Summary
यह प्रोटोकॉल पूरे रक्त, बफी कोट, या ल्यूकाफेरिस झिल्ली से न्यूट्रोफिल के अलगाव के लिए एक विधि का विवरण देता है, जो अच्छी उपज, उच्च शुद्धता और न्यूनतम कोशिका सक्रियण को प्राप्त करता है। हम उच्च गुणवत्ता/शुद्धता न्यूट्रोफिल तैयारी प्राप्त करने के लिए ढाल शुद्धिकरण, लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) तलछट, और आरबीसी लाइसिस का उपयोग करते हैं ।
Abstract
न्यूट्रोफिल (पीएमएन) मानव परिसंचरण में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं, जो कुल रक्त ल्यूकोसाइट्स के 40 से 70% तक हैं। वे जहाजों के माध्यम से तेजी से अतिव्यवसंकरण के माध्यम से सूजन की साइट पर भर्ती पहली कोशिकाएं हैं । वहां, न्यूट्रोफिल रोगजनकों पर हमला करने और प्रतिरक्षा संकेत मध्यस्थता करने के लिए कार्यों की एक सरणी करते हैं। मानव रक्त से हौसले से शुद्ध न्यूट्रोफिल अध्ययन के लिए पसंद के मॉडल हैं, क्योंकि कोई सेल लाइन पूरी तरह से पीएमएन कार्यों और जीव विज्ञान की प्रतिकृति नहीं है। हालांकि, न्यूट्रोफिल अल्पकालिक, मरणासन्न विभेदित कोशिकाएं हैं और भौतिक (तापमान, अपकेंद्रित्र गति) और जैविक (एंडोटॉक्सिन, कीमो-और साइटोकिन्स) उत्तेजनाओं के जवाब में सक्रियण के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं। इसलिए, शुद्ध और गैर-सक्रिय कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत, विश्वसनीय और तेज विधि का पालन करना महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल उच्च पीएमएन शुद्धता प्राप्त करने और सेल सक्रियण को कम करने के लिए घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र, लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) तलछट, और आरबीसी लाइसिस के संयोजन के लिए एक अद्यतन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, न्यूट्रोफिल अलगाव की गुणवत्ता, व्यवहार्यता और शुद्धता का आकलन करने के तरीकों पर भी चर्चा की जाती है।
Introduction
जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली में कई सेल प्रकार शामिल हैं जो कई अन्य शारीरिक कार्यों के साथ प्रतिरक्षा होमोस्टेसिस और रोगजनक निकासी को बनाए रखते हैं। न्यूट्रोफिल में मानव परिसंचरण में सफेद रक्त कोशिकाओं का सबसे बड़ा पूल शामिल है1. अधिकांश परिपक्व न्यूट्रोफिल बोन मैरो में संग्रहीत होते हैं, जो नए न्यूट्रोफिल के लिए पीढ़ी की साइट है, जिसे ग्रैनुलोपोइस भी कहा जाता है। बोन मैरो में, ग्रेनुलोसाइट जनक कोशिका चक्र से बाहर निकलते हैं और मरणासन्न अंतर करते हैं, उनकी विशिष्ट खंडित नाभिक और कणिकाएं2प्राप्त करते हैं। भड़काऊ परिस्थितियों में, केमोकिन, साइटोकिन्स, और क्षति से जुड़े और रोगजनक से जुड़े आणविक पैटर्न के जवाब में, न्यूट्रोफिल रक्त के बहाव से और अस्थि मज्जा से बाहर हुए कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला करने के लिए जुटाए जाते हैं। इनमें साइटोकिन स्राव, रोगजनक का प्रत्यक्ष फागोसिटोसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की रिहाई, एंटीमाइक्रोबियल प्रोटीन का डीग्रेंशन, और न्यूट्रोफिल एक्सपेरिमेंटल ट्रैप का निर्माण शामिल है।
