المصنوعة من محاليل البروتين الثابتة الفورمالديهايد كبدائل لأنسجة FFPE في تحليل الطيف الكتلي14. بحث عمل حديث آخر في بنية وخصائص المواد الهلامية التي تشكلت عن طريق تسخين محاليل ألبومين مصل الإنسان أو البقر بتركيزات مختلفة ودرجة الحموضة15. وجد هؤلاء المؤلفون أن ألبومين المصل يشكل ثلاثة أنواع من المواد الهلامية تختلف في المرونة الميكانيكية ، والحفاظ على البنية الثانوية ، والقدرة على ربط الأحماض الدهنية اعتمادا على الظروف التجريبية. وتبين هذه الورقات مجتمعة الجدوى العامة للنهج المستخدم هنا. تخلق محاليل البروتين ذات التركيب المحدد مواد هلامية تشبه الأنسجة يمكن معالجتها وتقسيمها وتلوينها باستخدام الطرق النسيجية الروتينية.
يصف هذا البروتوكول تشكيل عنصر تحكم اصطناعي في المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مصنوع من ألبومين مصل البقر (BSA) المبلمر بالحرارة والفورمالديهايد. يمكن أن تتضمن المواد الهلامية مجموعة واسعة من المستضدات ، بما في ذلك البروتينات كاملة الطول ، ومجالات البروتين ، والببتيدات الخطية ، بالإضافة إلى المستضدات غير البروتينية بما في ذلك oligonucleotides2. يستخدم هذا العرض التوضيحي مثالا على مستضد الببتيد الخطي الذي يشفر الأحماض الأمينية C-terminal 16 لبروتين ERBB2 البشري (HER2 / neu) TPTAENPEYLGLDVPVV-COOH (انظر جدول المواد). يتضمن هذا التسلسل الظواهر التي تم التعرف عليها من قبل ثلاثة أجسام مضادة متاحة تجاريا وذات صلة تشخيصية بما في ذلك كاشف Herceptest متعدد النسيلة (ENPEYLGLDVP) والأجسام المضادة وحيدة النسيلة CB11 (AENPEYL) و 4B5 (TAENPEYLGL) (انظر جدول المواد)16.
تستخدم الطريقة الموضحة هنا كواشف متاحة بسهولة باستخدام عمليات وتقنيات مألوفة لأي مختبر ممارس لعلم الأنسجة. ويتمثل أهم قيد في الحاجة إلى تحديد المستضدات المستهدفة وشرائها، وهو ما يمكن تحقيقه في كثير من الحالات بتكلفة متواضعة نسبيا. نظرا لأن هذه الضوابط الاصطناعية ذات تركيبة محددة بالكامل ومصنوعة بطرق بسيطة ، يمكن تنفيذها في العديد من المختبرات بنتائج قابلة للتكرار. وقد يسهل استخدامها التقييم الموضوعي القابل للقياس الكمي لنتائج تلطيخ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية ويسمح بمزيد من التكرار داخل المختبرات وفيما بينها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد حلول وأدوات المخزون
- تحضير 20 مل من محلول BSA 25٪ w / v عن طريق خلط 5 غرام من مسحوق BSA في 14 مل من PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.2 في أنبوب مخروطي 50 مل حتى يتم تشتيته بالتساوي. دوامة حسب الضرورة لتفريق مسحوق BSA.
- حافظ على المحلول بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية للسماح بالذوبان الكامل. اضبط الحجم النهائي إلى 20 مل باستخدام PBS لإنشاء حل مخزون w/v بنسبة 25٪.
- تحضير 20 مل من محلول BSA 31.3٪ w / v عن طريق خلط 6.26 غرام من مسحوق BSA في 13 مل من PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.2 في أنبوب مخروطي 50 مل حتى يتم تشتيته بالتساوي. حافظ على المحلول بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية للسماح بالذوبان الكامل. اضبط الحجم النهائي إلى 20 مل باستخدام PBS لإنشاء حل مخزون w/v بنسبة 31.3٪.
- سخني كتلة الحرارة إلى 85 درجة مئوية.
ملاحظة: ينشئ البروتوكول أدناه مواد هلامية من الببتيد / BSA بأحجام تتراوح بين 1.26 و 1.4 مل تتشكل في أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. لاستخدام كميات أصغر ، على سبيل المثال ، عندما تكون مخزونات المستضدات محدودة ، قم بإعداد المواد الهلامية في أنابيب PCR واستخدم جهاز تدوير حراري مضبوط على 85 درجة مئوية ككتلة حرارية. - اختبر أن خليط BSA / الفورمالديهايد يشكل هلام كما هو متوقع عن طريق خلط 700 ميكرولتر من محلول BSA 25٪ مع 700 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪. تخلط جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات في غضون 5-10 ثوان. تجنب خلق فقاعات الهواء.
تحذير: الفورمالديهايد المركز سام. استخدام مع احتياطات السلامة المناسبة. - مباشرة بعد خلط محاليل BSA والفورمالديهايد ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق المغلق في كتلة حرارية عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الأنبوب من كتلة الحرارة واتركه ليبرد. تأكد من أن الجل قد تشكل كما هو متوقع.
2. إعداد وتخفيف الببتيدات
- الحصول على 5-20 ملغ من الببتيد المجفف بالتجميد من التسلسل المطلوب.
