Summary
يحمل العلاج الجيني لعضلة القلب لمرض القلب الإقفاري وعدا كبيرا للعلاجات المستقبلية. هنا ، نقدم نموذجا حيوانيا كبيرا لتقييم فعالية العلاج الجيني في القلب الإقفاري.
Abstract
مرض الشريان التاجي هو أحد الأسباب الهامة للوفيات والمراضة في جميع أنحاء العالم. على الرغم من تطور العلاجات الحالية ، لا تزال نسبة كبيرة من مرضى مرض الشريان التاجي يعانون من أعراض. يوفر تكوين الأوعية العلاجي بوساطة العلاج الجيني طريقة علاجية جديدة لتحسين نضح عضلة القلب وتخفيف الأعراض. تمت دراسة العلاج الجيني بعوامل وعائية مختلفة في عدد قليل من التجارب السريرية. نظرا لحداثة الطريقة ، فإن تقدم العلاج الجيني لعضلة القلب هو مسار مستمر من مقاعد البدلاء إلى السرير. لذلك ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية كبيرة لتقييم السلامة والفعالية. كلما حدد النموذج الحيواني الكبير المرض الأصلي ونقاط النهاية المستخدمة في العيادات ، زادت النتائج التي يمكن التنبؤ بها من التجارب السريرية. هنا ، نقدم نموذجا حيوانيا كبيرا لتقييم فعالية العلاج الجيني في قلب الخنازير الإقفاري. نحن نستخدم طرق التصوير ذات الصلة سريريا مثل التصوير بالموجات فوق الصوتية و 15H2O-PET. لاستهداف عمليات نقل الجينات إلى المنطقة المرغوبة ، يتم استخدام رسم الخرائط الكهروتشريحية. الهدف من هذه الطريقة هو: (1) محاكاة مرض الشريان التاجي المزمن ، (2) للحث على تكوين الأوعية العلاجية في مناطق نقص الأكسجين في القلب ، و (3) لتقييم سلامة وفعالية العلاج الجيني باستخدام نقاط النهاية ذات الصلة.
Introduction
مرض الشريان التاجي مسؤول عن النسبة العظمى من الوفيات وعبء المرض في جميع أنحاء العالم1. استراتيجيات العلاج الحالية هي التدخلات عن طريق الجلد ، والعلاج الدوائي ، وجراحة المجازة2. ومع ذلك ، على الرغم من تطور هذه العلاجات الحالية ، يعاني العديد من المرضى مما يسمى بالذبحة الصدرية المقاومة للحرارة ، مما يؤكد الحاجة غير الملباة لنهج علاجية جديدة3. يمكن أن يستهدف تكوين الأوعية العلاجية بوساطة العلاج الجيني هذه المجموعة من المرضى.
غالبا ما يتم تقديم العلاج الجيني لعضلة القلب باستخدام نواقل فيروسية مختلفة ، وأكثرها شيوعا الفيروس الغدي 4 الذي يعاني من نقص التكاثر. كجينات علاجية ، يتم استخدام عوامل نمو وعائية مختلفة. أكثر عوامل النمو الوعائية التي تمت دراستها بشكل كبير هي عوامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGFs) التي تتوسط إشاراتها الوعائية من خلال مستقبلات عامل النمو البطاني الوعائي (VEGFRs) ومستقبلاتهاالمشتركة 5. أثبتت العديد من التجارب السريرية فائدة وسلامة العلاج الجيني للقلب وجعلت طريقة العلاج الجديدة هذه خيارا واقعيا لعلاج أمراض القلب الإقفارية 6,7. ومع ذلك ، لا يزال هذا المفهوم بحاجة إلى تعزيز الجينات العلاجية والنواقل الفيروسية التي يتم اختبارها في النماذج الحيوانية الكبيرة قبل دخول العيادات. كثيرا ما يستخدم الخنزير كحيوان مختبر لأن قلبه يشبه إلى حد كبير قلب الإنسان. يسمح حجم نظام القلب والأوعية الدموية للخنزير باستخدام اختراعات قسطرة مماثلة كما هو مستخدم في البشر. يمكن استخدام جميع طرق التصوير المتاحة للبشر في الخنازير8.
