Summary
この研究は、免疫組織化学のための合成抗原コントロールを作成する簡単な方法を文書化しています。この技術は、広範囲の濃度で様々な抗原に適応可能である。サンプルは、アッセイ内およびアッセイ間の性能と再現性を評価するための基準を提供します。
Abstract
免疫組織化学(IHC)アッセイは、タンパク質発現パターンに関する貴重な洞察を提供し、その信頼性の高い解釈には、十分に特徴付けられた陽性および陰性対照サンプルが必要です。適切な組織または細胞株コントロールが常に利用できるとは限らないため、合成IHCコントロールを作成する簡単な方法が有益であり得る。このような方法をここで説明する。これは、タンパク質、ペプチド、またはオリゴヌクレオチドを含む様々な抗原タイプに、広範囲の濃度で適応可能である。このプロトコルは、様々な診断的に関連する抗体によって認識されるヒト赤芽球性癌遺伝子B2(ERBB2/HER2)細胞内ドメイン(ICD)からのペプチドを例として用いて、合成抗原コントロールを作成するために必要なステップを説明する。ウシ血清アルブミン(BSA)溶液中のHER2 ICDペプチドの段階希釈物をホルムアルデヒドと混合し、85°Cで10分間加熱してペプチド/BSA混合物を固化および架橋する。得られたゲルは、組織のように処理、切片化、および染色することができ、広範囲の染色強度にまたがる既知の抗原濃度の一連のサンプルを生じる。
この単純なプロトコルは、日常的な組織学ラボ手順と一致しています。この方法は、ユーザが所望の抗原の十分な量を有することのみを必要とする。関連するエピトープをコードする組換えタンパク質、タンパク質ドメイン、または直鎖状ペプチドは、局所的または商業的に合成され得る。社内抗体を生成するラボは、免疫抗原のアリコートを合成制御標的として予約することができます。幅広い濃度にわたって明確に定義されたポジティブコントロールを作成する機会により、ユーザーは実験室内および実験室間のアッセイ性能を評価し、アッセイのダイナミックレンジと直線性に関する洞察を得て、特定の実験目標に合わせてアッセイ条件を最適化することができます。
Introduction
免疫組織化学(IHC)は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片における標的抗原の高感度かつ特異的で空間的に正確な検出を可能にします。しかし、IHC染色結果は、温冷虚血時間、組織固定、組織前処理、抗体反応性および濃度、アッセイ検出化学、および反応時間1を含む複数の変数によって影響を受ける可能性がある。したがって、IHC反応の再現性のある性能および解釈には、これらの変数の厳密な制御、および十分に特徴付けられた陽性および陰性対照サンプルの使用が必要である。頻繁に使用される対照には、目的抗原を発現するために独立した分析から知られているパラフィン包埋組織または培養細胞株が含まれるが、そのようなサンプルは必ずしも利用可能ではない1。さらに、組織および細胞株対照における標的抗原の発現レベルは、一般に定性的にのみ理解され、可変であり得る。再現可能で正確に既知の濃度の標的抗原を含むコントロールは、IHC反応条件の最適化を支援することができます。合成IHC対照試料を作成するために生理学的に関連する濃度範囲で様々な抗原タイプに適応可能な一般的な方法が、著者ら2によって記載されている。ここでは、このタイプの標準の作成と使用のための詳細なプロトコルを提供しています。
適切なコントロールは、IHCアッセイ1、3、4の有効な解釈に不可欠である。組織、培養細胞、およびペプチドコーティングされた基質は、研究者の特定のニーズに応じてIHC対照として採用されている。組織をIHC対照として使用することに内在する利点と限界は、広範囲に議論されてきた1,4。多くの抗体について、適切なコントロールを、広いダイナミックレンジにわたって標的抗原を発現する細胞集団を含む選択された正常組織から選択することができる。組織対照は、標的抗原が発現部位または存在量に関して十分に特徴付けられていない場合、または潜在的に交差反応する抗原が同じ細胞または組織部位で共発現される場合にはあまり適さない。これらの文脈において、目的抗原を発現する培養細胞株のブロックが有用であり得る。標的特異性のさらなる証拠を提供するために、細胞株は、標的抗原を過剰発現または過小発現するように操作することができる。例えば、このようなアプローチは、最近、PD−L1抗原5の範囲を発現する同種性細胞株の組織マイクロアレイを用いた様々な抗PD−L1アッセイを評価するために使用された。細胞株ブロックの日常的な使用に対する実際的な制限には、十分な細胞数を生成するのに必要なコストと時間、およびクローン細胞株6内でも、一部の抗原の発現が確実に一貫していない可能性があるという事実が含まれます。合成ペプチドは、短い線状エピトープを認識する抗体のIHCコントロールの3番目の選択肢です。今回、Steven Bogenたちの研究グループは、スライドガラス7,8およびガラスビーズ9の表面に結合させたペプチドの使用について広く発表している。このグループによるある研究は、ペプチドベースのIHC対照の定量的分析が、並行して分析された組織対照の定性的評価によって見逃された染色プロセス変動を検出できることを実証した10。ビーズベースの抗原を使用する標準は広く適用可能である可能性があるが、多くの詳細は著者に独占的であり、広範な採用を制限している。
