Summary
Denne protokollen beskriver en metode for isolering av nøytrofiler fra fullblod, buffy strøk eller leukaferesemembraner, oppnå godt utbytte, høy renhet og minimal celleaktivering. Vi bruker gradient rensing, rød blodcelle (RBC) sedimentering, og RBC lysis for å oppnå en høy kvalitet / renhet nøytrofil forberedelse.
Abstract
Nøytrofiler (PMNer) er de mest tallrike leukocyttene i menneskelig sirkulasjon, alt fra 40 til 70% av totale blod leukocytter. De er de første cellene som rekrutteres på stedet for betennelse via rask ekstravasasjon gjennom fartøy. Der utfører nøytrofiler en rekke funksjoner for å drepe invaderende patogener og formidle immunsignalering. Nyrensede nøytrofiler fra humant blod er den valgte modellen for studier, da ingen cellelinje fullt ut replikerer PMN-funksjoner og biologi. Imidlertid er nøytrofiler kortvarige, terminalt differensierte celler og er svært utsatt for aktivering som svar på fysiske (temperatur, sentrifugeringshastighet) og biologiske (endotoksin, kjemo- og cytokiner) stimuli. Derfor er det viktig å følge en standardisert, pålitelig og rask metode for å oppnå rene og ikke-aktiverte celler. Denne protokollen presenterer en oppdatert protokoll som kombinerer tetthet gradient sentrifugering, rød blodlegeme (RBC) sedimentering, og RBC lysis for å oppnå høy PMN renhet og minimere celleaktivering. Videre diskuteres også metoder for å vurdere nøytrofil isolasjonskvalitet, levedyktighet og renhet.
Introduction
Det medfødte immunforsvaret består av mange celletyper som opprettholder immun homeostase og patogenclearance sammen med mange andre fysiologiske funksjoner. Nøytrofiler utgjør det største bassenget av hvite blodlegemer i menneskeligsirkulasjon 1. De fleste modne nøytrofiler lagres i benmargen, som er stedet for generasjon for nye nøytrofiler, også kalt granulopoiesis. I benmargen går granulocytt forfedre ut av cellesyklusen og skiller seg terminalt, og får sine karakteristiske segmenterte kjerner og granulater2. Under inflammatoriske forhold, som svar på kjemokiner, cytokiner og skaderelaterte og patogenrelaterte molekylære mønstre, mobiliseres nøytrofiler fra blodet og ut av benmargen for å utføre et bredt spekter av funksjoner. Disse inkluderer cytokinsekresjon, direkte fagocytose av patogenet, frigjøring av reaktive oksygenarter, degranulering av antimikrobielle proteiner og dannelse av nøytrofile ekstracellulære feller.
Molekylene som brukes av nøytrofiler for å bekjempe infeksjon er giftige for mikrober og verten. Dermed er levetiden og riktig fjerning av aldring / døende nøytrofiler sterkt regulert, og de har en begrenset levetid i omløp (<48 t)3. På grunn av denne korte overlevelsen produserer menneskekroppen i gjennomsnitt 100 milliarder nye nøytrofiler hver dag for å opprettholde befolkningens homeostase4. Nødgranulopoiesis kan ytterligere øke frigjøringen av nøytrofiler, både modne og umodne, i blodet under betennelse og infeksjon5. Betydningen av nøytrofiler i medfødt immunrespons fremheves av pasienter med ervervet eller medfødt nøytropeni, som er utsatt for bakterielle og soppinfeksjoner6.
Mange utfordringer oppstår når de studerer nøytrofilbiologi og deres roller i immunresponsen på grunn av deres natur, inkludert deres korte overlevelse og cytotoksiske innhold. Nøytrofillignende cellelinjer har ofte blitt differensiert fra humant promyelocytisk leukemi HL-60 celler og PLB-985 celler7,8. Selv om de kan vise nøytrofillignende morfologi og utføre chemotaxis, kan disse cellelinjene ikke fullt ut rekapitulere biologien til nøytrofiler. In vitro-analyser som bruker disse cellelinjene, kan heller ikke rekapitulere in vivo-eksperimenter. Videre må differensiering av disse cellene induseres og kan påvirkes negativt av genmanipulering før differensiering.