ملاحظة: الأحماض الأمينية C-terminal 16 للمجال البشري ERBB2 داخل الخلايا المعترف بها بواسطة 4B5 هي TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.- أضف 4 أحماض أمينية إلى N-terminus و acetyl-YGSG و C-terminus و GSGC-amide لتسهيل الربط المتبادل للببتيد ب BSA وتوفير التباعد بين جزيء BSA وظهارة الببتيد.
ملاحظة: التسلسل الكامل هو: أسيتيل-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amide. - إذا رغبت في ذلك ، استخدم تسلسلات الأحماض الأمينية الطرفية N و C الأخرى لتوسيع ظهارة الببتيد الأساسية.
ملاحظة: يختلف تأثير التسلسلات المختلفة باختلاف مجموعات الأجسام المضادة/الظهارة. إضافة الببتيد الطرفي C يقلل من ارتباط بعض الأجسام المضادة بالظواهر الطرفية C. في مثل هذه الحالات ، احذف هذا التسلسل. - تأكد من أن الببتيدات من المصادر التجارية يتم توفيرها بنقاء >95٪ ، ويتم تأكيد تكوينه من خلال تحليل HPLC وقياس الطيف الكتلي.
- أضف 4 أحماض أمينية إلى N-terminus و acetyl-YGSG و C-terminus و GSGC-amide لتسهيل الربط المتبادل للببتيد ب BSA وتوفير التباعد بين جزيء BSA وظهارة الببتيد.
- احسب الأحجام اللازمة لحلول مخزون الببتيد 5x (1.25 E-2 M). بالإشارة إلى الجدول 1 ، الأعمدة C-E ، أدخل قيما للوزن الجزيئي للمستضد (g / mole) ، والنسبة المئوية لنقاء المستضد (0-100) ، وكتلة المستضد (mg).
ملاحظة: حجم المذيب (بالميكرولتر) لإعادة تعليق العينة لتحقيق محلول مخزون 1.25 E-2 M هو 800 × الوزن الجزيئي للمستضد × النسبة المئوية لنقاء المستضد / كتلة المستضد.- قم بإعداد ثمانية أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ولصقها بوضوح.
ملاحظة: ستحتوي الأنابيب على 5 أضعاف مخزون الببتيد في مذيب ، و 1 × مخزون الببتيد في المذيب ، وخمسة تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف من 2.5 E-4 M إلى 2.5 E-8 M الببتيد / BSA / الفورمالديهايد هلام ، وهلام التحكم السلبي الذي يحتوي على BSA / الفورمالديهايد يفتقر إلى مستضد إضافي. جميع عينات الجل تبدو متطابقة. عند إعداد مجموعات متعددة من تخفيفات الببتيد في وقت واحد ، احرص على تسمية وتحديد جميع الأنابيب ومعالجة الكاسيت بشكل صحيح. استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيق المرمزة بالألوان وأشرطة المعالجة حيثما أمكن لتقليل سوء التعريف.
- قم بإعداد ثمانية أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ولصقها بوضوح.
- قم بإعداد محلول مخزون الببتيد 5x عند 1.25 E-2 M عن طريق تعليق الكتلة الكاملة من الببتيد المجفف بالتجميد (20 ملغ لببتيدات ERBB2) في 60 ميكرولتر من المذيب المناسب.
ملاحظة: في هذا المثال، تمت إضافة ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) مباشرة إلى حاوية المورد.- افحص المحلول للتأكد من أن الببتيد يذوب تماما. إذا لزم الأمر ، أضف مذيبا إضافيا و / أو سونيك العينة حتى يذوب الببتيد تماما ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم المحسوب في الجدول 1 لمخزون الببتيد 5x.
تحذير: DMF سامة. استخدام مع الاحتياطات المناسبة.
ملاحظة: اعتمادا على تسلسل الأحماض الأمينية ، وكره الماء والشحنة المقابلة ، قد تكون الببتيدات قابلة للذوبان في DMF أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو الماء النقي أو المحاليل المخففة لحمض الخليك أو حمض الفورميك أو بيكربونات الأمونيوم. يمكن حساب خصائص الببتيد باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات عبر الإنترنت17. قد يقترح بعض بائعي الببتيد مذيبات مناسبة لتسلسلات محددة. - أضف المذيب حسب الضرورة لجلب حجم مخزون الببتيد 5x إلى الحجم النهائي المحسوب في الجدول 1. دوامة لمدة 5 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 5000 × غرام لمدة 5 ثوان. يمكن تخزين حلول مخزون الببتيد عند -80 درجة مئوية.
- افحص المحلول للتأكد من أن الببتيد يذوب تماما. إذا لزم الأمر ، أضف مذيبا إضافيا و / أو سونيك العينة حتى يذوب الببتيد تماما ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم المحسوب في الجدول 1 لمخزون الببتيد 5x.
- بالإشارة إلى الجدول 2 ، العمود C ، قم بإعداد 150 ميكرولتر من محلول مخزون الببتيد 1x (2.5 E-3 M) عن طريق تخفيف 30 ميكرولتر من مخزون الببتيد 5x إلى 120 ميكرولتر من المذيبات (DMF هذا المثال). دوامة لمدة 5 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 5000 × غرام لمدة 5 ثوان.
- بالإشارة إلى الجدول 2، العمود دال، قم بإعداد 700 ميكرولتر من محلول الببتيد E-4 M/BSA 5 (التخفيف 1) عن طريق تخفيف 140 ميكرولتر من مخزون الببتيد 1x إلى 560 ميكرولتر من 31.3٪ BSA/PBS، الرقم الهيدروجيني 7.2. دوامة لمدة 5 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 5000 × غرام لمدة 5 ثوان.