هناك العديد من النماذج الحيوانية الكبيرة لنقص التروية المزمن. الأكثر استخداما هو نموذج مضيق الأمرويد9،10،11. الجانب السلبي لهذه الطريقة هو الغزو لأن بضع الصدر ضروري للوصول إلى الأوعية الدموية التاجية. سابقا في مجموعتنا ، تم تطوير نموذج دعامة عنق الزجاجة الغازية المصغرة لنقص تروية عضلة القلب المزمن12. تستخدم هذه الطريقة أيضا في هذه المخطوطة للحث على نقص تروية عضلة القلب.
تطورت قابلية استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية بشكل كبير على الرغم من عمر طريقة التصوير. على سبيل المثال ، لا تزال سلالة عضلة القلب في الاستخدام البحثي بشكل رئيسي بسبب حداثتها. يعكس إجهاد عضلة القلب التغيرات في وظيفة انقباض القلب بشكل أفضل من قياس الكسر القذفي التقليديفي الوضع M 13. وهكذا ، هنا في النموذج الحيواني الكبير ، يتم استخدام قياس إجهاد عضلة القلب. لتقييم وظيفة القلب ، يتم قياس النتاج القلبي أيضا عن طريق التصوير السينمائي للبطين الأيسر أثناء تصوير الأوعية. يتم قياس النتاج القلبي أثناء الراحة وتحت الإجهاد الناجم عن الدوبوتامين لتقييم وظيفة عضلة القلب تحت الضغط.
بالإضافة إلى قياسات وظيفة القلب ، فإن المعلومات المتعلقة بنضح عضلة القلب ضرورية في دراسات العلاج الجيني التي تهدف إلى تكوين الأوعية العلاجية. في هذا النموذج الحيواني ، يتم تصوير الحيوانات باستخدام 15 تصوير مقطعي بالإصدار البوزيتروني للمياه المشعة المسمى O (15H2O-PET) لأن هذا هو المعيار الذهبي لقياس نضح عضلة القلب. 15تم التحقق من صحة H2O-PET مسبقا لقياس نضح قلب الخنازيرالإقفاري 14.
وبالتالي ، فإن الأساليب والطرائق المذكورة أعلاه تشكل منظورا ممتازا لتقييم فعالية العلاج الجيني في القلب الإقفاري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم إجراء التجارب المعروضة هنا باستخدام إناث الخنازير المنزلية البالغة من العمر حوالي 10 أسابيع وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس التجارب على الحيوانات في فنلندا. تزن الحيوانات 30-40 كجم في بداية البروتوكول ، مما يسمح بنفس المعدات الإجرائية وطرق التصوير الممكنة للبشر. يحدث نقص التروية المزمن قبل 14 يوما من نقل الجينات ، ويعتمد وقت المتابعة بعد نقل الجينات على الناقل الفيروسي المستخدم. يظهر بروتوكول الدراسة في الشكل 1. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء حقن العلاج الجيني الفيروسي الغدي أو AAV. يجب تعديل وقت جمع العينات إلى ذروة تعبير جين التحوير ، والتي تعتمد على الناقل الفيروسي المستخدم. على سبيل المثال ، عند إجراء عمليات نقل الجينات الفيروسية الغدية ، يتم ضبط وقت جمع العينات على 6 أيام بعد نقل الجينات.
1. الدواء
- تطبيق جرعة يومية من 200 ملغ من الأميودارون و2.5 ملغ من بيسوبرولول لمنع عدم انتظام ضربات القلب البطيني المميت. يبدأ الدواء قبل 1 أسبوع من عملية نقص التروية ويستمر يوميا حتى المتابعة.
- بالإضافة إلى ذلك ، يتم تطبيق جرعات peroral من كلوبيدوقرل (300 ملغ) وحمض أسيتيل الساليسيليك (300 ملغ) للحيوانات قبل يوم واحد من عملية نقص التروية لمنع تجلط الدم الحاد في الدعامة بعد وضع الدعامة.
- تطبيق 100 ملغ من الليدوكائين و2.5 مل من (246 ملغ/مل) مغسو4 عن طريق الوريد للحيوانات في بداية عملية نقص التروية لمنع عدم انتظام ضربات القلب البطيني.
- تطبيق الحقن العضلي للسيفوروكسيم (500 ملغ) في بداية كل عملية للوقاية من العدوى.
- تطبيق 30 ملغ من إينوكسابارين عن طريق الوريد في بداية عمليات نقص التروية وتحت الجلد بعد إجراء العملية للوقاية من تجلط الدم.