IHC標準に対する別のアプローチは、人工的に作成されたタンパク質ゲルに標的抗原を組み込む。この概念は、1972年にPer Brandzaegによって、正常なウサギ血清がグルタルアルデヒド11を使用して重合された研究で初めて実証されました。次いで、得られたゲルの小さなブロックを、様々な濃度で目的の免疫グロブリン抗原を含む溶液に1〜4週間浸漬した。アルコール固定およびパラフィン包埋後、得られた対照の切片は、それらが浸漬された抗原溶液の対数に対応する強度で染色されることが示された。その後、研究者らは、免疫電子顕微鏡研究における陽性対照として、希釈BSAまたは脳ホモジネート溶液中の特定のアミノ酸のグルタルアルデヒドコンジュゲートを調製した12,13。より最近の研究は、質量分析におけるFFPE組織の代用物としてのホルムアルデヒド固定タンパク質溶液から作られたゲルの使用を調査した14。別の最近の研究は、ヒトまたはウシの血清アルブミン溶液を様々な濃度およびpH15で加熱することによって形成されるゲルの構造および特性を調査した。これらの著者らは、血清アルブミンが実験条件に応じて機械的弾力性、二次構造保存、脂肪酸結合能が異なる3種類のゲルを形成することを見出した。これらの論文は、ここで採用されているアプローチの一般的な実現可能性を示しています。定義された組成のタンパク質溶液は、日常的な組織学的方法を使用してさらに処理、切片化、および染色することができる組織様ゲルを作成する。
このプロトコールは、熱およびホルムアルデヒドで重合されたウシ血清アルブミン(BSA)から作製された合成IHCコントロールの形成を記載している。ゲルには、完全長タンパク質、タンパク質ドメイン、および直鎖状ペプチドを含む多種多様な抗原、ならびにオリゴヌクレオチド2を含む非タンパク質抗原を組み込むことができる。この実証では、ヒトERBB2(HER2/neu)タンパク質TPTAENPEYLGLDVPV-COOHのC末端16アミノ酸をコードする直鎖状ペプチドである抗原の例を使用します( 材料表を参照)。この配列は、ハーセプトストポリクローナル試薬(ENPEYLGLDVP)およびモノクローナル抗体CB11(AENPEYL)および4B5(TAENPEYLGL)を含む3つの市販の診断関連抗体によって認識されるエピトープを含む( 材料表を参照のこと)16。
ここで実証された方法は、組織学研究室で実践されているあらゆる組織学検査室に馴染みのあるプロセスおよび技術を使用して、容易に入手可能な試薬を使用する。最も重要な制限は、標的抗原を同定して購入する必要性であり、多くの場合、比較的控えめなコストで達成することができる。これらの合成コントロールは完全に定義された組成であり、簡単な方法で作られているため、再現可能な結果で多くのラボで実装できます。それらの使用は、IHC染色結果の客観的で定量化可能な評価を容易にし、実験室内および実験室間の再現性を高めることができる。
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Protocol
1. 原液・工具の調製
- 50 mL の円錐形チューブ中で 5 g の BSA 粉末を 14 mL の PBS、pH 7.2 に混合して、20 mL の 25% w/v BSA 溶液を調製し、均一に分散します。必要に応じてボルテックスはBSA粉末を分散させる。
- 溶液を4°Cで一晩保ち、完全に溶解させる。PBSで最終容量を20 mLに調整し、25%w/vの原液を作ります。
- 6.26 g BSA 粉末を 13 mL の PBS、pH 7.2 に 50 mL の円錐管に入れて均一に分散するまで混合して、20 mL の 31.3% w/v BSA 溶液を調製します。溶液を4°Cで一晩保ち、完全に溶解させる。PBSで最終容量を20 mLに調整し、31.3% w/v のストック溶液を作ります。
- ヒートブロックを85°Cに予熱します。
注:以下のプロトコルは、1.5mLの微量遠心チューブで形成された容量1.26〜1.4mLのペプチド/BSAゲルを作成します。より小さな容量を使用するには、例えば、抗原ストックが制限されている場合、PCRチューブでゲルを調製し、ヒートブロックとして85°Cに設定したサーモサイクラーを使用する。 - BSA/ホルムアルデヒド混合物が、700 μL の 25% BSA 溶液と 700 μL の 37% ホルムアルデヒドを混合することによって、期待どおりにゲルを形成することをテストします。5〜10秒以内に5回上下にピペッティングしてよく混ぜる。気泡を作らないでください。
注意:濃縮ホルムアルデヒドは有毒です。適切な安全上の注意を払って使用してください。 - BSA溶液とホルムアルデヒド溶液を混合した直後に、密閉型微量遠心管をヒートブロックに入れ、85°Cで10分間置いた。ヒートブロックからチューブを取り外し、冷却します。ゲルが期待どおりに形成されていることを確認します。
