Summary
Målet med metoden er at screene for hypertermi eller varmeinducerede anfald i musemodeller. Protokollen beskriver brugen af et specialbygget kammer med kontinuerlig overvågning af kropstemperaturen for at afgøre, om forhøjet kropstemperatur fører til anfald.
Abstract
Transgene musemodeller har vist sig at være kraftfulde værktøjer til at studere forskellige aspekter af menneskelige neurologiske lidelser, herunder epilepsi. De SCN1A-associerede genetiske epilepsier omfatter et bredt spektrum af anfaldsforstyrrelser med ufuldstændig penetrans og klinisk variabilitet. SCN1A-mutationer kan resultere i en lang række anfaldsfænotyper, der spænder fra enkle, selvbegrænsede feberrelaterede feberanfald (FS), genetisk epilepsi på moderat niveau med feberkramper plus (GEFS+) til mere alvorligt Dravet syndrom (DS). Selvom FS almindeligvis ses hos børn under 6-7 år, der ikke har genetisk epilepsi, fortsætter FS hos GEFS + -patienter med at forekomme i voksenalderen. Traditionelt er eksperimentel FS blevet induceret i mus ved at udsætte dyret for en strøm af tør luft eller varmelamper, og ændringshastigheden i kropstemperaturen er ofte ikke godt kontrolleret. Her beskriver vi et specialbygget varmekammer med plexiglasfront, der er udstyret med en digital temperaturregulator og en varmeudstyret elektrisk ventilator, som kan sende opvarmet tvungen luft ind i testarenaen på en temperaturstyret måde. Kropstemperaturen på en mus, der er anbragt i kammeret, overvåget gennem en rektal sonde, kan øges til 40-42 °C på en reproducerbar måde ved at øge temperaturen inde i kammeret. Kontinuerlig visuel overvågning af dyrene i opvarmningsperioden viser induktion af varmeinducerede anfald hos mus, der bærer en FS-mutation ved en kropstemperatur, der ikke fremkalder adfærdsmæssige anfald hos vildtype kuldkammerater. Dyr kan let fjernes fra kammeret og placeres på en kølepude for hurtigt at returnere kropstemperaturen til normal. Denne metode giver mulighed for en enkel, hurtig og reproducerbar screeningsprotokol for forekomsten af varmeinducerede anfald i epilepsimusemodeller.
Introduction
Epilepsi, den fjerde mest almindelige familie af neurologiske lidelser i USA1, er kendetegnet ved en ubalance af excitatorisk og hæmmende drev i CNS, der fører til tilbagevendende anfald. Feberkramper (FS) eller feberrelaterede anfald kan forekomme i den generelle befolkning, oftest hos børn så tidligt som 3 måneder op til 6-7 år. Men hos nogle personer med genetiske mutationer, oftest i et natriumkanalgen, kan FS fortsætte ud over 7 år i voksenalderen. Denne tilstand kaldes feberkramper plus eller FS +. Hurtige fremskridt inden for genomsekventering har identificeret over 1.300 mutationer i det humane natriumionkanalgen SCN1A, hvilket gør det til et hotspot for epilepsimutationer. SCN1A-mutationer har været forbundet med et bredt spektrum af anfaldsforstyrrelser, herunder feberkramper (FS), genetisk epilepsi med feberkramper plus (GEFS+) og Dravet syndrom (DS)2,3,4,5,6. Omkring 20% af SCN1A missense mutationer fører til GEFS + 5,7,8. Pædiatrisk historie af kompleks eller langvarig FS i barndommen kan efterfølgende udvikle sig til mere svækkende former for epilepsi såsom temporal lobe epilepsi (TLE)9,10,11. Dravet syndrom opstår på grund af afkortningsmutationer eller tab af funktionsmutationer i SCN1A og er en alvorlig form for uhåndterlig epilepsi, med barndomsdebut af feberkramper, der udvikler sig til ildfaste anfald, og er ofte forbundet med kognitive, udviklingsmæssige og motoriske svækkelser2,5,12 . Da mange personer med GEFS + og / eller DS udviser feberkramper, bliver det bydende nødvendigt at udvikle nye terapier for bedre at bekæmpe disse anfaldsforstyrrelser.