Nylig har metoder blitt utviklet for å omgå disse problemene ved å bruke inducible promotører til å modulere genuttrykk etter differensiering i HL-60 celler9. Selv med slike verktøy er primære menneskelige PMNer pålagt å validere mål ved hjelp av farmakologiske tilnærminger. Dermed er det viktig å oppnå rene og inaktiverte nøytrofiler isolert fra blod for å validere funnene av cellelinje- og dyremodeller. Dette dokumentet presenterer en revidert PMN-isolasjonsprotokoll der fordeler og ulemper ved aktuelle metoder ble evaluert10. En kombinasjon ble utviklet som består av gradient sentrifugering for å skille PMNer fra andre immunceller, kort dekstranbasert sedimentering for å fjerne hoveddelen av RBCer, rask gjenværende RBC lysis via osmotisk trykk og lavhastighets sentrifugering for å fjerne blodplateforurensning.
Protocol
MERK: Humane nøytrofiler ble isolert fra venøst blod fra kasserte hvite blodlegemer hentet fra Blood Bank Lab på Boston Children's Hospital. Blodgivere var uidentifiserbare, og det var ingen interaksjon med levende personer eller kunnskap om identifiserbar personlig informasjon. Dette arbeidet er derfor ikke klassifisert som humanfaglig forskning i henhold til HHS-regelverket (45 CFR del 46). Boston Children's Hospital Institutional Review Board (IRB) godkjente protokollen.
1. Lagvis gradering
- Etter sterilisering av buffy frakk eller fullblodsemballasje og laminær hette, del blodet i 50 ml rør med 10 ml blod i hvert rør.
- Ta volumet opp til 35 ml med 5% foster bovint serum (FBS)/Hanks balanserte saltløsning (HBSS) for å fortynne blodet for en renere gradient.
MERK: Ved bruk av en leukaferesemembran kan celler skylles ut med en 60 ml sprøyte og 30 ml 5 % FBS/HBSS per filter. Fortynning er unødvendig når du arbeider med ferskt trukket fullblod. - Lukk 50 ml rørlokket, bland det flere ganger ved inversjon, og hold det opp ned for å ha bunnen blottet for RBCer.
- Tilsett 10 ml tetthetsgradientmedium (se materialtabellen) rett under blodet. Pass på at mediet og blodet ikke blandes, og at grensesnittet er skarpt (Figur 1A).
MERK: Dette trinnet er avgjørende. Forsikre deg om at tetthetsgradientløsningen er ved romtemperatur (RT) og godt blandet før hver gradient. Den første milliliteren av tetthetsgradientmediet må være forsiktig og jevnt lagdelt så sakte som mulig. Det anbefales å sette den elektroniske pipettehastigheten til lav. - Plasser røret forsiktig i en sentrifuge uten å forstyrre gradienten og spinn på 400 × g i 30 minutter ved RT, og sørg for å deaktivere bremsen. Vær oppmerksom på hvordan den spunnede gradienten skiller seg inn i et topp serum/plasma-lag, en midthvit ring av perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer), et skyet tetthetsgradientmediumlag og en bunnpellet som består av et hvitt, tynt nøytrofilbånd på toppen av RBCene (Figur 1B).
MERK: En overskyet eller ugjennomsiktig side av røret etter sentrifugering kan tyde på at cellene (nøytrofiler) er aktivert og kanskje ikke er egnet til bruk. - Fjern PBMC-ene først ved å åpne sugepipetten direkte i PBMC-laget. Sørg for å aspirere det helt mens serum/plasma-laget avtar etter hvert som ringen fjernes. Skrap siden av røret der cellene pelleted med sugepipetten for å maksimere fjerningen av PMBC. Fjern forsiktig det uklare tetthetsgradient middels laget mellom PBMC-ringen og nøytrofil / RBC pellet.
MERK: Skraping av pelleterte celler på siden av røret øker renheten av isolasjonen betraktelig. Vær forsiktig så du ikke aspirerer pelletsen, da de fleste nøytrofiler sitter direkte på toppen av RBC-ene.
2. Sedimentering av erytrocytter (RBCer)
- Bruk en 10 ml pipette og overfør nøytrofil/RBC-pelletsen til et rent rør. Ikke pipette opp og ned. Legg til 5% FBS / HBSS til et sluttvolum på 25 ml. Bland forsiktig ved inversjon.
MERK: Hvis du utfører RBC-sedimenteringen etter PBMC-fjerningen, forbedres utbyttet og aktiveringen reduseres10. - Tilsett direkte 25 ml forvarsel (37 °C) 3 % Dextran/0,9 % NaCl/H2O i røret som inneholder den fortynnede nøytrofil/RBC-pelletsen og bland forsiktig ved inversjon. Plasser røret på et jevnt, ikke-vibrerende underlag i 15 minutter (Figur 1C).
