Summary
이것은 버크 홀더리아 유익한 공생에서 후보 곤충 식민지 요인을 식별하기위한 적응 된 방법입니다. 딱정벌레 숙주는 트랜스포슨 돌연변이 발생을 통해 생성된 무작위 돌연변이 라이브러리에 감염되며, 식민지 화 후 라이브러리 복잡성은 시험관내에서자란 대조군과 비교된다.
Abstract
그들의 활동을 조작하여 유전자의 기능을 추론하는 것은 대부분의 생물학 프로세스의 유전 기초를 이해하기 위한 필수적인 공구입니다. 분자 미생물학의 발전은 유전자의 조작을 위한 다양한 돌연변이 발생 기술의 출현을 보았습니다. 그 중에서도, 트랜스포슨 삽입 시퀀싱(Tn-seq)은 무표적 방식으로 많은 후보 유전자의 기능을 동시에 평가하는 귀중한 도구이다. 이 기술은 여러 병원성 미생물과 몇 가지 유익한 공생에서 진핵 호스트의 식민지화를 위한 분자 메커니즘을 식별하는 열쇠가 되었습니다.
여기서 Tn-seq는 딱정벌레 라그리아 빌로사의상호 적인 부르크홀더리아 글래디올리 공생에서 식민지 화 요인을 식별하는 방법으로 설립된다. 인주에 의해, Tn5 트랜스포손 매개 삽입항생제 내성 카세트는 B. gladioli의무작위 게놈 위치에서 수행된다. 딱정벌레 숙주를 식민지화하는 박테리아의 능력에 대한 유전자 중단의 효과를 확인하기 위해 생성된 B. gladioli 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리는 딱정벌레 계란에 접종되고, 액체 배양 배지에서 체외에서 대조군이 성장한다. 식민지화에 충분한 시간을 허용한 후, DNA는 생체 내 및 체외 재배 라이브러리에서 추출됩니다. DNA 라이브러리 준비 프로토콜에 따라 DNA 샘플은 트랜스포슨 삽입 시퀀싱을 위해 준비됩니다. 트랜스포슨 삽입 가장자리와 측면 세균 DNA를 포함하는 DNA 단편이 선택되고, 돌연변이 부위는 트랜스포슨 삽입 가장자리에서 멀리 시퀀싱하여 결정된다. 마지막으로, 생체 내 및 체외 라이브러리 사이의 각 돌연변이의 주파수를 분석하고 비교함으로써 딱정벌레 식민지 화 시 특정 공생 유전자의 중요성을 예측할 수 있습니다.
Introduction
버크홀더리아 글래디올리는 라그리아 빌로사 딱정벌레와의 공생 적대적 인 교제에 종사 할 수 있으며, 곤충 호스트4,5,6의미생물 길항제에 대한 방어에 중요한 역할을한다. 암컷 딱정벌레는 생식 계통에 특화된 땀샘 부속품에 B. gladioli의 몇몇 긴장을 수용합니다. 계란 누워시, 암컷은 B. gladioli에 의해 생성된 항균 화합물이 내모병원성 곰팡이4,6에의한 감염을 억제하는 계란 표면에 B. gladioli 세포를 얼룩지게 한다. 늦은 배아 발달 도중 또는 애벌레 부화 후에 일찌기, 박테리아는 애벌레의 등지 표면에 자구성 질을 식민지화합니다. 공생의 이러한 특수국화 및 수직 전송 경로에도 불구하고, L. villosa는 아마도 환경4에서수평으로 B. gladioli를 취득할 수 있습니다. 또한, B. gladioli의 적어도 3개의 긴장은 L. villosa4와관련하여,6. 이 중, B. gladioli Lv-StA는 시험관 내에서재배할 수 있는 유일한 사람입니다.
B. 라디올리 Lv-StA는 8.56 Mb6의 게놈 크기를 가지고 있으며 7,468개의 유전자를 함유하고 있습니다. 이 유전자의 어떤 딱정벌레 호스트를 식민지로 B. gladioli 박테리아에 대 한 중요 한? 이 질문에 대답하기 위해, 우리는 조건부 필수 미생물 유전자1,2,3을식별하는 탐색 적 방법 인 트랜스포손 삽입 시퀀싱 (Tn-seq)을 사용했습니다. B. gladioli Lv-StA의 돌연변이 라이브러리는 Tn5 트랜스포슨을 사용하여 만들어졌습니다. 대장균 기증자 세포로부터 B. gladioli Lv-StA로 의 결합을 통해 Tn5 트랜스포손과 반전된 반복에 의해 측면에 있는 항생제 내성 카세트를 운반하는 pRL27 플라스미드가 전송되었다(도1). 이에 따라 3,736개의 공생 유전자의 중단을 개별적으로 전달하는 돌연변이 세트가 생성되었다(그림2).
돌연변이 풀은 딱정벌레 계란에 감염되어 식민지 인자를 식별하고, 대조군으로서, 또한 킹스 B (KB) 배지에서 시험관내에서 성장하였다. 식민지화를 위한 충분한 시간을 허용한 후에, 부화한 애벌레는 DNA 추출을 위해 집합되고 풀화되었습니다. B. gladioli Lv-StA의 트랜스포슨 삽입 및 측면 게놈 영역을 포함하는 DNA의 단편은 시퀀싱을 위한 수정된 DNA 라이브러리 준비 프로토콜을 사용하여 선택되었다. 읽기 품질 처리 에 따른 DESeq2 분석은 알 표면을 통해 전송될 때 L. villosa 애벌레를 식민지화하기 위하여 B. gladioli Lv-StA에 중요한 특정 유전자를 확인하기 위하여 실행되었습니다.
Protocol
1. 미디어 및 버퍼 준비
- 표 1에주어진 KB 및 LB 미디어 및 천 판을 준비하고 121 °C, 15 psi, 20 분에서 오토 클레이브를 준비하십시오.
- 50 μg/mL 필터 멸균 카나마이신과 300 μM 필터 멸균 2,6-디아노피멜산(DAP)을 E.coli WM3064 + pRL27을 배양하기 전에 오토클레이브 LB 배지에 추가합니다.