2. ペプチドの調製と希釈
- 所望の配列の凍結乾燥ペプチドを5〜20mg得る。
注:4B5によって認識されるヒトERBB2細胞内ドメインのC末端16アミノ酸はTPTAENPEYLGLDVPV-COOHである。- N末端に4つのアミノ酸、アセチル-YGSG、およびC末端GSGC-アミドを加えて、ペプチドのBSAへの架橋を容易にし、BSA分子とペプチドエピトープとの間に間隔をあける。
注:完全な配列は、アセチル-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-アミドである。 - 所望により、他のN末端およびC末端アミノ酸配列を使用して、コアペプチドエピトープを延長する。
注:異なる配列の影響は、抗体/エピトープの組み合わせによって異なります。C末端ペプチドの添加は、C末端エピトープに対するいくつかの抗体の結合を減少させる。このような場合は、このシーケンスを省略します。 - 市販の供給源からのペプチドが>95%の純度で供給されていることを確認し、その組成はHPLCおよび質量分析分析によって確認される。
- N末端に4つのアミノ酸、アセチル-YGSG、およびC末端GSGC-アミドを加えて、ペプチドのBSAへの架橋を容易にし、BSA分子とペプチドエピトープとの間に間隔をあける。
- 5x(1.25 E-2 M)ペプチドストック溶液の必要体積を計算します。 表 1 の列 C-E を参照して、抗原分子量 (g/mole)、抗原純度パーセント (0 ~ 100)、および抗原量 (mg) の値を入力します。
注:1.25 E-2 Mの原液を達成するためにサンプルを再懸濁するための溶媒の容量(μL単位)は、800 x 抗原分子量 x 抗原純度/抗原質量パーセントです。- 8本の1.5 mL微量遠心チューブを準備し、明確にラベル付けします。
注:チューブには、溶媒中の5倍のペプチドストック、溶媒中の1倍のペプチドストック、2.5 E-4 Mから2.5 E-8 Mのペプチド/BSA/ホルムアルデヒドゲルの5つの10倍連続希釈物、および抗原を添加しないBSA/ホルムアルデヒドを含むネガティブコントロールゲルが含まれます。すべてのゲルサンプルは同じように見えます。一度に複数のペプチド希釈液セットを調製する場合は、すべてのチューブと処理カセットを正しく標識して識別するように注意してください。色分けされた微量遠心チューブと処理カセットを可能な限り使用して、誤認を最小限に抑えます。
- 8本の1.5 mL微量遠心チューブを準備し、明確にラベル付けします。
- 凍結乾燥ペプチドの全質量(ERBB2ペプチドの場合は20 mg)を60 μLの適切な溶媒に再懸濁することにより、1.25 E-2 Mで5xペプチドストック溶液を調製する。
メモ: この例では、ジメチルホルムアミド(DMF)をベンダーの容器に直接添加しました。- 溶液を検査して、ペプチドが完全に溶解していることを確認します。必要に応じて、追加の溶媒を加え、および/またはペプチドが完全に溶解するまでサンプルを超音波処理し、5倍ペプチドストックについて 表1 で計算された体積を超えないように注意する。
注意: DMFは有毒です;適切な注意を払って使用してください。
注:アミノ酸配列、および対応する疎水性および電荷に応じて、ペプチドはDMF、ジメチルスルホキシド(DMSO)、純水、または酢酸、ギ酸、または炭酸水素アンモニウムの希薄溶液に可溶であり得る。ペプチド特性は、様々なオンラインツール17を用いて計算され得る。一部のペプチドベンダーは、特定の配列に適した溶媒を提案することがあります。 - 必要に応じて溶媒を加え、5xペプチドストックの体積を 表1で計算された最終体積に近づける。5秒間の渦と5000 x g の室温で5秒間の遠心分離機。ペプチドストック溶液は、-80°Cで保存することができる。
- 溶液を検査して、ペプチドが完全に溶解していることを確認します。必要に応じて、追加の溶媒を加え、および/またはペプチドが完全に溶解するまでサンプルを超音波処理し、5倍ペプチドストックについて 表1 で計算された体積を超えないように注意する。
- 表2、列Cを参照して、30 μLの5xペプチドストックを120 μLの溶媒(この例ではDMF)に希釈することによって、1xペプチドストック溶液(2.5E-3 M)の150 μLを調製する。5秒間の渦と5000 x gの室温で5秒間の遠心分離機。
- 表 2、列 D を参照し、1x ペプチドストック 140 μL を 560 μL の 31.3% BSA/PBS、pH 7.2 に希釈することにより、700 μL の 5 E-4 M ペプチド/BSA 溶液 (希釈 1) を調製します。5秒間の渦と5000 x gの室温で5秒間の遠心分離機。
注:この溶液の最終BSA濃度は25%(w / v)です。 - 表 2, カラム E-H を参照して、25% BSA/PBS、pH 7.2 の 630 μL に 70 μL のペプチド/BSA 溶液を加えて、5 E-4 M ペプチド/BSA ストックの 4 つの連続した 10x 段階希釈液を調製します。5秒間の渦と5000 x gの室温で5秒間の遠心分離機。
