Summary
Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di cheratinociti orali derivati dal palato del topo adulto. Viene anche riportato un metodo di valutazione che utilizza l'immunocolorazione.
Abstract
Per anni, la maggior parte degli studi che coinvolgono i cheratinociti sono stati condotti utilizzando cheratinociti epidermici della pelle umana e di topo. Recentemente, i cheratinociti orali hanno attirato l'attenzione a causa della loro funzione e caratteristiche uniche. Mantengono l'omeostasi dell'epitelio orale e servono come risorse per applicazioni nelle terapie rigenerative. Tuttavia, gli studi in vitro che utilizzano cheratinociti primari orali di topi adulti sono stati limitati a causa della mancanza di un protocollo di coltura efficiente e ben consolidato. Qui, i cheratinociti primari orali sono stati isolati dai tessuti del palato di topi adulti e coltivati in un mezzo commerciale a basso contenuto di calcio integrato con un siero chelexed. In queste condizioni, i cheratinociti sono stati mantenuti in uno stato proliferativo o simile alle cellule staminali e la loro differenziazione è stata inibita anche dopo un aumento dei passaggi. L'analisi dell'espressione dei marcatori ha mostrato che i cheratinociti orali in coltura esprimevano i marcatori delle cellule basali p63, K14 e α6-integrina ed erano negativi per il marcatore di differenziazione K13 e il marcatore dei fibroblasti PDGFRα. Questo metodo ha prodotto cellule vitali e coltivabili adatte per applicazioni a valle nello studio delle funzioni delle cellule staminali epiteliali orali in vitro.
Introduction
L'epitelio orale funge da prima barriera per proteggere l'organismo dagli stress ambientali, compresi i danni chimici o fisici e le infezioni batteriche e virali1,2. La mucosa orale comprende uno strato esterno di epitelio squamoso stratificato costituito da cheratinociti e tessuto connettivo sottostante chiamato lamina propria, che consiste principalmente di fibroblasti e matrice extracellulare. La mucosa orale del topo può essere ampiamente suddivisa in tre sottotipi: masticatoria (palato duro e gengiva), specializzata (lingua dorsale) e fodera (mucosa buccale, lingua ventrale, palato molle, labbra) mucosa2,3 (Figura 1A). L'epitelio orale è cheratinizzato nella mucosa masticatoria e specializzata e non cheratinizzato nella mucosa di rivestimento. Nonostante la sua posizione anatomica, l'epitelio orale è simile all'epidermide cutanea in quanto costituito da cellule epiteliali strettamente impacchettate con vari gradi di differenziazione: strati basali contenenti cellule indifferenziate; strati spinosi, granulari e cornificati che formano epitelio cheratinizzato o strati intermedi e superficiali che formano epitelio non cheratinizzato4. Modelli murini transgenici hanno facilitato lo studio delle caratteristiche cellulari e molecolari delle cellule staminali epiteliali orali nel palato, nella mucosa buccale, nella lingua e nella gengiva5,6,7,8,9,10,11. Tuttavia, la maggior parte di questi studi ha utilizzato principalmente esperimenti di topo in vivo. I sistemi di coltura cellulare non sono stati tipicamente impiegati a causa della mancanza di protocolli stabiliti ed efficienti.
Un sistema di coltura in vitro può essere utilizzato per l'analisi molecolare e biochimica dei regolatori delle cellule staminali, saggi basati su cellule e screening farmacologico. Attualmente sono stati sviluppati protocolli per la coltura di cheratinociti primari dell'epidermide cutanea, in cui i cheratinociti basali possono essere isolati e coltivati con successo per scopi clinici e di ricerca12,13,14,15. Nel 1980, Hennings et al. hanno dimostrato che una bassa concentrazione di calcio (< 0,09 mM Ca2+) nel terreno di coltura ha facilitato la proliferazione e mantenuto le cellule in uno stato indifferenziato. Un livello più elevato di calcio ha promosso la differenziazione cellulare e ridotto la proliferazione16. Successivamente, sono state stabilite metodologie di coltura per cheratinociti epidermici murini neonatali e adulti ampiamente applicate a numerosi modelli murini con background genetici diversi per studi in vitro17,18,19. Sebbene gli epiteli cutanei e orali condividano caratteristiche comuni, mostrano anche differenze intrinseche, ad esempio nel loro stato di cheratinizzazione, nel tasso di turnover, nell'espressione genica e nella capacità di guarigione delle ferite3,11,20,21,22,23,24,25,26.