- 50 μg/mL 필터 살균 카나마이신을 오토클레이브 KB 한천에 추가하여 성공적인 B. gladioli Lv-StA 트랜스컨쥬펀트를 선택하는 데 필요한 플레이트를 부어 넣습니다.
- NaCl 8 g/L, KCl 0.201 g/L, Na2HPO 4 1.42 g/L, KH2PO4 0.272 g/L. 증류수 및 오토클라브 혼합물121°C에서 소금을 용해하기 전에 1배 의인산염 완충식식(PBS)을 준비한다. 실온에서 보관하십시오.
- 10m Tris-HCl(pH 7.5), 1mM 에틸렌디아민 테트라아세틱산(EDTA), 증류수 2M NaCl 등 다음 성분을 용해하여 2배의 결합 및 세척 버퍼를 준비한다. 사용하기 전에 혼합물을 필터 로 살균하십시오. 실온에서 보관하십시오.
- 10m Tris-HCl(pH 8.0)과 0.1 mM EDTA를 이중 증류수로 용해하여 1배 로우-TE를 준비한다. 121 °C, 15 psi, 20 분에서 자동화하여 살균하십시오. 실온에서 보관하십시오.
2. 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하는 컨쥬게이션
그림 1: 컨쥬게이션 프로토콜 단계. pRL27 플라스미드(분홍색)를 함유한 컨쥬게이션 수혜자 인 버크홀더리아 글래디올리 Lv-StA(빨간색)와 기증자 에셰리치아 대장균은 각각 KB 한천과 LB에서 재배되며, 카나마이신과 DAP로 보충된다. 30°C에서 12-18h의 플라스미드를 연상시키는 후, 트랜스콩주간트 B. 글래디올리 세포는 가나마이신을 함유하고 KB에서 선택되고 함께 풀링된다. 약어: DAP = 2,6-디아미노피멜산; 칸 = 카나마이신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 멸균 후드 하에서, 가나마이신과 DAP로 보충된 LB 배지의 10mL에 Escherichia coli WM3064 + pRL27의 신선한 기증자 문화를 접종한다. KB배지 5mL에서 버크홀더리아 글래디올리 Lv-StA 수신자 셀을 접종하였다. 250 rpm에서 셰이커에 하룻밤 30 °C에서 배양.
- 하룻밤 성장 후, 원심분리기 4 mL각 배양의 각 9,600 × g에서 6 분 동안 세포를 펠릿. 상부체를 폐기합니다.
- 멸균 후드 하에서, DAP를 포함하는 KB 배지에서 펠렛 세포 배양을 세척하고 마지막으로 KB + DAP 배지의 4mL에서 별도로 배양을 재연한다.
- 신선한 15mL 튜브에서 세척된 대장균 기증자 세포의 250 μL을 세척된 B. gladioli Lv-StA 수신자 세포의 1mL와 혼합합니다.
- DAP를 함유한 KB 천식판상에서 이 컨쥬게이션 셀 혼합물의 10 μL을 반점한다. 접시가 실온에서 멸균 후드에 방해받지 않고 1 시간 동안 쉬도록 하십시오. 이어서, 12-18h에 대해 30°C에서 컨쥬게이션 반점으로 플레이트를 배양한다.
참고: 유도 기간은 대상 종에 따라 조정할 수 있습니다. 그러나, 긴 컨쥬게이션 기간은 게놈내로이중 삽입 또는 플라스미드 통합에 대한 위험을 증가시킨다. 천천히 성장하는 박테리아의 경우, 더 긴 결합 기간을 허용합니다. - 인큐베이션 후, 멸균 후드 아래 플레이트에 1x PBS의 2-4 mL을 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 한천에서 재배된 세균 성 균류 반점을 방출합니다. 2mL 마이크로퍼지 튜브로 컨쥬게이트 셀 믹스를 피펫합니다.
- 펠릿은 2 분 동안 9,600 × g에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛. 상체를 버리고 1x PBS의 1mL에서 위아래로 피펫을 하여 펠릿을 두 번 씻으십시오. 1x PBS의 1200 μL에서 최종 펠릿을 다시 중단합니다. 혼합물의 세포 수가 1 × 104이상이면 도금 전에 희석을 하십시오.
- 잘 혼합하고 카나마이신으로 보충된 대형 KB 천판(6개 이상)에 세포 혼합물의 200 μL을 확산시키고 하룻밤 사이에 30°C에서 배양한다.
참고: 대상 돌연변이 식민지는 선택적 한천 플레이트에서 30시간 이내에 나타납니다. 항생 저항 마커 때문에, 돌연변이된 식민지만이 선택적 한천 판에 나타난다. 따라서 모든 식민지는 성공적인 트랜스컨저간이 될 것으로 예상됩니다. - 세 개의 플레이트에 트랜스콩주간트 식민지의 총 수를 계산하고 모든 판에서 얻은 돌연변이의 대략적인 수를 계산하는 추정. 대표적인 도서관을 획득할 확률을 높이기 위해 총 식민지 수가 게놈의 총 유전자 수보다 몇 배 더 높은지 확인합니다. 컨쥬게이션의 성공을 확인하기 위해, 섹션 3에 설명된 바와 같이 10-20 샘플 콜로니를 사용하여 삽입 카세트를 대상으로 PCR을 수행한다.
참고: 목표는 식민지의 수가 전체 게놈에 있는 유전자의 적어도 10 배, 이 경우에, >75,000 돌연변이의 수이다는 것을 확인하는 것입니다. 그러나 일반적으로 완전히 대표되는 라이브러리에 해당하는 식민지 수를 정확하게 추정하는 것은 어렵습니다. 돌연변이된 유일한 유전자의 수는 필수 유전자에 있는 중단이 포착되지 않다는 것을 감안할 때, 이 시점에서 명확하지 않습니다, 동일 유전자를 위한 수시로 다중 다른 돌연변이 사이트가 있고, Tn5 transposons로 생성된 돌연변이는 완전히 무작위아닙니다. - 멸균 후드 아래에서, 한천에 1-2 mL의 1-2 mL을 추가하여 접시에서 식민지를 긁어. 플레이트에서 긁힌 셀 혼합물을 50mL 튜브로 풀을 냅니다. 라이브러리를 철저히 혼합한 다음 풀링된 돌연변이 라이브러리의 4mL를 여러 극저온튜브로 분할합니다. 튜브에 70% 글리세롤 1mL을 넣고 -80°C에 보관하십시오.