注:このステップの後、25%BSA/PBS、pH 7.2で5つの10倍段階希釈(5 E-4 Mから5 E-8 M)のペプチドが5回あります。最初の4つのサンプルは630μLを含む。最後のサンプルには700 μLが含まれます。 - 表2、列Iを参照して、pH7.2の25%BSA/PBS、700μLを含む陰性対照BSAサンプルを調製する(図1A)。
3. BSAペプチドゲルの調製
- ヒートブロックまたはサーモサイクラーが85°Cで安定していることを確認します。
- 表 3, 列 B-E を参照してください。一度に1つのサンプルを作業し、最初の25%BSA/ペプチドサンプル(希釈1)630μLに37%ホルムアルデヒドを加えます。5〜10秒以内に5回上下にピペッティングしてよく混ぜる。気泡を作らないでください。
注意:濃縮ホルムアルデヒドは有毒です。適切な安全上の注意を払って使用してください。- ペプチド/BSA溶液とホルムアルデヒド溶液を混合した後、密閉型微量遠心管を85°Cのヒートブロックに入れ、10分間置きます。
注:BSAペプチド溶液とホルムアルデヒドを十分に混合しますが、サンプルを熱にかける前に混合物をピペッティングに10秒以上費やさないでください。ホルムアルデヒド架橋はすぐに始まるので、手順を異なるサンプルに対して変化させると、ゲルは異なる形で形成され得る。これらのゲル中の最終BSA濃度は12.5%(w / v)です。最終BSA濃度が10%未満の場合、固化しないゲルを生じることがあります。最終BSA濃度が16%を超えると、ゲルがより脆く、処理後に切断しにくい場合があります。 - 希釈液2~4のそれぞれについて、ステップ3.2および3.2.1を繰り返します。
- 希釈5についてステップ3.2および3.2.1を繰り返すが、700μLの37%ホルムアルデヒドを、BSA抗原溶液の700μLに等しい容量で加える。
- 表 3 列の列 G を参照してください。陰性対照試料についてステップ3.2および3.2.1を繰り返し、700μLの37%ホルムアルデヒドを、700μLの陰性対照BSA溶液に等しい容量で加える。
- ペプチド/BSA溶液とホルムアルデヒド溶液を混合した後、密閉型微量遠心管を85°Cのヒートブロックに入れ、10分間置きます。
- 10〜12分後にヒートブロックからチューブを取り外します。加熱時間は、各サンプルについてできるだけ一致させる必要があります。ゲルをベンチトップで5~10分間冷やします(図1B)。
- 清潔で柔軟な使い捨て実験室用ヘラを用いて、微量遠心管からゲルサンプルを1枚に取り出し、少なくとも15mLの中性緩衝ホルマリン(NBF)を含む密閉容器に入れ、サンプルごとにNBFの別々の容器を使用する。
- あるいは、微量遠心管の底部を新しい片刃のカミソリ刃で切り取り、空気または適切なプローブでゲルを下から押し出します(図1C-G)。
注:固化したホルムアルデヒド/BSAゲルは、室温で最大24時間、微量遠心チューブに留まることができます。ゲルを微量遠心管に24時間以上放置すると、脆くなり、加工や切断が難しくなる可能性があります。
- あるいは、微量遠心管の底部を新しい片刃のカミソリ刃で切り取り、空気または適切なプローブでゲルを下から押し出します(図1C-G)。
4. BSAゲルのトリミング、加工、埋め込み
- 清潔なシングルエッジカミソリを使用して、ゲルコーンを厚さ約5mmの円筒形のディスクにトリミングします(図1H、I)。ディスクを生検ラップで包み、1つの大きなゲルディスクを1つのカセット(ステップ5のパイロット研究で使用する)に入れ、残りのゲルディスクを2番目のカセット(図2A、E)にまとめて、ステップ6の組織マイクロアレイ(TMA)構築に使用する。包んだゲルディスクを、明確にラベル付けされた組織加工カセットに入れます。
- 処理前にゲルサンプルあたり少なくとも15mLの10%NBFのカセットゲルを置き、各サンプルに対してNBFの別々の容器を使用する。ゲルは6〜48時間10%NBFに留まることができます。
- ゲルを自動組織学組織プロセッサで処理し、圧力と真空を伴う大規模な組織スケジュールに従います。各工程は1時間かかる:10%NBF、70%エタノール、95%エタノール(2回繰り返し)、100%エタノール(2回繰り返し)、キシレン(3回繰り返し)、パラフィンを60°Cで(3回繰り返す)。
注:サンプルを手動で処理することを選択する治験責任医師は、同じ試薬の順序と時間に従ってください。 - サンプル処理が完了したら、組織プロセッサからカセットを取り出し、パラフィン包埋センターに移動します。
- 生検ラップからゲルを包み込み、パラフィンにゲルを埋め込む。各サンプルについて、ゲルの1枚のディスクを15 mm x 15 mmの小さな型に埋め込み(図2B-D)、残りのゲルディスクを2番目の大きな型にまとめます(図2F-H)。1つのサンプルを含む最初のブロックは、パイロット研究でペプチドゲルをテストするために使用されます。2番目のブロックは、TMA構築に使用することができる。
