Summary
يصف هذا البروتوكول عزلة وثقافة الخلايا القرنية الفموية المشتقة من الحنك الفأري البالغ. كما يتم الإبلاغ عن طريقة تقييم تستخدم التثبيط المناعي.
Abstract
لسنوات, وقد أجريت معظم الدراسات التي تنطوي على keratinocytes باستخدام الإنسان والفأر الجلد البشرة keratinocytes. في الآونة الأخيرة، جذبت الكريات الكيراتينية عن طريق الفم الانتباه بسبب وظيفتها الفريدة وخصائصها. أنها تحافظ على التوازن من الظهارة الفموية وبمثابة موارد للتطبيقات في العلاجات التجديدية. ومع ذلك ، في المختبر الدراسات التي تستخدم الكيراتينيات الأولية عن طريق الفم من الفئران البالغة كانت محدودة بسبب عدم وجود بروتوكول ثقافة فعالة وراسخة. هنا، تم عزل الكريات الكيراتينية الأولية عن طريق الفم من أنسجة الحنك للفئران البالغة ومثقفة في وسط تجاري منخفض الكالسيوم مكمل بمصل chelexed. في ظل هذه الظروف ، تم الحفاظ على الخلايا القرنية في حالة التكاثر أو تشبه الخلايا الجذعية ، وتم منع تمييزها حتى بعد زيادة الممرات. أظهر تحليل تعبير العلامة أن الخلايا القرنية الفموية المثقفة عبرت عن علامات الخلايا القاعدية p63 و K14 و α6-integrin وكانت سلبية لعلامة التمايز K13 وعلامة الخلايا الليفية PDGFRα. أنتجت هذه الطريقة خلايا قابلة للحياة وقابلة للزراعة مناسبة لتطبيقات المصب في دراسة وظائف الخلايا الجذعية الظهارية الفموية في المختبر.
Introduction
الظهارة الفموية بمثابة الحاجز الأول في حماية الجسم من الضغوط البيئية، بما في ذلك الأضرار الكيميائية أو المادية والالتهابات البكتيرية والفيروسية1،2. تتكون الغشاء المخاطي الفموي من طبقة خارجية من الظهارة الحرشفية الطبقية التي تتكون من خلايا القرنية والأنسجة الضامة الأساسية تسمى البربريا الصفيحة ، والتي تتكون بشكل رئيسي من الخلايا الليفية والمصفوفة خارج الخلية. يمكن تقسيم الغشاء المخاطي الفموي للفأر على نطاق واسع إلى ثلاثة أنواع فرعية: المصطكي (الحنك الصلب واللثة) ، المتخصصة (اللسان الظهري) ، والبطانة (الغشاء المخاطي ، اللسان البطني ، الحنك الرخو ، الشفاه) الغشاء المخاطي 2،3 (الشكل 1A). الظهارة الفموية هي الكيراتينية في الغشاء المخاطي المصطكي والمتخصصة وغير الكيراتينية في الغشاء المخاطي بطانة. على الرغم من موقعه التشريحي ، فإن الظهارة الفموية تشبه البشرة من حيث أنها تتكون من خلايا ظهارية معبأة بإحكام بدرجات متفاوتة من التمايز: طبقات أساسية تحتوي على خلايا غير متمايزة ؛ طبقات أساسية تحتوي على خلايا غير متمايزة ؛ طبقات ظهارية ذات طبقات غير متمايزة ؛ طبقات ظهارية ذات نهايات ظهارية غير متمايزة ؛ طبقات ظهارية ذات نهايات مختلفة ؛ طبقات ظهارية متمايزة ؛ طبقات ظهارية ذات نهايات ظهارية متمايزة ؛ طبقات ظهارية تحتوي على خلايا غير متمايزة . طبقات شائكة، حبيبية، وكورنية تشكل ظهارة الكيراتينية، أو الطبقات المتوسطة والسطحية التي تشكل ظهارة غير القرنية4. وقد سهلت نماذج الماوس المعدلة وراثيا دراسة السمات الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية الظهارية الفموية في الحنك والغشاء المخاطي واللسان واللثة 6,7,8,9,10,11. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الدراسات تستخدم في المقام الأول في تجارب الماوس فيفو. ولم تستخدم نظم زراعة الخلايا عادة بسبب الافتقار إلى بروتوكولات راسخة وفعالة.