MERK: Lengre sedimentering reduserer RBC-forurensning, men reduserer også utbyttet. Videre kan langvarig dekstraneksponering føre til nøytrofil aktivering eller celledød11. - Ta forsiktig røret tilbake i hetten (for steril isolasjon). Ved bare å fordype pipetten litt i væsken, samle topplaget (~ 30 ml) etter væskeoverflaten nedover.
MERK: Hvis sedimenteringen gir et skarpt grensesnitt mellom mediet og RBC-ene, er RBC-pelletsen mindre, eller hvis et høyere utbytte er ønsket, samle opp opptil 35 ml. - Snurr røret (400 × g, 10 min, RT, med lav brems (3)), noe som resulterer i en rød pellet uten partikler som flyter i mediet.
3. Lysis av de resterende RBCene
- Aspirer forsiktig supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Tilsett 25 ml sterilt ultrarent vann direkte inn i røret og bland forsiktig ved å invertere i 28 s for å lyse OPP RBC-ene. Ikke bruk en pipet til å resuspendere pelletsen.
MERK: Ikke overskrid 30 s, da langvarige hypotoniske forhold kan aktiveres og føre til nøytrofil død12. - Tilsett straks 25 ml steril 1,8 % NaCl/H2O i røret og bland forsiktig ved å invertere for å bringe løsningen tilbake til isotoniske forhold.
MERK: Oppløsningen skal være rød, men uten turbiditet. - Spinn ned ved 200 × g i 3-5 min med lav brems (nivå 3) for å minimere RBCer og blodplater sedimentering sammen med nøytrofiler (Figur 1D og figur 2)13,14.
MERK: Pellet skal være hvit med et minimalt RBC-lag på toppen, som kan fjernes forsiktig mens supernatanten aspireres. - Resuspend nøytrofiler ved pipettering av kulturmediet (10% FBS / RPMI1640) direkte på pelletsen, men ikke pipette opp og ned. Gyng røret horisontalt fra side til side for å minimere celleaktivering.
MERK: Celler bør holdes i en konsentrasjon på ~ 2 × 106 celler / ml, da høyere tetthet vil føre til økt celleaktivering / død15. Av samme grunn bør cellepelleten brukes på nytt så snart som mulig. - Hvis celleaggregering eller klumping observeres, filtrerer du celleopphenget ved hjelp av et 70 μm nett for å kaste klumpete nøytrofiler.
4. Bestemme nøytrofil isolasjonskvalitet
- Beflekk cellene med markører som er spesifikke for nøytrofiler (CD66b, CD11b), eosinofiler (CD193) (figur 3) og en aktiveringsindikator som CD62L (figur 4). Skaff 20 000 celler ved strømningscytometri. Analyser cellerenhet og aktivering ved hjelp av gatingstrategiene som er foreslått i figur 3 og figur 4.
MERK: Kvaliteten på nøytrofilpreparatet kan vurderes ved hjelp av en 3% eddiksyre-metylenblå løsning for å visualisere den unike lobed kjernen av nøytrofiler. - Bestemme celle levedyktighet ved hjelp av Annexin V/propidiumjodid (PI) (Figur 5).
MERK: Trypan blå flekker kan brukes til å evaluere cellens levedyktighet.
Representative Results
Når du bruker tetthetsgradient for å rense nøytrofiler, er det avgjørende for grensesnittet mellom blodet og tetthetsgradientmediet å være så skarpt som mulig, og at en tydelig lagseparasjon forblir etter sentrifugering (trinn 1.4). Etter RBC lysis skal bufferen være en klar rød og ikke uklar (trinn 3.3). Hvis preparatet er overskyet, kan det være nødvendig med en andre runde lysis (trinn 3), selv om dette kan påvirke nøytrofil overlevelse (figur 1). Etter lysis anbefales lavhastighets sentrifugering (200 × g) når renhet prioriteres, da det reduserer blodplateforurensning betydelig. Høyhastighets sentrifugering (400 × g) øker imidlertid utbyttet på bekostning av renhet (trinn 3.4, figur 2). Etter nøytrofil isolasjon kan fluorescensaktivert cellesortering brukes til å vurdere isolasjonsrenhet (trinn 4.1) og bør velges over mikroskopi. Selv om FSC/SSC-fordelingen av celler alene gir et estimat av celleisolasjonskvaliteten (figur 3A), bør bruk av bestemte cellemarkører foretrekkes. I dette tilfellet er de vanligste forurensende cellepopulasjonene farget med spesifikke antistoffer sammen med CD66b, spesielt uttrykt på granulocytter. CD45 farging brukes til å skille leukocytter (CD45+) og røde blodlegemer og blodplater (CD45-).