ملاحظة: تركيز BSA النهائي لهذا المحلول هو 25٪ (ث / v). - بالإشارة إلى الجدول 2، الأعمدة E-H، تعد أربعة تخفيفات تسلسلية متتالية بمعدل 10 أضعاف لمخزون الببتيد E-4 M/BSA 5 بإضافة 70 ميكرولتر من محلول الببتيد/BSA إلى 630 ميكرولتر بنسبة 25 في المائة BSA/PBS، درجة الحموضة 7.2. دوامة لمدة 5 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 5000 × غرام لمدة 5 ثوان.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة ، سيكون هناك خمسة تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف من الببتيد (5 E-4 M إلى 5 E-8 M) في 25٪ BSA / PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.2. ستحتوي العينات الأربع الأولى على 630 ميكرولتر. ستحتوي العينة الأخيرة على 700 ميكرولتر. - بالرجوع إلى الجدول 2، العمود الأول، قم بإعداد عينة BSA ذات تحكم سلبي تحتوي على 700 ميكرولتر بنسبة 25٪ BSA/PBS، الرقم الهيدروجيني 7.2 (الشكل 1A).
3. إعداد المواد الهلامية BSA-الببتيد
- تأكد من أن كتلة الحرارة أو التدوير الحراري مستقرة عند 85 درجة مئوية.
- راجع الجدول 3، الأعمدة من باء إلى هاء. العمل عينة واحدة في كل مرة، إضافة إلى أول 25٪ BSA / الببتيد عينة (تخفيف 1) 630 ميكرولتر من 37٪ الفورمالديهايد. تخلط جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات في غضون 5-10 ثوان. تجنب خلق فقاعات الهواء.
تحذير: الفورمالديهايد المركز سام. استخدام مع احتياطات السلامة المناسبة.- بعد خلط محاليل الببتيد / BSA والفورمالديهايد ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق المغلق في كتلة حرارية عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: امزج محلول الببتيد BSA والفورمالديهايد جيدا ، ولكن لا تنفق أكثر من 10 ثوان في سحب الخليط قبل وضع العينة على النار. نظرا لأن ربط الفورمالديهايد يبدأ على الفور ، فقد يتشكل الجل بشكل مختلف إذا كان الإجراء مختلفا لعينات مختلفة. تركيز BSA النهائي في هذه المواد الهلامية هو 12.5٪ (ث / v). تركيزات BSA النهائية أقل من 10٪ قد تنتج المواد الهلامية التي لا تتصلب. تركيزات BSA النهائية أكبر من 16٪ قد تنتج المواد الهلامية أكثر هشاشة ويصعب تقسيمها بعد المعالجة. - كرر الخطوتين 3.2 و3.2.1 لكل من التخفيفات 2-4.
- كرر الخطوتين 3.2 و 3.2.1 للتخفيف 5 ، ولكن أضف 700 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ ، وهو حجم يساوي 700 ميكرولتر من محلول مستضد BSA.
- ارجع إلى عمود الجدول 3 العمود زاي؛ كرر الخطوتين 3.2 و 3.2.1 لعينة التحكم السالبة ، مع إضافة 700 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ ، وهو حجم يساوي 700 ميكرولتر من محلول BSA للتحكم السلبي.
- بعد خلط محاليل الببتيد / BSA والفورمالديهايد ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق المغلق في كتلة حرارية عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بإزالة الأنابيب من كتلة الحرارة بعد 10-12 دقيقة. يجب أن يكون وقت التسخين متسقا قدر الإمكان لكل عينة. اترك المواد الهلامية تبرد على سطح الطاولة لمدة 5-10 دقائق (الشكل 1B).
- باستخدام ملعقة مختبرية نظيفة ومرنة يمكن التخلص منها ، قم بإزالة عينة الجل في قطعة واحدة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، وضعها في حاوية مغلقة تحتوي على ما لا يقل عن 15 مل من الفورمالين المحايد المخزن مؤقتا (NBF) ، باستخدام حاوية منفصلة من NBF لكل عينة.
- بدلا من ذلك ، اقطع الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق بشفرة حلاقة جديدة أحادية الحافة ، وادفع الجل من الأسفل بالهواء أو مسبار مناسب (الشكل 1C-G).
ملاحظة: يمكن أن تبقى المواد الهلامية المتصلب من الفورمالديهايد / BSA في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 24 ساعة. يمكن أن يؤدي ترك المواد الهلامية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق لأكثر من 24 ساعة إلى أن تصبح هشة وأكثر صعوبة في المعالجة والتقسيم.
- بدلا من ذلك ، اقطع الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق بشفرة حلاقة جديدة أحادية الحافة ، وادفع الجل من الأسفل بالهواء أو مسبار مناسب (الشكل 1C-G).
4. تشذيب ومعالجة وتضمين المواد الهلامية BSA
- قم بقص مخروط الجل إلى أقراص أسطوانية بسماكة 5 مم تقريبا باستخدام ماكينة حلاقة نظيفة أحادية الحافة (الشكل 1H ، I). قم بلف الأقراص في غلاف خزعة ، ووضع قرص هلام أكبر في كاسيت واحد (لاستخدامه في الدراسة التجريبية في الخطوة 5) ، وأقراص الجل المتبقية معا في كاسيت ثان (الشكل 2A ، E) للاستخدام في بناء microarray الأنسجة (TMA) في الخطوة 6. ضع أقراص الجل الملفوفة في أشرطة معالجة الأنسجة ذات العلامات الواضحة.