يمكن استخدام نظام زراعة في المختبر للتحليل الجزيئي والكيميائي الحيوي لمنظمي الخلايا الجذعية، والفحوصات المستندة إلى الخلايا، وفحص الأدوية. حاليا، تم تطوير بروتوكولات لثقافة الخلايا القرنية الأولية للبشرة البشرة، والتي يمكن فيها عزل خلايا القرنية القاعدية بنجاح واستزراعها لأغراض سريرية وبحثية12,13,14,15. في عام 1980، أظهرت هينينغز وآخرون أن تركيز الكالسيوم المنخفض (< 0.09 mM Ca2+) في وسط الثقافة سهل الانتشار وحافظ على الخلايا في حالة غير متمايزة. وعزز ارتفاع مستوى الكالسيوم تمايز الخلايا وخفض الانتشار16. وفي وقت لاحق، تم وضع منهجيات ثقافية لخلايا القرنية النيدرماية الوليدية والبالغة وتطبيقها على نطاق واسع على العديد من نماذج الماوس ذات الخلفيات الجينية المختلفة للدراسات المختبرية17,18,19. على الرغم من أن الجلد والظهارة الفموية يشتركان في خصائص مشتركة، إلا أنهما يظهران أيضا اختلافات جوهرية، على سبيل المثال، في حالة الكيراتين، ومعدل الدوران، والتعبير الجيني، وقدرة التئام الجروح3،11،20،21،22،23،24،25،26.
على الرغم من أن الإنسان عن طريق الفم keratinocyte الثقافة قد أجريت بنجاح27,28,29, المنشورات على الماوس عن طريق الفم keratinocyte culture30,31,32 محدودة بسبب صغر حجم الأنسجة المستهدفة والخصائص المتميزة للخلايا مقارنة مع خلايا القرنية البشرة الجلد. يصف هذا البروتوكول تقنيات العزلة والثقافة طويلة الأجل لخلايا القرنية الفموية الأولية للفأر.
Protocol
وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة التجارب الحيوانية المؤسسية في جامعة كوماموتو وجامعة تسوكوبا.
1. إعداد الكواشف ووسائل الإعلام الثقافية
- إعداد 40 مل من الخلايا الكيراتينية المتوسطة التي تحتوي على 60 ميكرومتر من الكالسيوم و 600 ميكرولتر من محلول مضاد للمضادات الحيوية. إعداد 20 مل من 0.025٪ تريبسين و 400 ميكرولتر من المضادات الحيوية المضادة للذهان الحل.
- إذابة محلول تثبيط التريبسين في درجة حرارة الغرفة والاحتفاظ بها عند 4 درجة مئوية حتى استخدامها في الخطوة 4.1.
ملاحظة: يتم إعداد كاشف العزل لعزل الأنسجة من خمسة فئران.
- إذابة محلول تثبيط التريبسين في درجة حرارة الغرفة والاحتفاظ بها عند 4 درجة مئوية حتى استخدامها في الخطوة 4.1.
- لإعداد وسائل الإعلام الثقافية، واتخاذ 500 مل من المتوسط وإضافة 5 مل من محلول ملحق النمو (انظر جدول المواد) (يشار إليها فيما بعد باسم المتوسطة كاملة) و 20٪ من الكالسيوم المنضب مصل البقري الجنين (FBS)33 (يشار إليها فيما بعد باسم chelexed-FBS).
2. تشريح أنسجة الحنك من فأر بالغ
- التضحية بفأر C57BL/6J بالغ (ذكرا أو أنثى) عن طريق خلع عنق الرحم وفقا للوائح المرفق المتعلقة برفاهية الحيوان.
