Summary
מטרת השיטה היא לסנן היפרתרמיה או התקפים הנגרמים בחום במודלים של עכבר. הפרוטוקול מתאר את השימוש בתא שנבנה בהתאמה אישית עם ניטור רציף של טמפרטורת הגוף כדי לקבוע אם טמפרטורת הגוף הגבוהה מובילה להתקפים.
Abstract
מודלים מהונדסים של עכברים הוכיחו את עצמם ככלים רבי עוצמה בחקר היבטים שונים של הפרעות נוירולוגיות אנושיות, כולל אפילפסיה. אפילפסיות גנטיות הקשורות SCN1A כוללות קשת רחבה של הפרעות פרכוסים עם חרטה חלקית ושונות קלינית. מוטציות SCN1A יכולות לגרום למגוון גדול של פנוטיפ התקפים החל מהתקפי חום פשוטים ומוגבלים עצמית (FS), אפילפסיה גנטית ברמה בינונית עם התקפים חום חום בתוספת (GEFS+) לתסמונת דרבט חמורה יותר (DS). למרות FS נראים בדרך כלל אצל ילדים מתחת לגיל 6-7 שנים שאין להם אפילפסיה גנטית, FS ב GEFS + חולים ממשיכים להתרחש לבגרות. באופן מסורתי, FS ניסיוני הושרה בעכברים על ידי חשיפת החיה לזרם של אוויר יבש או מנורות חימום, ואת קצב השינוי בטמפרטורת הגוף הוא לעתים קרובות לא נשלט היטב. כאן, אנו מתארים תא חימום שנבנה בהתאמה אישית, עם חזית זכוכית פלסטית, המצויד בבקר טמפרטורה דיגיטלי ומאוורר חשמלי מצויד בתנור, אשר יכול לשלוח אוויר מאולץ מחומם לזירת הבדיקה באופן מבוקר טמפרטורה. טמפרטורת הגוף של עכבר להציב בתא, במעקב באמצעות בדיקה רקטלית, ניתן להגדיל ל 40-42 °C (40 °F) באופן לשחזור על ידי הגדלת הטמפרטורה בתוך התא. ניטור חזותי מתמשך של בעלי החיים במהלך תקופת החימום מדגים אינדוקציה של התקפים הנגרמים על ידי חום בעכברים הנושאים מוטציה FS בטמפרטורת גוף שאינה מעוררת התקפים התנהגותיים אצל בני זוג המלטה מסוג בר. ניתן להסיר בעלי חיים בקלות מהתא ולהניח אותם על כרית קירור כדי להחזיר במהירות את טמפרטורת הגוף לנורמלית. שיטה זו מספקת פרוטוקול סינון פשוט, מהיר וניתן לשחזור להתרחשות של התקפים הנגרמים על ידי חום במודלים של עכבר אפילפסיה.
Introduction
אפילפסיה, המשפחה הרביעית בשכיחותה של הפרעות נוירולוגיות בארצות הברית1, מאופיינת בחוסר איזון של דחף סינאפסות ומעכב במערכת העצבים המרכזית שמוביל להתקפים חוזרים ונשנים. התקפים חום (FS) או התקפים הקשורים לחום יכולים להתרחש באוכלוסייה הכללית, לרוב אצל ילדים כבר בגיל 3 חודשים עד גיל 6 -7. עם זאת, אצל אנשים מסוימים עם מוטציות גנטיות, לרוב בגן ערוץ נתרן, FS יכול להתמיד מעבר לגיל 7 שנים לבגרות. מצב זה נקרא התקפים חום בתוספת או FS +. התקדמות מהירה ברצף הגנום זיהתה מעל 1,300 מוטציות בגן ערוץ הנתרן-יון האנושי SCN1A, מה שהופך אותו לנקודה חמה למוטציות אפילפסיה. מוטציות SCN1A קושרו לספקטרום רחב של הפרעות פרכוסים, כולל התקפים חום (FS), אפילפסיה גנטית עם התקפים חום בתוספת (GEFS +), ותסמונת Dravet (DS)2,3,4,5,6. כ-20% מהמוטציות של SCN1A מובילות ל-GEFS+5,7,8. היסטוריה של ילדים של FS מורכב או ממושך בילדות יכול להתפתח לאחר מכן לצורות מתישה יותר של אפילפסיה כגון אפילפסיה האונה הטמפורלית (TLE)9,10,11. תסמונת Dravet מתעוררת עקב מוטציות חיתוך או אובדן מוטציות תפקוד ב SCN1A והוא צורה חמורה של אפילפסיה עקשנית, עם תחילת הילדות של התקפים חום המתפתחים להתקפים עקשן, והוא קשור לעתים קרובות עם ליקויים קוגניטיביים, התפתחותיים, ומוטוריים2,5,12 . מאז אנשים רבים עם GEFS + ו/או DS להפגין התקפים חום, זה הופך להיות הכרחי לפתח טיפולים חדשניים כדי להילחם טוב יותר בהפרעות פרכוסים אלה.