- ضع المواد الهلامية المحشوة بالكاسيت في 15 مل على الأقل من 10٪ NBF لكل عينة هلام قبل المعالجة ، باستخدام حاوية منفصلة من NBF لكل عينة. يمكن أن تبقى المواد الهلامية في 10٪ NBF لمدة 6-48 ساعة.
- قم بمعالجة المواد الهلامية في معالج الأنسجة الآلي ، باتباع جدول زمني كبير للأنسجة مع الضغط والفراغ. تستغرق كل خطوة 1 ساعة: 10٪ NBF ، 70٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول (كرر مرتين) ، 100٪ إيثانول (كرر مرتين) ، زيلين (كرر ثلاث مرات) ، بارافين عند 60 درجة مئوية (كرر ثلاث مرات).
ملاحظة: بالنسبة للمحققين الذين يختارون معالجة العينات يدويا، اتبع نفس تسلسل الكواشف والأوقات. - عند اكتمال معالجة العينة، قم بإزالة الكاسيت من معالج الأنسجة وانقلها إلى مركز تضمين البارافين.
- قم بفك المواد الهلامية من غلاف الخزعة وتضمين المواد الهلامية في البارافين. لكل عينة، قم بتضمين قرص واحد من الجل في قالب صغير بحجم 15 مم × 15 مم (الشكل 2B-D)، وأقراص الجل المتبقية معا في قالب ثان أكبر (الشكل 2F-H). سيتم استخدام الكتلة الأولى مع عينة واحدة لاختبار هلام الببتيد في دراسة تجريبية. يمكن استخدام الكتلة الثانية لبناء TMA.
5. التقييم التجريبي لسلسلة تخفيف الببتيد
- لكل سلسلة تخفيف الببتيد ، خطط لإنشاء شريحتين زجاجيتين تحتويان على ما مجموعه 6 أقسام منفصلة: قسم واحد من كل عينة من عينات سلسلة التخفيف الخمسة ، بالإضافة إلى قسم واحد من عينة التحكم السلبي BSA فقط.
- على الشريحة الزجاجية الأولى ، قم بقطع مقطع واحد بسماكة 4 ميكرومتر من كل كتلة من الكتل الأصغر التي تحتوي على قرص هلام واحد مع أعلى ثلاثة تركيزات للببتيد (2.5 E-4 M إلى 2.5 E-6 M).
- على شريحة ثانية ، قم بقطع مقطع واحد بسماكة 4 ميكرومتر من كل كتلة بأدنى تركيزين للببتيد (2.5 E-7 M و 2.5 E-8 M) وقسم واحد من كتلة التحكم BSA فقط. سجل ترتيب العينات على الشرائح.
ملاحظة: توقع أن تقطع المواد الهلامية المدمجة في البارافين بسلاسة ، مما ينتج مقاطع موحدة دون تجزئة أو تمزيق أو ثرثرة. إذا كان من الصعب تقسيم عينات معينة من الجل المدمج في البارافين ، فقم بنقع وجه الكتلة لفترة وجيزة في الماء المقطر البارد المثلج قبل التقسيم. إذا لزم الأمر ، جرب أوقات نقع مختلفة أو مع حلول مختلفة (على سبيل المثال ، ماء الأمونيا). - بعد التقسيم ، جفف الشرائح في درجة حرارة الغرفة (حوالي 23 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة تليها 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بتلطيخ الشريحتين المحضرتين لكل ببتيد بالجسم المضاد المطلوب وفقا لبروتوكولات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية القياسية.
ملاحظة: كان تركيز الأجسام المضادة الأولية على الشريحة المستخدمة للأرانب وحيدة النسيلة 4B5 في هذا العرض التوضيحي 1.5 ميكروغرام/مل.- توقع أن ترى إشارة موحدة نسبيا داخل كل قسم هلام ، حيث تظهر عينات الجل المختلفة مجموعة من شدة الإشارة المقابلة لتخفيفات الببتيد.
- إذا كانت نتائج الدراسة التجريبية مرضية ، فقم ببناء TMA من كتل مانحة الجل التي تحتوي على تركيزات مختلفة من مستضد الببتيد ، كما هو موضح في الخطوات التالية من البروتوكول.
6. BSA هلام TMA البناء
- قم ببناء مصفوفة دقيقة للأنسجة تحتوي على نوى مكررة قطرها 1 مم من كتل مانحة تحتوي على هلام BSA وحده وهلام BSA يحتوي على جميع التخفيفات الخمسة لببتيد ERBB2.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، قم بتضمين المواد الهلامية BSA التي تحتوي على نفس التخفيفات الخمسة للببتيد غير المستهدف كضوابط سلبية إضافية. إذا رغبت في ذلك ، قم بتضمين نوى خطوط الخلايا التمثيلية التي تعبر عن ERBB2 كعناصر تحكم إيجابية. - قطع 4 ميكرومتر من TMA ووصمة عار مع 1.5 ميكروغرام / مل من anti-ERBB2 / HER2 / neu أرنب وحيد النسيلة 4B5 (انظر جدول المواد) وفقا للبروتوكولات القياسية المختبرية.
- تقييم شدة البقع الناتجة نوعيا عن طريق الفحص أو كميا عن طريق المسح الضوئي والتحليل الرقمي للصور (الشكل 3A ، B).