- للتخدير وتسكين الألم، يتم تطبيق 1.5 مل من الأتروبين، 6 مل من الأزابيرون (40 ملغ/مل)، البروبوفول 20 ملغ/مل، بمعدل 15 ملغ/كغ/ساعة، والفنتانيل 50 ميكروغرام/مل بمعدل 10 ميكروغرام/كغ/ساعة. كانت جرعات الدواء هي نفسها لكل خنزير. ارجع إلى إرشادات استخدام الحيوانات المحلية لإدارة الجرعة.
- تخدير الحيوانات خلال جميع العمليات. يجب إجراء جميع العمليات في بيئة معقمة باستخدام تقنية معقمة.
2. تخطيط صدى القلب عبر الصدر
- إجراء تخطيط صدى القلب عبر الصدر قبل عملية نقص التروية ونقل الجينات والقتل الرحيم لتقييم أي سائل التامور يمكن اكتشافه وتحديد سلالة عضلة القلب.
- ضع محول الطاقة في الفضاء الوربي الثالث أو الرابع تحت إبط الخنزير للوصول إلى مناظر المحور القصير شبه القصي على مستوى الصمام التاجي والعضلات الحليمية والمستويات القمية (الفيديو 1). يجب أن تشير علامة محول الطاقة إلى عظم الخنزير. لحفظ مقطع، اضغط على اكتساب.
3. عمليات الأوعية الدموية تحت التوجيه الفلوري
- إجراء تصوير سينمائي للبطين الأيسر بعد تصوير الأوعية التاجية قبل عملية نقص التروية ونقل الجينات وجمع الأنسجة.
- التحضير للعملية
- الاستعداد للعمليات عن طريق تخدير الخنازير مع الحقن العضلي من 1.5 مل من الأتروبين و 6 مل من azaperone.
- بعد التخدير ، قم بتحفيز التخدير العام للبروبوفول والفنتانيل لإجراءات تصوير الأوعية الدموية للخنازير بجرعات 15 مجم / كجم / ساعة و 10 ميكروغرام / كجم / ساعة ، على التوالي.
ملاحظة: يتم تخدير الخنازير للإجراء بأكمله. - دعم التهوية عن طريق التنبيب وجهاز التنفس الصناعي ومراقبة المعلمات الفسيولوجية الحيوية ، مثل تخطيط القلب والمعلمات التنفسية.
- وضع غمد المعرف
- ضع غمد مقدم في الشريان الفخذي الأيمن لجميع العمليات كممارسة قياسية في أمراض القلب. استخدم الموجات فوق الصوتية لتتبع الشريان الفخذي وثقبه بإبرة دخول (18 جم).
ملاحظة: استخدم غمد مقدم 8F لنقل الجينات داخل عضلة القلب وغمد 6F لجميع العمليات الأخرى. أدخل سلك التوجيه الخاص بالغلاف من خلال الإبرة لربط الشريان وتثبيت سلك التوجيه أثناء إزالة الإبرة. - أدخل غلاف الإدخال على طول سلك التوجيه ، وعند وضعه ، قم بإزالة سلك التوجيه وإعطاء 1.25 مجم من ثنائي النترات تحت اللسان للخنزير للحث على توسع الأوعية التاجية.
- ضع غمد مقدم في الشريان الفخذي الأيمن لجميع العمليات كممارسة قياسية في أمراض القلب. استخدم الموجات فوق الصوتية لتتبع الشريان الفخذي وثقبه بإبرة دخول (18 جم).
- تصوير الأوعية التاجية
- إجراء تصوير الأوعية التاجية مباشرة قبل عملية نقص التروية ونقل الجينات وجمع الأنسجة. يوضح الشكل 2 الآلات اللازمة للتصوير الوعائي.
- استخدم قسطرة 6F تحت توجيه التنظير الفلوري مع عامل تباين اليود لتصوير الشريان التاجي الأيمن والشريان التاجي الصاعد الأيسر (فيديو 2).
- تصوير البطين الأيسر السينمائي تحت الراحة وإجهاد الدوبوتامين
- تطبيق بلعة 21 مل من عامل تباين اليود في البطين الأيسر عبر قسطرة ضفيرة 5F باستخدام حاقن تلقائي. أولا، اضبط مدة البلعة على 3 ثوان والحجم الكلي على 21 mL. ثم اضغط على مفرد ونعم.
- احسب الكسر القذفي بواسطة برنامج القياس لمحطة عمل تصوير الأوعية. لإجراء العملية الحسابية، حدد التحليل البطيني للصورة المعنية. قم بتمرير الصورة لتحديد إطار زمني ، واحد في الانبساط والآخر في الانقباض. حدد أداة لرسم الخطوط العريضة البطينية لكل إطار زمني.
