Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van neutrofielen uit volbloed, buffy coats of leukaferesemembranen, het bereiken van een goede opbrengst, hoge zuiverheid en minimale celactivering. We maken gebruik van gradiëntzuivering, rode bloedcel (RBC) sedimentatie en RBC-lysis om een hoogwaardig / zuiver neutrofielenpreparaat te verkrijgen.
Abstract
Neutrofielen (PMN's) zijn de meest voorkomende leukocyten in de menselijke circulatie, variërend van 40 tot 70% van de totale bloedleukocyten. Het zijn de eerste cellen die worden gerekruteerd op de plaats van ontsteking via snelle extravasatie door bloedvaten. Daar voeren neutrofielen een reeks functies uit om binnendringende pathogenen te doden en immuunsignalering te bemiddelen. Vers gezuiverde neutrofielen uit menselijk bloed zijn het model bij uitstek voor onderzoek, omdat geen enkele cellijn PMN-functies en biologie volledig repliceert. Neutrofielen zijn echter kortlevende, terminaal gedifferentieerde cellen en zijn zeer gevoelig voor activering als reactie op fysieke (temperatuur, centrifugatiesnelheid) en biologische (endotoxine, chemo- en cytokines) stimuli. Daarom is het cruciaal om een gestandaardiseerde, betrouwbare en snelle methode te volgen om zuivere en niet-geactiveerde cellen te verkrijgen. Dit protocol presenteert een bijgewerkt protocol dat dichtheidsgradiëntcentrifugatie, sedimentatie van rode bloedcellen (RBC) en RBC-lysis combineert om een hoge PMN-zuiverheid te verkrijgen en celactivering te minimaliseren. Bovendien worden ook methoden besproken om de kwaliteit, levensvatbaarheid en zuiverheid van neutrofiele isolatie te beoordelen.
Introduction
Het aangeboren immuunsysteem bestaat uit vele celtypen die immuunhomeostase en pathogeenklaring handhaven, samen met vele andere fysiologische functies. Neutrofielen vormen de grootste pool van witte bloedcellen in de menselijkecirculatie 1. De meeste volwassen neutrofielen worden opgeslagen in het beenmerg, dat de plaats is van generatie voor nieuwe neutrofielen, ook wel granulopoiese genoemd. In het beenmerg verlaten granulocytenvoorlopers de celcyclus en differentiëren terminaal, het verkrijgen van hun karakteristieke gesegmenteerde kernen enkorrels 2. Onder inflammatoire omstandigheden, als reactie op chemokines, cytokines en schade-geassocieerde en pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, worden neutrofielen gemobiliseerd uit de bloedbaan en uit het beenmerg om een breed scala aan functies uit te voeren. Deze omvatten cytokinecretie, directe fagocytose van het pathogeen, de afgifte van reactieve zuurstofsoorten, degranulatie van antimicrobiële eiwitten en de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen.
De moleculen die neutrofielen gebruiken om infecties te bestrijden, zijn giftig voor de microben en de gastheer. De levensduur en de juiste verwijdering van ouder wordende / stervende neutrofielen zijn dus sterk gereguleerd en ze hebben een beperkte levensduur in omloop (<48 uur)3. Vanwege deze korte overleving produceert het menselijk lichaam dagelijks gemiddeld 100 miljard nieuwe neutrofielen om de homeostase van de bevolking te handhaven4. Noodgranulopoiese kan de afgifte van neutrofielen, zowel volwassen als onvolwassen, in het bloed verder verhogen tijdens ontsteking en infectie5. Het belang van neutrofielen in de aangeboren immuunrespons wordt benadrukt door patiënten met verworven of aangeboren neutropenie, die vatbaar zijn voor bacteriële en schimmelinfecties6.
Veel uitdagingen doen zich voor bij het bestuderen van neutrofielenbiologie en hun rol in de immuunrespons vanwege hun aard, inclusief hun korte overleving en cytotoxische inhoud. Neutrofielachtige cellijnen zijn vaak gedifferentieerd van menselijke promyelocytaire leukemie HL-60-cellen en PLB-985-cellen7,8. Hoewel ze neutrofielachtige morfologie kunnen vertonen en chemotaxis kunnen uitvoeren, kunnen deze cellijnen de biologie van neutrofielen niet volledig samenvatten. In vitro assays met behulp van deze cellijnen zijn ook niet in staat om in vivo experimenten samen te vatten. Bovendien moet de differentiatie van deze cellen worden geïnduceerd en kan deze nadelig worden beïnvloed door genmanipulatie vóór differentiatie.