- إزالة الشعر حول الفم مع ماكينة حلاقة. باستخدام مقص، وقطع من الخد نحو الفك، على كلا الجانبين.
ملاحظة: يجب تخدير الماوس قبل التضحية. يتم استخدام خليط مخدر من ميدتوميدين، ميدازولام، وبوتورفانول (انظر جدول المواد).
- إزالة الشعر حول الفم مع ماكينة حلاقة. باستخدام مقص، وقطع من الخد نحو الفك، على كلا الجانبين.
- استخدم ملقط لفتح الفم على مصراعيه وامتصاص أي دم باستخدام مسحة قطنية. لتطهير الحنك، امسح داخل الفم بمسحة قطنية تحتوي على 10٪ من اليود البوفيدون.
- لحصاد الحنك الماوس، أولا، استخدم شفرة مشرط الجراحية لجعل شق هامشي كامل سمك على طول الجانب الحنك من الأسنان الفك العلوي. ثم، تشريح بعناية الحنك بأكمله باستخدام raspatorium.
ملاحظة: الراستاتوريوم هو أداة تستخدم لرفع رفرف متملق (انظر جدول المواد) (الشكل 1B). - نقل بسرعة أنسجة الحنك إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 4 مل من محلول متوسط + مضاد حيوي مضاد للذهان. إبقاء الأنسجة على الجليد حتى تصبح جاهزة للحضانة.
ملاحظة: لجمع من الفئران متعددة، يمكن الاحتفاظ أنسجة الحنك على الجليد لمدة تصل إلى 4 ساعة.
3. المعالجة المسبقة لأنسجة الحنك
- في غطاء تدفق صفح، نقل الأنسجة إلى طبق 60 ملم تحتوي على 4 مل من محلول متوسط كامل + مضاد حيوي مضاد للعضلات.
- باستخدام ملقط قصير، حاد وشفرة مشرط، بلطف إزالة أي دم من الأنسجة. غسل الأنسجة 10 مرات في وسط كامل.
- نقل الأنسجة إلى طبق 35 ملم يحتوي على 4 مل من 0.025٪ تريبسين + محلول مضاد للمضادات الحيوية، مع سطح الظهارية التي تواجه أسفل.
ملاحظة: يجب أن يكون سطح الظهارية، الذي ينحني إلى الداخل، غارقة في الحل تريبسين؛ يجب أن تواجه بروبريا lamina. وينبغي تسوية الأنسجة قدر الإمكان ليتم احتضانها تماما في حل تريبسين. - احتضان الأنسجة في 0.025٪ تريبسين ل ~ 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة الثقافة.
4. جمع وثقافة الخلايا الأساسية
- باستخدام زوج واحد من ملقط حاد، وإزالة الأنسجة من محلول تريبسين (في طبق 35 ملم) ونقل إلى محلول مثبط تريبسين في طبق 60 ملم (4 مل لكل طبق) مع سطح الظهارية التي تواجه ما يصل.
- باستخدام ملقط للتمسك حافة الحنك، كشط بلطف طبقة الظهارية قبالة بروبريا الصفيحة الكامنة باستخدام شفرة مشرط.
ملاحظة: لا يتم هضم النسيج الضام عن طريق التريبسين، لذلك لا يقشر أثناء كشط. - لجمع أكبر قدر ممكن من الخلايا الظهارية من الأنسجة، نقل الأنسجة إلى طبق آخر 60 ملم مع 4 مل متوسطة كاملة وتكرار خطوة كشط.
ملاحظة: تأكد من تجنب كشط الأنسجة مع طرف النصل. استخدام حافة النصل بدلا من ذلك. يتم إجراء كشط لمدة 5-10 دقيقة لكل نسيج. - ضع مصفاة خلية معقمة 100 ميكرومتر على الجزء العلوي من أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
- باستخدام ماصة معقمة، نقل 2 مل من محلول تريبسين (من الخطوة 4.1) إلى مصفاة لتبلل سطحه.