Andre forurensninger inkluderer lymfocytter (CD3+ eller CD19+, figur 3F), monocytter (CD14+, figur 3D) og eosinofiler (CD193+, figur 3G). CD11b er et integrin uttrykt på myeloid avgrensning; nøytrofiler og monocytter er CD11b+, mens lymfocytter er CD11b- (Figur 3C). Siden nøytrofilaktivering kan påvirke nedstrøms eksperimenter, bør uttrykket av CD62L vurderes; nøytrofiler blir CD62L- når de er aktivert (trinn 4.1). Peptid fMLP kan brukes som en positiv kontroll for CD62L shedding (Figur 4). Det er også viktig å evaluere helsen til nøytrofiler før du utfører analyser; nøytrofiler har en relativt kort halveringstid, og aktivering kan forkorte den ytterligere (trinn 4.2). En standard annexin V- og PI-farging kan gi informasjon om den nøytrofile kulturens live/døde status på angitte tidspunkter (Figur 5).
Figur 1: Tetthetsgradient middels basert separasjon av granulocytter. (A) Før og (B) etter sentrifugering. Legg merke til det skarpe grensesnittet mellom blodet og tetthetsgradientens middels lag. (C) Sedimentering av pellets i B resuspended (1:1) i 5% FBS / HBSS og 3% Dextran-0,9% NaCl. (D) PMN pellet etter lysis av gjenværende RBCer i supernatant av (C) med H2O. Forkortelser: PBMC = perifer blod mononukleær celle; PMN = nøytrofil; RBC = rød blodlegeme; FBS = foster bovint serum; HBSS = Hanks balanserte saltløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Spinning ved lavere hastigheter etter rbc lysis redusert blodplateforurensning. Etter lysis av RBCer med H2O, ble celler spunnet ned ved 200 × g (A) eller 400 × g (B). Nøytrofiler ble farget, og strømningscytometrianalyse ble utført, som beskrevet i figur 3, med tilsetning av anti-CD41 for å merke blodplater. Forkortelser: RBC = rød blodlegeme; CD41 = differensieringsklynge 41; SSC-A = sidespredningsområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vurdering av nøytrofiler isolert fra buffy coat. Isolerte nøytrofiler ble farget med anti-CD66b, anti-CD11b, anti-CD14 og anti-CD193 etter en standardprotokoll. Enkeltceller (B) ble gated fra totalceller (A). (C) CD11b+ celler ble inngjerdet fra enkeltceller. (D) Prikkplott som viser nøytrofiler (CD66b+, CD14 lav /-) og en svært lav monocyttforurensning (CD66b-, CD14+, Q1). (E) CD66b- og CD66b+ celler ble inngjerdet. (F) CD66b- cellene var positive for lymfocyttmarkører (CD3, CD19). (G) Uttrykk for CD11b- og CD193-celler i CD66b+-celler, som viser distinkt nøytrofil (CD66b+, CD11b+, CD193-) og eosinofil (CD66b+, CD11b-, CD193+) . I det representative resultatet som vises her, er nøytrofil renhet ~ 93% med ~ 3,7% lymfocytt og ~ 3,7% eosinofil forurensning. (H) Kvantifisering av nøytrofil renhet etter rensing. Data er samlet fra 5 individuelle studier og presentert som gjennomsnittlig ± SD. Forkortelser: CD = klynge av differensiering; SSC-A = SSC-A = sidespredningsområde; FSC-A = fremoverspredningsområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gradientrensing forårsaket ikke CD62L shedding. (A-B) Control (A) eller fMLP-stimulerte nøytrofiler (B) (1 mM fMLP i 15 min ved 37 °C) ble farget med nøytrofilmarkører og CD62L. (C) Fluorescerende gjennomsnittsintensitet for CD62L reduseres i fMLP-behandlede celler, noe som indikerer CD62L shedding og nøytrofil aktivering. Forkortelser: CD26L = L-selectin; fMLP = N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanin; SSC-A = SSC-A = sidespredningsområde; FSC-A = fremoverspredningsområde; PE = fykoerythrin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Spontan død av nøytrofiler renset av tetthetsgradient eller nøytrofil isolasjonssett. Nøytrofiler ble renset med tetthetsgradient (A og B) eller kommersielle mikrober (C og D) og dyrket i 0 t (A og C) eller 24 timer (B og D) i RPMI-10% FCS. Celler ble farget ved hjelp av Annexin V og PI på respektive tidspunkter etter en standardprotokoll. (E) Kvantifisering av renset nøytrofil spontan død. n=5, gjennomsnitt ± SD. Forkortelser: SSC-A = SSC-A = sidespredningsområde; FSC-A = fremoverspredningsområde; PI = propidiumjodid; FCS = føtal kalv serum; FITC = fluorescein isothiocyanate; AV5 = Annexin V. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