Onlangs zijn methoden ontwikkeld om deze problemen te omzeilen door induceerbare promotors te gebruiken om genexpressie postdifferentiatie in HL-60-cellen te moduleren9. Zelfs met dergelijke hulpmiddelen zijn primaire menselijke PMN's vereist om doelen te valideren met behulp van farmacologische benaderingen. Het is dus noodzakelijk om zuivere en geïnactiveerde neutrofielen geïsoleerd uit bloed te verkrijgen om de bevindingen van cellijn- en diermodellen te valideren. Dit artikel presenteert een herzien PMN-isolatieprotocol waarin de voor- en nadelen van de huidige methoden werden geëvalueerd10. Er werd een combinatie bedacht bestaande uit gradiëntcentrifugatie om PMN's te scheiden van andere immuuncellen, korte sedimentatie op basis van dextran om het grootste deel van de RBC's te verwijderen, snelle resterende RBC-lysis via osmotische druk en centrifugering met lage snelheid om bloedplaatjesbesmetting te verwijderen.
Protocol
OPMERKING: Menselijke neutrofielen werden geïsoleerd uit veneus bloed uit afgedankte witte bloedcelfilters verkregen uit het Blood Bank Lab in het Boston Children's Hospital. Bloeddonoren waren niet identificeerbaar en er was geen interactie met levende personen of kennis van identificeerbare persoonlijke informatie. Daarom is dit werk niet geclassificeerd als onderzoek naar menselijke proefpersonen onder de HHS human subjects regulations (45 CFR Part 46). De Boston Children's Hospital Institutional Review Board (IRB) keurde het protocol goed.
1. Het verloop in lagen leggen
- Na het steriliseren van de buffy coat of volbloed verpakking en de laminaire kap, verdeel het bloed in 50 ml buizen met 10 ml bloed in elke buis.
- Breng het volume op 35 ml met 5% foetaal runderserum (FBS) / Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) om het bloed te verdunnen voor een schonere gradiënt.
OPMERKING: Bij gebruik van een leukaferesemembraan kunnen cellen worden weggespoeld met een spuit van 60 ml en 30 ml 5% FBS / HBSS per filter. Verdunning is niet nodig bij het werken met vers getrokken volbloed. - Sluit het buisdeksel van 50 ml, meng het meerdere keren door inversie en houd het ondersteboven om de bodem zonder RBC's te hebben.
- Voeg 10 ml dichtheidsgradiëntmedium (zie de tabel met materialen)direct onder het bloed toe. Zorg ervoor dat het medium en het bloed niet mengen en dat de interface scherp is(figuur 1A).
OPMERKING: Deze stap is cruciaal. Zorg ervoor dat de dichtheidsgradiëntoplossing op kamertemperatuur (RT) is en goed gemengd is voor elke gradiënt. De eerste milliliter van het dichtheidsgradiëntmedium moet zo langzaam mogelijk zorgvuldig en gestaag worden gelaagd. Het wordt aanbevolen om de snelheid van de elektronische pipet op laag in te stellen. - Plaats de buis voorzichtig in een centrifuge zonder de helling te verstoren en draai gedurende 30 minuten bij RT op 400 × g, zorg ervoor dat u de rem uitschakelt. Observeer hoe de gesponnen gradiënt zich scheidt in een bovenste serum / plasmalaag, een middelste witte ring van perifere bloedmononnucleaire cellen (PBMC's), een troebele dichtheidsgradiënt mediumlaag en een onderste pellet bestaande uit een witte, dunne neutrofiele band bovenop de RBC's (Figuur 1B).