ملاحظة: نظرا لأن تحليل الصور الرقمية ليس محور هذا البروتوكول ، يتم ترك هذه الخطوات للقارئ لتنفيذها وفقا لتفضيلاته.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجب أن تذوب الببتيدات بالكامل في مذيب مناسب في درجة حرارة الغرفة لتشكيل محلول واضح بصريا. إذا كانت مادة الجسيمات المرئية لا تزال موجودة بعد 30-60 دقيقة ، فقد يكون من المفيد إضافة كميات إضافية من المذيب الأصلي أو مذيب بديل لا يتجاوز الحجم المقصود لمحلول مخزون الببتيد 5x المحسوب في الجدول 1. وبالمثل، ينبغي أن يظل محلول الببتيد/BSA المشترك شفافا (الشكل 1 ألف).
يجب أن تشكل عينات هلام الببتيد / BSA كتلة مطاطية غير شفافة بعد التسخين بنسبة 37٪ من الفورمالديهايد (الشكل 1B-I). قد يحدث تكسير طفيف لعينات الجل أثناء الإزالة من أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة (الشكل 3A). وينبغي ألا تتداخل هذه الخطوات مع الخطوات اللاحقة. يجب أن تقسم عينات الجل المضمنة في البارافين بسلاسة دون تمزق أو ثرثرة. قد تستفيد المواد الهلامية التي تظهر تمزقات غير منتظمة (الشكل 3B) من مواجهة كتلة أقل عدوانية و / أو نقع قصير في الماء المثلج أو ماء الأمونيا. قد تحدث مناطق ذات إشارة منخفضة بشكل متغير في نمط العلامة المائية عندما يكون توزيع واحد أو أكثر من كواشف التلطيخ غير متساو (الشكل 3C). يمكن رؤية الإشارة العيانية المتزايدة بشكل فوكلي إذا كان هناك احتباس كاشف تحت أقسام الجل في أي مرحلة من مراحل عملية التلطيخ (الشكل 3C). قد يؤدي استخدام الشرائح الزجاجية المشحونة إيجابيا والتجفيف الدقيق للشرائح بعد التقسيم إلى تقليل هذه القطعة الأثرية. قد تحدث مناطق مجهرية للإشارة المخفضة إذا كان هناك توزيع غير متساو للمستضد في مصفوفة الهلام أو إذا كان الاختلاف في بنية الجل المحلية يحد من تفاعل الأجسام المضادة مع المستضد (الشكل 3D). قد يؤدي ذوبان الببتيد غير المكتمل إلى مناطق متناثرة من الإشارة المكثفة بشكل فوكالي في خلفية منخفضة الكثافة (الشكل 3E).
بعد التفاعل مع جسم مضاد مناسب ، يجب أن تظهر عينات هلام BSA السلبية الحد الأدنى من الإشارة (الشكل 4A) ، على النحو الأمثل أقل من 2٪ -3٪ من نطاق الفحص الديناميكي. نادرا جدا ، قد يكون هناك تفاعل كبير للأجسام المضادة مع مادة هلام BSA التي تفتقر إلى أي مستضد لا يمكن القضاء عليه عن طريق تغيير ظروف التفاعل. يجب أن تكون شدة الإشارة في عينة هلام فردية موحدة نسبيا ، مع زيادة الإشارة في العينات ذات تركيزات المستضدات المتزايدة (الشكل 4A ، B). تختلف شدة الإشارة المطلقة اعتمادا على مزيج المستضد والأجسام المضادة والظروف المستخدمة لبقعة IHC. اعتمادا على ظروف التلطيخ ، قد يكون هناك تركيز مستضد عتبة تكون الإشارة تحته في الخلفية وتركيز مستضد يتم تشبع الإشارة فوقه. في بعض الفحوصات، قد تكون الإشارة فوق الخلفية مرئية في العينات التي تحتوي على أقل من 2.5 ببتيد E-8 M2. في عمليات التلطيخ المتماثلة ، يجب أن تكون شدة الإشارة للأقسام المقطوعة من كل عينة هلام قابلة للتكرار من تشغيل إلى آخر. في هذا التطبيق للأجسام المضادة المضادة ل HER2 ، تم تلطيخ عناصر التحكم في خط الخلايا MDA-175 و SK-BR-3 المستخدمة على نطاق واسع في نفس التجربة لمقارنتها بعناصر التحكم في الببتيد. تظهر خطوط الخلايا التوزيع المتوقع وشدة الإشارة: >10٪ من خلايا MDA-175 (HER2 1+) تظهر باهتة (الشكل 4C ، D) ، تلطيخ غشائي محيطي غير كامل ، و >10٪ من خلايا SK-BR-3 (HER2 3+) (الشكل 4E ، F) تظهر تلطيخا غشائيا محيطيا شديدا.
تشمل الأسباب المحتملة لعدم وجود إشارة ما يلي: (1) تسلسل الببتيد ليس هدفا وظيفيا للجسم المضاد. (2) لم يتم تحسين بروتوكول التلطيخ للكشف عن تركيزات المستضدات الموجودة في المواد الهلامية ؛ (3) كانت عينة الببتيد الخاطئة ملطخة ؛ (4) خطأ في الكاشف أو الصك. تشمل الأسباب المحتملة للإشارة في العينات التي لا يتوقع فيها ذلك التفاعل غير المحدد للأجسام المضادة الأولية أو كواشف الكشف مع هلام BSA أو عينات الببتيد التي تم تصنيفها بشكل خاطئ أثناء التحضير.