מודלים בעלי חיים של אפילפסיה הקשורים SCN1A הוכיחו שלא יסולא בפז באפיון סוגים שונים של התקפים (חום לעומת כללי) וניתוח המנגנון העצבי של יצירת פרכוסים13,14,15,15,16,17,18. בעוד המחקר של התקפים ספונטניים באמצעות הקלטות EEG / EMG במוחות מכרסמים מבוסס היטב והוא כלי שימושי מאוד, רק מחקרים מעטים ניסו לחקות התקפים חום במודלים עכבר14,16,16,19,20,21,22,23 . מחקרים קודמים השתמשו סילון של אוויר יבש מחומם, או גליל מתקרילט מצויד במערכת תרמית, או מנורות חום עם בקר טמפרטורה בזירות בדיקה סגורות9,16,21,22,23,24 כדי לגרום להתקפים באמצעות היפרתרמיה. על מנת להגביר את טמפרטורת הגוף בסביבה מבוקרת יותר, הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בתא שנבנה בהתאמה אישית עם מערכת חימום מבוקרת טמפרטורה המאפשרת קצבי עלייה לשחזור בטמפרטורת הגוף של עכבר בתוך התא. תא החום נבנה מעץ (אורך 40 ס"מ x רוחב 34 ס"מ x גובה 31 ס"מ) והיה מצויד בבקר טמפרטורה דיגיטלי עם תרמי K. מאוורר צירי קטן המצויד בתנור בלוח האחורי של התא מכוון אוויר מחומם לחדר המווסת על ידי בקר טמפרטורה דיגיטלי. מערכת חימום אוויר כפויה זו מאפשרת לשלוט בקצב שבו טמפרטורת התא עולה. (איור 1א,ב). תרמי K הממוקם בתוך תא החום מעץ שולח משוב לבקר הטמפרטורה הדיגיטלי, כדי לשמור על טמפרטורות קבועות בתוך הקופסה במהלך הבדיקה. הגדרת הטמפרטורה בבקר הטמפרטורה הדיגיטלי מאפשרת למאוורר החשמלי לשלוח אוויר מאולץ מחומם דרך פתחי אוורור כדי לחמם באופן אחיד את התא (איור 1A). הלוח הקדמי של תא החום הוא יריעת פרספקס ברורה כדי לאפשר הקלטת וידאו קלה של הניסויים.
עכברים בוגרים (P30-P40), הטרוזיגוס למוטציה שגויה ב- SCN1A הגורמת ל- GEFS+ ומספר שווה של בני זוג המלטה מסוג בר לשמש כקבוצת הביקורת, נבחרו לכל ניסוי. בעלי חיים, הן זכר והן נקבה, בשימוש במחקרים אלה שקלו לפחות 15 גרם כמו עכברים מסוג בר במשקל פחות היו רגישים יותר התקפים הנגרמים בחום מאשר בעלי חיים כבדים יותר באותו גיל. במחקר הפיילוט נצפו עכברים מוטנטיים ופראיים מחפשים את הפינות הקרירות יותר של התא מאחור ונשארו שם לפרקי זמן ממושכים. כדי לעקוף זאת, גודל הרצפה האפקטיבי בתוך זירת הבדיקות של תא החום צומצם לאורך 16.5 ס"מ x רוחב 21.5 ס"מ x גובה 27.5 ס"מ על ידי הצבת בלוק עץ B (מידות 20 ס"מ x 8 ס"מ x 7.2 ס"מ) בצד ימין של התא (איור 1A). תא החום נבנה מדיקט בעובי 1.9 ס"מ (אורך 40 ס"מ x רוחב 34 ס"מ x גובה 31 ס"מ) מכוסה למינציה לבנה ומצויד בבקר טמפרטורה דיגיטלי עם תרמי K. פני השטח למינציה של קירות התא הוא אטום והוא יכול להיות מחוטא בקלות בין ניסויים על ידי ניגוב עם 70% אתנול. הטמפרטורה של תא החום נקבעה בתחילה על 50 °C (50 °F) וחומם מראש לפחות 1 שעות לפני תחילת הניסוי, כדי להבטיח חימום אחיד בתוך התא. כל עכבר היה מצויד במדחום רקטלי לניטור רציף של טמפרטורת הגוף לאורך כל הניסוי. עכבר בודד הונח בתא בכל פעם והטמפרטורה נשמרה על 50 מעלות צלזיוס בין הדקה הראשונה לדקה העשירית. הטמפרטורה הועלתה אז ל-55 מעלות צלזיוס בדקה ה-11-20, ולבסוף הועלתה ל-60 מעלות צלזיוס בדקה ה-21-30. כתוצאה מכך ניתן לשחזר את קצב העלייה בטמפרטורת גוף העכבר (איור 2A). כל ניסוי הוקלט בווידאו וניתוח התנהגותי נערך במצב לא מקוון.