OPMERKING: Een troebele of ondoorzichtige kant van de buis na centrifugeren kan erop wijzen dat de cellen (neutrofielen) geactiveerd zijn en mogelijk niet geschikt zijn om te gebruiken. - Verwijder de PBMC's eerst door de zuigpipet rechtstreeks in de PBMC-laag te plaatsen. Zorg ervoor dat u het volledig opzwept terwijl de serum/ plasmalaag afneemt naarmate de ring wordt verwijderd. Schraap de zijkant van de buis waar cellen worden gepelleteerd met de zuigpipet om de verwijdering van de PMBC te maximaliseren. Verwijder voorzichtig de troebele dichtheidsgradiënt mediumlaag tussen de PBMC-ring en de neutrofiel/RBC-pellet.
OPMERKING: Het schrapen van de gepelleteerde cellen aan de zijkant van de buis verhoogt de zuiverheid van de isolatie aanzienlijk. Pas op dat u de pellet niet opzweait, omdat de meeste neutrofielen direct op de RBC's zitten.
2. Sedimentatie van erytrocyten (RBC's)
- Breng met een pipet van 10 ml de neutrofiel/RBC-pellet over in een schone buis. Pipetteer niet op en neer. Voeg 5% FBS/HBSS toe aan een eindvolume van 25 ml. Meng voorzichtig door inversie.
OPMERKING: Het uitvoeren van de RBC-sedimentatie na de PBMC-verwijdering verbetert de opbrengst en vermindert de activering10. - Voeg direct 25 ml voorgewarmde (37 °C) 3% Dextran/0,9% NaCl/H2O toe aan de buis met de verdunde neutrofiel/RBC-pellet en meng voorzichtig door inversie. Plaats de buis gedurende 15 minuten op een vlak, niet-trillend oppervlak(figuur 1C).
OPMERKING: Langere sedimentatie vermindert RBC-verontreiniging, maar vermindert ook de opbrengst. Bovendien kan langdurige blootstelling aan dextran leiden tot activering van neutrofielen of celdood11. - Breng de buis voorzichtig terug in de kap (voor steriele isolatie). Door de pipet slechts lichtjes in de vloeistof onder te dompelen, verzamelt u de bovenste laag (~ 30 ml) die het vloeistofoppervlak naar beneden volgt.
OPMERKING: Als de sedimentatie een scherpe interface tussen het medium en de RBC's produceert, is de RBC-pellet kleiner of als een hogere opbrengst gewenst is, verzamel dan tot 35 ml. - Draai de buis (400 × g,10 min, RT, met behulp van lage rem (3)), wat resulteert in een rode pellet zonder deeltjes die in de media zweven.
3. Lysis van de resterende RBC's
- Adem het supernatant voorzichtig op zonder de pellet te verstoren.
- Voeg 25 ml steriel ultrapijn water rechtstreeks in de buis toe en meng voorzichtig door gedurende 28 s om te keren om de RBC's te lyseren. Gebruik geen pipet om de pellet opnieuw te suspensen.
OPMERKING: Niet langer dan 30 s als langdurige hypotone aandoeningen kunnen activeren en leiden tot neutrofiele dood12. - Voeg onmiddellijk 25 ml steriele 1,8% NaCl/H2O toe aan de buis en meng voorzichtig door om te keren om de oplossing terug te brengen naar isotone omstandigheden.
OPMERKING: De oplossing moet rood zijn, maar zonder troebelheid. - Draai naar beneden bij 200 × g gedurende 3-5 minuten met lage rem (niveau 3) om RBC's en bloedplaatjesbezinking samen met de neutrofielen te minimaliseren (Figuur 1D en Figuur 2)13,14.
OPMERKING: De pellet moet wit zijn met een minimale RBC-laag bovenop, die voorzichtig kan worden verwijderd terwijl het supernatant wordt aangezogen. - Resuspend neutrofielen door het kweekmedium (10% FBS/RPMI1640) direct op de pellet te pipetteren, maar pipetteer niet op en neer. Schommel de buis horizontaal van links naar rechts om de celactivering te minimaliseren.
OPMERKING: Cellen moeten worden gehouden in een concentratie van ~ 2 × 106 cellen / ml, omdat een hogere dichtheid zal leiden tot verhoogde celactivatie / dood15. Om dezelfde reden moet de celkorrel zo snel mogelijk opnieuw worden gesuspendeerd. - Als celaggregatie of klonteren wordt waargenomen, filtert u de celsuspensie met behulp van een mesh van 70 μm om samengeklontelde neutrofielen weg te gooien.