Dyremodeller af SCN1A-associeret epilepsi har vist sig uvurderlige til at karakterisere forskellige typer anfald (febril vs generaliseret) og dissekere neuronal mekanisme for anfaldsgenerering13,14,15,16,17,18. Mens undersøgelsen af spontane anfald via EEG / EMG-optagelser i gnaverhjerner er veletableret og er et meget nyttigt værktøj, har kun få undersøgelser forsøgt at efterligne feberkramper i musemodeller14,16,19,20,21,22,23 . Tidligere undersøgelser har brugt en stråle opvarmet tør luft eller en methacrylatcylinder udstyret med et termisk system eller varmelamper med en temperaturregulator i lukkede testarenaer9,16,21,22,23,24 til at fremkalde anfald via hypertermi. For at øge kropstemperaturen i et mere kontrolleret miljø bruger protokollen beskrevet her et specialbygget kammer med et temperaturstyret varmesystem, der tillod reproducerbare stigningshastigheder i kropstemperaturen på en mus inde i kammeret. Varmekammeret blev konstrueret af træ (længde 40 cm x bredde 34 cm x højde 31 cm) og var udstyret med en digital temperaturregulator med et K-termoelement. En lille aksial ventilator udstyret med en varmelegeme på kammerets bagpanel leder opvarmet luft ind i kammeret reguleret af en digital temperaturregulator. Dette tvungne luftvarmesystem gør det muligt for en at styre den hastighed, hvormed kammertemperaturen stiger. (Figur 1A,B). K-termoelementet, der er placeret inde i trævarmekammeret, sender feedback til den digitale temperaturregulator for at opretholde konstante temperaturer inde i kassen under analysen. Indstilling af temperaturen på den digitale temperaturregulator gør det muligt for den elektriske ventilator at sende opvarmet tvungen luft gennem ventilationsåbninger for ensartet opvarmning af kammeret (figur 1A). Varmekammerets frontpanel er en klar plexiglasplade, der muliggør nem videooptagelse af forsøgene.
Voksne (P30-P40) mus, heterozygote for en missense-mutation i SCN1A, der får GEFS+ og et lige antal vildtypekuldkammerater til at fungere som kontrolgruppe, blev udvalgt til hvert forsøg. Dyr, både han- og hundyr, der blev anvendt i disse undersøgelser, vejede mindst 15 g, da vildtypemus, der vejede mindre, var mere følsomme over for varmeinducerede anfald end tungere dyr i samme alder. I pilotstudiet blev både mutante og vildtypemus observeret for at opsøge de køligere hjørner af kammeret bagpå og forblev der i længere perioder. For at omgå dette blev den effektive gulvstørrelse inde i varmekammertestarenaen reduceret til længde 16,5 cm x bredde 21,5 cm x højde 27,5 cm ved at placere en træblok B (dimensioner 20 cm x 8 cm x 7,2 cm) i højre side af kammeret (figur 1A). Varmekammeret blev konstrueret af 1,9 cm tyk krydsfiner (længde 40 cm x bredde 34 cm x højde 31 cm) dækket af hvidt laminat og udstyret med en digital temperaturregulator med et K-termoelement. Laminatoverfladen på kammervæggene er uigennemtrængelig og kan let desinficeres mellem forsøg ved at tørre ned med 70% ethanol. Varmekammerets temperatur blev oprindeligt sat til 50 °C og forvarmet i mindst 1 time før forsøgets start for at sikre ensartet opvarmning inde i kammeret. Hver mus blev udstyret med et rektalt termometer til kontinuerlig overvågning af kropstemperaturen under hele eksperimentet. En enkelt mus blev placeret i kammeret ad gangen, og temperaturen blev holdt på 50 °C mellem 1.-10. minut. Temperaturen blev derefter hævet til 55 °C i det 11.-20. minut og til sidst hævet til 60 °C i det 21.-30. minut. Dette resulterede i en reproducerbar stigningshastighed i musens kropstemperatur (figur 2A). Hvert forsøg blev videofilmet, og adfærdsanalyse blev udført offline.
Opvarmningsprotokollen kan let ændres for at ændre varmekammerets starttemperatur og den hastighed, som kammeret opvarmes, hvilket igen ændrer, hvor hurtigt musens kropstemperatur hæves under analysen. Således giver denne metode mere fleksibilitet i forhold til traditionelle metoder til opsætning af adfærdsmæssige skærme, der involverer varmeinducerede anfald. Den varmeinducerede anfaldsprotokol kan også bruges til at screene for antiepileptiske lægemidler, der gør mutante mus mere modstandsdygtige over for varmeinducerede anfald eller øger tærskeltemperaturen, ved hvilken anfald observeres. Tilsvarende kan gavnlige virkninger af restriktive diætregimer såsom keto-diæt på varmeinducerede anfald undersøges hos normale chow-fodrede vs keto-fodrede mus.
Figur 1: Beskrivelse af det specialbyggede musevarmekammer. (A) Frontpanelet på træmusens varmekammer viser sidekontrolpanelet, der indeholder tænd / sluk-kontakt, der tænder digital temperaturregulator, K-termoelement, ventilatorvarmerens ON / OFF-kontakt og varmeindikator. Kassens ydre dimensioner og den indre testarena er vist i cm. En træblok B, der bruges til effektivt at reducere testarenaoverfladen, er også vist. Bunden af testarenaen er dækket af kolbestrøelse for at forhindre mus i at komme direkte i kontakt med opvarmede træoverflader. (B) Varmekammerets bagpanel viser ventilatoren monteret på den øverste udluftning og netledningen for at levere elektricitet til kammeret. Dette tal er modificeret fra figur 3 i Das et al., 2021, eNeuro14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California, Irvine.