פרוטוקול החימום יכול להשתנות בקלות כדי לשנות את הטמפרטורה הראשונית של תא החום ואת הקצב כי התא מחומם, אשר בתורו משנה כמה מהר טמפרטורת הגוף של העכבר הוא גבוה במהלך הבדיקה. לפיכך, שיטה זו מספקת גמישות רבה יותר על פני שיטות מסורתיות בהקמת המסכים ההתנהגותיים הכרוכים בהתקפים הנגרמים על ידי חום. פרוטוקול ההתקף המושרה בחום יכול לשמש גם כדי לסנן תרופות אנטי אפילפטיות שהופכות עכברים מוטנטיים עמידים יותר להתקפים הנגרמים על ידי חום או להגדיל את טמפרטורת הסף שבה ההתקפים נצפים. באופן דומה, השפעות מועילות של משטרי דיאטה מגבילים כגון דיאטה קטוגנית על התקפים הנגרמים על ידי חום ניתן לבחון בעכברים רגילים מוזן צ'או לעומת קטו-fed.
איור 1: תיאור תא החום של העכבר שנבנה בהתאמה אישית. (A) הלוח הקדמי של תא החום של עכבר העץ מציג את לוח הבקרה הצדדי המכיל מתג הפעלה/כיבוי של Power שמפעיל בקר טמפרטורה דיגיטלי, פלקס שכפול K, מתג הפעלה/כיבוי של מחמם מאווררים ומחוון חום. הממדים החיצוניים של התיבה וזירת הבדיקה הפנימית מוצגים בס"מ. בלוק עץ B המשמש להפחתת משטח זירת הבדיקה ביעילות מוצג גם. החלק התחתון של זירת הבדיקה מכוסה במיטות קלח כדי למנוע מעכברים לבוא במגע ישיר עם משטחי עץ מחוממים. (B) הלוח האחורי של תא החום מציג את המאוורר המותקן על פתח האוורור העליון ואת כבל החשמל כדי לספק חשמל לתא. נתון זה משתנה מאיור 3 בדאס ואח', 2021, eNeuro14. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה, אירווין.
1. הכנה לבדיקת ההתקף הנגרמת על ידי חום
- הפעל את לחצן ההפעלה בתא החום ולאחריו לחצן ההפעלה .
- הגדר את הטמפרטורה של תא החום על 50 °C (50 °F) באמצעות לוח המקשים בבקר הטמפרטורה הדיגיטלי.
- המתן למינימום של שעה אחת כדי לחמם מראש את התא בטמפרטורה של 50 °C (50 °F) לפני החדרת העכבר הראשון לתוך התא. חימום מראש מבטיח חימום אחיד בתוך התא.
- מרפדים את רצפת תא החום של העכבר עם מצעים לקלח.
- התקן מצלמת הקלטת וידאו מול תא החום להקלטת כל משפט בדיקת תפיסה הנגרמת על ידי חום.
- מרפדים צלחת פטרי בקוטר 140 מ"מ בשכבות עבות של נייר טישו ומניחים אותה על קרח כדי לשמש כרית קירור.
הערה: בסוף הבדיקה, עכבר בודד יועבר על כרית הקירור prechilled כדי לעזור להוריד את טמפרטורת הגוף הגבוהה שלהם.
2. הכנת העכבר לבדיקת התקפים הנגרמת על ידי חום
- בחר 10 עכברים בוגרים (P30-P40), 5 הנושאים את האפילפסיה הגורמת למוטציה ו -5 של בני זוג המלטה מסוג בר לבדיקת הקרנת התקפים הנגרמת בחום.