3. PcR 및 젤 전기 포는 B. gladioli Lv-StA에 성공적인 삽입을 확인
- 삽입의 존재를 확인하기 위해, 2.9 단계에서 선택 플레이트에서 개별 돌연변이 콜로니를 선택하고 표 2에나열된 프라이머를 사용하여 삽입 카세트를 대상으로 PCR을 수행한다. 표 3에 따라 PCR 마스터 믹스를 준비하고 표 4에설명된 대로 열 사이클러의 조건을 설정한다.
- PCR 제품을 전기전도(250V, 40분)에 의한 1.6% 아가로즈 젤로 실행하여 증폭된 DNA 단편이 1580bp의 예상 길이인지 확인한다.
4. 딱정벌레 계란에 돌연변이 풀 감염
- 도서관 세척 단계
- 얼음 위에 준비된 돌연변이 라이브러리의 알리쿼트를 해동합니다. 원심분리기는 2,683g에서 10분 동안 × 상부체를 제거합니다. 멸균 후드 아래에서 세포를 1x PBS의 4mL로 세척하여 세포에서 남은 배지를 제거하십시오. 1x PBS의 4mL에서 세포를 다시 중단합니다.
- 셀 카운팅 챔버를 사용하여 라이브러리의 알리쿼트에 있는 셀 수를 계산합니다. 라이브러리의 일부를 1x PBS에서 2 × 106 셀/μL로 희석합니다.
- 필요한 볼륨을 복용하기 전에 라이브러리 알리쿼트 를 철저히 혼합하여 필요한 볼륨을 복용합니다.
- 계란 클러치 살균 및 생체 내 감염
- L. 빌로사 에그 클러치를 선택합니다. 클러치에 100개 이상의 달걀이 들어 있는 경우 계란 수를 계산하고 계속하십시오.
- 계란 클러치 전체를 살균합니다.
- 70% 에탄올의 200 μL을 넣고 달걀을 5분간 부드럽게 씻습니다. 에탄올을 제거하고 자동 물로 계란을 두 번 씻으신다.
- 12% 표백제(NaOCl)의 200 μL을 넣고 달걀을 30s로 부드럽게 씻습니다. 표백제를 즉시 제거하고 200 μL의 자동 용수로 다시 세 번 씻으십시오.
- 멸균 된 계란 클러치 (계란 당 2.5 μL)에 세척 된 돌연변이 라이브러리의 × 106 세포 / μL을 감염시보입니다.
- 감염된 딱정벌레 애벌레 해치 후 이틀 후, 1.5mL 마이크로퍼지 튜브 당 100 2nd 인스타 애벌레를 수집하고 -80 °C에 저장하십시오.
-
체외 돌연변이 라이브러리 컨트롤
- 멸균 후드 하에서, 가나마이신을 함유하는 KB 배지의 10mL에서 세척된 돌연변이 라이브러리의 2 × 106 세포/μL의 250 μL을 접종한다.
- 체외 돌연변이 배양을 30°C에서 20시간 동안 배양한다.
참고: 식민지화 시 생체내에서 WT B. gladioli Lv-StA의 대략적인 수와 일치하도록 인큐베이션의 지속 시간을 계산합니다. - 20h 인큐베이션 후, 체외 돌연변이 배양에 70% 글리세롤의 동일한 부피를 추가하고 -80°C에 저장한다.
5. 감염된 딱정벌레와 체외 돌연변이 라이브러리 DNA 추출
참고: DNA 추출은 아래에 간략하게 설명된 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 및 RNA 정제 키트를 사용하여 수행하였다.
- 풀이 된 유충(마이크로퍼지 튜브 당 최대 4 mg)을 균질화하여 액체 질소 1-2mL를 추가하고 유봉으로 분쇄합니다.
- 얼음에 글리세롤 주식에서 체외 재배 돌연변이 문화를 해동. 펠릿은 세포 용해 전 10 분 동안 9,600 × g에서 원심분리하여 세포를 합니다.
- 체외 및 생체 내 샘플에 300 μL의 조직 및 세포 용해 용액을 추가합니다. 10 mg / mL Proteinase K의 5 μL을 추가하고 60 °C에서 15 분 동안 혼합을 배양 한 다음 얼음에 3-5 분 동안 놓습니다.
- 150 μL의 단백질 침전 시약을 리스와 소용돌이에 완전히 넣습니다. 펠릿 단백질 파편은 10 분 동안 9,600 × g에서 원심분리하여 단백질 이물질을 합니다.
- 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브로 상체를 전송합니다. 상체에 500 μL의 이소프로판올을 추가하고 1 시간 또는 하룻밤 동안 -20 °C에서 배양하기 전에 튜브를 적어도 40 번 부드럽게 반전시십시오.
- 10 분 동안 9,600 × g에서 원심분리하여 침전 된 DNA를 펠렛. 상체를 버리고 DNA 펠릿에 얼음 차가운 70 % 에탄올을 추가하십시오.
- 원심분리기 ≥10,000 × g에서 5분 동안. 상체를 버리고 샘플을 공기 건조시 최소 1시간 동안 그대로 둡니다.
- 체외 및 생체 내 샘플에서 낮은 TE 버퍼의 100 μL에서 DNA를 다시 중단합니다.
- 샘플을 -20°C에 저장합니다.
6. 도서관 준비 시퀀싱
참고: DNA 라이브러리 준비를 위한 프로토콜 및 시약은 DNA 라이브러리 준비 키트의 제조업체가 제공한 지침에서 조정 및 수정됩니다.
그림 2: DNA 라이브러리 준비 단계의 회로도. 전단 및 어댑터 결찰 후, 수정된 프로토콜에는 삽입 카세트를 함유한 DNA 단편을 보강하기 위한 스트렙타비딘 비드 선택 단계가 포함되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 샘플을 20 ng/μL 농도 및 100 μL의 부피로 희석하고 얼음 위에 보관하십시오.