4. Bepaling van de kwaliteit van neutrofiele isolatie
- Kleur de cellen met markers specifiek voor neutrofielen (CD66b, CD11b), eosinofielen (CD193) (Figuur 3) en een activeringsmarker zoals CD62L (Figuur 4). Verkrijg 20.000 cellen door flowcytometrie. Analyseer de celzuiverheid en -activering met behulp van de gatingstrategieën die worden voorgesteld in figuur 3 en figuur 4.
OPMERKING: De kwaliteit van het neutrofielenpreparaat kan worden beoordeeld met behulp van een 3% azijnzuur-methyleenblauwoplossing om de unieke gelobde kern van neutrofielen te visualiseren. - Bepaal de levensvatbaarheid van cellen met behulp van Annexine V/propidiumjodide (PI) (figuur 5).
OPMERKING: Trypan blauwe kleuring kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren.
Representative Results
Bij het gebruik van dichtheidsgradiënt om neutrofielen te zuiveren, is het van cruciaal belang dat het raakvlak tussen het bloed en het dichtheidsgradiëntmedium zo scherp mogelijk is en dat er na centrifugering een duidelijke laagscheiding overblijft (stap 1.4). Na RBC-lysis moet de buffer duidelijk rood zijn en niet troebel (stap 3.3). Als het preparaat troebel is, kan een tweede ronde lysis (stap 3) nodig zijn, hoewel dit de overleving van neutrofielen kan beïnvloeden(figuur 1). Na lysis wordt centrifugering met lage snelheid (200 × g)aanbevolen wanneer zuiverheid prioriteit krijgt, omdat dit de besmetting met bloedplaatjes aanzienlijk vermindert. Snelle centrifugatie (400 × g) verhoogt echter het rendement ten koste van de zuiverheid (stap 3.4, figuur 2). Na neutrofiele isolatie kan fluorescentie-geactiveerde celsortering worden gebruikt om de isolatiezuiverheid te beoordelen (stap 4.1) en moet worden gekozen boven microscopie. Hoewel alleen de FSC/SSC-verdeling van cellen een schatting geeft van de celisolatiekwaliteit (figuur 3A), verdient het gebruik van specifieke celmarkers de voorkeur. In dit geval worden de meest voorkomende contaminerende celpopulaties gekleurd met specifieke antilichamen samen met CD66b, specifiek uitgedrukt op granulocyten. CD45-kleuring wordt gebruikt om leukocyten (CD45+) en rode bloedcellen en bloedplaatjes (CD45-) te onderscheiden.
Andere verontreinigingen zijn lymfocyten (CD3+ of CD19+, Figuur 3F),monocyten (CD14+, Figuur 3D) en eosinofielen (CD193+, Figuur 3G). CD11b is een integrine uitgedrukt op de myeloïde afstamming; neutrofielen en monocyten zijn CD11b+, terwijl lymfocyten CD11b- zijn (Figuur 3C). Aangezien neutrofiele activering stroomafwaartse experimenten kan beïnvloeden, moet de expressie van CD62L worden beoordeeld; neutrofielen worden CD62L- eenmaal geactiveerd (stap 4.1). Het peptide fMLP kan worden gebruikt als een positieve controle voor CD62L-afstoten(figuur 4). Het is ook belangrijk om de gezondheid van neutrofielen te evalueren voordat testen worden uitgevoerd; neutrofielen hebben een relatief korte halfwaardetijd en activering kan deze verder verkorten (stap 4.2). Een standaard Annexin V- en PI-kleuring kan informatie geven over de levend/dood-status van de neutrofielencultuur op aangewezen tijdstippen(figuur 5).