संक्रमण से लड़ने के लिए न्यूट्रोफिल द्वारा उपयोग किए जाने वाले अणु रोगाणुओं और मेजबान के लिए जहरीले होते हैं। इस प्रकार, जीवन काल और उम्र बढ़ने/मरने वाले न्यूट्रोफिल को उचित रूप से हटाना अत्यधिक विनियमित होता है, और उनका जीवन काल प्रचलन में सीमित होता है (<48 एच)3। इस छोटे से अस्तित्व के कारण, मानव शरीर जनसंख्या होरोस्टेसिस4को बनाए रखने के लिए हर दिन औसतन 100 बिलियन नए न्यूट्रोफिल का उत्पादन करता है। आपातकालीन ग्रैनुलोपोइस सूजन और संक्रमण 5 केदौरानरक्त में परिपक्व और अपरिपक्व दोनों न्यूट्रोफिल की रिहाई को और बढ़ा सकता है। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में न्यूट्रोफिल के महत्व को अधिग्रहीत या जन्मजात न्यूट्रोपेनिया वाले रोगियों द्वारा हाइलाइट किया जाता है, जो बैक्टीरियल और फंगल संक्रमण6के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं।
न्यूट्रोफिल जीव विज्ञान का अध्ययन करते समय कई चुनौतियां उत्पन्न होती हैं और उनकी प्रकृति के कारण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में उनकी भूमिकाएं, जिनमें उनकी छोटी जीवित रहने और साइटोटॉक्सिक सामग्री शामिल है। न्यूट्रोफिल जैसी कोशिका रेखाओं को आमतौर पर मानव प्रोमाइलोसिटिक ल्यूकेमिया एचएल-60 कोशिकाओं और पीएलबी-985 कोशिकाओं7,8से अलग किया गया है। हालांकि वे न्यूट्रोफिल की तरह आकृति विज्ञान प्रदर्शित कर सकते हैं और केमोटैक्सिस प्रदर्शन कर सकते हैं, इन सेल लाइनों को पूरी तरह से न्यूट्रोफिल के जीव विज्ञान का पुनर्मूल्यांकन नहीं कर सकते । इन सेल लाइनों का उपयोग कर इन विट्रो परख भी वीवो प्रयोगों में पुनः आत्मसमर्पण करने में असमर्थ हैं। इसके अलावा, इन कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करने की जरूरत है और भेदभाव से पहले जीन हेरफेर से प्रतिकूल रूप से प्रभावित हो सकता है ।
हाल ही में, एचएल-60 कोशिकाओं में भेदभाव के बाद जीन अभिव्यक्ति को मिलाना करने के लिए अकक्षीय प्रमोटरों का उपयोग करके इनमुद्दोंको दरकिनार करने के तरीके विकसित किए गए हैं। यहां तक कि ऐसे उपकरणों के साथ, प्राथमिक मानव पीएमएन को औषधीय दृष्टिकोणों का उपयोग करके लक्ष्यों को मान्य करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, सेल लाइन और पशु मॉडल के निष्कर्षों को मान्य करने के लिए रक्त से अलग शुद्ध और निष्क्रिय न्यूट्रोफिल प्राप्त करना अनिवार्य है। यह पत्र एक संशोधित पीएमएन आइसोलेशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसमें वर्तमान तरीकों के पेशेवरों और विपक्षों का मूल्यांकन10किया गया था। एक संयोजन ढाल अपकेंद्रित्र से अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं से पीएमएन अलग करने के लिए तैयार किया गया था, लघु डेक्सट्रन आधारित तलछट आरबीसी के थोक को दूर करने के लिए, तेजी से अवशिष्ट आरबीसी लाइसिस के माध्यम से osmotic दबाव, और प्लेटलेट संदूषण को दूर करने के लिए कम गति अपकेंद्रित्र ।
Protocol
नोट: मानव न्यूट्रोफिल बोस्टन बच्चों के अस्पताल में रक्त बैंक प्रयोगशाला से प्राप्त त्याग सफेद रक्त सेल फिल्टर से शिराकार रक्त से अलग थे । रक्त दाताओं अज्ञात थे, और वहां रहने वाले व्यक्तियों या पहचाने जाने योग्य व्यक्तिगत जानकारी के ज्ञान के साथ कोई बातचीत नहीं थी । इसलिए, इस काम को एचएचएस मानव विषय विनियमों (45 सीएफआर भाग 46) के तहत मानव विषय अनुसंधान के रूप में वर्गीकृत नहीं किया गया है। बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) ने प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी ।
1. ढाल लेयरिंग
- बफी कोट या पूरे रक्त पैकेजिंग और लैमिनार हुड को स्टरलाइज करने के बाद, रक्त को प्रत्येक ट्यूब में 10 एमएल रक्त के साथ 50 एमएल ट्यूबों में विभाजित करें।
- एक क्लीनर ढाल के लिए रक्त को पतला करने के लिए 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)/हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ ३५ एमएल तक की मात्रा लाओ ।