Sebbene la coltura orale umana di cheratinociti sia stata eseguita con successo27,28,29, le pubblicazioni sulla coltura orale dei cheratinociti di topo30,31,32 sono limitate a causa delle piccole dimensioni del tessuto bersaglio e delle caratteristiche distinte delle cellule rispetto ai cheratinociti epidermici cutanei. Questo protocollo descrive le tecniche di isolamento e di coltura a lungo termine dei cheratinociti orali primari di topo.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida dell'Institutional Animal Experiment Committee dell'Università di Kumamoto e dell'Università di Tsukuba.
1. Preparazione dei reagenti e dei terreni di coltura
- Preparare 40 mL di terreno di coltura dei cheratinociti contenente 60 μM di calcio e 600 μL di soluzione antibiotico-antimicotica. Preparare 20 ml di tripsina allo 0,025% e 400 μL di soluzione antibiotico-antimicotica.
- Scongelare la soluzione di inibizione della tripsina a temperatura ambiente e mantenerla a 4 °C fino all'uso nel passaggio 4.1.
NOTA: Il reagente di isolamento viene preparato per l'isolamento tissutale di cinque topi.
- Scongelare la soluzione di inibizione della tripsina a temperatura ambiente e mantenerla a 4 °C fino all'uso nel passaggio 4.1.
- Per preparare il terreno di coltura, prelevare 500 mL di terreno e aggiungere 5 mL di una soluzione di integratore per la crescita (vedere Tabella dei materiali) (di seguito denominato mezzo completo) e il 20% di siero bovino chelexed-fetale impoverito di calcio (FBS)33 (di seguito denominato chelexed-FBS).
2. Dissezione del tessuto del palato da topo adulto
- Sacrificare un topo adulto C57BL/6J (maschio o femmina) per lussazione cervicale in conformità con le normative della struttura in materia di benessere degli animali.
- Rimuovere i peli intorno alla bocca con un rasoio. Usando le forbici, tagliare dalla guancia verso la mascella, su entrambi i lati.
NOTA: il mouse deve essere anestetizzato prima del sacrificio. Viene utilizzata una miscela anestetica di medetomidina, midazolam e butorfanolo (vedere Tabella dei materiali).
- Rimuovere i peli intorno alla bocca con un rasoio. Usando le forbici, tagliare dalla guancia verso la mascella, su entrambi i lati.
- Utilizzare una pinza per aprire la bocca e assorbire il sangue utilizzando un batuffolo di cotone. Per disinfettare il palato, pulire l'interno della bocca con un batuffolo di cotone contenente il 10% di povidone-iodio.
- Per raccogliere il palato del topo, in primo luogo, utilizzare una lama chirurgica del bisturi per eseguire un'incisione marginale a tutto spessore lungo il lato del palato dei denti mascellari. Quindi, sezionare attentamente l'intero palato usando un raspatorium.
NOTA: Un raspatorium è uno strumento utilizzato per elevare un lembo mucoperiostale (vedi Tabella dei materiali) (Figura 1B). - Trasferire rapidamente il tessuto del palato in un tubo da 15 ml contenente 4 mL di soluzione media completa + antibiotico-antimicotico. Mantenere i tessuti sul ghiaccio fino a quando non sono pronti per l'incubazione.
NOTA: Per la raccolta da più topi, i tessuti del palato possono essere tenuti sul ghiaccio per un massimo di 4 ore.