- باستخدام ماصة، اخلط تعليق الخلية في طبق 60 مم (من الخطوات 4.2-4.3) عدة مرات وتصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر المعدة في الخطوات 4.4-4.5.
- عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم. إعداد 15 ميكرولتر من الحل الأزرق تريبان وإضافة 15 ميكرولتر من تعليق الخلية (الخطوة 4.6). نقل 10 ميكرولتر من مزيج أزرق خلية تريبان إلى مقياس الدم وعدد الخلايا.
ملاحظة: قطعة واحدة من الحنك الماوس يمكن أن تسفر عن ما يصل إلى 1 مليون خلية. - أثناء العد، طاردة مركزية الأنبوب (من الخطوة 4.6) في 100 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- يستنشق الناسخة الفائقة بماصة. إضافة 2 مل من المتوسطة كاملة + chelexed-FBS إلى الأنبوب. Resuspend بيليه الخلية عن طريق التحوير عدة مرات باستخدام ماصة 5 مل.
- لوحة 2-5 × 105 خلايا من فأر واحد في بئر واحد من لوحة 24 جيدا المغلفة مسبقا مع الكولاجين النوع الأول (انظر جدول المواد).
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة يومين دون تغيير الوسط.
- بعد يومين من البذر، استبدل نصف الوسط الثقافي بالوسط الكامل + chelexed-FBS. تحقق من مورفولوجيا الخلية تحت المجهر. تغذية الخلايا مع المتوسطة كاملة + chelexed-FBS كل 2 أيام.
ملاحظة: بعد البذر، سيتم ملاحظة خلايا من أحجام مختلفة. بعد حوالي 3-5 أيام من البذر ، يمكن ملاحظة خلايا القرنية ذات مورفولوجيا المرصوفة بالحصى (الشكل 2). وسوف يستغرق 1-2 أسابيع من الثقافة قبل أن يمكن إجراء المقطع الأول وبعد 1-2 أسابيع ضرورية قبل الخلايا جاهزة للمقاطع الثاني والثالث. بعد ذلك، سوف تنمو الخلايا بشكل أسرع ويمكن أن تكون مستعدة لالتبريد. يمكن إعادة طلاء الخلايا إلى بئر واحد (من لوحة من 24 بئرا) ولوحة من 6 آبار في الممر الأول والثاني على التوالي. وسوف يعتمد المرور اللاحق على نمو الخلايا وكثافتها. يمكن استخدام نسبة انقسام الخلية من 1:2 أو 1:3 بعد المقطع الثالث.
5. مرور الكرياتينية
- جمع 2 مل من supernatant من طبق الثقافة والاستغناء في أنبوب مخروطي 15 مل (على الجليد). غسل الخلايا مع عقيمة 1x برنامج تلفزيوني مرتين.
ملاحظة: عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -80٪ تقريبا، تكون جاهزة للمرور. - إضافة 1 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى الطبق إلى بئر واحد من لوحة 6-جيدا.
- حضانة لمدة 5-15 دقيقة في 37 درجة مئوية؛ تحقق بعد 5 دقائق لمعرفة ما إذا كانت الخلايا تنفصل عن الطبق.
- تحييد رد الفعل باستخدام 1 مل من محلول تثبيط التريبسين و 2 مل من الثقافة الكاملة المتوسطة + chelexed-FBS عن طريق pipetting لطيف. بعد ذلك، نقل تعليق الخلية إلى نفس أنبوب مخروطي 15 مل كما هو الحال في الخطوة 5.1.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 100 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق supernatant مع ماصة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 1 مل من المتوسطة ثقافة كاملة.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. بعد ذلك ، لوحة 1 مل من تعليق الخلية في لوحة ثقافة جديدة 24 - أو 6 جيدا.
ملاحظة: يمكن تجميد بعض الخلايا من الممرات المبكرة في خليط من 70٪ ثقافة كاملة المتوسطة + 20٪ chelexed-FBS + 10٪ DMSO. 1-2 يمكن جمع cryovials من الخلايا من لوحة واحدة ثقافة التقاء.