1. Forberedelse af det varmeinducerede anfaldsassay
- Tænd for tænd /sluk-knappen på varmekammeret efterfulgt af knappen Heat On .
- Indstil temperaturen i varmekammeret til 50 °C ved hjælp af tastaturet på den digitale temperaturregulator.
- Vent i mindst 1 time for at forvarme kammeret ved 50 °C, før du indfører den første mus i kammeret. Forvarmning sikrer ensartet opvarmning inde i kammeret.
- Liny gulvet i musens varmekammer med cob sengetøj.
- Monter et videooptagelseskamera foran varmekammeret til optagelse af hvert varmeinduceret anfaldsanalyseforsøg.
- Bekæd en petriskål med en diameter på 140 mm med tykke lag silkepapir og læg den på is for at tjene som kølepude.
BEMÆRK: I slutningen af analysen overføres den enkelte mus på den forkølede kølepude for at hjælpe med at nedbringe deres forhøjede kropstemperatur.
2. Forberedelse af musen til varmeinduceret anfaldsanalyse
- Vælg 10 voksne mus (P30-P40), 5, der bærer den epilepsi, der forårsager mutation, og 5 af vildtypekuldkammeraterne til varmeinduceret anfaldsscreeningsassay.
BEMÆRK: Vildtypemus, der ikke har epilepsi, der forårsager mutation, udviser ikke varmeinducerede anfald ved temperaturer under 44 °C og fungerer som kontrolgruppe. - Vej hver mus, der skal bruges til screeningsassayet, og registrer dens kropsvægt. Kun mus, der vejer 15 g eller mere, bør anvendes til analysen.
- Skærm en mus ad gangen i musens varmekammer.
- Kort anæstesi musen i 10-15 s ved hjælp af et par dråber isofluran i bunden af en klokkekrukke.
- Tag dyret ud af klokkekrukken og læg det på et papirhåndklæde.
- Sørg for, at musen er fuldstændigt anæstesi ved at kontrollere, at musen ikke reagerer på en skadelig tåklemme.
- Belæg metalspidsen af den rektale temperatursonde med et smøremiddel (såsom vaselin) og indsæt det forsigtigt i musen i en dybde på mindre end eller lig med 2 cm.
- Fastgør den rektale sonde til musens hale med tape, så sonden ikke kommer ud under analysen.
BEMÆRK: Alternativt kan du placere dyret i en musebegrænserkegle og indsætte rektaltemperatursonden. Fastgør det ved at tape til halen. - Sørg for, at den rektale sonde er forbundet til et multimeter, der viser musens indre kropstemperatur.
- Placer dyret i et frisk bur foret med cob strøelse, dvs. genopretningsburet.
- Start en timer, og vent i 5 minutter. Overhold musen, indtil den er helt kommet sig efter anæstesi, og musen er aktiv og pleje.
- Samtidig skal du overvåge musens kernekropstemperatur, indtil den stabiliseres ved 35-36 °C.
- I slutningen af 5 minutter skal du bemærke musens kropstemperatur. Dette er den oprindelige kropstemperatur på tidspunktet "0" min.
BEMÆRK: Hvis musens kernekropstemperatur er under 35 °C, skal du vente på yderligere tid på, at dyret kommer sig efter anæstesiinduceret hypotermi. - Overfør hurtigt den enkelte mus til det forvarmede musekammer. Dette markerer STARTEN på forsøgsforsøget. Kun én mus screenes ad gangen.
3. Varmeinduceret anfaldsassay
- Når du forsigtigt har placeret musen på gulvet i det forvarmede musevarmekammer, skal du lukke plexiglasdøren og starte kameraet til videooptagelse af eksperimentet.
- Start stopuret. Optag musens kropstemperatur fra det rektale termometer med 1 minuts mellemrum i eksperimentets varighed.
- Med jævne mellemrum øges temperaturen i musevarmekammeret, således at musens kropstemperatur stiger med en hastighed på 0,25-0,5 °C /min.
BEMÆRK: Hurtige stigninger i kropstemperaturen kan føre til hedeslag eller død og bør undgås. - Efter denne protokol øges temperaturen i musevarmekammeret med 5 °C hvert 10. minut som vist i figur 2A.
- Ved 9,5 min. indstilles varmekammerets temperatur til 55 °C for at stabilisere varmekammerets temperatur til 55 °C inden det 10. minut som vist på det digitale temperaturdisplay.
- Tilsvarende øges temperaturen til 60 °C ved 19,5 min. for at stabilisere varmekammerets temperatur til 60 °C inden det 20. minut. Hvert anfaldsscreeningsforsøg varer i 30 minutter.