3. Pretrattamento del tessuto del palato
- In una cappa a flusso laminare, trasferire i tessuti in un piatto da 60 mm contenente 4 mL di soluzione media completa + antibiotico-antimicotico.
- Usando una pinza corta e smussata e una lama di bisturi, rimuovere delicatamente il sangue dai tessuti. Lavare i fazzoletti 10 volte in mezzo completo.
- Trasferire i tessuti in un piatto da 35 mm contenente 4 ml di tripsina allo 0,025% + soluzione antibiotico-antimicotica, con la superficie epiteliale rivolta verso il basso.
NOTA: La superficie epiteliale, che si curva verso l'interno, deve essere immersa nella soluzione di tripsina; la lamina propria dovrebbe essere rivolta verso l'alto. Il tessuto deve essere appiattito il più possibile per essere incubato interamente nella soluzione di tripsina. - Incubare i tessuti in tripsina allo 0,025% per ~ 16 ore a temperatura ambiente nella cappa di coltura.
4. Raccolta e coltura di cellule primarie
- Utilizzando un paio di pinze smussate, rimuovere il tessuto dalla soluzione di tripsina (nel piatto da 35 mm) e trasferirlo in una soluzione inibitore della tripsina in un piatto da 60 mm (4 ml per piatto) con la superficie epiteliale rivolta verso l'alto.
- Usando una pinza per aggrapparsi al bordo del palato, raschiare delicatamente lo strato epiteliale dalla lamina propria sottostante usando una lama di bisturi.
NOTA: Il tessuto connettivo non viene digerito dalla tripsina, quindi non si stacca durante la raschiatura. - Per raccogliere la quantità massima di cellule epiteliali dai tessuti, trasferire il tessuto in un altro piatto da 60 mm con 4 mL di mezzo completo e ripetere la fase di raschiatura.
NOTA: Assicurarsi di evitare di raschiare il tessuto con la punta della lama; utilizzare invece il bordo della lama. La raschiatura viene eseguita per 5-10 minuti per tessuto. - Posizionare un filtro cellulare sterile da 100 μm sulla parte superiore di un tubo conico da 50 ml.
- Utilizzando una pipetta sterile, trasferire 2 ml di soluzione di tripsina (dal punto 4.1) nel filtro per bagnarne la superficie.
- Utilizzando una pipetta, mescolare la sospensione cellulare nella parabola da 60 mm (dai passaggi 4.2-4.3) alcune volte e filtrare le celle attraverso il filtro cellulare da 100 μm preparato nei passaggi 4.4-4.5.
- Contare il numero di cellule usando un emocitometro. Preparare 15 μL di soluzione di tripano blu e aggiungere 15 μL di sospensione cellulare (fase 4.6). Trasferire 10 μL della miscela blu cellula-tripano su un emocitometro e contare il numero di cellule.
NOTA: Un pezzo di palato di topo può produrre fino a 1 milione di cellule. - Durante il conteggio, centrifugare il tubo (dal punto 4.6) a 100 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante con una pipetta. Aggiungere 2 ml di media completo + chelexed-FBS al tubo. Risospesso il pellet cellulare triturando più volte utilizzando una pipetta da 5 ml.
- Piastra 2-5 x 105 cellule da un topo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti pre-rivestita con collagene di tipo I (vedi Tabella dei materiali).
- Incubare le cellule a 37 °C per 2 giorni senza cambiare il mezzo.
- Due giorni dopo la semina, sostituire metà del terreno di coltura con il mezzo completo + chelexed-FBS. Controllare la morfologia cellulare al microscopio. Alimenta le celle con mezzo completo + chelexed-FBS ogni 2 giorni.