- 초음파를 사용하여 생체 내 및 체외 샘플 DNA에서 전단. 초음파 를 70 %의 전력으로 설정합니다. 샘플을 간략하게 소용돌이시키고 1분 30초 동안 전단합니다.
참고: 초음파 검사기의 설정은 계측기마다 다릅니다. 이 경우, 단편 크기는 200-400 bp였으며, 이는 150bp, 페어링-엔드의 이 시퀀싱 접근 방식에 적합합니다(단계 9.1 참조). 전단 매개 변수는 실험자의 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다. - DNA가 원하는 크기 범위로 전단되었는지 확인하십시오 (이 경우 200-400 bp). 1.6% 아가로즈 젤에서 40분 동안 250V에서 1.1 비율로 젤 로딩 염료와 혼합한 후 미세어드 및 시어드 DNA의 5 μL을 적재한다(그림3A,B).
- 어댑터 리합에 필요한 조각 끝 의 준비
- 시어드 DNA의 50 μL에, 라이브러리 준비 키트에 주어진 최종 준비 시약을 추가: 효소 믹스의 3 μL 및 반응 버퍼의 7 μL 및 파이펫팅에 의해 잘 혼합. 75°C≥가열뚜껑이 있는 열 사이클러를 설정하고 20°C에서 30분, 65°C에서 30분 동안 시료를 배양한다. 4 °C에서 유지하십시오.
- 어댑터 리시션
- 어댑터 리딩의 경우 최종 준비 단계의 제품에 다음 시약을 추가합니다: 30 μL 리기션 마스터 믹스, 1 μL 리기증강제 및 2.5 μL 희석 어댑터. 가열 된 뚜껑을 끄고 열 사이클러에서 20 °C에서 15 분 동안 샘플을 배관하여 철저히 섞습니다.
- 15 분 후, 효소의 3 μL을 추가 (우라실 DNA 글리코슬라제 + DNA 글리코슬라세 - 리아제 엔도누셀리스 VIII) (재료의 표참조). 피펫팅으로 잘 섞어서 샘플을 37°C에서 37°C에서 15분 동안 배양하고 뚜껑을 가열하여 ≥47°C로 가열합니다.
참고: 프로토콜은 이 단계에서 일시 중지할 수 있으며 샘플은 -20°C로 저장할 수 있습니다.
- 250 bp의 어댑터 리게팅 된 DNA 표적화 의 크기 선택
- 자기 비드 용액을 소용돌이 (재료의 표참조) 사용 하기 전에 30 분 동안 실온에 배치 합니다.
- 구슬의 0.3 x를 합착 된 DNA 혼합물의 96.5 μL에 넣고 완전히 파이펫팅하여 혼합합니다. 비드 혼합물을 5분 동안 배양합니다.
참고: 비드 혼합물에 소금과 폴리에틸렌 글리콜의 존재는 구슬에 DNA 단편의 침전을 용이하게합니다. DNA 분자에 대한 구슬의 낮은 비율은 구슬에 만 더 큰 DNA 단편의 결합으로 이어집니다. 이 경우 길이 가 250 bp 이상의 DNA 단편은 구슬에 바인딩됩니다. - 튜브를 자기 스탠드에 놓고 구슬을 내리고 원치 않는 크기의 DNA 조각을 제거합니다. 구슬을 5분 동안 정착한 다음 명확한 상체관을 새로운 미세분리기 튜브로 옮기게 하십시오(상체 유지).
- 상체에 신선한 구슬 0.15x를 넣고 잘 파이펫으로 섞습니다. 비드 혼합물을 5분 동안 배양한 다음 자기 스탠드에 튜브를 배치하여 대상 DNA에 바인딩된 구슬을 당깁니다. 5 분 기다린 다음 슈퍼 나티를 폐기하십시오 (구슬을 유지하십시오).
참고: DNA에 비드의 이 비율은 원하는 250 bp 크기의 단편의 결합으로 이어집니다. - 마그네틱 스탠드에 구슬을 장착하면 80%의 200 μL(갓 준비된)을 추가하고 30s를 기다립니다. 파이펫을 꺼내 서 자면에 구슬을 방해하지 않고 조심스럽게 에탄올 세척을 폐기하십시오. 이 단계를 반복합니다.
- 마지막 세척 후, 구슬에서 에탄올의 흔적을 제거한 다음 구슬을 2 분 동안 공기 건조한 다음 광택이 나타나지만 완전히 건조되지 는 않습니다. 구슬을 과도하게 건조시키지 마십시오.
- 자기 스탠드에서 튜브를 제거하고 10mM Tris-HCl 또는 0.1x TE(Low-TE)의 17 μL을 추가합니다. 파이펫팅으로 혼합하여 ~10회 혼합하고 실온에서 혼합물을 2분 동안 배양합니다.
- 튜브를 자기 스탠드에 다시 놓고 5 분 기다립니다. 구슬이 정착되면 DNA 를 새로운 튜브로 옮기십시오.
- 삽입 카세트를 포함하는 DNA 단편에 비오틴 태그를 추가하는 PCR I
- 트랜스포손 특이적 생체개화 프라이머(표5)및 인덱스 프라이머를 사용하여 Tn5 삽입 카세트를 포함하는 DNA 단편에 생체개화 프라이머 태그를 추가합니다. 표 6에 따라 PCR 마스터 믹스를 준비하고 표 7에나열된 열 사이클러의 PCR 조건을 따릅니다.
- 사이즈 선택 없이 PCR I의 정리
- 소용돌이 0.9 x 구슬을 청소하기 전에 적어도 30 분 동안 실온에 놓습니다.
- PCR 제품에 0.9배 구슬을 넣고 완전히 섞습니다.
- 구슬을 자기 스탠드에 놓고 구슬을 당깁니다.
- 투명 상체를 제거하고 200 μL의 200 μL로 비드 바운드 DNA를 두 번 세척합니다.
- 세척 단계 후 에탄올을 제거하고 광택이 있지만 너무 건조하지 않을 때까지 구슬을 공기 건조.