नोट: ल्यूकाफेरिस झिल्ली का उपयोग करते समय, कोशिकाओं को 60 एमएल सिरिंज और 5% एफबीएस/एचबीएसएस प्रति फ़िल्टर के 30 एमएल का उपयोग करके बाहर निकाला जा सकता है। हौसले से तैयार पूरे खून के साथ काम करते समय कमजोर पड़ने अनावश्यक है। - 50 एमएल ट्यूब ढक्कन बंद करें, इसे उलटा करके कई बार मिलाएं, और आरबीसी से रहित नीचे रखने के लिए इसे उल्टा रखें।
- सीधे रक्त के नीचे घनत्व ढाल माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें) के 10 एमएल जोड़ें। सुनिश्चित करें कि मध्यम और रक्त मिश्रण नहीं है और इंटरफेस तेज है(चित्रा 1A)।
नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि घनत्व ढाल समाधान कमरे के तापमान (आर टी) पर है और प्रत्येक ढाल से पहले अच्छी तरह से मिश्रित है। घनत्व ढाल माध्यम के पहले मिलीलीटर को ध्यान से और तेजी से संभव के रूप में धीरे-धीरे स्तरित करने की आवश्यकता है। इलेक्ट्रॉनिक पिपेट गति कम करने के लिए सेट होने की सिफारिश की है । - धीरे-धीरे ट्यूब को रेडिएंट को परेशान किए बिना एक अपकेंद्रित्र में रखें और आर टी में 30 मिनट के लिए 400 × जी पर स्पिन करें, जिससे ब्रेक को अक्षम करना सुनिश्चित हो सके। निरीक्षण कैसे घूमती ढाल एक शीर्ष सीरम/प्लाज्मा परत में अलग, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs), एक बादल घनत्व ढाल मध्यम परत की एक मध्य सफेद अंगूठी, और एक नीचे गोली RBCs(चित्रा 1B)के शीर्ष पर एक सफेद, पतली न्यूट्रोफिल बैंड से मिलकर ।
नोट: अपकेंद्रित्र के बाद ट्यूब के एक बादल या अपारदर्शी पक्ष सुझाव दे सकते हैं कि कोशिकाएं (न्यूट्रोफिल) सक्रिय हैं और उपयोग करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती हैं। - पीबीएमएमसी को सबसे पहले सक्शन पिपेट को सीधे पीबीएमएमसी लेयर में उभरकर हटा दें। इसे पूरी तरह से एस्पिरेट करना सुनिश्चित करें जबकि अंगूठी निकलते ही सीरम/प्लाज्मा परत कम हो जाती है । ट्यूब के उस पक्ष को कुरेदें जहां कोशिकाओं को पीएमबीसी को हटाने को अधिकतम करने के लिए सक्शन पिपेट के साथ गोली लगी है। पीबीएमसी रिंग और न्यूट्रोफिल/आरबीसी पेलेट के बीच बादल घनत्व ढाल मध्यम परत को सावधानी से हटा दें।
नोट: ट्यूब के किनारे पर पेल्ड कोशिकाओं को स्क्रैप करने से अलगाव की शुद्धता काफी बढ़ जाती है। सावधान रहें कि गोली को एस्पिरेट न करें, क्योंकि अधिकांश न्यूट्रोफिल सीधे आरबीसी के शीर्ष पर बैठे हैं।
2. एरिथ्रोसाइट्स (आरबीसी) का तलछट
- 10 एमएल पिपेट का इस्तेमाल करते हुए न्यूट्रोफिल/आरबीसी पेलेट को साफ ट्यूब में ट्रांसफर करें । ऊपर-नीचे पाइपेट न करें। 25 एमएल के अंतिम वॉल्यूम में 5% एफबीएस/एचबीएसएस जोड़ें। धीरे-धीरे उलटा करके मिलाएं।
नोट: पीबीएमसी हटाने के बाद आरबीसी तलछट प्रदर्शन उपज में सुधार और सक्रियण10कम हो जाती है । - सीधे पतला न्यूट्रोफिल/आरबीसी गोली युक्त ट्यूब में प्रीवार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) 3% डेक्सट्रान/0.9% एनएसीएल/एच2ओ जोड़ें और उलटा करके धीरे से मिलाएं। ट्यूब को 15 मिनट(चित्रा 1C)के लिए एक स्तर, गैर-कंपन सतह पर रखें।
नोट: अब तलछट आरबीसी संदूषण को कम कर देता है, लेकिन यह भी उपज कम हो जाती है । इसके अलावा, लंबे समय तक डेक्सट्रान एक्सपोजर से न्यूट्रोफिल एक्टिवेशन या सेल डेथ11हो सकती है। - धीरे से ट्यूब को हुड में वापस लाएं (बाँझ अलगाव के लिए)। तरल में पिपेट को केवल थोड़ा डुबोकर, तरल सतह के नीचे के बाद शीर्ष परत (~ 30 एमएल) एकत्र करें।