ملاحظة: يقوم البرنامج الآن بحساب الكسر القذفي وحجم السكتة الدماغية بطريقة Simpson. يتم إجراء قياس الكسر القذفي أثناء الراحة وتحت الضغط الناجم عن الدوبوتامين.
- تصوير الإجهاد
- جرعة الدوبوتامين عن طريق الوريد في جرعات متصاعدة من 10 ميكروغرام / كغ / دقيقة إلى 20 ميكروغرام / كغ / دقيقة لتصوير الإجهاد الناجم عن الدوبوتامين حتى يتم الوصول إلى معدل ضربات القلب المستهدف البالغ 160 نبضة في الدقيقة. ثم قم بإجراء التصوير السينمائي.
- عملية نقص التروية
- ضع دعامة عنق الزجاجة في الشريان التاجي الأيسر (LAD) قبل 14 يوما من نقل الجينات للحث على إقفار عضلة القلب المزمن. بعد وضع دعامة عنق الزجاجة ، تحقق مما إذا كانت دعامة عنق الزجاجة موضوعة بشكل صحيح ، مما يحد من تدفق الدم التاجي.
ملاحظة: يتم وضع دعامة عنق الزجاجة على قسطرة التمدد وتتكون من دعامة معدنية عارية مغطاة بأنبوب متعدد تترافلورو إيثيلين يتكون في شكل عنق الزجاجة لتقليل تدفق الدم التاجي9.
- ضع دعامة عنق الزجاجة في الشريان التاجي الأيسر (LAD) قبل 14 يوما من نقل الجينات للحث على إقفار عضلة القلب المزمن. بعد وضع دعامة عنق الزجاجة ، تحقق مما إذا كانت دعامة عنق الزجاجة موضوعة بشكل صحيح ، مما يحد من تدفق الدم التاجي.
- تحديد حجم الدعامة
- اختر حجم الدعامة ، إما 3.0 / 3.5 / 4.0 × 8 مم ، وفقا لحجم الشريان التاجي الصاعد الأيسر في تصوير الأوعية باستخدام برنامج القياس التلقائي في محطة عمل تصوير الأوعية (فيديو 3)12.
- وضع الدعامة
- ضع ملفا على الشريان التاجي الأيسر وحرك دعامة عنق الزجاجة إلى LAD ، وضعها بعيدا إلى القطر الأول.
- قم بتضخيم الدعامة إلى الضغط الاسمي في الشريان باستخدام مفرغ الهواء بنسبة دعامة إلى تجويف تبلغ 1.3 ، لتثبيت عنق الزجاجة في مكانه. بعد 15 ثانية إضافية ، قم بتفريغ الدعامة وسحب المعدات من الشريان.
ملاحظة: تأكد من الموضع الصحيح لدعامة عنق الزجاجة عن طريق تصوير الأوعية الدموية.
4. التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني
ملاحظة: قبل يوم واحد من نقل الجينات ، قم بإجراء الراحة والإجهاد 15فحص PET / CT للمياه المشعة المسمى O (يتطلب بيئة المستشفى وفنيي الأشعة).
- التصوير المرجعي
- قم بإجراء فحوصات التصوير المقطعي المحوسب (CT) قبل الراحة وتصوير الإجهاد. استخدم معلومات التصوير المقطعي المحوسب لتصحيح التوهين.
- 15تصوير المياه المشعة المسمى O
- قم بإجراء تصوير الراحة والإجهاد باستخدام جرعة 800 MBq 15H2O.
- تصوير الإجهاد
- قم بإجراء تصوير الإجهاد باستخدام بلعة ماء إضافية تبلغ 800 ميجابايت + 15بعد اضمحلال إشعاعي مناسب لمدة 12 دقيقة.
ملاحظة: يحدث احتقان الدم بواسطة الأدينوزين (200 ميكروغرام / كجم / دقيقة عن طريق الوريد) ، كما هو موضح سابقا12.
- قم بإجراء تصوير الإجهاد باستخدام بلعة ماء إضافية تبلغ 800 ميجابايت + 15بعد اضمحلال إشعاعي مناسب لمدة 12 دقيقة.
5. نقل الجينات
- رسم الخرائط الكهروتتشية
- انتقل إلى رسم الخرائط الكهروتشريحية بعد تصوير الأوعية التاجية والقياسات الوظيفية (تخطيط صدى القلب ، التصوير السينمائي LV).