- Hvis musen har et anfald (vokaliserer, viser hovedet nikkende, forben clonus, bagben forlængelse, falder på sin side eller oplever generaliserede toniske / kloniske kramper), skal du registrere følgende oplysninger.
- Optag musens kropstemperatur under anfaldet (anfaldstærskeltemperatur) fra rektaltemperaturtermometeret.
- Registrer anfaldsadfærdskarakteristika såsom hovednik, forbenklous, forlængelse af bagbenet, fald på siden og / eller generaliserede toniske / kloniske anfald (GTCS), der vises af musen.
- Tag hurtigt, men forsigtigt musen op fra kammeret, og læg den på kølepuden, der er forberedt i trin 1.6.
BEMÆRK: Hvis en mus oplever Racine skala 5 anfald og udviser ukontrolleret hoppe, kan det være svært at samle dyret op fra varmekammeret og overføres til kølepuden udenfor. Et typisk varmeinduceret anfald varer dog mellem 30 s og 60 s.Musen skal således tages ud af varmekammeret og lægges på kølepuden inden for 60 s efter starten af varmeinduceret anfaldsepisode. - Vent på, at musens kropstemperatur kommer ned på 36-37 °C, før du overfører den til et restitutionsbur. Kun en mus placeres i et genopretningsbur ad gangen.
BEMÆRK: Bland ikke mus, der endnu ikke skal bruges til varmeinduceret screening, med musen, der allerede har oplevet det varmeinducerede anfaldsforsøg. - Skær forsigtigt og forsigtigt båndet mellem musehalen og rektal sondetråd med en saks for at fjerne den rektale sonde fra musen.
- Tør metalspidsen af rektalsonden af med 70% alkohol og blødt vævsservietter for at holde den klar til næste forsøg.
- Fortsæt med at observere musen i genopretningsburet, indtil den genoptager normal aktivitet (gang, pleje osv.), Før musen returneres til sit hjemmebur. Dette markerer afslutningen på eksperimentforsøget for denne mus.
- Registrere dyrets status efter analysen i live og rask efter prøvesessionen eller død. Anfald med høj intensitet, der involverer ukontrolleret spring og generaliserede toniske / kloniske anfald, kan undertiden resultere i musens død.
- Hvis en mus ikke oplever varmeinducerede anfald inden for observationsperioden på 30 minutter, eller musens kropstemperatur når 44 °C, skal musen fjernes fra varmekammeret og anbringes på kølepuden, indtil musens kropstemperatur vender tilbage til 36-37 °C.
- Nulstil temperaturen i musevarmekammeret til 50 °C, og lad det udligne, indtil visningstemperaturen på den digitale temperaturregulator viser 50 °C.
- Skift cob sengetøj mellem individuelle museforsøg.
- Forbered den næste mus til screeningsforsøg som beskrevet i punkt 2, og gentag trinnene fra punkt 3.
4. Aflivning af dyrene
- Selvom de fleste dyr kommer sig efter varmeinducerede anfald, er det vores erfaring, at et par af musene gennemgår SUDEP (Sudden Unexplained Death in EPilepsy) i deres hjemmebur inden for 24-48 timer efter varmeinducerede anfald. Efter at have afsluttet screeningen på alle musene individuelt for varmeinducerede anfald efter 30 minutters forsøg, aflives alle musene i henhold til institutionens IACUC-retningslinjer.
5. Analyse af de varmeinducerede anfaldsdata
- Når screeningen af en kohorte af dyr er afsluttet, beregnes procentdelen af mus i en given genotype, der viser anfald, ved hjælp af følgende formel:
- Estimer den gennemsnitlige anfaldstærskeltemperatur for mus inden for en given genotype ved at beregne gennemsnittet af anfaldstærskeltemperaturen for alle mus (noteret i trin 3.7) i den genotype, der udviser varmeinducerede anfald.
- Mens du stadig er blind for identiteten og genotypen, skal du afspille videooptagelserne af hver af musen under den varmeinducerede anfaldsanalysescreening på en computerskærm for at score sværhedsgraden af anfaldskampe.
- Giv score til individuel mus, der udviser varmeinduceret anfaldsadfærd ved hjælp af den modificerede Racine-skala13 som beskrevet i tidligere undersøgelser13,14. Se tabel 1 for at få flere oplysninger.
- Hvis en mus, mens den oplever varmeinducerede anfald, kun viser hovedet nikkende, skal du give den en score på 2. Hvis en mus starter en anfaldsepisode med hovedet, der nikker, men også udviser forbenklonus, falder over og / eller hopper, giver den en score på 5.
- Optag den maksimale score for hver mus ved hjælp af den ændrede Racine-skala13 som beskrevet ovenfor.
- Plot en scatter graf over maksimale Racine scores udstillet af alle mus i en given genotype.