- 10m Tris-HCl 또는 0.1X TE(Low-TE)의 32 μL을 추가하고 구슬을 5분 동안 배양합니다. 혼합물을 자기 스탠드에 다시 놓고 상체를 신선한 미세 분리 튜브로 옮기십시오.
- 연쇄상 구슬에 결합 바이오티니드 DNA 단편
- 1x 바인드 앤 워시 버퍼에서 스트렙타비딘 구슬 32 μL을 재차 판제합니다. 마그네틱 스탠드에 놓으면서 완충구로 구슬을 세 번 씻습니다.
- 2x 바인드 앤 워시 버퍼32 μL을 추가하고 구슬을 다시 수일 수 있습니다. 이를 위해 청소된 PCR 1 제품의 32 μL을 추가합니다. 철저히 섞어서 실온에서 30분 동안 배양하십시오.
- 2 분 동안 자기 스탠드에 비드 DNA 혼합물을 놓습니다. 삽입 가장자리를 포함하는 비오틴 태그 DNA로 피펫은 구슬에 스트렙타비딘에 결합합니다.
- 1x 바인드 앤 워시 버퍼의 500 μL로 구슬을 씻은 다음 200 μL의 Low-TE로 구슬을 씻습니다. 낮은 TE의 17 μL에서 DNA 바인딩 구슬을 다시 중단합니다.
- 삽입 카세트 가장자리를 포함하는 조각에 어댑터를 추가하는 PCR II
- 표 8에표시된 대로 인덱스 프라이머와 표 5에나열된 수정된 범용 PCR 프라이머를 사용하여 마스터 믹스를 준비합니다. PCR 믹스에 이전 단계에서 DNA 바인딩 스트렙타비딘 구슬의 15 μL을 추가합니다. 열 사이클러 조건의 표 7을 참조하십시오.
- 이 프로토콜의 6.8 단계에서 주어진 대로 크기 선택 없이 PCR 제품을 정리합니다. 분자급 수의 30 μL에서 최종 DNA 제품을 엘테.
- 샘플을 -20°C에 저장하고 시퀀싱에 사용합니다.
7. 시퀀싱 및 분석
- 고처리량 시퀀싱 기술을 사용하여 라이브러리를 시퀀싱합니다. 아래와 같이 트랜스포슨 라이브러리 크기에 따라 시퀀싱 깊이를 조정합니다. FastQC7로판독 품질을 평가합니다. 읽기의 5' 끝에 Tn5 삽입 모서리를 포함하는 읽기를 선택하고 Cutadapt8 및/또는 Trimmomatic9을사용하여 삽입 가장자리 시퀀스를 제거합니다.
참고: 여기서는 페어링 형 단면 시퀀싱 접근 방식이 읽기 당 150 bp를 대상으로 사용되었으며 총 8 개의 Mio 읽기가 사용되었습니다. 대표 데이터 집합을 얻으려면 시퀀스된 읽기의 총 수가 라이브러리의 가능한 최대 돌연변이 수(예: 2.9단계의 총 추정 식민지 수를 초과)를 초과하는지 확인합니다. 참조로 이 프로토콜은 가능한 최대 라이브러리 크기의 40배를 목표로 합니다. 유사한 목적을 위해 Tn-seq를 이용한 다른 성공적인 연구는 해당 돌연변이라이브러리(22,23)에서실제 삽입 수의 25배에 가까운 총 읽기 수를 시퀀싱했다. - 유전자 의 끝에 돌연변이가 기능적으로 파괴적이지 않다는 것을 고려하면, 참조 게놈 GFF 파일의 유전자 주석의 양쪽 끝을 5% 잘라. 다듬어진 읽기를 Bowtie210을사용하여 참조 게놈에 매핑합니다.
- 정렬 BAM 파일의 고유한 5' 위치 수의 삽입 수를 계산합니다.
- FeatureCounts11을사용하여 각 복제 샘플에 대한 적중 유전자 수를 얻습니다.
- RStudio의 DESeq212 패키지를 사용하여 다양한 조건 간의 돌연변이 풍부의 차이를 계산합니다.
Representative Results
호스트 관련 박테리아는 접착, 운동성, 화학 요법, 스트레스 반응 또는 특정 운송업체를 포함한 여러 가지 요인을 사용하여 협회를 설립할 수 있습니다. 병원체 숙주 상호 작용에 중요한 요인은 여러 박테리아에 대해보고되었지만, 13,14,15,16,17,18,속 버크 홀더리아19의구성원을 포함,20,적은 연구는 식민지에 대한 유익한 공생에 의해 사용되는 분자 메커니즘을탐구했다 21,22,23 . 트랜스포슨 삽입 시퀀싱을 사용하여, 목표는 B. gladioli가 L. villosa 딱정벌레를 식민지화할 수 있게 하는 분자 요인을 확인하는 것이었습니다.
트랜스포손 매개 돌연변이 발생은 Tn5 트랜스포손과 반전 반복 부위에 의해 측면에 있는 카나마이신 저항 카세트를 운반하는 pRL27 플라스미드를 사용하여 수행되었다. 플라스미드는 플라스미드 기증자 E. 대장균 WM3064 균주와 의합으로써 표적 B. gladioli Lv-StA 세포로 도입되었다(도 1에도시된 바와 같이). 컨쥬게이션 후, B. gladioli 수신자와 대장균 기증자 세포를 포함하는 유도 믹스는 카나마이신을 포함하는 선택적 천판에 도금되었다. 플레이트상DAP의 부재로 기증자 대장균 세포와 성공적인 B. gladioli Lv-StA 트랜스컨저개를 위해 선택된 카나마이신의 존재가 제거되었습니다. 100,000개의 트랜스콘주간트 콜로니를 수확하여 얻은 풀링된 B. gladioli Lv-StA 돌연변이 라이브러리는 수정된 DNA 라이브러리 준비 키트 및 사용자 지정 프라이머를 사용하여 시퀀싱을 위해 준비되었다. 그림 2는 DNA 라이브러리 준비 단계를 강조합니다. 시퀀싱은 4 미오 페어링 읽기를 산출; B. gladioli Lv-StA에 있는 7,468의 유전자중 3,736의 유전자는 중단되었습니다.