- إدخال قسطرة رسم الخرائط إلى البطين الأيسر عن طريق غمد الفخذ في التوجيه بالمنظار.
ملاحظة: سجل حوالي 100-150 نقطة حول البطين الأيسر باستخدام قسطرة رسم الخرائط لإنشاء الخريطة التشريحية الكهربائية.
- الانتهاء من الخريطة الكهروتتشية
- احذف النقاط المتطرفة لضمان خريطة تشريحية كهربية أكثر موثوقية للبطين الأيسر.
- قم بذلك عن طريق تحديد Clip Planes من الخريطة وحذف النقاط التي تختلف عن النقاط التي تشكل شكل البطين. بعد ذلك، حدد المسارات لعرض الخريطة واحذف النقاط التي انتقلت أفقيا أثناء تسجيل النقاط.
ملاحظة: تأكد من أن النقاط المتبقية تغطي البطين الأيسر وتسجيل المزيد من النقاط إذا لزم الأمر.
- حقن نقل الجينات
- إدخال قسطرة حقن داخل عضلة القلب إلى البطين الأيسر عبر غمد الفخذ تحت توجيه التنظير الفلوري. اضبط طول إبرة الحقن على 3 مم.
- معايير الحقن داخل عضلة القلب
- توجيه عمليات نقل الجينات عن طريق نظام رسم الخرائط الكهروتشريحية واستهداف الحقن في مناطق قابلة للحياة ولكن ناقصة الحركة في البطين الأيسر.
ملاحظة: من أجل الجدوى ، استخدم جهدا أحادي القطب يزيد عن 5 مللي فولت كمعيار. بالنسبة لنقص الحركة ، حدد تقصيرا خطيا محليا (LLS) منخفضا بقدر ما هو متاح ، على الأقل أقل من 12٪ ولكن يفضل أن يكون أقل من 6٪ 13.
- توجيه عمليات نقل الجينات عن طريق نظام رسم الخرائط الكهروتشريحية واستهداف الحقن في مناطق قابلة للحياة ولكن ناقصة الحركة في البطين الأيسر.
- حقن داخل عضلة القلب
- خلال 30 ثانية ، قم بحقن المادة المتجهة في نقطة الاختيار (الخطوة 5.4) واحتفظ بإبرة الحقن داخل عضلة القلب لمدة 5 ثوان إضافية قبل التراجع لمنع التدفق العكسي إلى البطين الأيسر.
6. القتل الرحيم وجمع العينات
ملاحظة: بعد تصوير الأوعية التاجية وقياسات الكسر القذفي الموصوفة في الخطوتين 3.4.1 و 3.5.2 ، على التوالي ، يتم تطبيق 50 مل من كلوريد البوتاسيوم المشبع عن طريق الوريد للخنزير المخدر.
- تثبيت التروية للقلب
- حصاد القلب من التجويف الصدري. شطف بالماء. ضع إبرة 18 جم فوق الصمام الأبهري وقم بتوصيل الإبرة بمضخة التروية. قم بتغذية القلب ب 750 مل من 1٪ بارافورمالدهيد (PFA).
- جمع العينات
- قطعي القلب إلى شرائح بسمك 1 سم باستخدام سكين مطبخ حاد. اجمع العينات من منطقة نقل الجينات إلى 4٪ PFA والنيتروجين السائل.
ملاحظة: لحصاد الضوابط السلبية ، اجمع عينة تحكم من الجدار الخلفي للبطين الأيسر.
- قطعي القلب إلى شرائح بسمك 1 سم باستخدام سكين مطبخ حاد. اجمع العينات من منطقة نقل الجينات إلى 4٪ PFA والنيتروجين السائل.
- جمع أنسجة السلامة
- حصاد العينات من الأنسجة النائية ، مثل الرئة والكبد والكلى والطحال والمبيض. خذ عينات إلى 4٪ PFA والنيتروجين السائل.