नोट: यदि तलछट माध्यम और आरबीसी के बीच एक तेज इंटरफ़ेस पैदा करता है, तो आरबीसी गोली छोटी है, या यदि अधिक उपज वांछित है, तो 35 एमएल तक एकत्र करें। - ट्यूब (400 × जी,10 मिनट, आरटी, कम ब्रेक (3)) का उपयोग करके स्पिन करें, जिसके परिणामस्वरूप मीडिया में तैरते हुए कोई कण नहीं था।
3. अवशिष्ट आरबीसी के Lysis
- धीरे-धीरे गोली को बाधित किए बिना सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
- 25 एमएल बाँझ अल्ट्रापुरे पानी को सीधे ट्यूब में जोड़ें और आरबीसी को lyse करने के लिए 28 एस के लिए उलटा करके धीरे से मिलाएं। पैलेट को रीस्बल्ब करने के लिए पिपेट का इस्तेमाल न करें।
नोट: 30 एस से अधिक न करें क्योंकि लंबे समय तक हाइपोटोनिक स्थितियां सक्रिय हो सकती हैं और न्यूट्रोफिल मृत्यु12का कारण बन सकती हैं । - तुरंत बाँझ 1.8% NaCl/H 2 O के25एमएल ट्यूब में जोड़ें और धीरे से समाधान आइसोटोनिक स्थितियों को वापस लाने के लिए उलटा द्वारा मिश्रण।
नोट: समाधान लाल लेकिन टर्बिडिटी के बिना होना चाहिए। - 200 × जी पर लो ब्रेक (लेवल 3) के साथ 3-5 मिनट के लिए स्पिन करें ताकि न्यूट्रोफिल(चित्रा 1D और चित्रा 2) 13, 14के साथ आरबीसी और प्लेटलेट तलछट को कम किया जासके।
नोट: गोली शीर्ष पर एक न्यूनतम आरबीसी परत के साथ सफेद होना चाहिए, जिसे धीरे से हटाया जा सकता है जबकि सुपरनैक्टेंट एस्पिरेटेड होता है। - सीधे गोली पर संस्कृति माध्यम (10% FBS/RPMI1640) को पाइपिंग करके न्यूट्रोफिल को फिर से पेंड करें, लेकिन ऊपर और नीचे पिपेट न करें । सेल एक्टिवेशन को कम करने के लिए ट्यूब को क्षैतिज रूप से साइड से रॉक करें।
नोट: कोशिकाओं को ~ 2 × १०६ कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर रखा जाना चाहिए, क्योंकि उच्च घनत्व से सेल सक्रियण/मृत्यु15में वृद्धि होगी । इसी कारण से, सेल पैलेट को जितनी जल्दी हो सके फिर से निलंबित किया जाना चाहिए। - यदि सेल एकत्रीकरण या झुरमुट मनाया जाता है, तो झुरमुट न्यूट्रोफिल को त्यागने के लिए 70 माइक्रोन जाल का उपयोग करके सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।
4. न्यूट्रोफिल अलगाव की गुणवत्ता का निर्धारण
- न्यूट्रोफिल (सीडी 66b, सीडी 11बी), इओसिनोफिल्स (सीडी 1 9 3)(चित्रा 3)और सीडी 62एल(चित्रा 4)जैसे सक्रियण मार्कर के लिए विशिष्ट मार्कर के साथ कोशिकाओं को दाग दें। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा 20,000 कोशिकाओं का अधिग्रहण करें। चित्र 3 और चित्रा 4 में प्रस्तावित गेटिंग रणनीतियों का उपयोग करके सेल शुद्धता और सक्रियता काविश्लेषण करें ।
नोट: न्यूट्रोफिल तैयार करने की गुणवत्ता का आकलन 3% एसिटिक एसिड-मेथिलीन ब्लू सॉल्यूशन का उपयोग करके न्यूट्रोफिल के अद्वितीय लोबेड न्यूक्लियस की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। - एनेक्सटिन वी/प्रोपिडियम आयोडाइड(पीआई) (चित्रा 5)का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता निर्धारित करें ।
नोट: ट्रिपन ब्लू धुंधला सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Representative Results