호스트에서 식민지 결함이 있는 돌연변이를 확인하기 위해 B. gladioli Lv-StA 돌연변이 라이브러리는 딱정벌레 알에 감염되어 KB 배지에서 대조군으로 성장했습니다. 생체 내 식민지 병목 현상 크기는 실험 전에 계산하였다. 알려진 수의 B. gladioli Lv-StA 세포는 딱정벌레 계란에 감염되었고, 갓 부화한 첫 번째 인스타 애벌레에서 식민지 세포의 수는 각 애벌레로부터 현탁액을 도금하고 개별당 식민지 형성 단위를 계산하여 수득하였다. 이러한 계산은 식민지 세포의 수가 호스트를 식민지화하는 능력에 대한 라이브러리에서 돌연변이의 전부 또는 높은 비율을 평가하기에 충분한지 확인하기 위해 수행되었다. 추가적으로, 시험관 내및 생체 내 조건 사이 성장 시간은 이 견본을 비교하기 위하여 세균성 세대의 수에 근거를 두어 정규화되었습니다.
알이 부화한 후 13개의 수영장에서 1,296개의 유충이 수집되었습니다. 생체 내 돌연변이 배양은 글리세롤 주식으로 재배되고 저장되었다. 생체 내 및 체외 에서 재배된 돌연변이 라이브러리의 DNA를 초음파에서 추출하여 단편화시켰다. 도 3은 파편의 대부분이 예상대로 100에서 400 bp 사이에 걸쳐 있는 전단 된 DNA의 크기 분포를 보여줍니다. 이 단계는 시퀀싱을 위한 수정된 DNA 라이브러리 준비 프로토콜에 의해 뒤따랐다. 프로토콜의 각 단계에서, 남은 DNA의 농도는 단계가 올바르게 수행되었는지 확인하고 DNA의 손실을 추적하기 위해 검사되었다. 품질 검사 (재료의 표참조) 시퀀싱 전에 DNA 라이브러리는 예기치 않게 큰 (>800 bp) DNA 조각을 포함하고 있음을 밝혀, 이것은 생체 내 라이브러리에서 더 발음되었다. 시퀀싱 레인에서 조각의 클러스터링을 최적화하는 데 어려움을 감안할 때, 원하는 판독 횟수를 달성하기 위해 생체 내 라이브러리에서 10 개의 Mio 페어링 된 읽기로 시퀀싱 깊이를 증가시킬 필요가 있었습니다. 시퀀싱 결과의 분석은 생체 내 라이브러리에서 평균 4 개의 미오가 읽으며 시험관 내 3.1 Mio가 판독-1(표 9)의5'끝에 트랜스 포슨 가장자리를 포함하고 있는 것으로 나타났습니다. 원래 라이브러리에서 B. gladioli 게놈을 가로 질러 24,224 개의 고유 삽입의 분포는 도 4에도시된다. DESeq2를 사용하여 수행된 분석에 따르면 271개의 돌연변이체의 풍부도생체 내 및 체외 조건 간에 상당히 다른 것으로 나타났습니다.
도 3: 돌연변이 및 DNA 라이브러리의 아가로즈 젤. (A)아가로즈 젤은 레인 x에서 돌연변이의 미광택 DNA와 스케일을 위한 1kbp 사다리를 가진 아가로즈 젤. (B)전철 DNA 라이브러리와 젤. 첫 번째 차선의 사다리의 밴드 크기는 왼쪽에 표시됩니다. 처음 세 차선 a, b 및 c에는 생체 내 라이브러리의 전조된 DNA 조각이 들어있습니다. 차선 d, e, f 및 g에는 체외 라이브러리의 전단 DNA 조각이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 버크홀더리아 글래디올리 Lv-StA 게놈의 4개의 규충에 걸쳐 원래 라이브러리에 고유 삽입 사이트의 위치. x축을 따라 있는 각 막대는 삽입 사이트에 있습니다. y축을 따라 막대의 높이는 해당 사이트와 연결된 읽기 수에 해당합니다. 두 개의 염색체와 두 개의 플라스미드가 전체 길이로 표시되므로 x 축에 다른 비늘이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 킹스 B 중간/ 한천 | |
| 펩톤 (대두) | 20 g/L |
| K2HPO4 | 1.5 g/L |
| MgSO4.7H2O | 1.5 g/L |
| 아가르 (Agar) | 15 g/L |
| 증류수에 용해 | |
| LB 미디엄/한천 | |
| 트립톤 | 10 g/L |
| 효모 추출물 | 5 g/L |
| 나Cl | 10 g/L |
| 증류수에 용해 | |
표 1: 미디어 구성 요소입니다.
| 아니요. | 뇌관 | 순서 | PCR 어닐링 온도. (°C) | |
| 1 | tpnRL17-1RC | 5'-CGTTACATCCCTCTGTT-3' | 58.2 | |
| 2 | tpnRL13-2RC | 5'-TCGTGA아가그GTTGCTG-3' | ||
표 2: 연상의 성공을 확인하는 프라이머.
| 구성 요소 | 부피(μL) |
| HPLC 정제수 | 4.92 |
| 10x 버퍼 S(높은 특이성) | 1 |
| MgCl2 (25 mM) | 0.2 |
| dNTP (2mM) | 1.2 |
| 프라이머 1 (오후 10시/μL) | 0.8 |
| 프라이머 2 (10 pmol/μL) | 0.8 |
| 타크 (U/μL 5개) | 0.08 |
| 마스터믹스 합계 | 9 |
| 템플렛 | 1 |
표 3: PCR 마스터 믹스는 컨쥬게이션의 성공을 확인합니다. 약어: HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피; dNTP = 탈옥뉴클레오사이드 트리호스페이트.
| 단계 | 온도 °C | 시간 | 사이클 |
| 초기 성하 | 95 | 3분 | 1 |
| 변성 | 95 | 40 s | |
| 어 닐 링 | 58.2 | 40 s | 30 ~35 |
| 확장 | 72 | 1-2분 | |
| 최종 확장 | 72 | 4분 | 1 |
| 들다 | 4 | ∞ | |
표 4: PCR 조건은 컨쥬게이션의 성공을 확인합니다.