5. ペプチド希釈系列のパイロット評価
- ペプチド希釈系列ごとに、合計 6 つの別々のセクション (5 つの希釈系列サンプルのそれぞれから 1 つのセクションと、BSA のみの陰性対照サンプルから 1 つのセクション) を含む 2 つのスライドガラスを作成する計画を立てます。
- 最初のスライドガラス上に、3つの最も高いペプチド濃度(2.5 E-4 M〜2.5 E-6 M)の1つのゲルディスクを含む小さなブロックのそれぞれから厚さ4 μmのセクションを1つ切り取ります。
- 2 番目のスライド上に、2 つの最低ペプチド濃度 (2.5 E-7 M および 2.5 E-8 M) を持つ各ブロックから厚さ 4 μm のセクションを 1 つ、BSA のみのコントロールブロックから 1 つのセクションを切り取ります。スライド上のサンプルの順序を記録します。
注:パラフィン包埋ゲルは滑らかに切断され、断片化、引き裂き、またはチャタリングアーチファクトなしで均一なセクションを生成することを期待してください。特定のパラフィン包埋ゲルサンプルを切片化することが困難な場合は、切片化する前にブロック面を氷冷蒸留水に短時間浸してください。必要に応じて、異なる浸漬時間または異なる溶液(例えば、アンモニア水)で実験する。 - 切片化後、スライドを室温(約23°C)で24時間乾燥させ、続いて60°Cで30分間乾燥させる。
- 各ペプチドについて調製した2つのスライドを、標準的なIHCプロトコルに従って所望の抗体で染色する。
注:この実証でウサギモノクローナル4B5に使用した一次抗体のスライド上の濃度は1.5 ug/mLでした。- 各ゲルセクション内で比較的均一なシグナルが見られ、異なるゲルサンプルはペプチド希釈物に対応するシグナル強度の範囲を示すことを期待してください。
- パイロット研究の結果が満足のいくものである場合、プロトコールの次のステップで説明するように、異なる濃度のペプチド抗原を含むゲルドナーブロックからTMAを構築する。
6. BSAゲルTMA構造
- ERBB2ペプチドの5つの希釈物すべてを含むBSAゲルおよびBSAゲルのみを含むドナーブロックからの直径1mmの重複コアを含む組織マイクロアレイを構築する。
注:必要に応じて、追加のネガティブコントロールとして、非標的ペプチドの同じ5つの希釈物を含むBSAゲルを含めます。所望により、陽性対照として代表的なERBB2発現細胞株のコアが挙げられる。 - TMAの厚さ4μmの切片を切断し、実験室標準プロトコルに従って1.5ug/mLの抗ERBB2/HER2/neuウサギモノクローナル4B5( 材料表を参照)で染色します。
- 得られた染色強度を検査により定性的に、またはデジタル画像スキャンおよび分析によって定量的に評価する(図3A、B)。
メモ:デジタル画像解析はこのプロトコルの焦点ではないため、これらの手順は読者が自分の好みに応じて実行するために残されています。
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Representative Results
ペプチドは、光学的に透明な溶液を形成するために、室温で適切な溶媒に完全に溶解すべきである。目に見える粒状物質が30〜60分後にまだ存在する場合、 表1で計算された5倍のペプチド原液の意図された体積を超えない元の溶媒または代替溶媒の追加体積を追加することが有用であり得る。同様に、ペプチド/BSAを組み合わせた溶液は半透明のままでなければなりません(図1A)。
ペプチド/BSAゲルサンプルは、37%ホルムアルデヒドで加熱した後、不透明なゴム状の塊を形成するはずです(図1B-I)。ゲルサンプルの軽微なフラクチャリングは、微量遠心チューブからの取り出し中に起こり得る(図3A)。これらは、後続の手順を妨げてはなりません。パラフィン包埋ゲルサンプルは、裂け目やチャタリングすることなくスムーズに切断する必要があります。不規則な引き裂きを示すゲル(図3B)は、ブロック面の攻撃性が低い、および/または氷水またはアンモニア水に短時間浸すことで恩恵を受ける可能性があります。ウォーターマークパターン内の可変的に減少した信号の領域は、1つ以上の染色試薬の分布が不均一である場合に生じ得る(図3C)。焦点的に増加した巨視的シグナルは、染色プロセスの任意の段階でゲル切片の下に試薬トラップがある場合に見られる(図3C)。正に帯電したスライドガラスの使用と、切片化後のスライドの慎重な乾燥により、このアーチファクトが減少する可能性があります。ゲルマトリックス中に抗原の不均一な分布がある場合、または局所的なゲル構造の変動が抗体-抗原相互作用を制限する場合、シグナル低下の微視的な領域が発生する可能性があります(図3D)。不完全なペプチド溶解は、低強度バックグラウンドでフォカルに強いシグナルの散乱領域をもたらし得る(図3E)。