न्यूट्रोफिल को शुद्ध करने के लिए घनत्व ढाल का उपयोग करते समय, रक्त और घनत्व ढाल माध्यम के बीच इंटरफेस के लिए यह महत्वपूर्ण है कि जितना संभव हो उतना तेज हो, और एक अलग परत पृथक्करण अपकेंद्रित्र (चरण 1.4) के बाद रहता है। आरबीसी लाइसिस के बाद, बफर एक स्पष्ट लाल होना चाहिए न कि टर्बिड (चरण 3.3)। यदि तैयारी बादल छाए हुए है, तो लाइसिस (चरण 3) के दूसरे दौर की आवश्यकता हो सकती है, हालांकि यह न्यूट्रोफिल अस्तित्व(चित्रा 1)को प्रभावित कर सकता है। लाइसिस के बाद, कम गति वाले अपकेंद्रित्र (200 × जी)की सिफारिश की जाती है जब शुद्धता को प्राथमिकता दी जाती है, क्योंकि यह प्लेटलेट संदूषण को काफी कम कर देता है। हालांकि, हाई-स्पीड अपकेंद्रित्र (400 × जी)शुद्धता की कीमत पर उपज को बढ़ाता है (चरण 3.4, चित्र 2)। न्यूट्रोफिल अलगाव के बाद, फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई का उपयोग अलगाव शुद्धता (चरण 4.1) का आकलन करने के लिए किया जा सकता है और इसे माइक्रोस्कोपी पर चुना जाना चाहिए। हालांकि अकेले कोशिकाओं का एफएससी/एसएससी वितरण सेल आइसोलेशन क्वालिटी(चित्रा 3 ए)का अनुमान देता है, लेकिन विशिष्ट सेल मार्कर के इस्तेमाल को तरजीह दी जानी चाहिए । इस मामले में, सबसे आम दूषित सेल आबादी CD66b के साथ विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं, विशेष रूप से ग्रैनुलोसाइट्स पर व्यक्त की गई। CD45 धुंधला ल्यूकोसाइट्स (CD45 +) और लाल रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट्स (सीडी 45-) भेद करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
अन्य संदूषकों में लिम्फोसाइट्स (सीडी 3 + या सीडी 19+, चित्रा 3F),मोनोसाइट्स (सीडी 14+, फिगर 3डी),और इओसिनोफिल्स (सीडी 193+, चित्रा 3जी)शामिल हैं। CD11b माइलॉयड वंश पर व्यक्त किया गया एक इंटीग्रीन है; न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट्स सीडी 11b +हैं, जबकि लिम्फोसाइट्स CD11b-(चित्रा3C)हैं । चूंकि न्यूट्रोफिल एक्टिवेशन डाउनस्ट्रीम प्रयोगों को प्रभावित कर सकता है, इसलिए सीडी 62एल की अभिव्यक्ति का आकलन किया जाना चाहिए; न्यूट्रोफिल CD62L बन जाते हैं- एक बार सक्रिय (चरण 4.1)। पेप्टाइड एफएमएलपी का उपयोग CD62L बहा(चित्रा 4)के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है। परख प्रदर्शन करने से पहले न्यूट्रोफिल के स्वास्थ्य का मूल्यांकन करना भी महत्वपूर्ण है; न्यूट्रोफिल में अपेक्षाकृत कम आधा जीवन होता है, और सक्रियण इसे और छोटा कर सकता है (चरण 4.2)। एक मानक एनेक्सलिन वी और पीआई स्टेनिंग निर्धारित समय(चित्रा 5)पर न्यूट्रोफिल संस्कृति की लाइव/डेड स्थिति के बारे में जानकारी दे सकते हैं ।
चित्र 1:ग्रेनुलोसाइट्स का घनत्व ढाल मध्यम आधारित पृथक्करण। (ए)अपकेंद्रित्र के बाद पहले और(बी)। रक्त और घनत्व ढाल मध्यम परतों के बीच तेज इंटरफेस पर ध्यान दें। (C) बी में गोली का तलछट (1:1) 5% एफबीएस/एचबीएसएस और 3% डेक्सट्रान-09% एनएसीएल में। (घ)पीएमएन गोली के सुपरनेट में अवशिष्ट आरबीसी के लाइसिस के बाद(सी)एच2ओ संक्षिप्त के साथ: पीबीएमसी = परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल; पीएमएन = न्यूट्रोफिल; आरबीसी = लाल रक्त कोशिका; FBS = भ्रूण गोजातीय सीरम; HBSS = हांक संतुलित नमक समाधान । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2-आरबीसी लाइसिस कम होने के बाद कम गति से कताई करने से प्लेटलेट संदूषण में कमी आई। एच2ओ के साथ आरबीसी के लाइसिस के बाद कोशिकाओं को 200 × जी (ए)या 400 × जी (बी)पर घूमती थी। न्यूट्रोफिल दाग रहे थे, और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण किया गया था, जैसा कि चित्र 3में वर्णित है, प्लेटलेट्स को लेबल करने के लिए एंटी-सीडी 41 के अलावा। संक्षिप्त रूप: आरबीसी = लाल रक्त कोशिका; CD41 = भेदभाव 41 का