| 뇌관 | 순서 | Tm °C | 쓰다 | 근원 | |
| 트랜스포슨 별 바이오티니저 프라이머 | 5'-비오틴-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3' |
63.5 | 6.7.1. PCR I | 관습 | |
| 수정된 범용 PCR 프라이머 | 5'-아가타그그CGACCACCACCACCACCATC 타박트CTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGAT가트 GGTTGAGATGT – 3' |
62 | 6.10.1. PCR II | 관습 | |
| 인덱스 프라이머 | 제조업체 매뉴얼 참조 | 6.7.1. PCR I 및 6.10.1. PCR II | 일루미나에 대한 NEBNext 멀티플렉스 올리고스 (인덱스 프라이머 세트 1) | ||
| 어댑터 | 제조업체 매뉴얼 참조 | 6.5. 어댑터 리시션 | 일루미나를 위한 NEBNext 울트라 II DNA 라이브러리 준비 키트 | ||
표 5: DNA 라이브러리 준비 중 PCR I 및 II용 프라이머 및 어댑터입니다.
| PCR 믹스 | (μL) |
| 어댑터 계각 DNA 단편 | 15 |
| NEBNext 울트라 II Q5 마스터 믹스 | 25 |
| 인덱스 프라이머(오후 10시/μL) | 5 |
| 트랜스포슨 특정 바이오티니저 프라이머 (10 pmol/μL) | 5 |
| 총 볼륨 | 50 |
표 6: DNA 라이브러리 준비-PCRI 마스터 믹스.
| 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 초기 성하 | 98 °C | 30 s | 1 |
| 변성 | 98 °C | 10 s | 6 ~ 12 |
| 어 닐 링 | 65 °C | 30 s | |
| 확장 | 72 °C | 30 s | |
| 최종 확장 | 72 °C | 2분 | 1 |
| 들다 | 16°C | ∞ | |
표 7: DNA 라이브러리 준비-PCR I 및 II 조건.
| PCR 믹스 | (μL) |
| 비드 선택 DNA | 15 |
| NEBNext 울트라 II Q5 마스터 믹스 | 25 |
| 인덱스 프라이머 | 5 |
| 수정된 범용 PCR 프라이머 | 5 |
| 총 볼륨 | 50 |
표 8: DNA 라이브러리 준비-PCR II 마스터 믹스.
| 라이브러리 | 인비보-1 | 인비보-2 | 인비보-3 | 인비스트로-1 | 인비스트로-2 | 인비스트로-3 | 원본 라이브러리 | |
| 아니요. 읽기 (PE) | 56,57,710 | 39,19,051 | 30,65,849 | 35,73,494 | 28,83,440 | 36,61,956 | 46,09,410 | |
| 아니요. Tn을 포함하는 읽기의 – 읽기-1의 5'끝에 가장자리 | 54,15,880 | 37,31,169 | 29,36,247 | 33,00,499 | 27,35,705 | 33,50,402 | 41,53,270 | |
| Bowtie2 전체 정렬 속도 (%) (읽기-1만) | 95.53% | 83.71% | 89.87% | 80.79% | 78.00% | 73.06% | 74.92% | |
| 고유 삽입 수 | 8,539 | 4,134 | 7,183 | 18,930 | 18,421 | 20,438 | 24,224 | |
| 명중된 유전자의 수 | 1575 | 993 | 1450 | 2793 | 2597 | 3037 | 3736 | |
표 9: 라이브러리당 시퀀싱 출력 및 트랜스포슨 삽입 주파수의 요약입니다. 약어: PE = 페어링-엔드.
Discussion
B. gladioli 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리는 L. villosa 딱정벌레와 B. gladioli 박테리아 사이의 공생 상호 작용에서 중요한 호스트 식민지 화 요인을 식별하기 위해 생성되었다. 프로토콜의 주요 단계는 연상, 호스트 감염, DNA 라이브러리 준비 및 시퀀싱이었습니다.
버크홀더리아의 많은 변종은24,25,트랜스포손 및 항생제 삽입 카세트를 운반하는 플라스미드가 대장균으로부터표적 B. gladioli Lv-StA 균주에 성공적으로 접합되었다. 전기포이션에 의한 이전의 변환 시도는 거의 B. gladioli 변압제로 매우 낮게 산출되었습니다. 많은 수의 변압제를 효율적으로 산출하기 위해 대상 유기체의 변형 기술을 최적화하는 것이 좋습니다.
한 라운드의 컨쥬게이션과 40개의 연상 반점은 B. gladioli Lv-StA에서 3,736개의 유전자를 중단시켰습니다. 뒤늦게, 인후의 여러 라운드는 7,468개의 유전자의 대부분을 중단하고 포화 된 라이브러리를 얻기 위해 필요할 것입니다. 특히, 컨쥬게이션 중 인큐베이션 시간은 B. gladioli의기하급수적 성장 단계의 끝인 12-18h를 초과할 수 없었다. 세균 세포의 기하급수적 성장 단계를 넘어 결합을 허용하면트랜스컨쥬펀트(26)를획득하는 성공 확률을 감소시킨다. 따라서, 균종의 성장에 따라 컨쥬게이션 기간을 조정해야 한다.
숙주에서 돌연변이 라이브러리의 감염을 성공적으로 수행하려면,감염1,2,27전에 라이브러리에 있는 식민지화 도중 세균성 인구 병목 현상 및 돌연변이의 다양성을 평가하는 것이 중요하다. 실험을 준비하기 위해 라이브러리의 각 돌연변이를 샘플링하고 식민지화할 수 있는 높은 기회를 갖기 위해 감염되어야 하는 딱정벌레의 최소 수를 추정했습니다. 생체 내 세균 발생 시간 및 실험 기간 동안세대 수에 대한 근사치도 계산하였다. 체외 문화는 인큐베이션 시간을 조정하여 비슷한 수의 세대까지 성장했습니다. 다른 비모델 호스트에서 유사한 감염 실험의 경우, 숙주 유기체의 실험실 배양 및 일정한 근원을 유지하는 능력이 바람직하다.