適切な抗体と反応した後、陰性対照BSAのみのゲルサンプルは、最小限のシグナル(図4A)を示すはずであり、ダイナミックアッセイ範囲の2%〜3%未満が最適である。ごくまれに、反応条件の変更によって排除できない抗原を欠いているBSAゲル材料との有意な抗体相互作用が存在する可能性がある。個々のゲルサンプル中のシグナル強度は比較的均一でなければならず、抗原濃度の増加とともにサンプル中のシグナルは増加している必要があります(図4A、B)。絶対シグナル強度は、IHC染色に使用される抗原抗体の組み合わせおよび条件に応じて変化する。染色条件によっては、シグナルがバックグラウンドで存在する閾値抗原濃度と、シグナルが飽和する抗原濃度が存在する場合があります。いくつかのアッセイでは、バックグラウンド上のシグナルは、わずか2.5E-8Mペプチド2を有するサンプルにおいて可視であり得る。反復染色ランでは、各ゲルサンプルから切り出された切片のシグナル強度は、ランからランまで再現可能である必要があります。抗HER2抗体のこの適用において、広く使用されているMDA−175およびSK−BR−3細胞株コントロールを、ペプチドコントロールと比較するために同じ実験で染色した。MDA-175細胞(HER2 1+)の>10%はかすかな(図4C、D)の不完全な円周膜染色を示し、SK-BR-3細胞(HER2 3+)の>10%(図4E、F)は強烈な完全円周膜染色を示す。
シグナルの不在の考えられる理由としては、(1)ペプチド配列が抗体の機能的標的ではない;(2)染色プロトコルが、ゲル中に存在する抗原濃度を検出するように最適化されていない;(3)間違ったペプチド試料が染色された;(4)試薬または機器のエラー。シグナルが予想されないサンプルにおける考えられる理由としては、調製中に誤標識されたBSAゲルまたはペプチドサンプルとの一次抗体または検出試薬の非特異的反応性が挙げられます。
図1:ペプチド-BSAゲル調製物(A)PBS、pH 7.2中の25%(w/v)BSA(ペプチド無添加)。(B)等量の25%BSAと37%ホルムアルデヒド溶液を混合し、85°Cに10分間加熱して形成したゲル(C-G)室温で5〜10分間冷却した後、BSAゲルを可撓性使い捨てヘラを用いて微量遠心管から除去することができる。(H-I)無傷のゲルは、加工および埋め込みの準備のために〜5mmの厚さのディスクにスライスされる。スケールバーは1cmです。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:処理および包埋のためのBSAゲルサンプルの調製。 (A-D)BSAゲルの単一ディスクを含むパラフィンブロックの調製。(A)BSA抗原ゲルを、処理前に生検組織に包む。(b)パラフィン浸潤後、半透明になったゲルディスクを包埋中心加熱ステージ上に載置し、包み外す。(C)単一のゲルディスクを、流動パラフィンを含む15mm×15mmの包埋型に入れる。(D)完成したパラフィンブロックは、切片化の準備ができている。(E-H)BSAゲルの複数のディスクを含むパラフィンブロックの調製。上記の図A~Dに関しては、残りのゲルサンプルが処理され、TMA構築のための材料を提供するために1つのブロックに埋め込まれる。スケールバーは1cmです。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:ゲル調製および染色アーチファクト(A)コアは、処理および/または埋め込みステップ中に導入された軽微なフラクチャリングを示す可能性がある。焦点暗化は、セクションの下の試薬トラップを反映し得る。(B)ゲル材料の引き裂き(染色された切片では不規則な空隙として見られる)は、切片化前にブロックを過剰または過小浸すことから生じる可能性がある。(c)不規則な透かし染色パターンは、1つ以上の染色ステップにおける不均一な試薬分布によって引き起こされ得る。(D)BSAペプチド構造の顕微鏡的パターニングは、特により高いペプチド濃度で見られることがある。(e)不完全なペプチド溶解は、低強度バックグラウンドで焦点信号を有する星空パターンを生成し得る。スケールバーは200μm(A-C)または20μm(D、E)です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:染色されたERBB2/HER2ペプチドTMAをERBB2/HER2 1+および3+細胞株で染色した。 (A)ペプチドを含まないTMAコア(左列)またはERBB2ペプチドを2.5E-8 M~2.5 E-4 Mの範囲の濃度で複製し、メーカーの推奨に従って抗HER2/neuクローン4B5で染色した。ペプチド濃度の増加を伴うコアは、シグナルの段階的な増加を示す。(B)パネルAに示すTMAコアをデジタルスキャンし、平均画素強度[0.01 x (100 - % 透過率) x 255]対ペプチド濃度をプロットした。(C-F)ERBB2/HER2発現細胞株MDA-175(HER2 1+、C,D)およびSK-BR-3(HER2 3+、E,F)を含む細胞株陽性対照をBSAペプチドゲルを含むTMAに含め、細胞株とBSAペプチドゲルのシグナル強度を同じスライド上で比較できるようにした。スケールバーは、500 μm (A)、250 μm (C、E)、および 20 μm (D、F) です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ある | B | C | D | E | F | G | H | |||