7. تخزين العينات
- قم بتخزين العينات للتلطيخ في 4٪ PFA لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: استبدل PFA يوميا بسائل جديد.- بعد 48 ساعة ، استبدل PFA بنسبة 15٪ سكروز في ماء منزوع الأيونات. يخزن لمدة 24 ساعة على الأقل قبل تضمين العينات في كتل البارافين. يتم تخزين العينات المجمدة المفاجئة في -70 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن تأكيد نجاح عملية نقص التروية من خلال هذا البروتوكول عن طريق تصوير الأوعية التاجية وتحديد منطقة نقص الحركة عن طريق الموجات فوق الصوتية عبر الصدر (الشكل 1) قبل الشروع في توصيل الجينات. يمكن تقييم حالة انسداد الشريان التاجي عن طريق تصوير الأوعية التاجية ، ويضمن رسم الخرائط الكهروتشريحية المناطق الإقفارية والسبات.
يمكن تحليل فعالية العلاج الجيني عن طريق قياس الإجهاد المحيطي والكسر القذفي ونضح عضلة القلب بمقدار 15H2O-PET (الشكل 3). يمكن جمع عينات الأنسجة مباشرة من منطقة نقل الجينات عن طريق مقارنة القلب بالخريطة التشريحية الكهربية. يمكن تقييم التعبير الجيني التحوير وتكوين الأوعية العلاجية (الشكل 4) من خلال التحليل المناعي النسيجي عن طريق تحليل عدد الخلايا الإيجابية بعد تلطيخ بيتا غالاكتوزيداز وتحليل منطقة الشعيرات الدموية لعضلة القلب بعد تلطيخ CD31. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم سلامة العلاج الجيني عن طريق التصوير التشخيصي (تقييم انصباب التامور عن طريق تخطيط صدى القلب) ، وعلم الأنسجة المناعي ، وتحليل التوزيع.
الشكل 1: بروتوكول الدراسة. يحدث نقص التروية قبل 14 يوما من نقل الجينات. 15يتم إجراء التصوير H2O-PET قبل يوم واحد من نقل الجينات وقبل القتل الرحيم وجمع العينات. يعتمد وقت جمع العينات على الناقل الفيروسي والجين العلاجي المستخدم. عند استخدام ناقلات الفيروسات الغدية ، يكون 15H2O-PET الثاني في اليوم الخامس ، ووقت جمع العيناتفي اليوم السادس ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد الأوعية الدموية. الآلات اللازمة للتدخلات التاجية: جهاز الموجات فوق الصوتية ، جهاز التنفس الصناعي ، ومحطة تصوير الأوعية ، من اليسار إلى اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صورة تمثيلية للإجهاد المحيطي، و15H2O-PET وخريطة تشريحية كهربية من القلب الإقفاري. 15H2O-PET: يمثل اللون الأحمر منطقة التروية القصوى ، ويشير اللون الأزرق إلى منطقة نقص التروية. الخريطة الكهروتتشية: تمثل النقاط البنية في الخريطة الكهروتتشية مواقع الحقن. يشير اللون الأحمر إلى مناطق ناقصة الحركة في البطين الأيسر ، بينما يشير اللون الأرجواني إلى منطقة الانقباض الطبيعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صورة تمثيلية لتلطيخ β-galactosidase و PECAM-1. يتم التعبير عن β-galactosidase في القلوب المحولة AdLacZ ويمكن استخدامه لإظهار تعبير الجينات المحورة. يستخدم تلطيخ PECAM-1 للكشف عن الشعيرات الدموية عضلة القلب وتحليل منطقة الشعيرات الدموية. يمثل الصف السفلي المنطقة البعيدة عن نقل الجينات. شريط المقياس في تلطيخ β-galactosidase: 200 ميكرومتر. شريط المقياس في بقع PECAM-1: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
فيديو 1: عرض المحور القصير لتخطيط صدى القلب عبر الصدر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2: تصوير الأوعية التاجية ل LAD قبل نقل الجينات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 3: قياس قطر الشريان الأمامي الأيسر النازل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تعديل النقاط الزمنية لهذا البروتوكول وفقا للناقل الفيروسي المستخدم. أيضا ، يمكن اختيار التحليلات المناعية وفقا للجين العلاجي. من الممكن أيضا إضافة المزيد من النقاط الزمنية ونقاط النهاية إلى البروتوكول إذا لزم الأمر.