Figuur 1: Dichtheidsgradiënt op middellange basis scheiding van granulocyten. (A) Vóór en (B) na centrifugering. Let op de scherpe interface tussen het bloed en de mediumlagen van de dichtheidsgradiënt. (C) Sedimentatie van de pellet in B geresuspendeerd (1:1) in 5% FBS/HBSS en 3% Dextran-0,9% NaCl. (D) PMN-pellet na lysis van de resterende RBC's in het supernatant van (C) met H2O. Afkortingen: PBMC = perifere mononucleaire bloedcel; PMN = neutrofiel; RBC = rode bloedcel; FBS = foetaal runderserum; HBSS = Hank's Gebalanceerde Zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Draaien bij lagere snelheden na RBC-lysis verminderde de bloedplaatjesbesmetting. Na lysis van RBC's met H2O werden cellen afgesponnen bij 200 × g (A) of 400 × g (B). Neutrofielen werden gekleurd en flowcytometrie-analyse werd uitgevoerd, zoals beschreven in figuur 3, met de toevoeging van anti-CD41 om de bloedplaatjes te labelen. Afkortingen: RBC = rode bloedcel; CD41 = cluster van differentiatie 41; SSC-A = zijverstrooiingsgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Beoordeling van neutrofielen geïsoleerd uit buffy coat. Geïsoleerde neutrofielen werden gekleurd met anti-CD66b, anti-CD11b, anti-CD14 en anti-CD193 volgens een standaardprotocol. Enkele cellen (B) waren afgeschermd van totale cellen (A). (C) CD11b+ cellen waren gated van enkele cellen. (D) Dot plot met neutrofielen (CD66b+, CD14 laag/-) en een zeer lage monocytenbesmetting (CD66b-, CD14+, Q1). (E) CD66b- en CD66b+ cellen waren gated. (F) CD66b- cellen waren positief voor lymfocytenmarkers (CD3, CD19). (G) Expressie van CD11b en CD193 in CD66b+ cellen, met verschillende neutrofiele (CD66b+, CD11b+, CD193-) en eosinofiele (CD66b+, CD11b-, CD193+) populaties. In het representatieve resultaat dat hier wordt getoond, is de zuiverheid van neutrofielen ~ 93% met ~ 3,7% lymfocyten en ~ 3,7% eosinofiele besmetting. (H) Kwantificering van de zuiverheid van neutrofielen na zuivering. Gegevens worden verzameld uit 5 individuele onderzoeken en gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Afkortingen: CD = cluster van differentiatie; SSC-A = SSC-A = zijspreidingsgebied; FSC-A = voorwaarts strooigebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gradiëntzuivering veroorzaakte geen CD62L-uitscheiding. (A-B) Controle (A) of fMLP-gestimuleerde neutrofielen (B) (1 mM fMLP gedurende 15 min bij 37 °C) werden gekleurd met neutrofielenmarkers en CD62L. (C)De fluorescerende gemiddelde intensiteit voor CD62L is afgenomen in met fMLP behandelde cellen, wat wijst op CD62L-afstoting en neutrofielactivering. Afkortingen: CD26L = L-selectin; fMLP = N-Formylmethionyl-leukyl-fenylalanine; SSC-A = SSC-A = zijspreidingsgebied; FSC-A = voorwaarts spreidingsgebied; PE = fycoerythrin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Spontane dood van neutrofielen gezuiverd door dichtheidsgradiënt of neutrofielenisolatiekit. Neutrofielen werden gezuiverd met dichtheidsgradiënt (A en B) of commerciële microbeads (C en D) en gekweekt gedurende 0 uur (A en C) of 24 uur (B en D) in RPMI-10% FCS. Cellen werden gekleurd met behulp van Annexin V en PI op respectievelijke tijdstippen volgens een standaardprotocol. (E) Kwantificering van gezuiverde neutrofiele spontane dood. n=5, gemiddelde ± SD. Afkortingen: SSC-A = SSC-A = side scatter-Area; FSC-A = voorwaarts spreidingsgebied; PI = propidiumjodide; FCS = foetaal kalfsserum; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; AV5 = Annexin V. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Vanwege de korte levensduur, terminale differentiatiestatus en lytische inhoud van neutrofielen, is het bestuderen van deze cellen altijd een uitdaging geweest. Afgezien van het gebruik van muismodellen of cellen uit patiëntencohorten, zijn cellijnen nuttige hulpmiddelen om neutrofielenbiologie te helpenbestuderen 16. Neutrofielachtige cellijnen kunnen echter niet alle aspecten van de neutrofiele biologie volledig herhalen, waardoor een extra laag van moeilijkheid wordt toegevoegd bij het bestuderen van deze cellen. Het meest gebruikte in vitro model is de HL-60 cellijn, die kan worden gedifferentieerd in neutrofiel-achtige cellen door behandeling met dimethylsulfoxide of retinoïnezuur17,18. Hoewel deze cellen nuttig zijn bij de studie van migratie en respiratoire burst, zijn ze niet geschikt voor het bestuderen van de microbiocidale activiteit van neutrofielen. Andere cellijnen bestaan (PLB-98, NB4), en ze zijn ook geassocieerd met hun set van beperkingen19.