क्लस्टर; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-एरिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:बफी कोट से अलग न्यूट्रोफिल का आकलन। एक मानक प्रोटोकॉल के बाद अलग-थलग न्यूट्रोफिल को एंटी-सीडी66बी, एंटी-सीडी 11बी, एंटी-सीडी 14 और एंटी-सीडी 193 से दाग दिया गया। एकल कोशिकाओं(बी)कुल कोशिकाओं(ए)से gated थे । (C)CD11b+ कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं से गेट किया गया था । (घ)डॉट प्लॉट दिखा न्यूट्रोफिल (सीडी 66b+,सीडी14 कम/-) और एक बहुत कम मोनोसाइट संदूषण (CD66b-, CD14+,Q1) । (ई)CD66b-और CD66b+ कोशिकाओं gated थे । (एफ)CD66b- कोशिकाओं लिम्फोसाइट मार्कर (सीडी 3, सीडी 19) के लिए सकारात्मक थे। (जी)CD66b+ कोशिकाओं में CD11b और CD193 की अभिव्यक्ति, अलग न्यूट्रोफिल (सीडी 66b+,CD11b+,CD193-) और eosinophil (CD66b+,CD11b-, CD193+)आबादी दिखा । यहां दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम में, न्यूट्रोफिल शुद्धता ~ 3.7% लिम्फोसाइट और ~ 3.7% इओसिनोफिल संदूषण के साथ ~ 93% है। (H)शुद्धि के बाद न्यूट्रोफिल शुद्धता का मात्राकरण। डेटा 5 व्यक्तिगत परीक्षणों से संकलित किए जाते हैं और एसडी संक्षिप्त ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं: सीडी = भेदभाव का क्लस्टर; एसएससी-ए = एसएससी-ए = साइड स्कैटर-एरिया; एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर-एरिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4:ढाल शुद्धिकरण के कारण CD62L बहा नहीं था । (ए-बी)नियंत्रण(ए)या FMLP-उत्तेजित न्यूट्रोफिल(बी)(1 mm fMLP 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए) न्यूट्रोफिल मार्कर और CD62L के साथ दाग थे । (ग)सीडी 62L के लिए फ्लोरोसेंट मतलब तीव्रता fMLP-इलाज कोशिकाओं में कमी आई है, जो सीडी 62L शेडिंग और न्यूट्रोफिल सक्रियण का संकेत है । संक्षिप्त रूप: CD26L = एल-सेलेक्टिन; fMLP = N-Formylmethionyl-leucyl-फेनिलैनिन; एसएससी-ए = एसएससी-ए = साइड स्कैटर-एरिया; एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर-एरिया; पीई = फाइकोरीथ्रिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5:घनत्व ढाल या न्यूट्रोफिल आइसोलेशन किट द्वारा शुद्ध न्यूट्रोफिल की सहज मौत। न्यूट्रोफिल घनत्व ढाल(ए और बी)या वाणिज्यिक माइक्रोमोतियों(सी और डी)के साथ शुद्ध और आरपीएमआई-10% एफसीएस में 0 घंटे(ए और सी)या 24 घंटे(बी और डी)के लिए सुसंस्कृत थे। एक मानक प्रोटोकॉल के बाद संबंधित समय बिंदुओं पर एनेक्सटिन वी और पीआई का उपयोग करके कोशिकाओं को दाग दिया गया था। (ई)शुद्ध न्यूट्रोफिल सहज मृत्यु का मात्राकरण। n=5, मतलब ± एसडी संक्षिप्त: एसएससी-ए = एसएससी-ए = साइड स्कैटर-एरिया; एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर-एरिया; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड; FCS = भ्रूण बछड़ा सीरम; फिटसी = फ्लोरोसेइन आइसोथिओसाइनेट; AV5 = एनेक्सटिन वी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
छोटे जीवन काल, टर्मिनल भेदभाव की स्थिति, और न्यूट्रोफिल की lytic सामग्री के कारण, इन कोशिकाओं का अध्ययन हमेशा एक चुनौती रही है। रोगी साथियों से माउस मॉडल या कोशिकाओं का उपयोग करने के अलावा, सेल लाइनें न्यूट्रोफिल जीव विज्ञान16का अध्ययन करने में मदद करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं। हालांकि, न्यूट्रोफिल जैसी सेल लाइनें न्यूट्रोफिल जीव विज्ञान के सभी पहलुओं को पूरी तरह से दोहरा नहीं सकती हैं, जिससे इन कोशिकाओं का अध्ययन करने में