생체 내 및 시험관 내 및 샘플 수집에서 돌연변이 라이브러리의 성장에 따라, 트랜스포슨 삽입 시퀀싱을 위한 수정된 DNA 라이브러리 준비 프로토콜이 수행되었다. 프로토콜의 수정은 사용자 정의 PCR 프라이머를 설계하고 삽입 카세트를 포함하는 DNA 단편을 선택하는 PCR 단계를 추가하는 것을 포함했다. 프로토콜을 사용자 지정했기 때문에 프로토콜의 추가 PCR 주기는 최종 라이브러리에서 오버앰프 및 혼성 어댑터 조각의 위험을 증가시켰습니다. 따라서 이러한 조각을 제거하는 데 도움이 되므로 두 개의 PcR 후 최종 정리 단계(크기 선택 제외)가 권장됩니다. DNA 라이브러리의 크기 분포는 여전히 예상보다 광범위했습니다. 그러나 시퀀싱 깊이를 늘리면 생물정보학 분석 중에 필터링된 충분한 데이터가 제공되어 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다.
트랜스포슨 매개 돌연변이 발생은 단일 실험에서 수천 개의 무작위 삽입을 생성하므로 세균 성장에 필수적인 유전자가 중단된 돌연변이를 제외한 모든 돌연변이체 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 우리는 버크 홀더리아 스프에 대한 다른 연구에서 필수 유전자의 추정을 감안할 때 포화 돌연변이 라이브러리와 함께 작동하지 않았을 가능성이 큽분입니다. 28,29. 그럼에도 불구하고 포화되지 않은 도서관은 표적 돌연변이 발생을 사용하여 추가 연구를 위한 다양한 후보 유전자를 탐구하는 데 도움이됩니다. 실험 전에, 일부 트랜스포슨에는게놈(30)의특정 좌엽에서 돌연변이의 풍부를 증가시키는 특정 삽입 표적 부위가 있다는 것을 기억하는 것도 중요하다. 마리너 트랜스포슨은삽입(31)에대한 AT 부위를 표적으로 하는 것으로 알려져 있으며, Tn5 트랜스포슨은 GC바이어스(32,33)를갖는다. 트랜스포슨 삽입에 대한 핫스팟을 인식하는 생물 정보학 분석 중에 단계를 포함하여 모든 분포 편향을 평가하는 데 도움이 됩니다.
좌절하는 경향이 있더라도, 잘 설계된 transposon 삽입 순서 분석 실험은 단 하나 실험 내의 박테리아에 있는 많은 조건부 로 중요한 유전자를 확인하는 강력한 공구일 수 있습니다. 예를 들어, 난초잎 괴사의 억제에 중요한 버크홀더리아 정액에 있는 12개의 유전자는 트랜스포손 돌연변이 발생 및 유전체학(34)을 결합하여 확인되었다. 버크홀더리아를 넘어, 여러 접착 및 운동 성 유전자와 수송은 아피스 멜라이프라 (허니비)22의 스노드 그라셀라 알비 공생에서 중요한 식민지 요인으로 확인되었으며, 유프리모 피셰리 공생 (하와이 밥테일 스퀴드)23 트랜스포지션을 사용하여 돌연변이 를 삽입하였다.
대체 접근법으로, 트랜스포슨 돌연변이 발생은 시퀀싱 대신 선택적 매체를 사용하여 개별 돌연변이에 대한 검열에 의해 뒤따를 수 있다. 운동성, 생리활성 이차 대사 산물 생산 또는 특정 보조 트로피와 같은 결함을 식별하기 위한 페노티픽 스크리닝 또는 생체 학적 검사가 가능합니다. 예를 들어, 버크홀더리아 곤충콜라(카바예로니아 35)의검진은 공생이 립토르투스 페데스트리,곤충숙주(36)를식민지화하기 위한 운동성 유전자를 채택한다는 것을 확인하는 데 핵심적인 것으로 나타났습니다. 더욱이, 트랜스포슨 돌연변이 발생 및 페노티픽 스크리닝을 이용하여, 생합성 유전자 클러스터는 생활성 이차 대사산물 카요이넨신(Burkholderia caryophylli37)에서확인되었다. 버크홀더리아 의사말레이의 보조 돌연변이는 트랜스포손 돌연변이 발생 및 검진에 따라 확인되었으며, 인간과 동물의 위험한 질병인 멜리오이도증에 대하여 가능한 감쇠 백신후보이다 38. 따라서, 트랜스포손 돌연변이 발생 및 시퀀싱은 병원성 또는 상호 연관에서 각각의 호스트와의 상호 작용에 중요한 박테리아의 분자 특성을 연구하는 데 있어 귀중한 접근법이다.
Disclosures
저자는 연구 와 관련된 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이준범 교수님은 대장균 WM3064+pRL27 균주를 절차의 컨쥬게이션및 지도, 돌연변이 도서관 세대 의 문제 해결을 도운 카트린 허프마이어, 곤충 수집 및 허가 취득을 지원하는 안드레 로드리게스 교수에게 감사드립니다. 또한 레베카 얀케와 다그마르 클레브쉬에게 곤충의 수집과 사육을 지원해 주신 것에 대해서도 감사드립니다. 우리는 브라질 당국이 곤충 표본의 접근, 수집 및 수출에 대한 다음과 같은 허가를 부여한 것을 인정합니다: SISBIO 승인 Nr. 45742-1, 45742-7 및 45742-10, CNPq 공정 nº 01300.004320/2014-21 및 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR01615151DF 205.20.20.20.20.20.25.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.23. 이 연구는 독일 과학 재단 (DFG) 연구 보조금 FL1051/1-1 및 KA2846/6-1의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
| Agar - Agar | Roth | 5210 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
| Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
| Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
| Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
| Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
| DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
| DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
| dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
| EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
| Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
| Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
| FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
| FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
| Glycerol | Roth | 7530 | |
| K2HPO4 | Roth | P749 | |
| Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
| KCl | Merck | 4936 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904 | |
| MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
| Na2HPO4 | Roth | P030 | |
| NaCl | Merck | 6404 | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
| Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
| peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
| Petri plates - 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
| Petri plates - 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
| Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
| Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
| Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
| Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
| Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
| Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
| Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
| USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
| Yeast extract | Roth | 2363 |
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