- Statistisk sammenligne maksimale Racine score blandt forskellige musegrupper som en metode til at bestemme sværhedsgraden af adfærdsmæssige anfald såsom varmeinducerede anfald.
BEMÆRK: Racine scores er nyttige til at sammenligne anfaldskarakteristika mellem forskellige mutante musegrupper eller genotyper. Det forventes, at vildtypemusene ikke vil gennemgå varmeinducerede anfald og ikke behøver at komme i betragtning til sammenligninger af Racine-score. - Baseret på eksperimentelt design skal der udføres passende statistisk analyse for at afgøre, om procentdelen af mus, der udviser anfald mellem vildtype- og mutantmus, og deres gennemsnitlige anfaldstærskeltemperaturværdier er signifikant forskellige fra hinanden.
| Racine Score | Beslaglæggelse egenskaber | ||
| 0 | Ingen anfald | ||
| 1 | Mund- og ansigtsbevægelser | ||
| 2 | Hovedet nikker | ||
| 3 | Forben clonus, normalt et lem | ||
| 4 | Forben clonus med opdræt | ||
| 5 | Generaliseret tonisk-klonisk anfald, opdræt, hoppe, falde over | ||
Tabel 1: Racine scores.
Representative Results
Dyremodeller med feberkrampelsesmutationer forventes at gennemgå varmeinducerede anfald ved forhøjede kropstemperaturer, der ikke fremkalder anfald hos vildtypekuldkammeraterne. SCN1A-mutationer har været forbundet med feberkramper, herunder K1270T GEFS+-patienter, der udviser både febrile og afebrile generaliserede anfald7. Vi screenede CRISPR-genererede SCN1A K1270T GEFS+ mutante mus, der for nylig blev beskrevet i en undersøgelse14 for forekomsten af varmeanfald i to genetiske baggrunde - anfaldsresistente 129X1 / SvJ (129X1) og anfaldsfistente C57BL / NJ (B6N) baggrunde. Aldersmatchede vildtypekuldskammerater i musevarmekammeret, som ikke har nogen GEFS+-mutationer og derfor ikke forventes at udvise varmeinducerede anfald, fungerede som kontrolgruppe. Hastigheden af kropstemperaturændringen over tid blev evalueret ved at plotte den gennemsnitlige kropstemperatur for mus, der blev registreret hvert minut under analysen. Der var ingen forskel i hastigheden af ændring af kropstemperaturen mellem heterozygote mutante mus og vildtypekuldkammerater testet i respektive 129X1 og B6N genetiske baggrunde (figur 2B,C). Dette tyder på, at termoregulering ikke ændres i K1270T GEFS+ heterozygote mutante mus.
Alle heterozygote mutante mus fra 129X1 (n = 15) eller B6N (n = 9) genetiske baggrunde udviste varmeinducerede anfald (figur 2D). Ingen af vildtypemusene i den 129X1 berigede baggrund (n = 13) udviste varmeinducerede anfald (figur 2D). I modsætning hertil udviste en tredjedel af de testede mus (n = 3 ud af de 9 mus) i den anfaldsfølsomme B6N-baggrund varmeinducerede anfald. Statistisk sammenligning viser, at procentdelen af heterozygote mutante mus, der udviste varmeinducerede anfald, var signifikant højere end deres respektive vildtype-modstykkemus i både 129X1- og B6N-genetiske baggrunde (figur 2D, Fishers nøjagtige test, 129X1 p < 0,0001; B6NJ p = 0,009). Den gennemsnitlige anfaldstærskeltemperatur mellem de heterozygote mutante mus i 129X1 og B6N genetisk baggrund var ens. 129X1 mutante mus har en gennemsnitlig anfaldstærskeltemperatur på 42,6 ± 0,20 °C, hvilket ikke var signifikant forskelligt fra den gennemsnitlige anfaldstærskeltemperatur på 42,7 ± 0,06 °C set hos B6N-mus (figur 2E; tohalet uparret Student's t-test, p = 0,782). Det er vigtigt at bemærke, at den gennemsnitlige anfaldstærskeltemperatur for tre B6N-vildtypemus, der udviste varmeinducerede anfald, var 43,7 ± 0,08 °C og signifikant højere end den gennemsnitlige anfaldstærskel på 42,7 ± 0,06 °C vist af B6N heterozygote mutante mus (figur 2E, tohalet uparret Student's t-test, p < 0,0001).