NOTA: Dopo la semina, verranno osservate cellule di diverse dimensioni. Circa 3-5 giorni dopo la semina, si possono osservare cheratinociti con morfologia di ciottoli (Figura 2). Ci vorranno 1-2 settimane di coltura prima che il primo passaggio possa essere condotto e sono necessarie 1-2 settimane successive prima che le cellule siano pronte per il secondo e il terzo passaggio. Dopodiché, le cellule cresceranno più velocemente e potrebbero essere preparate per la crioconservazione. Le cellule possono essere ripiazionate in un pozzo (di una piastra a 24 pozzetti) e in una piastra a 6 pozzetti rispettivamente nel primo e nel secondo passaggio. Il passaggio successivo dipenderà dalla crescita e dalla densità cellulare. Un rapporto di divisione cellulare di 1:2 o 1:3 può essere utilizzato dopo il terzo passaggio.
5. Passaggio dei cheratinociti
- Raccogliere 2 mL del surnatante dal piatto di coltura ed erogare in un tubo conico da 15 ml (su ghiaccio). Lavare le cellule con 1x PBS sterile due volte.
NOTA: quando le celle raggiungono circa il 70%-80% di confluenza, sono pronte per il passaggio. - Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% al piatto all'unico pozzetto di un piatto a 6 pozzetti.
- Incubare per 5-15 minuti a 37 °C; controllare dopo 5 minuti per vedere se le cellule si staccano dal piatto.
- Neutralizzare la reazione utilizzando 1 mL di soluzione di inibizione della tripsina e 2 mL di terreno di coltura completo + chelexed-FBS mediante pipettaggio delicato. Quindi, trasferire la sospensione cellulare nello stesso tubo conico da 15 ml come nel passaggio 5.1.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 100 x g per 5 min a 4 °C. Aspirare il surnatante con una pipetta e risospescere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura completo.
- Contare le cellule usando un emocitometro. Quindi, placcare 1 mL della sospensione cellulare in una nuova piastra di coltura a 24 o 6 pozzetti.
NOTA: Alcune delle cellule dei primi passaggi possono essere congelate in una miscela di 70% di terreno di coltura completo + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. 1-2 crioviali di cellule possono essere raccolti da una piastra di coltura confluente.
6. Crioconservazione e recupero dei cheratinociti
- Congelamento cellulare
- Crescere i cheratinociti all'80% -90% di confluenza.
NOTA: non permettere alle cellule di crescere troppo, in quanto ciò potrebbe ridurre il loro stato di proliferazione e vitalità. - Trattare i cheratinociti nel piatto con lo 0,05% di tripsina-EDTA, come descritto nei passaggi 5.1-5.5.
- Contare i cheratinociti usando un emocitometro. Preparare le crioviali in base ai numeri di cella calcolati per consentire il trasferimento di 1 x 106 cellule/mL a ciascun flaconcino.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 100 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospescere il pellet cellulare in una soluzione da 10 ml di 10% DMSO + 20% chelexed-FBS + 70% terreno di coltura completo (9 mL di mezzo completo + chelexed-FBS e 1 mL di DMSO).
- Erogare le cellule in crioviali a 1 mL di sospensione per flaconcino. Mettere i flaconcini in un contenitore criogenico per una notte a -80 °C. Trasferire i flaconcini in un serbatoio di azoto liquido il giorno seguente.
- Crescere i cheratinociti all'80% -90% di confluenza.
- Recupero cellulare
- Rimuovere un crioviale dal serbatoio di azoto liquido e scongelare parzialmente a temperatura ambiente. In un tubo da 15 mL, mescolare 1 mL della sospensione cellulare con 3 mL di terreno di coltura completo + chelexed-FBS.
- Centrifugare la miscela per 5 min a 100 x g e 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet in 1 mL di terreno di coltura completo + chelexed-FBS.
- Placcare le sospensioni cellulari in nuovi piatti di coltura rivestiti di Collagen I da 60 mm. Sostituire il terreno di coltura ogni 2-3 giorni e passare le cellule una volta confluenti.