يتكون هذا البروتوكول من مراحل ضرورية للنجاح ومن المستحيل تصحيحها بعد ذلك. أولا ، إذا فشل المرء في إحداث نقص التروية المناسب ، فيجب استبعاد الحيوان من الإجراءات والتحليلات الإضافية. يعد توحيد الأساليب والتصوير أمرا بالغ الأهمية بحيث تكون النتائج قابلة للمقارنة بين النقاط الزمنية والحيوانات. ثانيا ، يجب جمع العينات من منطقة نقل الجينات الدقيقة ومعالجتها بنجاح لإجراء مزيد من التحليلات. أيضا ، يتطلب هذا البروتوكول معرفة عميقة بإجراءات تصوير الأوعية وطرق التصوير المختلفة. على سبيل المثال ، يتطلب تصوير الأوعية التاجية والحقن الفيروسية للقلب النابض تدريبا مكثفا بالإضافة إلى إجراء تخطيط صدى القلب الصحيح عبر الصدر. ومع ذلك ، فإن طرق التصوير هذه تقيس وظيفة عضلة القلب والتروية لتوفير المعلومات الأساسية لمزيد من الدراسات.
يشبه نظام القلب والأوعية الدموية للخنزير الجهاز البشري بسبب أوجه التشابه التشريحية والفسيولوجية ، وبالتالي ، غالبا ما تستخدم الخنازير لنمذجة ميكانيكا وإجراءات أمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، يقتصر وقت المتابعة على حوالي 6 أشهر بسبب النمو السريع للحيوان. بعد 6 أشهر ، يصبح التعامل مع الحيوان صعبا ، وتتدهور جودة التصوير.
أيضا ، الخنازير مقاومة إلى حد كبير لتصلب الشرايين ، مما يجعل تصلب الشرايين الناجم عن النظام الغذائي معقدا للنموذج في الخنازير17. ومع ذلك ، تم تطوير نماذج نقص التروية المزمنة لتقليد المرض الأصلي. الميزة الكبيرة لنموذج نقص تروية الدعامة عنق الزجاجة المستخدم في هذا البروتوكول هي أن الانسداد التدريجي للدعامة يمثل مرض الشريان التاجي أفضل من الانسداد المفاجئ. بالمقارنة مع نموذج مضيق الأمرويد ، فإن هذه الطريقة أقل توغلا. ثانيا ، يعد وضع دعامة عنق الزجاجة عن طريق الجلد إجراء سريعا يجب القيام به. يتيح استخدام نظام رسم الخرائط الكهروتشريحية استهداف نقل الجينات إلى عضلة القلب السبات ، وليس إلى منطقة الاحتشاء ، وهي نتيجة محتملة عند استخدام توجيه الموجات فوق الصوتية لاستهداف الحقن. ومع ذلك ، فإن الجانب السلبي لرسم الخرائط الكهروتشريحية هو طول الإجراء. علاوة على ذلك ، نظرا لأن قلب الخنزير شديد الحساسية لعدم انتظام ضربات القلب البطيني ، فإن رسم الخرائط يمكن أن يحفز الرجفان البطيني أثناء إجراء رسم الخرائط. ومع ذلك ، فإن عدم انتظام ضربات القلب هذه يمكن إزالة الرجفان بسهولة.
تحدد نقاط النهاية المستخدمة في هذا النموذج الحيواني الكبير تلك المستخدمة في التجارب السريرية ، مما يعزز الانتقال إلى العيادات. بالإضافة إلى ذلك ، تنطبق هذه الطرق على الدراسات الحيوانية الكبيرة التي تقيم فعالية العلاج الجيني لعضلة القلب مع أوقات متابعة مختلفة ونقاط نهاية مساعدة أخرى بالإضافة إلى تلك الموضحة في هذا النموذج. تم توحيد هذا البروتوكول بعد تجربة واسعة من التجارب على الحيوانات الكبيرة. في المستقبل ، ينطبق هذا البروتوكول على تقييم سلامة وفعالية العلاج الجيني لعضلة القلب قبل الترجمة إلى العيادات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا ماريا هيدمان ، وتينا لايتينن ، وتومي لايتينن ، وبيكا بوتياينن ، وأنيكا فيرين ، وسيفيري سورمونن على المساعدة والسماح ب 15تصوير O-PET في مستشفى جامعة كوبيو ؛ وهيكي كارهونن ومينا تورونين وريكا فينالاينن من المركز الوطني لحيوانات المختبر لمساعدتهم في العمل الحيواني.