الشكل 1: إعداد هلام الببتيد-BSA. (A) 25٪ (ث / v) BSA (بدون إضافة الببتيد) في PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.2. (ب) جل يتكون عن طريق خلط أحجام متساوية من 25٪ BSA و 37٪ محلول الفورمالديهايد والتسخين إلى 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (C-G) بعد التبريد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق ، يمكن إزالة هلام BSA من أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام ملعقة مرنة يمكن التخلص منها. (H-I) يتم تقطيع الجل السليم إلى أقراص بسماكة ~ 5 مم استعدادا للمعالجة والتضمين. أشرطة المقياس 1 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: إعداد عينات هلام BSA للمعالجة والتضمين. (أ-دال) إعداد كتلة البارافين التي تحتوي على قرص واحد من هلام BSA. (أ) يتم لف جل مستضد BSA في أنسجة الخزعة قبل المعالجة. (ب) بعد تسلل البارافين ، يتم وضع قرص الجل الشفاف الآن على مرحلة تسخين مركز التضمين وغير ملفوف. (ج) يتم وضع قرص هلام واحد في قالب تضمين 15 مم × 15 مم يحتوي على البارافين السائل. (د) كتلة البارافين المكتملة جاهزة للتقسيم. (ه-ح) تحضير كتلة البارافين التي تحتوي على أقراص متعددة من هلام BSA. أما بالنسبة للأرقام من ألف إلى دال أعلاه، فإن عينات الهلام المتبقية تتم معالجتها وتضمينها في كتلة واحدة لتوفير المواد اللازمة لبناء التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي (TMA). أشرطة المقياس 1 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحضير الجل وتلطيخ القطع الأثرية. (أ) قد تظهر النوى تكسير طفيف يتم إدخاله أثناء خطوات المعالجة و / أو التضمين. قد يعكس السواد البؤري ملائمة الكاشف تحت القسم. (ب) قد ينتج تمزيق مادة الهلام (التي تظهر في الأقسام الملطخة على أنها فراغات غير منتظمة) عن الإفراط في نقع الكتلة أو نقضها قبل التقسيم. (ج) قد تكون أنماط تلطيخ العلامات المائية غير المنتظمة ناتجة عن التوزيع غير المتكافئ للكاشف في خطوة واحدة أو أكثر من خطوات التلطيخ. (دال) يمكن رؤية الأنماط المجهرية لهيكل الببتيد BSA، ولا سيما عند تركيزات الببتيد الأعلى. (هاء) قد ينتج عن ذوبان الببتيد غير الكامل نمطا من السماء المرصعة بالنجوم مع إشارة بؤرية في خلفية منخفضة الكثافة. قضبان المقياس هي 200 ميكرومتر (A-C) أو 20 ميكرومتر (D ، E). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الببتيد الملون ERBB2 / HER2 TMA مع خطوط الخلايا ERBB2 / HER2 1+ و 3 +. (أ) تكرار نوى التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي (الصفوف العلوية والسفلية) التي لا تحتوي على الببتيد (العمود الأيسر) أو ببتيد ERBB2 بتركيزات تتراوح بين 2.5 E-8 M و 2.5 E-4 M ملطخة باستنساخ مضاد ل HER2 / neu 4B5 وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. تظهر النوى ذات تركيزات الببتيد المتزايدة زيادة متدرجة في الإشارة. (B) تم مسح نوى التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) الموضحة في اللوحة A رقميا، وتم رسم متوسط كثافة البكسل [0.01 × (نفاذية 100 - ٪) × 255] مقابل تركيز الببتيد. (C-F) تم تضمين عناصر التحكم الإيجابية لخط الخلية التي تحتوي على خطوط الخلايا المعبرة عن ERBB2 / HER2 MDA-175 (HER2 1+ ، C ، D) و SK-BR-3 (HER2 3+ ، E ، F) في TMA التي تحتوي على المواد الهلامية BSA-peptide بحيث يمكن مقارنة شدة الإشارة في خطوط الخلايا والمواد الهلامية BSA-peptide على نفس الشريحة. قضبان المقياس هي 500 ميكرومتر (A) و 250 ميكرومتر (C ، E) ، و 20 ميكرومتر (D ، F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| A | B | C | D | E | F | G | H | |||
| اسم الببتيد | تسلسل الببتيد | ميغاواط (دا) | نقاء الببتيد (٪) | كتلة الببتيد المقدمة (ملغ) | الشامات من الببتيد في عينة (بما في ذلك تصحيح للنقاء) | حجم (ميكرولتر) من المذيبات التي يمكن فيها إعادة تعليق الببتيد للحصول على مخزون 1.25 e-2 M | المذيبات | |||
| ERBB2 / HER2 | Ac YGSGTPTAENP EYLGLDVPVGSGC أميد |
2424.6 | 95.0 | 20.0 | 7.84E-06 | 626.9 | DMF | |||
الجدول 1: حسابات إعداد مخزون الببتيد.