Plexiglasfronten i kammeret gør det muligt at lave kontinuerlige videooptagelser under analysen, der senere kan bruges til at score for anfaldets sværhedsgrad hos hver mus på en modificeret Racine-skala som beskrevet tidligere14,20. Under et typisk assay ville heterozygote mutante mus vise varmeinducerede anfald med vokalisering og / eller hovednikken (Racine score 2) og hurtigt overgå til forbenklous, falde på siden, hoppe, bagbensforlængelse og / eller generaliserede toniske / kloniske anfald (Racine scorer 3-5), når kropstemperaturen nåede ca. 42 ° C. Den maksimale Racine-score repræsenterer den mest alvorlige varmeinducerede anfaldsadfærd blandt de mutante mus. Den maksimale racin-score for heterozygote mutante mus i 129X1 beriget baggrund (n = 15) adskiller sig ikke fra heterozygote mutante mus i B6N (n = 9) genetisk baggrund (figur 2F; Mann-Whitney test, p > 0,9999). Dette tyder på, at varmeinducerede anfaldsadfærdsegenskaber hos K1270T GEFS + mutante mus er uafhængige af stammebaggrund.
Samlet set viser dataene, at alle mutante mus udviser varmeinducerede anfald med samme frekvens, anfaldstærskeltemperatur og adfærdsmæssig anfaldssværhedsgrad på en belastningsinafhængig måde. De fleste vildtlevende kuldkammerater udviser ikke sådanne anfald ved eller under 44 °C. Omkring en tredjedel af vildtypekontrolmusene i en anfaldsfølsom B6N-baggrund viste varmeinducerede anfald (muligvis på grund af genetiske baggrundseffekter), men anfaldstærskeltemperaturen var signifikant højere sammenlignet med mutante mus i samme baggrund. Disse resultater tyder på, at mutante mus i B6N genetisk baggrund er modtagelige for varmeinducerede anfald ved lavere temperaturtærskler på grund af SCN1A GEFS + mutationen, de har. Ved hjælp af denne protokol kan man således evaluere varmeinducerede anfald hos epilepsimutantmus og skelne fra vildtype kuld mate mus, som enten ikke gennemgår varmeinducerede anfald eller viser varmeanfald ved signifikant højere temperaturer.
Figur 2: Mutante mus udviser varmeinducerede anfald. (A) Opvarmningsprotokollen til adfærdsmæssig screening af varmeinducerede anfald hos mus. (B-C) Gennemsnitlig kropstemperatur for mus over tid i vildtype (Scn1a+/+ - sorte trekanter) og heterozygote mutante (Scn1aKT/+ - orange cirkler) mus med to genetiske baggrunde henholdsvis 129X1 og B6N. D) Procentdel af mus, der viser varmeinducerede anfald i begge genetiske baggrunde. Vildtype (Scn1a+/+) og heterozygote (Scn1aKT/+) mus er repræsenteret af henholdsvis sorte og orange bjælker. Heterozygote mutanter i 129X1 og B6N baggrunde er vist i henholdsvis orange faste søjler og orange søjler med sorte striber. (E) Beslaglæggelsestemperaturtærskel for varmeinducerede anfald hos vildtype (Scn1a+/+) og heterozygote mutante (Scn1aKT/+) mus i begge stammer. (F) Spredningsfordeling af maksimale racine-scorer af varmeinducerede anfald udvist af heterozygote (Scn1aKT/+) mus i begge genetiske baggrunde. Hver dot repræsenterer maksimal Racine-score i en enkelt mus. Antallet af dyr i hver genotype er vist i parentes. Data vist i panel B-F er gennemsnitlige ± S.E.M. Dette tal er modificeret fra figur 3 i Das et al., 2021, eNeuro14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Vi beskriver en enkel og effektiv protokol til at screene for forekomst af varmeinducerede anfald hos mus, den adfærdsmæssige ækvivalent af feberkramper hos humane patienter. Assayet evaluerer flere parametre - herunder procentdelen af mus, der viser anfald, anfaldstærskel, sværhedsgraden af anfald på en Racine-skala, for at sammenligne følsomheden af kontrol- og testmusgrupper til stigninger i kropstemperaturen.
Et kritisk trin i denne protokol indebærer at øge varmen i kammeret, mens musens kropstemperatur løbende overvåges. Det er bydende nødvendigt, at den maksimale kropstemperatur, musene vil opleve i disse analyser, er 44 °C, fordi vildtypedyr kan gennemgå varmeinducerede anfald ved kropstemperaturer >44 °C. Forbehandling med generel anæstesi eller smertestillende midler kan reducere dyrenes kropstemperatur eller forstyrre termoreguleringen, hvilket igen ville forvirre indsamlingen af data om anfaldstærskeltemperaturen. Således kunne mus under denne screeningsprotokol ikke forsynes med disse midler i løbet af 30 minutters forsøgsvinduet. Alle procedurer skal godkendes af institutionens IACUC-udvalg. For at sikre kontinuerlig overvågning af musens kernekropstemperatur under analysen skal du tape den rektale temperatursonde sikkert til musens hale. Hvis musens kropstemperatur under analysen viser sig at forblive uændret i længere perioder, selv efter at have øget temperaturen i musekammeret, skal du sørge for, at den rektale temperatursonde ikke er kommet ud af musen eller er fastgjort løst til halen.