6. التبريد واستعادة الخلايا الكيراتينية
- تجميد الخلايا
- تنمو الكريات الكيراتينية إلى 80٪ -90٪ التقاء.
ملاحظة: لا تسمح للخلايا بالزيادة، لأن هذا يمكن أن يقلل من حالة الانتشار وقابليتها للاستمرار. - علاج الخلايا القرنية في الطبق مع 0.05٪ تريبسين-EDTA, كما هو موضح في الخطوات 5.1-5.5.
- عد الخلايا القرنية باستخدام مقياس الدم. إعداد cryovials على أساس أرقام الخلايا المحسوبة للسماح لنقل 1 × 106 خلايا / مل إلى كل قارورة.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 100 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في حل 10 مل من 10٪ DMSO + 20٪ chelexed-FBS + 70٪ متوسط ثقافة كاملة (9 مل من المتوسط الكامل + chelexed-FBS و 1 مل من DMSO).
- الاستغناء عن الخلايا في cryovials في 1 مل من التعليق لكل قارورة. ضع القنينات في حاوية تخزين مبردة بين عشية وضحاها عند -80 درجة مئوية. نقل قوارير إلى خزان النيتروجين السائل في اليوم التالي.
- تنمو الكريات الكيراتينية إلى 80٪ -90٪ التقاء.
- استرداد الخلية
- إزالة cryovial من خزان النيتروجين السائل وتذوب جزئيا في درجة حرارة الغرفة. في أنبوب 15 مل، اخلط 1 مل من تعليق الخلية مع 3 مل من متوسط الثقافة الكامل + chelexed-FBS.
- طارد مركزي الخليط لمدة 5 دقائق في 100 × ز و 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 1 مل من الثقافة الكاملة المتوسطة + chelexed-FBS.
- لوحة تعليق الخلية في جديد 60 مم الكولاجين I المغلفة أطباق الثقافة. استبدال المتوسطة الثقافة كل 2-3 أيام ومرور الخلايا مرة واحدة التقاء.
7. تلطيخ المناعة
- زراعة الخلايا القرنية الفموية على الأغطية المربعة (22 مم × 22 مم) في لوحات 6 آبار (5 × 105 خلايا / جيدا) لمدة يومين.
- إصلاح الخلايا القرنية في حل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) وبرنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الغسيل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x.
- Permeabilize الخلايا في حل من 0.1٪ تريتون في برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا في حجب الكاشف (2.5٪ مصل الماعز، 2.5٪ مصل حمار) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، تليها الحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد) في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدمت الأجسام المضادة الأولية في التخفيفات التالية: أرنب المضادة K14 (1:1000)، الفئران α6-integrin (1:100)، أرنب المضادة P63 (1:500)، أرنب المضادة K13 (1:100)، والماعز المضادة PDGFRα (1:100). - غسل العينات في حل من 0.1٪ تريتون في برنامج تلفزيوني، تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا 488 أو 555) في تخفيف 1:300. - مكافحةتتحوين جميع العينات مع الحل Hoechst لمدة 10 دقيقة وجبل الخلايا على الشرائح الزجاجية.
ملاحظة: يستخدم محلول Hoechst لتلطيخ نواة الخلايا. - إجراء تصوير العينة باستخدام مجهر كونفوجكال.
ملاحظة: يتم ضبط السطوع والتباين على نفس الكثافة باستخدام برنامج تحرير الصور.