7. Colorazione immunofluorescente
- Coltura di cheratinociti orali su coverslip quadrati (22 mm x 22 mm) in piastre a 6 pozzetti (5 x 105 cellule/pozzetto) per 2 giorni.
- Fissare i cheratinociti in una soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) e PBS per 20 minuti a temperatura ambiente prima di lavare tre volte con 1x PBS.
- Permeabilizzare le cellule in una soluzione di Tritone allo 0,1% in PBS. Incubare le cellule in reagente bloccante (2,5% siero di capra, 2,5% siero d'asino) per 1 ora a temperatura ambiente, seguito da incubazione notturna con anticorpi primari (vedi Tabella dei materiali) a 4 °C.
NOTA: Gli anticorpi primari sono stati utilizzati nelle seguenti diluizioni: anti-K14 di coniglio (1:1000), α6-integrina di ratto (1:100), anti-p63 di coniglio (1:500), anti-K13 di coniglio (1:100) e anti-PDGFRα di capra (1:100). - Lavare i campioni in una soluzione di Tritone allo 0,1% in PBS, seguita da incubazione con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente.
NOTA: Gli anticorpi secondari (Alexa 488 o 555) sono stati utilizzati a una diluizione di 1:300. - Controbattere tutti i campioni con la soluzione di Hoechst per 10 minuti e montare le celle su vetrini.
NOTA: La soluzione di Hoechst viene utilizzata per macchiare i nuclei delle cellule. - Eseguire l'imaging del campione utilizzando un microscopio confocale.
NOTA: la luminosità e il contrasto vengono regolati alla stessa intensità utilizzando un software di modifica delle immagini.
Representative Results
Panoramica del processo di dissezione e isolamento dei cheratinociti orali dal palato del topo adulto
I cheratinociti orali dissociati sono stati raccolti dal palato del topo adulto e coltivati in un FBS chelexed personalizzato al 20%. Il palato del topo è costituito dal palato duro e dal palato molle (Figura 1C). La procedura per l'isolamento dei cheratinociti orali di topo è riassunta nella Figura 1D. Il tessuto del palato viene sezionato e trasferito in un mezzo contenente una soluzione antibiotico-antimicotica prima di essere incubato in una soluzione di tripsina allo 0,025% a 4 °C durante la notte. Il giorno seguente, il tessuto del palato viene trattato con una soluzione di inibitore della tripsina e un terreno di coltura completo in volumi uguali. Successivamente, i tessuti vengono raschiati utilizzando una lama chirurgica del bisturi per raccogliere i cheratinociti orali. La sospensione cellulare viene filtrata attraverso un filtro cellulare da 100 μm e centrifugata. Le cellule vengono quindi seminate in piastre a 24 pozzetti rivestite con collagene I contenenti 2 ml di terreno di coltura completo + chelexed-FBS.
Risultati rappresentativi del successo dell'isolamento dei cheratinociti orali di topo
I cheratinociti orali primari sono cresciuti come un monostrato e hanno mostrato una morfologia di ciottoli (Figura 2). Piccole colonie di cheratinociti erano visibili a 3-5 giorni (Figura 2A,B); questi sono diventati più grandi e hanno formato colonie strette a 1 settimana di incubazione (Figura 2C). Le colonie di cheratinociti mostravano le caratteristiche morfologiche tipiche dei cheratinociti basali, indicando le loro condizioni di salute. I cheratinociti orali umani sono rimasti indifferenziati per diversi passaggi nel terreno di coltura completo contenente 0,06 mM Ca2+16,28. Il primo passaggio è stato eseguito a circa 2 settimane dalla placcatura iniziale (Figura 2D). Nei passaggi successivi, i cheratinociti hanno mostrato una crescita stabile con un periodo di coltura più breve (Figura 2E-G). I cheratinociti hanno smesso di crescere se si è verificata una significativa contaminazione da fibroblasti durante il processo di isolamento (Figura 2H).