הערה: עכברים מסוג בר, שאינם מחסים כל אפילפסיה הגורמת למוטציה אינם מפגינים התקפים הנגרמים על ידי חום בטמפרטורות מתחת ל -44 °C (60 °F) ומשמשים כקבוצת הביקורת. - שקול כל עכבר שישמש לבדיקת ההקרנה ולתעד את משקל גופו. רק עכברים במשקל 15 גרם או יותר צריכים לשמש לבדיקה.
- מסך עכבר אחד בכל פעם בתא החום של העכבר.
- להרדים בקצרה את העכבר עבור 10-15 s באמצעות כמה טיפות של איזופלוריין בתחתית צנצנת פעמון.
- מוציאים את החיה מצנצנת הפעמונים ומניחים אותה על מגבת נייר.
- ודא שהעכבר מורדם לחלוטין על-ידי בדיקה שהעכבר אינו מגיב לצביטת בוהן מזיקה.
- מצפים את קצה המתכת של בדיקת הטמפרטורה הרקטלית בחומר סיכה (כגון ג'לי נפט) ומכניסים אותו בעדינות לעכבר בעומק של פחות או שווה ל -2 ס"מ.
- אבטחו את הגשוש הרקטלי לזנב העכבר עם סרט הדבקה, כך שהגשוש לא יצא במהלך הבדיקה.
הערה: לחלופין, מניחים את החיה בקונוס מרסן עכברים ומכניסים את בדיקת הטמפרטורה הרקטלית. אבטח אותו על ידי הדבקה לזנב. - ודא שהגשש הרקטי מחובר למינימטר המציג טמפרטורת גוף פנימית של העכבר.
- מניחים את החיה בכלוב טרי מרופד עם מצעים קלח, כלומר, כלוב ההתאוששות.
- התחל טיימר והמתן 5 דקות. שים לב לעכבר עד שהוא התאושש לחלוטין מהרדמה והעכבר פעיל ומטפח.
- בו זמנית, לפקח על טמפרטורת הגוף הליבה של העכבר עד שהוא מתייצב ב 35-36 °C (50 °F).
- בסוף 5 דקות, שים לב לטמפרטורת הגוף של העכבר. זוהי טמפרטורת הגוף הראשונית בזמן "0" דקות.
הערה: אם טמפרטורת הגוף הליבה של העכבר היא מתחת 35 °C (50 °F), לחכות זמן נוסף עבור החיה להתאושש היפותרמיה הנגרמת על ידי הרדמה. - במהירות, העבר את העכבר הבודד לתא העכבר שחומם מראש. זה מסמן את תחילת הניסוי. רק עכבר אחד מוקרן בזמן נתון.
3. בדיקת התקפים הנגרמת על ידי חום
- לאחר הנחת העכבר בעדינות על רצפת תא החום של העכבר המחומם מראש, סגור את דלת זכוכית הפלסטית והפעל את המצלמה להקלטת וידאו של הניסוי.
- הפעל את שעון העצר. רשום את טמפרטורת הגוף של העכבר מהמדחום הפי הטבעתי במרווחי זמן של דקה אחת למשך הניסוי.
- במרווחי זמן קבועים, להגדיל את הטמפרטורה של תא החום של העכבר כך טמפרטורת הגוף של העכבר עולה בקצב של 0.25-0.5 °C (5 °F ) / דקה.
הערה: עלייה מהירה בטמפרטורת הגוף עלולה להוביל לשבץ חום או למוות ויש להימנע ממנה. - בהתאם לפרוטוקול זה, הגדילו את טמפרטורת תא החום של העכבר ב-5 מעלות צלזיוס כל 10 דקות, כפי שמוצג באיור 2A.
- ב 9.5 דקות, להגדיר את הטמפרטורה של תא החום ל 55 °C (55 °F), כדי לייצב את הטמפרטורה של תא החום ל 55 °C (55 °F) על ידי 10 דקות כפי שמוצג בתצוגת הטמפרטורה הדיגיטלית .
- באופן דומה, להגדיל את הטמפרטורה ל 60 °C (60 °F) ב 19.5 דקות כדי לייצב את הטמפרטורה של תא החום ל 60 °C (60 °F) על ידי 20 ° C (20 °F). כל ניסוי סינון התקפים נמשך 30 דקות.
- אם לעכבר יש התקף (משמיע קול, מראה הנהון ראש, קלונוס קדמי, הרחבה אחורית, נופל על צידו, או חווה עוויתות טוניק / קלוניות כלליות), להקליט את המידע הבא.
- רשום את טמפרטורת הגוף של העכבר במהלך ההתקף (טמפרטורת סף ההתקף) ממדחום הטמפרטורה פי הטבעתי.