| A | B | C | D | E | F | G | H | أنا |
| أنبوب | 5x مخزون الببتيد | 1x مخزون الببتيد | التخفيف 1 | التخفيف 2 | التخفيف 3 | التخفيف 4 | التخفيف 5 | سلبي كونترول |
| مخزون [الببتيد] (M) | 1.25*10-2 | 2.5*10-3 | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | اي |
| محلول الببتيد (في المذيب) |
>30 لتر | 30 ساعة من 5x (1.25E-2 M) مخزون الببتيد |
140 uL من 1x (2.5E-3 م) مخزون الببتيد |
70 uL من التخفيف 1 |
70 uL من التخفيف 2 |
70 uL من التخفيف 3 |
70 uL من التخفيف 4 |
اي |
| حجم المذيبات | 120 ش ل | |||||||
| الببتيد النهائي حجم المخزون |
150 ريال | |||||||
| 31.3٪ BSA / PBS حجم |
560 ريال 31.3٪ BSA |
|||||||
| 25٪ BSA / PBS حجم |
630 ريال 25٪ BSA |
630 ريال 25٪ BSA |
630 ريال 25٪ BSA |
630 ريال 25٪ BSA |
700 ريال 25٪ BSA |
|||
| حجم الببتيد المخفف في BSA | 700 ريال | 700 ريال | 700 ريال | 700 ريال | 700 ريال | 700 ريال |
الجدول 2: حسابات تحضير تخفيفات الببتيد BSA.
| A | B | C | D | E | F | G |
| أنبوب | التخفيف 1 | التخفيف 2 | التخفيف 3 | التخفيف 4 | التخفيف 5 | السيطرة السلبية |
| الحجم المتبقي من الببتيد في BSA المخفف | 630 ريال | 630 ريال | 630 ريال | 630 ريال | 700 ريال | 700 ريال |
| [الببتيد] (M) في BSA المخفف | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | اي |
| حجم 37٪ الفورمالديهايد لإضافة | 630 ريال | 630 ريال | 630 ريال | 630 ريال | 700 ريال | 700 ريال |
| النهائي [الببتيد] (M) في هلام |
2.5*10-4 | 2.5*10-5 | 2.5*10-6 | 2.5*10-7 | 2.5*10-8 | اي |
الجدول 3: حسابات لإعداد المواد الهلامية BSA-الفورمالديهايد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تسمح هذه الطريقة للمستخدم بإنشاء عينات موحدة من التركيب المعروف وتركيز المستضد كمعايير في تفاعلات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية ، باستخدام مواد وتقنيات مألوفة لمعظم مختبرات الأنسجة. الخطوة الأكثر أهمية هي تحديد الظهارة التي يرتبط بها الجسم المضاد للاهتمام. يصف هذا البروتوكول استخدام مستضد الببتيد الخطي من ERBB2 / HER2 ICD. يمكن استخدام نفس البروتوكول لتشكيل المواد الهلامية BSA التي تحتوي على oligonucleotides ، أو ملصقات الفلورسنت ، أو مجالات البروتين ، أو البروتينات كاملة الطول. يمكن أن يكون هذا النهج الأخير مفيدا للأجسام المضادة المرتبطة بالظواهر التوافقية التي لا يتم إعادة إنشائها بواسطة تسلسل ببتيد خطي واحد. على سبيل المثال ، يمكن استخدام معايير BSA gel التي تحتوي على 0.1 mg / mL ساذجة IgG من الفئران والجرذان والأرانب كعناصر تحكم في العملية للتأكد من أن خطوات الكشف والتلطيخ الثانوية قد عملت كما هو متوقع.
تكمل طريقة هلام المستضد-BSA الموصوفة هنا تقنيات أخرى للتحكم في تفاعلات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية وتوحيدها. كانت خطوط الخلايا وعينات الأنسجة ذات مستويات التعبير المميزة جيدا للمستضدات المستهدفة ضرورية لبروتوكولات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية التي يتم التحكم فيها جيدا1،3،4. تم اقتراح الببتيدات المقترنة بسطح الشرائح الزجاجية والخرز الزجاجي كضوابط كمية7،8،9. كل طريقة من الطرق المحتملة لها مزايا وقيود متداخلة. المواد الهلامية مستضد BSA لها العديد من المزايا. فهي بسيطة لصنع وقابلة للتكيف مع مختلف التراكيب المستضدات والتركيزات. وهي تعيد إنتاج بعض البنية ثلاثية الأبعاد لعينات الأنسجة مع التحكم في عدم التجانس المتأصل الموجود في العينات البيولوجية. نظرا لأنه يمكن تصنيع المواد الهلامية المستضدية الاصطناعية بتركيزات مستضدات قابلة للاختيار من قبل المستخدم تمتد من أقل من حد الكشف إلى أعلى التركيزات الموجودة في العينات البيولوجية (~ 10-4 M)2 ، فإنها توفر فرصا لمعايرة وتوحيد الفحوصات التي يتم إجراؤها باستخدام التقنيات الحديثة ، على سبيل المثال ، AQUA18 والتصوير الكتليالطيفي 19 ، الذي يتجاوز نطاقه الديناميكي بكثير المدينة العالمية للخدمات الإنسانية التقليدية الكروموجينية. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الطريقة بعناصر تحكم تتضمن أكثر من مستضد واحد ، والذي يمكن استخدامه في تطوير وتوحيد المقايسة متعددة الإرسال.
في حين أن هذه الطريقة تتطلب من المستخدم معرفة الظهارة للأجسام المضادة ذات الأهمية ، فإن العديد من الأجسام المضادة ترتبط بالظواهر الخطية الموثقة جيدا. يمكن لتقنيات رسم خرائط Epitope 20,21,22 في كثير من الأحيان تحديد الظهارة الخطية غير المحددة ، ويمكن شراء الببتيدات الاصطناعية بما في ذلك الظهارات الخطية المعروفة بتكلفة متواضعة. ترتبط الأجسام المضادة الأخرى بالظواهر التوافقية التي لا يتم استنساخها بواسطة الببتيدات الخطية ولكن يتم الحفاظ عليها في البروتينات الكاملة أو مجالات البروتين. بالنسبة لبعض هذه الأجسام المضادة ، تتوفر أشكال مؤتلفة من المستضدات المستهدفة تجاريا.