Het is cruciaal om te valideren met primaire menselijke neutrofielenwaarnemingen gemaakt met muisziektemodellen en cellijnen. Neutrofielen kunnen niet efficiënt worden gecryopreserveerd en worden daarom vaak vers geïsoleerd uit volbloed of buffy coats verkregen van donoren en onmiddellijk verwerkt. Eenmaal geïsoleerd, beginnen de cellen een complexe vorm van spontane dood te ondergaan, gereguleerd door oxidatie, cytoplasmatische caspasen en proteasen gevonden in neutrofielenkorrels20,21. Onjuiste isolatiemethoden of -technieken kunnen leiden tot de activering van neutrofielen, waardoor de celondergang alleen maar wordt versneld. Het is absoluut noodzakelijk om een betrouwbare en consistente methode te hebben om zuivere en hoogwaardige neutrofielen van donoren te verkrijgen.
Er zijn veel methoden gepubliceerd over menselijke neutrofiele isolatie10,22. Ze vallen voornamelijk in twee categorieën, met enkele gedeelde strategieën. De eerste categorie is gebaseerd op antilichamen, hetzij door positieve of negatieve selectie. Positieve selectie zou neutrofielen direct labelen, waardoor een zeer zuivere celpopulatie wordt geboden, hoewel het ook leidt tot snelle celactivering, celdood en ongewenste tagging van neutrofielen23. Negatieve selectie, hoewel de cellen ongelabeld bleven en een zeer zuivere populatie gaven, versnelde neutrofiele dood, hoewel het precieze mechanisme onbekend is(figuur 5). Of gen- of eiwitexpressie ook verandert na positieve of negatieve selectie moet verder worden onderzocht. Bovendien, vanwege de hoeveelheid antilichaam die nodig is om de andere soorten cellen uit te putten, kunnen deze methoden geen grote hoeveelheden neutrofielen produceren. Op antilichamen gebaseerde assays kunnen echter nog steeds worden gebruikt voor kortetermijnkweek en experimenten op kleinere schaal en zijn methoden bij uitstek voor experimenten die een zeer hoge celzuiverheid vereisen, zoals gen- en eiwitexpressiestudies.
Het tweede type isolatiemethode is gradiënt- en dichtheidsgebaseerd. Het gaat meestal om Percoll, Ficoll-Paque of andere polysaccharide / polyvinylpyrrolidoncomponenten en maakt gebruik van centrifugatiekracht om verschillende soorten bloedcellen te scheiden op basis van celdichtheid. Deze methoden worden vaak aangevuld met de sedimentatie van rode bloedcellen door dextran. Deze methoden kunnen grotere schalen van uitgangsmateriaal aan en kunnen ook een hoge zuiverheid bereiken. Een voorbehoud van op dichtheid gebaseerde isolatie is de inefficiënte scheiding van andere veel minder overvloedige granulocyten (meestal eosinofielen) van neutrofielen, en het is daarom de belangrijkste beperking van het gepresenteerde protocol, omdat zelfs de aanwezigheid van kleincellige besmetting de neutrofielenrespons kan beïnvloeden24.
Hier gepresenteerd is een samengevatte methode op basis van gradiëntisolatie, waarbij eerdere methoden10,22wordenverfijnd. We gebruiken de huidige onderschatting van neutrofiele specificiteiten om op betrouwbare wijze zuivere menselijke neutrofielen te isoleren met beperkte resterende bloedplaatjes en RBC's, waardoor neutrofielenactivatie en versnelde dood worden voorkomen. De meest cruciale stap is de gelaagdheid van de gradiënt, die veel effectiever wordt verkregen door het dichtheidsgradiëntmedium onder het bloed toe te voegen om een scherpe interface te verkrijgen. Een snel onderzoek van de PBMC-ring en de gradiënt na centrifugeren kan mogelijke verontreiniging, activering en lage opbrengsten aan het licht brengen. Bij het werken met een leukaferesemembraan of buffy coat is het verdunnen van het bloed belangrijk omdat overmatige celdichtheid zou leiden tot celaggregatie, wat zou leiden tot onzuiverheden en celactivering.