هذه الدراسة مدعومة بمنح من الأكاديمية الفنلندية و ERC ومنحة CardioReGenix EU Horizon 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 15 % sucrose | VWR | VWRC27480.294 | Prepared from solid sucrose |
| 4% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 5 F pigtail catheter | Cordis | 534-550S | |
| 6 F catheter AR2 | Cordis | 670-112-00 | |
| 6 F introducer sheath | Cordis | 504-606X | |
| 8 F introducer sheath | Cordis | 504-608X | |
| Acetylsalicylic acid | Varying producer | ||
| Amiodarone | Varying producer | ||
| Angiographic station | GE Healthcare | ||
| Angiolaboratory set | Mölnlycke | designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs | |
| Bisoprolol | Varying producer | ||
| Cefuroxime | Varying producer | ||
| Clopidogrel | Varying producer | ||
| Coroflex Blue stent | B.Braun Medical | 5029012 | Catalog number depends on stent size |
| Crile forceps | |||
| Cyclotron | GE Healthcare | ||
| Dobutamine | Varying producer | ||
| Electroanatomical mapping system | Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company | ||
| Enoxaparin | Varying producer | ||
| Fentanyl | Varying producer | ||
| Intramyocardial injection catheter | Johnson & Johnson | ||
| Iodine contrast agent | Iomeron | ||
| Kitchen knife | Varying producer | ||
| Lidocaine | Varying producer | ||
| Liquid nitrogen | Varying producer | ||
| MgSO4 | Varying producer | ||
| Needle 18 G | Cordis | 12-004943 | |
| Perfusion pump | |||
| PET-CT scanner | Siemens Healthcare | ||
| Polytetrafluoroethylene tube | |||
| Propofol | Varying producer | ||
| Scalpel no 11 | VWR | SWAN0503 | |
| Sublingual dinitrate | Takeda | ||
| Ultrasound machine | Philips |
References
- Naghavi, M., et al. Global, regional, and national age-sex specifc mortality for 264 causes of death, 1980-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Knuuti, J., et al. 2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes: The Task Force for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 41 (3), 407-477 (2020).
- Davies, A., et al. Management of refractory angina: An update. European Heart Journal. 42 (3), 269-283 (2021).
- Ylä-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular gene therapy: Past, present, and future. Molecular Therapy. 25 (5), 1095-1106 (2017).
- Lähteenvuo, J., Ylä-Herttuala, S. Advances and challenges in cardiovascular gene therapy. Human Gene Therapy. 28 (11), 1024-1032 (2017).
- Hammond, H. K., et al. Intracoronary gene transfer of adenylyl cyclase 6 in patients with heart failure: A randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 1 (2), 163-171 (2016).
- Hartikainen, J., et al. Adenoviral intramyocardial VEGF-DDNDC gene transfer increasesmyocardial perfusion reserve in refractory angina patients: A phase I/IIa study with 1-year follow-up. European Heart Journal. 38 (33), 2547-2555 (2017).
- Laakkonen, J. P., Ylä-Herttuala, S. Recent advancements in cardiovascular gene therapy and vascular biology. Human Gene Therapy. 26 (8), 518-524 (2015).
- Roth, D. M., et al. Effects of left circumflex Ameroid constrictor placement on adrenergic innervation of myocardium. The American Journal of Physiology. 253 (6), Pt 2 1425-1434 (1987).
- White, F. C., Carroll, S. M., Magnet, A., Bloor, C. M. Coronary collateral development in swine after coronary artery occlusion. Circulation Research. 71 (6), 1490-1500 (1992).
- Liu, C. -B., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells improve left ventricular function, perfusion, and remodeling in a porcine model of chronic myocardial ischemia. Stem Cells Translational Medicine. 5 (8), 1004-1013 (2016).
- Rissanen, T. T., et al. The bottleneck stent model for chronic myocardial ischemia and heart failure in pigs. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1297-1308 (2013).
- Greenberg, N. L., et al. Doppler-derived myocardial systolic strain rate is a strong index of left ventricular contractility. Circulation. 105 (1), 99-105 (2002).
- Grönman, M., et al. Assessment of myocardial viability with [15O]water PET: A validation study in experimental myocardial infarction. Journal of Nuclear Cardiology. , 1-10 (2019).
- Tarkia, M., et al. Evaluation of 68Ga-labeled tracers for PET imaging of myocardial perfusion in pigs. Nuclear Medicine and Biology. 39 (5), 715-723 (2012).
- Gyöngyösi, M., Dib, N. Diagnostic and prognostic value of 3D NOGA mapping in ischemic heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (7), 393-404 (2011).
- Shim, J., Al-Mashhadi, R. H., Sørensen, C. B., Bentzon, J. F. Large animal models of atherosclerosis - New tools for persistent problems in cardiovascular medicine. Journal of Pathology. 238 (2), 257-266 (2016).