På grunn av den korte levetiden, terminal differensieringsstatus og lytisk innhold av nøytrofiler, har det alltid vært en utfordring å studere disse cellene. Bortsett fra å bruke musemodeller eller celler fra pasientkohorter, er cellelinjer nyttige verktøy for å studere nøytrofilbiologi16. Imidlertid kan nøytrofile cellelinjer ikke helt gjenta alle aspekter av nøytrofilbiologi, og legger til et ekstra lag med vanskeligheter med å studere disse cellene. Den mest brukte in vitro-modellen er HL-60-cellelinjen, som kan differensieres til nøytrofile celler ved behandling med dimetylsulfoksid eller retinoinsyre17,18. Selv om disse cellene er nyttige i studiet av migrasjon og respiratorisk utbrudd, er de ikke egnet for å studere mikrobiocidal aktivitet av nøytrofiler. Det finnes andre cellelinjer (PLB-98, NB4), og de er også knyttet til settet med begrensninger19.
Det er avgjørende å validere med primære menneskelige nøytrofiler observasjoner gjort med musesykdomsmodeller og cellelinjer. Nøytrofiler kan ikke kryopreserveres effektivt og blir derfor ofte ferskt isolert fra fullblods- eller buffyfrakker hentet fra donorer og umiddelbart behandlet. Når de er isolert, begynner cellene å gjennomgå en kompleks form for spontan død, regulert av oksidasjon, cytoplasmatiske caspaser og proteaser som finnes i nøytrofilgranulat20,21. Feil isolasjonsmetoder eller teknikker kan føre til aktivering av nøytrofiler, bare akselererende celle død. Det er viktig å ha en pålitelig og konsistent metode for å oppnå rene og høykvalitets nøytrofiler fra givere.
Det har vært mange metoder publisert på menneskelig nøytrofil isolasjon10,22. De faller hovedsakelig inn i to kategorier, med noen delte strategier. Den første kategorien er antistoffbasert, enten gjennom positiv eller negativ seleksjon. Positiv merking vil merke nøytrofiler direkte, og gir derfor en svært ren cellepopulasjon, selv om det også fører til rask celleaktivering, celledød, samt uønsket merking av nøytrofiler23. Negativt utvalg, selv om cellene ikke er merket og gir en veldig ren befolkning, akselerert nøytrofil død, selv om den nøyaktige mekanismen er ukjent (Figur 5). Hvorvidt gen- eller proteinuttrykk også endres etter positiv eller negativ seleksjon må undersøkes nærmere. Videre, på grunn av mengden antistoff som trengs for å tømme de andre typer celler, kan disse metodene ikke gi store mengder nøytrofiler. Imidlertid kan antistoffbaserte analyser fortsatt brukes til kortsiktig kultur og eksperimenter i mindre skala og er metoder for valg for eksperimenter som krever svært høy cellerenhet, for eksempel gen- og proteinuttrykksstudier.
Den andre typen isolasjonsmetode er gradient- og tetthetsbasert. Det involverer vanligvis Percoll, Ficoll-Paque, eller andre polysakkarid / polyvinylpyrrolidonkomponenter og bruker sentrifugeringskraft for å skille forskjellige typer blodceller basert på celletetthet. Disse metodene kompletteres ofte med sedimentering av røde blodlegemer ved dextran. Disse metodene kan håndtere større skalaer av startmateriale og kan også oppnå høy renhet. En advarsel om tetthetsbasert isolasjon er den ineffektive separasjonen av andre langt mindre rikelige granulocytter (for det meste eosinofiler) fra nøytrofiler, og det er derfor den største begrensningen av protokollen som presenteres, da selv tilstedeværelsen av småcelleforurensning kan påvirke nøytrofil respons24.