I cheratinociti orali isolati di topo esprimono marcatori di cellule basali
Per confermare lo stato dei cheratinociti orali primari, l'immunocolorazione è stata eseguita utilizzando i marcatori delle cellule basali Cheratina 14 (K14) e α6-integrina34. K14 e α6-integrina sono state espresse nei cheratinociti dopo la coltura (Figura 3A,B). Le cellule sono state anche colorate con il marcatore di cellule staminali p63 per confermare la loro staminalità. Le cellule di passaggio precoce (passaggio 4) e passaggio tardivo (passaggio 7) hanno mostrato un'espressione uniforme di p63 (Figura 3C,D). Al contrario, i cheratinociti trattati con calcio elevato (induzione di 1,2 mM per 2 giorni) hanno mostrato una diminuzione dell'espressione di p63 (Figura 3E), indicando che un elevato trattamento con calcio sopprime i geni correlati alle cellule staminali nei cheratinociti primari come precedentemente riportato16. Il marcatore di differenziazione Cheratina 13 (K13) ha mostrato un'espressione rara o assente sia nei passaggi precoci che tardivi e un'espressione significativa sotto trattamento ad alto contenuto di calcio (Figura 3F-H). Per testare la possibilità di contaminazione dei fibroblasti nella coltura dei cheratinociti, la colorazione utilizzando il marcatore dei fibroblasti PDGFRα è stata eseguita con lo stesso set di cheratinociti rispetto ai fibroblasti embrionali di topo (MEF). Non c'è stata espressione di PDGFRα nella coltura dei cheratinociti, rispetto all'alta espressione osservata nelle cellule MEF (Figura 3I-3L). Questi risultati hanno indicato che questo protocollo potrebbe isolare con successo i cheratinociti basali e mantenere queste cellule nello stato indifferenziato.
Figura 1: Panoramica della procedura di dissezione e isolamento dei cheratinociti orali di topo. (A) Rappresentazione schematica della cavità orale del topo. (B) Strumenti utilizzati per sezionare il palato e isolare i cheratinociti orali di topo. (C) Immagine a campo luminoso del palato del topo. Barra della scala: 100 μm. (D) Riepilogo del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi del successo dell'isolamento dei cheratinociti orali di topo. (A-G) Immagini a tempo di cheratinociti orali primari in coltura a 3 giorni (A), 5 giorni (B), 1 settimana (C) e 2 settimane (D) di coltura dopo l'isolamento. Vengono mostrate le morfologie dei cheratinociti orali di topo dopo il primo (E), il secondo (F) e il terzo (G) passaggio. (H) Esempio di contaminazione da fibroblasti in coltura orale di cheratinociti di topo. Barra della scala: 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: I cheratinociti orali isolati di topo esprimono marcatori di cellule basali. (A-B) Immagini rappresentative della colorazione immunofluorescente di K14 (A; rosso) e α6-integrina (B; verde) nel passaggio 4. (C-E) Immagini rappresentative della colorazione immunofluorescente di p63 (verde) nel passaggio 4 (C), nel passaggio 7 (D) e nel trattamento ad alto contenuto di calcio (E). (F-H) Immagini immunocoloranti di K13 (verde) nel passaggio 4 (F), passaggio 7 (G) e trattamento ad alto contenuto di calcio (H). (I-L) Immagini immunocoloranti di PDGFRα (rosso) nel passaggio 4 (I), passaggio 7 (J), trattamento ad alto contenuto di calcio (K) e MEF (L). I nuclei sono macchiati con Hoechst (blu). Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
I cheratinociti primari isolati dall'epidermide cutanea umana o di topo sono stati utilizzati per molti anni nella ricerca e nelle applicazioni cliniche12,13,15,18,27,28,29. Al contrario, sono stati stabiliti pochi protocolli per isolare e coltivare cheratinociti orali primari da topi adulti30,31,32. Il presente studio ha utilizzato un terreno di coltura commerciale completo e chelexed-FBS per mantenere i cheratinociti in uno stato proliferativo o simile alle cellule staminali. Questo sistema di coltura può essere impiegato in saggi molecolari e biochimici per comprendere ulteriormente le caratteristiche delle cellule staminali epiteliali orali e delle loro malattie correlate.