कठिनाई की एक अतिरिक्त परत जोड़ दी जाती है । सबसे अधिक इन विट्रो मॉडल एचएल-60 सेल लाइन है, जिसे डाइमिथाइल्सुल्फोक्साइड या रेटिनोइक एसिड17, 18के साथ उपचार द्वारा न्यूट्रोफिल जैसी कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है। हालांकि ये कोशिकाएं माइग्रेशन और श्वसन फटने के अध्ययन में उपयोगी होती हैं, लेकिन वे न्यूट्रोफिल की माइक्रोबायोसाइड गतिविधि का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। अन्य सेल लाइनें मौजूद हैं (पीएलबी-98, एनबी 4), और वे19सीमाओं के अपने सेट के साथ भी जुड़े हुए हैं।
माउस रोग मॉडल और सेल लाइनों के साथ किए गए प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल टिप्पणियों के साथ मान्य करना निर्णायक है। न्यूट्रोफिल को कुशलतापूर्वक क्रायोप्रेवित नहीं किया जा सकता है और इस प्रकार अक्सर रक्तदाताओं से प्राप्त पूरे रक्त या बफी कोट से ताजा अलग किया जाता है और तुरंत संसाधित किया जाता है। एक बार अलग होने के बाद, कोशिकाएं सहज मृत्यु के जटिल रूप से गुजरना शुरू कर देती हैं, जो ऑक्सीकरण, साइटोप्लाज्मिक कैपेस और न्यूट्रोफिल कणिकाओं20, 21में पाए जाने वाले प्रोटीज द्वारा विनियमित होती हैं। अनुचित अलगाव विधियों या तकनीकों से न्यूट्रोफिल की सक्रियता हो सकती है, केवल सेल निधन में तेजी आ सकती है। दानदाताओं से शुद्ध और उच्च गुणवत्ता वाले न्यूट्रोफिल प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत विधि होना अनिवार्य है।
मानव न्यूट्रोफिल आइसोलेशन10,22पर कई तरीके प्रकाशितहुएहैं . वे मुख्य रूप से दो श्रेणियों में आते हैं, कुछ साझा रणनीतियों के साथ । पहली श्रेणी एंटीबॉडी आधारित है, या तो सकारात्मक या नकारात्मक चयन के माध्यम से किया जा रहा है । सकारात्मक चयन सीधे न्यूट्रोफिल लेबल करेगा, इसलिए एक अत्यधिक शुद्ध सेल आबादी प्रदान करता है, हालांकि यह तेजी से सेल सक्रियण, सेल मृत्यु, साथ ही न्यूट्रोफिल23की अवांछित टैगिंग की ओर भी जाता है। नकारात्मक चयन, हालांकि कोशिकाओं को अवेलेबल छोड़कर और एक बहुत ही शुद्ध आबादी दे रहा है, त्वरित न्यूट्रोफिल मौत, हालांकि सटीक तंत्र अज्ञात है(चित्रा 5)। क्या सकारात्मक या नकारात्मक चयन के बाद जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति को भी बदल दिया जाता है, इसकी आगे जांच की जरूरत है । इसके अलावा, अन्य प्रकार की कोशिकाओं को कम करने के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा के कारण, ये विधियां बड़ी मात्रा में न्यूट्रोफिल का उत्पादन नहीं कर सकतीं। हालांकि, एंटीबॉडी आधारित परख अभी भी एक छोटे पैमाने पर अल्पकालिक संस्कृति और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह के जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययन के रूप में बहुत उच्च सेल शुद्धता की आवश्यकता प्रयोगों के लिए पसंद के तरीके हैं ।
दूसरे प्रकार की अलगाव विधि ढाल और घनत्व आधारित है। इसमें आमतौर पर परकोल, फिकोल-पैक, या अन्य पॉलीसैकराइड/पॉलीविनाइलपाइरोलिज्ड घटक शामिल होते हैं और कोशिका घनत्व के आधार पर विभिन्न प्रकार की रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए अपकेंद्रित्र बल का उपयोग करते हैं। इन तरीकों को अक्सर डेक्सट्रान द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं के तलछट के साथ पूरित किया जाता है। ये विधियां शुरू करने की सामग्री के बड़े पैमाने को संभाल सकती हैं और उच्च शुद्धता भी प्राप्त कर सकती हैं। घनत्व-आधारित अलगाव की एक चेतावनी न्यूट्रोफिल से अन्य कम प्रचुर मात्रा में ग्रैनुलोसाइट्स (ज्यादातर इओसिनोफिल) का अक्षम पृथक्करण है, और इसलिए, यह प्रस्तुत प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा है, क्योंकि छोटे सेल संदूषण की उपस्थिति भी न्यूट्रोफिल प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकती है24।