Representative Results
نظرة عامة على عملية تشريح وعزل الخلايا القرنية الفموية من الحنك الماوس الكبار
تم جمع الكريات الكيراتينية الفموية المفككة من حنك الفأر البالغ ومثقفة في chelexed-FBS مخصصة بنسبة 20٪. يتكون الحنك الفأري من الحنك الصلب والحنك الرخو (الشكل 1C). يتم تلخيص الإجراء لعزل الخلايا القرنية الفموية الماوس في الشكل 1D. يتم تشريح أنسجة الحنك ونقلها إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على محلول مضاد للمضادات الحيوية قبل احتضانها في محلول التريبسين 0.025٪ عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، يتم علاج نسيج الحنك بمحلول مثبط التريبسين ووسط الثقافة الكامل بكميات متساوية. في وقت لاحق، يتم كشط الأنسجة باستخدام شفرة مشرط الجراحية لجمع الخلايا القرنية عن طريق الفم. تتم تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر والطرد المركزي. ثم يتم بذر الخلايا في الكولاجين I المغلفة 24-جيدا لوحات تحتوي على 2 مل من الثقافة الكاملة المتوسطة + chelexed-FBS.
النتائج التمثيلية للعزل الناجح لخلايا القرنية الفموية الماوس
نمت الخلايا القرنية الفموية الأولية كطاجنة واحدة وعرضت مورفولوجيا مرصوفة بالحصى (الشكل 2). كانت مستعمرات الكيراتينوسي الصغيرة مرئية في 3-5 أيام (الشكل 2A، B)؛ نمت هذه أكبر وشكلت مستعمرات ضيقة في 1 أسبوع من الحضانة (الشكل 2C). أظهرت مستعمرات الكيراتينية السمات المورفولوجية النموذجية لخلايا القرنية القاعدية ، مما يشير إلى ظروفها الصحية. ظلت الخلايا القرنية الفموية البشرية غير متمايزة لعدة مقاطع في وسط الثقافة الكامل الذي يحتوي على 0.06 mM Ca2 +16,28. تم تنفيذ المقطع الأول حوالي أسبوعين من الطلاء الأولي (الشكل 2D). في المقاطع اللاحقة، أظهرت الخلايا القرنية نموا مستقرا مع فترة أقصر من الثقافة (الشكل 2E-G). توقفت الخلايا الكيراتينية عن النمو إذا حدث تلوث كبير في الخلايا الليفية أثناء عملية العزل (الشكل 2H).
الخلايا الكيراتينية الفموية الماوس معزولة التعبير عن علامات الخلايا القاعدية
لتأكيد حالة الخلايا الكيراتينية الفموية الأولية، تم إجراء التأني المناعي باستخدام علامات الخلايا القاعدية كيراتين 14 (K14) وα6-integrin34. تم التعبير عن K14 و α6-integrin في الخلايا الكيراتينية بعد الترسيب (الشكل 3A، B). كما كانت الخلايا ملطخة بعلامة الخلايا الجذعية P63 لتأكيد جذعها. وأظهر المرور المبكر (المقطع 4) والمرور المتأخر (المقطع 7) الخلايا تعبيرا موحدا عن P63 (الشكل 3C، D). في المقابل، أظهرت خلايا القرنية المعالجة بارتفاع الكالسيوم (1.2 mM التعريفي لمدة يومين) انخفاض التعبير p63 (الشكل 3E)، مما يشير إلى أن علاج الكالسيوم العالي يقمع الجينات المرتبطة بالخلايا الجذعية في خلايا القرنية الأولية كما ذكر سابقا16. وأظهرت علامة التمايز الكيراتين 13 (K13) نادرة أو معدومة التعبير في كل من المقاطع المبكرة والمتأخرة والتعبير كبيرة تحت علاج الكالسيوم عالية (الشكل 3F-H). لاختبار إمكانية تلوث الخلايا الليفية في زراعة الخلايا الكيراتينية ، تم إجراء التلطيخ باستخدام علامة الخلايا الليفية PDGFRα بنفس المجموعة من الخلايا الكيراتينية مقارنة بالخلايا الليفية الجنينية للفأرة (MEFs). لم يكن هناك تعبير عن PDGFRα في ثقافة الخلايا الكيراتينية ، مقارنة بالتعبير العالي الملاحظ في خلايا MEF (الشكل 3I-3L). وأشارت هذه النتائج إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن يعزل بنجاح الخلايا القرنية القاعدية والحفاظ على هذه الخلايا في الحالة غير المتمايزة.