| ペプチド名 | ペプチド配列 | メガワット (ダ) | ペプチド純度(%) | 提供されるペプチド質量(mg) | サンプル中のペプチドのモル数(純度の補正を含む) | 1.25 e-2 Mストックを得るためにペプチドを再懸濁する溶媒の容量(マイクロリットル) | 溶媒 | |||
| ERBB2 / HER2 | Ac YGSGTPTAENP EYLGLDVPVGSGCアミド |
2424.6 | 95.0 | 20.0 | 7.84E-06 | 626.9 | ティッカー | |||
表1:ペプチドストックの調製のための計算。
| ある | B | C | D | E | F | G | H | 私 |
| 管 | 5xペプチドストック | 1xペプチドストック | 希釈液1 | 希釈液2 | 希釈3 | 希釈4 | 希釈率5 | 負のコントロl |
| [ペプチド]ストック(M) | 1.25*10-2 | 2.5*10-3 | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | 何一つ |
| ペプチド溶液 (溶媒中) |
>30 uL | 5 倍速から 30 uL (1.25E-2 M) ペプチドストック |
1x から 140 uL (2.5E-3 M) ペプチドストック |
70 uL から 希釈液1 |
70 uL から 希釈液2 |
70 uL から 希釈3 |
70 uL から 希釈4 |
何一つ |
| 溶剤量 | 120 ウル | |||||||
| 最終ペプチド 在庫量 |
150 uL | |||||||
| 31.3% BSA / PBS 容積 |
560 ユーロ 31.3% BSA |
|||||||
| 25% BSA / PBS 容積 |
630 ウル 25% BSA |
630 ウル 25% BSA |
630 ウル 25% BSA |
630 ウル 25% BSA |
700 uL 25% BSA |
|||
| BSA中の希釈ペプチドの量 | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL |
表2:BSAペプチド希釈液の調製のための計算。
| ある | B | C | D | E | F | G |
| 管 | 希釈液1 | 希釈液2 | 希釈3 | 希釈4 | 希釈率5 | ネガティブコントロール |
| 希釈BSA中のペプチドの残存量 | 630 ウル | 630 ウル | 630 ウル | 630 ウル | 700 uL | 700 uL |
| [ペプチド](m)希釈BSAで | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | 何一つ |
| 添加する37%ホルムアルデヒドの量 | 630 ウル | 630 ウル | 630 ウル | 630 ウル | 700 uL | 700 uL |
| 最終[ペプチド](M) ゲル中 |
2.5*10-4 | 2.5*10-5 | 2.5*10-6 | 2.5*10-7 | 2.5*10-8 | 何一つ |
表3:BSA-ホルムアルデヒドゲルの調製のための計算。
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Discussion
この方法により、ユーザーは、ほとんどの組織学研究所で使い慣れた材料と技術を使用して、IHC反応の標準として既知の組成と抗原濃度の均一なサンプルを作成できます。最も重要なステップは、目的の抗体が結合するエピトープを特定することです。このプロトコルは、ERBB2/HER2 ICDからの線状ペプチド抗原の使用を記載している。同じプロトコールを使用して、オリゴヌクレオチド、蛍光標識、タンパク質ドメイン、または完全長タンパク質を含むBSAゲルを形成することができる。この後者のアプローチは、単一の線状ペプチド配列によって再作成されない立体構造エピトープに結合する抗体にとって有用であり得る。例えば、マウス、ラット、ウサギの0.1 mg/mLナイーブIgGを含むBSAゲル標準物質をプロセスコントロールとして使用して、二次検出および染色ステップが期待どおりに機能したことを確認することができます。
ここで説明する抗原-BSAゲル法は、IHC反応を制御および標準化するための他の技術を補完するものです。標的抗原の発現レベルが十分に特徴付けられた細胞株および組織サンプルは、十分に制御されたIHCプロトコル1、3、4に不可欠であった。スライドガラスおよびガラスビーズの表面に結合されたペプチドは、定量的対照として提案されている7、8、9。潜在的な方法のそれぞれには、重複する利点と制限があります。BSA抗原ゲルにはいくつかの利点があります。それらは作るのが簡単で、様々な抗原組成および濃度に適応可能である。彼らは、組織サンプルの3次元構造の一部を再現しながら、生物学的サンプルに見られる固有の不均一性を制御します。合成抗原ゲルは、検出限界以下から生体試料に含まれる最高濃度(~10-4M)2まで、ユーザーが選択可能な抗原濃度で作製できるため、AQUA18やイメージング質量分析19などの最新技術で実施されるアッセイを校正および標準化する機会を提供します。そのダイナミックレンジは、従来の発色性IHCをはるかに超えています。加えて、本方法は、複数の抗原を組み込むコントロールを可能にし、これはマルチプレックスアッセイ開発および標準化において使用することができる。