Presentert her er en oppsummert metode basert på gradient isolasjon, raffinering av tidligere metoder10,22. Vi bruker den nåværende diskretingen av nøytrofile spesifisiteter for pålitelig å isolere rene menneskelige nøytrofiler med begrenset restplate og RBCer, og forhindrer nøytrofilaktivering og akselerert død. Det mest avgjørende trinnet er lagdelingen av gradienten, som er mye mer effektivt oppnådd ved å legge til tetthetsgradientmediet under blodet for å oppnå et skarpt grensesnitt. En rask undersøkelse av PBMC-ringen og gradienten etter sentrifugering kan avsløre mulig forurensning, aktivering og lave utbytter. Når du arbeider med en leukaferesemembran eller buffy frakk, er fortynning av blodet viktig, da overdreven celletetthet vil føre til celleaggregering, noe som fører til urenheter og celleaktivering.
Denne protokollen bør fullføres innen 2 timer for å sikre celle friskhet, og trinn som involverer tetthet gradient medium, dextran, og lysis gjøres umiddelbart, da eksponering for disse løsningene kan endre nøytrofiler. Med denne protokollen er det forventede utbyttet av nøytrofiler minst ~ 10 millioner / 10 ml fullblod og minst ~ 60 millioner / 10 ml buffy frakk. Evaluering av isolasjonskvalitet bør gjøres som følger: aktiverte nøytrofiler bør være mindre enn 10%, lymfocyttforurensning lavere enn 5%, minimal eosinofil (samme sidespredning, men lavere fremoverspredningspopulasjon), og celle levedyktigheten bør være over 90%. Lavere renhet kan skyldes feil lagdeling eller lagring av tetthetsgradientmediet eller på grunn av kvaliteten og friskheten til startblodproduktet.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av P01HL095489. A.Y.H ble støttet av T32HL066987.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
| Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
| Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
| CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
| CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
| CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
| CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
| CD41-APC | biolegend | 303710 | |
| Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
| CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
| CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
| Dextran | Fisher | BP1580 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
| Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
| Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
| MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium chloride | sigma | 71376 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |
References
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Stoller, J. K. Murray & Nadel's textbook of respiratory medicine, 6th edition. Annals of the American Thoracic Society. 12 (8), 1257-1258 (2015).
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A.
- Manz, M. G., Boettcher, S.
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Tucker, K. A., Lilly, M. B., Heck, L., Rado, T. A. Characterization of a new human-diploid myeloid-leukemia cell-line (Plb-985) with granulocytic and monocytic differentiating capacity. Blood. 70 (2), 372-378 (1987).
- Hsu, A. Y., et al. Inducible overexpression of zebrafish microRNA-722 suppresses chemotaxis of human neutrophil like cells. Molecular Immunology. 112, 206-214 (2019).
- Kremserova, S., Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 2087, 33-42 (2020).
- Quach, A., Ferrante, A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. Journal of Immunological Research. 2017, 1254792 (2017).
- Thorson, L. M., Turkalj, A., Hung, J. C. In vitro evaluation of neutrophil viability after exposure to a hypotonic medium. Nuclear Medicine Communications. 16 (7), 615-620 (1995).
- Dhurat, R., Sukesh, M. Principles and methods of preparation of platelet-rich plasma: a review and author's perspective. Journal of Cutaneous and Aesthetetic Surgery. 7 (4), 189-197 (2014).
- Etulain, J., et al. An optimised protocol for platelet-rich plasma preparation to improve its angiogenic and regenerative properties. Scientific Reports. 8 (1), 1513 (2018).
- Hannah, S., et al. Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion. FEBS Letters. 421 (2), 141-146 (1998).
- Hsu, A. Y., et al. Phenotypical microRNA screen reveals a noncanonical role of CDK2 in regulating neutrophil migration. Proceedings of the National Acadermy of Sciences of the United States of America. 116 (37), 18561-18570 (2019).
- Martin, S. J., Bradley, J. G., Cotter, T. G. HL-60 cells induced to differentiate towards neutrophils subsequently die via apoptosis. Clinical and Experimental Immunology. 79 (3), 448-453 (1990).
- Hauert, A. B., Martinelli, S., Marone, C., Niggli, V. Differentiated HL-60 cells are a valid model system for the analysis of human neutrophil migration and chemotaxis. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 34 (7), 838-854 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Siemsen, D. W., et al. Neutrophil isolation from nonhuman species. Methods in Molecular Biology. 1124, 19-37 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), 17314 (2011).
- Calzetti, F., Tamassia, N., Arruda-Silva, F., Gasperini, S., Cassatella, M. A. The importance of being "pure" neutrophils. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (1), 352-355 (2017).