الشكل 1: نظرة عامة على إجراء تشريح وعزل الخلايا القرنية الفموية الماوس. (أ) التمثيل التخطيطي تجويف الماوس عن طريق الفم. (ب) الأدوات المستخدمة لتشريح الحنك وعزل خلايا القرنية الفموية الماوس. (ج) صورة برايتفيلد للحنك الماوس. شريط المقياس: ملخص البروتوكول 100 ميكرومتر (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية للعزلة الناجحة لخلايا القرنية الفموية الماوس. (A-G) صور الدورة الزمنية لخلايا القرنية الفموية الأولية المستزرعة في 3 أيام (A) و 5 أيام (B) وأسبوع واحد (C) وأسبوعين (D) من الثقافة بعد العزلة. تظهر مورفولوجيات الخلايا القرنية الفموية للفأرة بعد المقاطع الأولى (E) والثانية (F) والثالثة (G). (ح) مثال على تلوث الخلايا الليفية في زراعة الخلايا الكيراتينية الفموية الماوس. شريط المقياس: 400 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الخلايا القرنية الفموية الماوس معزولة التعبير عن علامات الخلايا القاعدية. (أ-ب) صور تمثيلية لتلطيخ المناعة من K14 (A; الأحمر) وα6-integrin (B; الأخضر) في المقطع 4. (C-E) صور تمثيلية لتلطيخ المناعة من p63 (أخضر) في الممر 4 (C) ، المقطع 7 (D) ، وعلاج الكالسيوم العالي (E). (F-H) صور مناعة ل K13 (أخضر) في الممر 4 (F)، المقطع 7 (G)، وعلاج الكالسيوم العالي (H). (I-L) صور مناعة ل PDGFRα (أحمر) في المقطع 4 (I) ، المقطع 7 (J) ، علاج الكالسيوم العالي (K) ، و MEFs (L). النوى ملطخة هويشست (الأزرق). أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وقد استخدمت الخلايا الكيراتينية الأولية المعزولة عن البشرة البشرية أو الماوس لسنوات عديدة في البحوث والتطبيقات السريرية12,13,15,18,27,28,29. وعلى النقيض من ذلك، تم وضع بروتوكولات قليلة لعزل وزراعة الخلايا القرنية الفموية الأولية من الفئران البالغة30,31,32. استخدمت هذه الدراسة وسيلة ثقافية تجارية كاملة وchelexed-FBS للحفاظ على الخلايا الكيراتينية في حالة التكاثر أو الخلايا الجذعية. يمكن استخدام هذا النظام الثقافي في المقايسات الجزيئية والبيوكيميائية لزيادة فهم ملامح الخلايا الجذعية الظهارية الفموية والأمراض المرتبطة بها.
يتم تضمين العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. أولا، تركيز التريبسين ووقت الحضانة ضروريان في إنتاج خلايا قابلة للحياة للثقافات اللاحقة. استخدمنا باستمرار حلول التريبسين بنسبة 0.025٪ وفترات حضانة 16 ساعة في غطاء الغرفة في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم احتضانها لفترة كافية من الزمن ، فإن الخلايا القرنية لن تنأى بشكل صحيح عن الأنسجة ، مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج الخلية النهائية. ثانيا، يؤثر الأنابيب اللطيفة لتعليق الخلية في اليوم الثاني بشكل ملحوظ على صلاحية الخلية. يجب أن يبدأ الكشط بلطف من الجانب الظهاري ولا يتجاوز 10 دقائق لكل عينة من الأنسجة. وأخيرا، يحتوي تعليق الخلية المعزولة الأولى على الخلايا الليفية وأنواع الخلايا الأخرى. هذه الخلايا غير المرغوب فيها عادة ما تبدأ في الاختفاء في الثقافات اللاحقة.