Diversi passaggi critici sono inclusi in questo protocollo. In primo luogo, la concentrazione di tripsina e il tempo di incubazione sono essenziali per produrre cellule vitali per le colture successive. Abbiamo utilizzato costantemente soluzioni di tripsina allo 0,025% e periodi di incubazione di 16 ore nella cappa della camera a temperatura ambiente. Se non incubati per un periodo di tempo sufficiente, i cheratinociti non si dissociano correttamente dal tessuto, con conseguente minore resa cellulare finale. In secondo luogo, il pipettaggio delicato della sospensione cellulare il secondo giorno influisce in particolare sulla vitalità cellulare. La raschiatura deve iniziare delicatamente dal lato epiteliale e non superare i 10 minuti per campione di tessuto. Infine, la prima sospensione cellulare isolata contiene fibroblasti e altri tipi di cellule; queste cellule indesiderate di solito iniziano a scomparire nelle colture successive.
Potenziali limitazioni sono state identificate durante l'isolamento cellulare e la coltura. In rari casi, i fibroblasti possono essere contaminati durante il processo di isolamento e i fibroblasti possono inibire la crescita dei cheratinociti nei passaggi successivi (Figura 2H). È necessario selezionare un mezzo commerciale che contenga un inibitore della crescita dei fibroblasti per eliminare tale contaminazione nella coltura. Poiché il palato del topo e altre mucose orali hanno dimensioni relativamente piccole, la resa cellulare iniziale di un topo può essere bassa. Pertanto, l'intero periodo di coltura di questo protocollo, fino alla fase di crioconservazione, è più lungo di quello dei cheratinociti cutanei primari. I cheratinociti orali isolati sono utilizzati al meglio entro 10 passaggi, poiché periodi di coltura più lunghi potrebbero modificare le proprietà cellulari e ridurre il numero di cellule staminali.
Il metodo attuale ha mostrato che i cheratinociti orali di topo mostravano una morfologia di ciottoli strettamente imballata e formavano colonie monostrato in condizioni proliferative. Hanno anche mostrato un'alta espressione dei marcatori basali α6-integrina, K14 e del marcatore delle cellule staminali p63. In studi futuri, oltre alla colorazione immunofluorescenza, il sequenziamento dell'RNA, la RT-PCR e le analisi western blot saranno utilizzate per verificare l'eterogeneità cellulare e la purezza dei cheratinociti orali, il che migliorerà ulteriormente la nostra comprensione della natura di queste cellule.
Dopo 2-3 passaggi, i cheratinociti orali erano abbastanza stabili da essere utilizzati in ulteriori esperimenti funzionali. È importante sottolineare che questo protocollo di coltura può essere combinato con linee di topo transgenico, tra cui knockout genico, Cre-loxP e sistemi inducibili tet, e può anche essere utilizzato in saggi cellulari e molecolari. Pertanto, il presente protocollo fornisce ai ricercatori un metodo fondamentale ed efficiente che potrebbe essere utilizzato per comprendere ulteriormente la biologia delle cellule staminali dei cheratinociti orali.
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03266) (ad A.S.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (18K14709) (ad A.S.), AMED con il numero di sovvenzione JP21gm6110016 e 21bm0704067 (ad A.S.), e da borse di ricerca della Takeda Science Foundation (ad A.S.). Ringraziamo il Centro per le risorse animali e lo sviluppo dell'Università di Kumamoto e il Centro di risorse animali dell'Università di Tsukuba per la loro eccellente cura del topo. Ringraziamo la struttura centrale IRCMS dell'Università di Kumamoto per il suo supporto nell'imaging confocale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
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