この方法では、ユーザーは目的の抗体のエピトープを知る必要がありますが、多くの抗体は十分に文書化された線状エピトープに結合します。エピトープマッピング技術20、21、22は、未定義の直鎖状エピトープを同定することができ、そして既知の直鎖状エピトープを含む合成ペプチドを、控えめなコストで購入することができる。他の抗体は、直鎖状ペプチドによって再生されないが、タンパク質全体またはタンパク質ドメインにおいて保存される立体構造エピトープに結合する。これらの抗体のいくつかについて、標的抗原の組換え形態が市販されている。
最適な均一性と再現性を備えた対照サンプルを作成するには、ペプチドまたは他の標的抗原を完全に溶解し、BSA溶液に慎重に希釈する必要があります。また、BSA/ペプチド溶液と37%ホルムアルデヒドの効率的かつ迅速な混合は、サンプルがゲル化し始める前に行われ、混合サンプルを85°Cで10分間速やかに配置することも不可欠です。過剰固定および加工アーチファクトを回避するために、ゲルは、推奨されるスケジュールに従って処理およびパラフィン包埋によって採取されるべきである。
ここで説明する方法のバリエーションは、特定のコンテキストで役立つ場合があります。例えば、代替のN末端およびC末端ペプチド配列は、BSA2に結合したペプチドの検出を最適化するために使用され得る。タンパク質の極端なC末端からのエピトープを認識する抗体は、天然配列のC末端修飾に対して可変的に感受性であり得ることが予想される。ペプチド-BSAゲルサンプルは、固定液なしで85°Cで10分間加熱することによって形成することもでき、次いで凍結ブロックとして調製するか、または様々な化学薬品で後固定する2。加えて、ペプチドコンジュゲーションは、マレイミド化学または本明細書に記載される以外の他の方法を用いて達成することができる。
細胞株や組織などの生物学的サンプルは、生命においてのみ見られる多くの変数の複雑さを表す対照としての利点を有する。一方、組織および細胞標準はどちらも内部的に不均一であり、サンプルごとに可変であるため、実行から実行への可変染色の解釈は交絡します。さらに、組織や細胞中の抗原濃度は定性的にしか知られていないことが多いが、定量的質量分析の使用の増加に伴い、絶対タンパク質濃度がより頻繁に報告されている23。ここで説明するBSA抗原コントロールは、細胞および組織中のタンパク質の空間的および生物学的文脈を意図的に排除する。このため、これらのコントロールに見られるIHCシグナル強度と抗原濃度との相関関係は、組織で見られることを不完全に再現し得る。ここで説明する合成コントロールは、IHC アッセイ性能のいくつかの側面を最適化および標準化するのに役立ちます。それでも、それらは他の対照試料の適切な使用の必要性を妨げるものではない。例えば、標的組織における潜在的な非特異的染色は、陰性組織対照試料の並行使用によってのみ評価することができる。さらに、BSA抗原ゲルコントロールは、IHC性能に影響を与える可能性のある温冷虚血時間、タンパク質分解、または固定および処理条件を含む、組織特異的な事前分析変数を再現しません。したがって、他の場所でより詳細に議論されているように、研究者はIHCシステムの性能を正確に特徴付けるために細胞および組織標準を慎重に使用すべきである。
BSA抗原コントロールは、染色プロトコールを開発または最適化するために使用され、確立されたプロトコールの再現性を評価する際の実験室内およびラボ間の参照サンプルとして機能します。明確に定義された標準サンプルへのアクセスにより、ユーザーはIHC反応挙動をより厳密に特性評価し、染色性能の変動を特定し、特定の目標を達成するために反応条件を最適化することができます。
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Disclosures
チャールズ・A・ハブナー、キャシー・J・ヘッツェル、チャールズ・A・ジョーンズ、カーミナ・M・エスピリトゥ、リンダ・K・ランゲル、フランクリン・V・ピールは、ジェネンテックとロシュの従業員および株主です。彼らの関連会社は、この研究で使用された試薬と器具を生産しています。
Acknowledgments
著者らは、ペプチド合成の同僚であるJeffrey TomとAimin Song、TMA構築のNianfeng Ge、IHC染色のShari Lau、デジタル顕微鏡スキャンのMelissa Edick、デジタル画像定量化のHai Nguに感謝の意を表している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
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