यहां प्रस्तुत एक सारांशित विधि है जो ढाल अलगाव पर आधारित है, पिछले तरीकों को परिष्कृत करतेहैं 10,22। हम न्यूट्रोफिल सक्रियण और त्वरित मृत्यु को रोकने, सीमित अवशिष्ट प्लेटलेट और आरबीसी के साथ शुद्ध मानव न्यूट्रोफिल को मज़बूती से अलग करने के लिए न्यूट्रोफिल विशिष्टताओं के वर्तमान अंडरकभाषी का उपयोग करते हैं। सबसे महत्वपूर्ण कदम ढाल की परत है, जो एक तेज इंटरफ़ेस प्राप्त करने के लिए रक्त के नीचे घनत्व ढाल माध्यम जोड़कर अधिक प्रभावी ढंग से प्राप्त किया जाता है। पीबीएमसी रिंग की त्वरित जांच और अपकेंद्रित्र के बाद ढाल संभावित संदूषण, सक्रियण और कम पैदावार का पता लगा सकता है। ल्यूकाफेरिस झिल्ली या बफी कोट के साथ काम करते समय, रक्त को पतला करना महत्वपूर्ण है क्योंकि अत्यधिक सेल घनत्व सेल एकत्रीकरण का कारण बनेगा, जिससे अशुद्धियों और सेल सक्रियण होगा।
इस प्रोटोकॉल को सेल ताजगी सुनिश्चित करने के लिए 2 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए, और घनत्व ढाल माध्यम, डेक्सट्रान और लाइसिस से जुड़े कदम तुरंत किए जाने चाहिए, क्योंकि इन समाधानों के संपर्क में न्यूट्रोफिल को बदल सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ, न्यूट्रोफिल की अपेक्षित उपज कम से कम ~ 10 मिलियन/10 एमएल पूरे रक्त और कम से कम ~ 60 मिलियन/10 एमएल बफी कोट है। अलगाव की गुणवत्ता का मूल्यांकन इस प्रकार किया जाना चाहिए: सक्रिय न्यूट्रोफिल 10% से कम होना चाहिए, लिम्फोसाइट संदूषण 5% से कम, न्यूनतम इओसिनोफिल (एक ही तरफ तितर-बितर लेकिन कम आगे स्कैटर आबादी), और सेल व्यवहार्यता 90% से अधिक होनी चाहिए। कम शुद्धता घनत्व ढाल माध्यम के अनुचित परत या भंडारण या शुरुआती रक्त उत्पाद की गुणवत्ता और ताजगी के कारण हो सकती है।
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि अनुसंधान हितों के किसी भी संघर्ष के अभाव में आयोजित किया गया था ।
Acknowledgments
इस परियोजना को P01HL095489 द्वारा समर्थित किया गया था। A.Y.H T32HL066987 द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
| Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
| Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
| CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
| CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
| CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
| CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
| CD41-APC | biolegend | 303710 | |
| Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
| CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
| CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
| Dextran | Fisher | BP1580 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
| Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
| Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
| MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium chloride | sigma | 71376 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |
References
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