تم تحديد القيود المحتملة أثناء عزل الخلايا والثقافة. في حالات نادرة، قد تكون الخلايا الليفية ملوثة أثناء عملية العزل، وقد تمنع الخلايا الليفية نمو الخلايا الكيراتينية في المقاطع اللاحقة (الشكل 2H). من الضروري اختيار وسيط تجاري يحتوي على مثبط نمو الخلايا الليفية للقضاء على هذا التلوث في الثقافة. لأن الحنك الماوس والغشاء المخاطي عن طريق الفم الأخرى لها أحجام صغيرة نسبيا، قد تكون نسبة إنتاج الخلية الأولية من فأر واحد منخفضة. لذلك، فإن فترة الثقافة بأكملها من هذا البروتوكول- حتى مرحلة التبريد-أطول من ذلك لخلايا القرنية الجلد الأولية. يتم استخدام خلايا القرنية الفموية المعزولة بشكل أفضل في غضون 10 مقاطع ، حيث يمكن أن تغير فترات الثقافة الموسعة خصائص الخلية وتخفض عدد الخلايا الجذعية.
أظهرت الطريقة الحالية أن خلايا القرنية الفموية الماوس أظهرت مورفولوجيا معبأة بإحكام ، مرصوفة بالحصى وشكلت مستعمرات أحادية الطبقة في ظل ظروفتكاثرية. كما أظهرت تعبيرات عالية عن العلامات القاعدية α6-integrin و K14 وعلامة الخلايا الجذعية p63. في الدراسات المستقبلية، بالإضافة إلى تلطيخ immunofluorescence، RNA-التسلسل، RT-PCR، والغرب لطخة التحليلات سوف تستخدم للتحقق من عدم التجانس الخلوي ونقاء الخلايا القرنية عن طريق الفم، والتي سوف تعزز فهمنا لطبيعة هذه الخلايا.
بعد مرور 2-3 ، كانت الخلايا القرنية الفموية مستقرة بما يكفي لاستخدامها في تجارب وظيفية أخرى. والأهم من ذلك، يمكن الجمع بين بروتوكول الثقافة هذا وخطوط الماوس المعدلة وراثيا، بما في ذلك خروج المغلوب الجيني، وأنظمة Cre-loxP، وأنظمة tet-inducible، ويمكن استخدامها أيضا في المقايسات الخلوية والجزيئية. وهكذا، يوفر هذا البروتوكول للباحثين طريقة أساسية وفعالة يمكن استخدامها لفهم بيولوجيا الخلايا الجذعية الكيراتينية عن طريق الفم بشكل أكبر.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة في المعونة للبحث العلمي (B) (20H03266) (إلى A.S.) ، منحة في المعونة للعلماء في وقت مبكر الوظيفي (18K14709) (إلى A.S.)، AMED تحت رقم المنحة JP21gm6110016 و 21bm0704067 (إلى A.S.)، والمنح البحثية من مؤسسة تاكيدا للعلوم (إلى A.S.). نشكر مركز الموارد الحيوانية والتنمية في جامعة كوماموتو ومركز الموارد الحيوانية في جامعة تسوكوبا على رعايتهم الممتازة للفأر. نشكر منشأة IRCMS الأساسية في جامعة كوماموتو لدعمها في التصوير البؤري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
- Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).
- Squier, C. A., Kremer, M. J. Biology of oral mucosa and esophagus. Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).
- Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
- Winning, T. A., Townsend, G. C. Oral mucosal embryology and histology. Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).
- Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium. Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).
- Bickenbach, J. R. Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin. Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).
- Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
- Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
- Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).
- Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
- Compton, C. C., et al. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).
- Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2 (2013).
- O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells. Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. Long-term culture of murine epidermal keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Yano, S., Okochi, H. Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes. British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).
- Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Papagerakis, S., et al. Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis. Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).
- Chen, L., et al. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471 (2010).
- Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds. Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).
- Simoes, A., et al. Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds. Scientific Reports. 9 (1), 7160 (2019).
- Turabelidze, A., et al. Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes. PLoS One. 9 (9), 101480 (2014).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Hatakeyama, S., et al. Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).
- Ookura, T., et al. Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro. In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