Musemodellernes genetiske baggrund kan påvirke følsomheden over for SCN1A-mutationen og farmakologisk inducerede anfald18,25,26,27. Som diskuteret i resultaterne ovenfor kan musenes genetiske baggrund påvirke deres modtagelighed for varmeinducerede anfald. Scn1a K1270T GEFS+ mutante mus blev testet med to genetiske baggrunde - 129X1 og B6NJ, og en lille procentdel af vildtypemus (33 %) i den anfaldsfølsomme B6NJ-baggrund blev også observeret at gennemgå varmeinducerede anfald. I sammenligning med de heterozygote mutante Scn1aKT/+-mus oplevede B6NJ-vildtypemusene imidlertid varmeinducerede anfald ved en signifikant højere temperaturtærskel. Dette bekræfter, at den genetiske mutation (Scn1a K1270T), der blev introduceret ved CRISPR-knock-in, gør de mutante mus mere modtagelige for hypertermi-inducerede anfald.
Der er flere fordele ved at vedtage denne protokol, som er opsummeret nedenfor. For det første giver en temperaturstyret tvungen luft, der er oprettet i et lukket rum, i modsætning til brugen af strøm af tør luft eller opvarmede lamper eksperimentatoren mere kontrol over opvarmning af testarenaen med en ønsket hastighed. Trinene i opvarmningsprotokollen kan let ændres for at øge / mindske starttemperaturen, varigheden af hvert trin osv. For at screene ældre mus, der er tungere eller større gnavere, såsom rotter. For det andet giver kontinuerlig overvågning af musens kropstemperatur via den vedhæftede rektale sonde værdifuld information om hastigheden af kropstemperaturændringen i den enkelte mus gennem hele analysen. Dette gør det muligt for forsøgsdyrkeren nøje at observere, at musens temperaturændringshastighed ikke overstiger 0,25-0,5 °C/min (hvilket kan være stressende for dyrene), når denne protokol tilpasses til andre testarenaer. Det er vigtigt, at hastigheden af ændring af kropstemperaturen over tid i forskellige musegrupper kan kaste lys over deres evne til at termoregulere og kan være nyttigt at forstå, om feberkramper, der forårsager mutationer, også ændrer termoregulering hos mus. For det tredje sikrer kontinuerlig kropstemperaturovervågning, at målingerne af anfaldstærskeltemperaturen ved hjælp af denne protokol er nøjagtige, da de registreres samtidig med det første anfald, som musen oplevede. Hvis dyrets kropstemperatur ikke overvåges kontinuerligt, eller hvis anfaldstærskeltemperaturen måles efter at dyret er taget ud af testarenaen, kan anfaldstærskelværdierne variere på grund af den tid, det tager at håndtere musene efter anfald. Endelig omgår denne metode behovet for at anvende invasive metoder til at fremkalde feber (ved at injicere patogener) hos mus for at efterligne feberkramper hos humane patienter.
En af begrænsningerne ved denne protokol er, at det er vanskeligt at screene unge (mindre end P30 i alderen) mus for varmeinducerede anfald. Protokollen blev udviklet til at screene for følsomhed hos voksne mus (P30-P40 og derover) over for varme- eller hypertermi-inducerede anfald. Efter vores erfaring er de yngre vildtypemus, især dem, der vejer under 15 g, mere tilbøjelige til at gennemgå varmeinducerede anfald, hvilket kan skyldes underudviklede termoreguleringsmekanismer, fysiologisk termisk stress eller en kombination af begge. Derfor er det ikke ideelt at udføre den varmeinducerede anfaldsskærm på unge mus ved hjælp af denne protokol.
Fremtidige undersøgelser, der kombinerer EEG-overvågning, mens musen udsættes for varmeinducerede anfald, kan kaste lys over EEG-anfaldsmønstre af varmeinducerede anfald, svarende til en tidligere undersøgelse19. Neuronal aktivitet i bestemte områder i musehjernen kan spores ved at kombinere optogenetiske tilgange og immunhistokemibaserede undersøgelser efter høst af hjernevævet. Virkningerne af restriktive diæter såsom keto-diæt på reduktion af feberkramper kan også evalueres ved at udsætte keto-fodrede mus og normale chow-fodrede mus for varmeinduceret anfaldsprotokol. Tilsvarende kan epilepsilægemiddelscreeningsparadigmer udvikles til at teste og identificere kandidat anti-epileptiske lægemidler, der lindrer eller undertrykker varmeinducerede anfald hos lægemiddelfodrede eller behandlede mus sammenlignet med køretøjsfodrede eller kontrolmus.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Connor J. Smith for hans hjælp med at bygge det tilpassede musevarmekammer. Vi anerkender hjælp fra O'Dowd-laboratoriemedlemmer, Lisha Zeng og Andrew Salgado til standardisering af opvarmningsprotokollen i de tidlige stadier af assayudviklingen. Vi takker også Danny Benavides og Kumar Perinbam for videooptagelse af dele af den eksperimentelle procedure for manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIH-bevillingen (NS083009), der blev tildelt D.O.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axial fan | Farnam | AF20-200-120-xx10-3.1 | Farnam custom products -Axial Fan Heater with Fan |
| Digital temperature controller | Inkbird | ITC-100RH | Inkbird digital PID temperature controller ITC-100RH with K thermocouple |
| Mouse rectal temperature probe | ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc | RET-3 | Mouse rectal temperature probe with thermometer |
References
- Hirtz, D., et al. How common are the 'common' neurologic disorders. Neurology. 68, 326-337 (2007).