Dit protocol moet binnen 2 uur worden voltooid om de versheid van de cel te garanderen en stappen met betrekking tot het dichtheidsgradiëntmedium, dextran en lysis moeten onmiddellijk worden uitgevoerd, omdat blootstelling aan deze oplossingen neutrofielen kan veranderen. Met dit protocol is de verwachte opbrengst van neutrofielen ten minste ~ 10 miljoen / 10 ml volbloed en ten minste ~ 60 miljoen / 10 ml buffy coat. Evaluatie van de isolatiekwaliteit moet als volgt worden uitgevoerd: geactiveerde neutrofielen moeten minder dan 10% zijn, lymfocytenbesmetting lager dan 5%, minimale eosinofiel (dezelfde zijdelingse scatter maar lagere voorwaartse scatterpopulatie) en de levensvatbaarheid van cellen moet meer dan 90% zijn. Lagere zuiverheid kan het gevolg zijn van onjuiste gelaagdheid of opslag van het dichtheidsgradiëntmedium of vanwege de kwaliteit en versheid van het startbloedproduct.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd in afwezigheid van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door P01HL095489. A.Y.H werd ondersteund door T32HL066987.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
| Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
| Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
| CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
| CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
| CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
| CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
| CD41-APC | biolegend | 303710 | |
| Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
| CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
| CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
| Dextran | Fisher | BP1580 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
| Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
| Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
| MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium chloride | sigma | 71376 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |
References
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Stoller, J. K. Murray & Nadel's textbook of respiratory medicine, 6th edition. Annals of the American Thoracic Society. 12 (8), 1257-1258 (2015).
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A.
- Manz, M. G., Boettcher, S.
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Tucker, K. A., Lilly, M. B., Heck, L., Rado, T. A. Characterization of a new human-diploid myeloid-leukemia cell-line (Plb-985) with granulocytic and monocytic differentiating capacity. Blood. 70 (2), 372-378 (1987).
- Hsu, A. Y., et al. Inducible overexpression of zebrafish microRNA-722 suppresses chemotaxis of human neutrophil like cells. Molecular Immunology. 112, 206-214 (2019).
- Kremserova, S., Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 2087, 33-42 (2020).
- Quach, A., Ferrante, A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. Journal of Immunological Research. 2017, 1254792 (2017).
- Thorson, L. M., Turkalj, A., Hung, J. C. In vitro evaluation of neutrophil viability after exposure to a hypotonic medium. Nuclear Medicine Communications. 16 (7), 615-620 (1995).
- Dhurat, R., Sukesh, M. Principles and methods of preparation of platelet-rich plasma: a review and author's perspective. Journal of Cutaneous and Aesthetetic Surgery. 7 (4), 189-197 (2014).
- Etulain, J., et al. An optimised protocol for platelet-rich plasma preparation to improve its angiogenic and regenerative properties. Scientific Reports. 8 (1), 1513 (2018).
- Hannah, S., et al. Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion. FEBS Letters. 421 (2), 141-146 (1998).
- Hsu, A. Y., et al. Phenotypical microRNA screen reveals a noncanonical role of CDK2 in regulating neutrophil migration. Proceedings of the National Acadermy of Sciences of the United States of America. 116 (37), 18561-18570 (2019).
- Martin, S. J., Bradley, J. G., Cotter, T. G. HL-60 cells induced to differentiate towards neutrophils subsequently die via apoptosis. Clinical and Experimental Immunology. 79 (3), 448-453 (1990).
- Hauert, A. B., Martinelli, S., Marone, C., Niggli, V. Differentiated HL-60 cells are a valid model system for the analysis of human neutrophil migration and chemotaxis. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 34 (7), 838-854 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Siemsen, D. W., et al. Neutrophil isolation from nonhuman species. Methods in Molecular Biology. 1124, 19-37 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), 17314 (2011).
- Calzetti, F., Tamassia, N., Arruda-Silva, F., Gasperini, S., Cassatella, M. A. The importance of being "pure" neutrophils. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (1), 352-355 (2017).