لإنشاء عينات تحكم ذات توحيد وقابلية للتكرار الأمثل ، يجب إذابة الببتيد أو المستضد المستهدف الآخر بالكامل وتخفيفه بعناية في محاليل BSA. من الضروري أيضا أن يحدث خلط فعال وسريع لمحلول BSA / الببتيد مع 37٪ من الفورمالديهايد قبل أن تبدأ العينة في الهلام ، ثم يتم وضع العينة المختلطة على الفور عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لتجنب الإفراط في التثبيت ومعالجة القطع الأثرية ، يجب أن تؤخذ المواد الهلامية من خلال المعالجة وتضمين البارافين وفقا للجدول الزمني الموصى به.
قد تكون الاختلافات في الطريقة الموضحة هنا مفيدة في سياقات محددة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام تسلسلات الببتيد الطرفية N و C البديلة لتحسين اكتشاف الببتيدات المرتبطة ب BSA2. وينبغي توقع أن الأجسام المضادة التي تتعرف على الظواهر من البروتينات C-termini المتطرفة قد تكون حساسة بشكل متفاوت للتعديلات الطرفية C للتسلسل الأصلي. يمكن أيضا تشكيل عينات هلام الببتيد-BSA عن طريق التسخين عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق دون تثبيت ، ثم يتم تحضيرها ككتل مجمدة أو بعد تثبيتها باستخدام مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحقيق اقتران الببتيد باستخدام كيمياء ماليميد أو طرق أخرى غير الموضحة هنا.
تتمتع العينات البيولوجية مثل خطوط الخلايا والأنسجة بميزة كعناصر تحكم في تمثيل تعقيد العديد من المتغيرات الموجودة فقط في الحياة. من ناحية أخرى ، نظرا لأن معايير الأنسجة والخلايا غير متجانسة داخليا ومتغيرة من عينة إلى أخرى ، فإن تفسير التلطيخ المتغير من تشغيل إلى تشغيل أمر مربك. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون تركيزات المستضدات في الأنسجة والخلايا معروفة نوعيا فقط ، على الرغم من أنه مع الاستخدام المتزايد لقياس الطيف الكتلي الكمي ، يتم الإبلاغ عن تركيزات البروتين المطلقة بشكل متكررأكثر 23. تقضي ضوابط مستضد BSA الموصوفة هنا عمدا على السياق المكاني والبيولوجي للبروتينات في الخلايا والأنسجة. ولهذا السبب، فإن العلاقة بين كثافة إشارة المدينة العالمية للخدمات الإنسانية وتركيز المستضد الموجود في هذه الضوابط قد تعيد إنتاج تلك التي شوهدت في الأنسجة بشكل غير كامل. قد تكون عناصر التحكم الاصطناعية الموضحة هنا مفيدة لتحسين وتوحيد بعض جوانب أداء فحص المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. ومع ذلك ، فإنها لا تمنع الحاجة إلى الاستخدام المناسب لعينات التحكم الأخرى. على سبيل المثال ، لا يمكن تقييم التلطيخ غير المحدد المحتمل في الأنسجة المستهدفة إلا من خلال الاستخدام المتوازي لعينة التحكم في الأنسجة السلبية. بالإضافة إلى ذلك، لا تعيد عناصر التحكم في جل مستضد BSA إنتاج متغيرات ما قبل التحليل الخاصة بالأنسجة، بما في ذلك وقت نقص التروية الدافئ والبارد، أو التحلل البروتيني، أو ظروف التثبيت والمعالجة التي قد تؤثر على أداء المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. وبناء على ذلك، وكما نوقش في مكان آخر بمزيد من التفصيل1،3،4، ينبغي للمحققين أن يستخدموا بشكل مدروس معايير الخلايا والأنسجة لتوصيف أداء نظام المدينة العالمية للخدمات الإنسانية بدقة.
يمكن استخدام ضوابط مستضد BSA لتطوير أو تحسين بروتوكولات التلطيخ وتكون بمثابة عينات مرجعية داخل المختبر وفيما بينه عند تقييم قابلية تكرار البروتوكولات المعمول بها. يجب أن يسمح الوصول إلى عينات قياسية محددة جيدا للمستخدمين بتوصيف سلوك تفاعل المدينة العالمية للخدمات الإنسانية بشكل أكثر صرامة ، وتحديد التباين في أداء التلطيخ ، وتحسين ظروف التفاعل لتحقيق أهداف محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تشارلز أ. هافنار، كاثي ج. هوتزل، تشارلز أ. جونز، كارمينا م. إسبيريتو، ليندا ك. رانجل، وفرانكلين ف. بيل هم موظفون ومساهمون في جينينتيك وروش. تنتج الشركات التابعة لها كواشف وأدوات مستخدمة في هذه الدراسة.
Acknowledgments
يعترف المؤلفون بامتنان بزملائهم جيفري توم وأيمن سونغ لتوليف الببتيد ، و Nianfeng Ge لبناء TMA ، و Shari Lau لتلطيخ IHC ، وميليسا إيديك للمسح المجهري الرقمي ، و Hai Ngu لقياس كمية الصور الرقمية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
- Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
- Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
- Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
- Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
- Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
- Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
- Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
- Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. 'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
- Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
- Schrohl, A. -S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
- Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
- Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
- Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).
- Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).