- Catterall, W. A. Sodium Channel Mutations and Epilepsy. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies. , Center for Biotechnology Information. US. Internet (2012).
- Mantegazza, M., Broccoli, V. SCN 1A /Na V 1.1 channelopathies: Mechanisms in expression systems, animal models, and human iPSC models. Epilepsia. 60, (2019).
- Stafstrom, C. E. Persistent Sodium Current and Its Role in Epilepsy. Epilepsy Currents. 7, 15-22 (2007).
- Schutte, S. S., Schutte, R. J., Barragan, E. V., O'Dowd, D. K. Model systems for studying cellular mechanisms of SCN1A-related epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115, 1755-1766 (2016).
- Wei, F., et al. Ion Channel Genes and Epilepsy: Functional Alteration, Pathogenic Potential, and Mechanism of Epilepsy. Neuroscience Bulletin. 33, 455-477 (2017).
- Abou-Khalil, B., et al. Partial and generalized epilepsy with febrile seizures plus and a novel SCN1A mutation. Neurology. 57, 2265-2272 (2001).
- Zhang, Y. -H., et al. Genetic epilepsy with febrile seizures plus: Refining the spectrum. Neurology. 89, 1210-1219 (2017).
- Patterson, K. P., et al. Enduring memory impairments provoked by developmental febrile seizures are mediated by functional and structural effects of neuronal restrictive silencing factor. Journal of Neuroscience. 37, 3799-3812 (2017).
- Rossi, M. A. SCN1A and febrile seizures in mesial temporal epilepsy: An early signal to guide prognosis and treatment. Epilepsy Currents. 14, 189-190 (2014).
- Zhang, Y., et al. Altered gut microbiome composition in children with refractory epilepsy after ketogenic diet. Epilepsy Research. 145, 163-168 (2018).
- Meng, H., et al. The SCN1A mutation database: Updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype. Human Mutation. 36, 573-580 (2015).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Das, A., et al. Interneuron dysfunction in a new mouse model of SCN1A GEFS. eNeuro. , (2021).
- Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigations. 123, 1798-1808 (2013).
- Martin, M. S., et al. Altered function of the SCN1A voltage-gated sodium channel leads to gamma-aminobutyric acid-ergic (GABAergic) interneuron abnormalities. Journal of Biological Chemistry. 285, 9823-9834 (2010).
- Rubinstein, M., et al. Dissecting the phenotypes of Dravet syndrome by gene deletion. Brain. 138, 2219-2233 (2015).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nature Neuroscience. 9, 1142-1149 (2006).
- Dutton, S. B. B., et al. Early-life febrile seizures worsen adult phenotypes in Scn1a mutants. Experimental Neurology. 293, 159-171 (2017).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Oakley, J. C., Cho, A. R., Cheah, C. S., Scheuer, T., Catterall, W. A. Synergistic GABA-enhancing therapy against seizures in a mouse model of Dravet Syndrome. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 345, 215-224 (2013).
- Ricobaraza, A., et al. Epilepsy and neuropsychiatric comorbidities in mice carrying a recurrent Dravet syndrome SCN1A missense mutation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Warner, T. A., Liu, Z., Macdonald, R. L., Kang, J. -Q. Heat induced temperature dysregulation and seizures in Dravet Syndrome/GEFS+ Gabrg2+/Q390X mice. Epilepsy Research. 134, 1-8 (2017).
- Eun, B. -L., Abraham, J., Mlsna, L., Kim, M. J., Koh, S.
- Miller, A. R., Hawkins, N. A., McCollom, C. E., Kearney, J. A. Mapping genetic modifiers of survival in a mouse model of Dravet syndrome. Genes Brain and Behavior. 13, 163-172 (2013).
- Mistry, A. M., et al. Strain- and age-dependent hippocampal neuron sodium currents correlate with epilepsy severity in Dravet syndrome mice. Neurobiology of Disease. 65, 1-11 (2014).
- Ogiwara, I., et al. Nav1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation. Journal of Neuroscience. 27, 5903-5914 (2007).