- תיעד את מאפייני התנהגות ההתקפים כגון הנהון ראש, clonus קדמי, הארכת גפיים אחוריות, נפילה בצד ו/או התקפי טוניק/קלוניים כלליים (GTCS) המוצגים על ידי העכבר.
- מהר אך בעדינות להרים את העכבר מהתא ולהניח אותו על כרית הקירור מוכן בשלב 1.6.
הערה: אם עכבר חווה התקפים בקנה מידה ראסין 5 ומפגין קפיצות בלתי מבוקרות, זה יכול להיות קשה להרים את החיה מתא החום ומועבר למשטח הקירור בחוץ. עם זאת, התקף חום אופייני נמשך בין 30 s ל 60 s.Thus, העכבר צריך להיות נלקח מתוך תא החום ולשים על כרית הקירור בתוך 60 שניות של תחילת פרק התקף הנגרמת על ידי חום. - המתן לטמפרטורת הגוף של העכבר לרדת 36-37 °C (50 °F), לפני העברתו לכלוב התאוששות. רק עכבר אחד ממוקם בכלוב התאוששות בכל פעם.
הערה: אל תערבב עכברים שעדיין לא שימשו להקרנה הנגרמת על ידי חום עם העכבר שכבר חווה את ניסוי ההתקף המושרה בחום. - בעדינות ובזהירות, לחתוך את הסרט בין זנב העכבר חוט בדיקה רקטלית עם זוג מספריים כדי להסיר את הבדיקה רקטלית מהעכבר.
- נגב את קצה המתכת של הבדיקה הפי הטבעתית עם 70% אלכוהול ומגבוני רקמות רכות כדי לשמור אותו מוכן לניסוי הבא.
- המשך להתבונן בעכבר בכלוב השחזור עד שהוא חוזר לפעילות רגילה (הליכה, טיפוח וכו '), לפני החזרת העכבר לכלוב הבית שלו. פעולה זו מסמנת את סוף ניסוי הניסוי עבור עכבר זה.
- תיעד את מצב החיה לאחר הבדיקה-בחיים והתאושש מפגישת המבחן או מת. התקפים בעצימות גבוהה הכוללים קפיצות בלתי מבוקרות והתקפי טוניק/ קלוניים כלליים יכולים לפעמים לגרום למותו של העכבר.
- אם עכבר אינו חווה התקפים הנגרמים בחום בתוך תקופת התצפית של 30 דקות או שטמפרטורת הגוף של העכבר מגיעה ל -44 °C (60 °F), הסר את העכבר מתא החום והנח על משטח הקירור עד שטמפרטורת הגוף של העכבר חוזרת ל -36-37 מעלות צלזיוס.
- אפס את טמפרטורת תא החום של העכבר ל-50 מעלות צלזיוס ואפשר לו להשתוות עד שטמפרטורת התצוגה בבקר הטמפרטורה הדיגיטלי מראה 50 מעלות צלזיוס.
- שנה את מצעי הקלח בין ניסיונות עכבר בודדים.
- הכן את העכבר הבא לניסיון הקרנה כמתואר בסעיף 2 וחזור על השלבים מסעיף 3.
4. המתת חסד לבעלי החיים
- למרות שרוב בעלי החיים להתאושש לאחר התקפים הנגרמים על ידי חום, מניסיוננו, כמה מהעכברים עוברים SUDEP (מוות בלתי מוסבר פתאומי ב EPilepsy) בכלוב הבית שלהם בתוך 24-48 שעות של התקפים הנגרמים על ידי חום. לאחר סיכום ההקרנה על כל העכברים בנפרד עבור התקפים הנגרמים על ידי חום לאחר ניסוי 30 דקות, להרדים את כל העכברים בהתאם להנחיות IACUC של המוסד.
5. ניתוח נתוני ההתקף הנגרמים מחום
- לאחר השלמת ההקרנה של קבוצת בעלי חיים, לחשב את אחוז העכברים בגנוטיפ נתון המציג התקפים באמצעות הנוסחה הבאה:
- הערך את טמפרטורת סף ההתקפים הממוצעת של עכברים בתוך גנוטיפ נתון על ידי חישוב ממוצע טמפרטורת סף ההתקפים של כל העכברים (המצוין בשלב 3.7) בגנוטיפ זה המציג התקפים הנגרמים על ידי חום.
- בעודו עדיין עיוור לזהות ולגנוטיפ, הפעל מחדש את הקלטות הווידאו של כל אחד מהעכברים במהלך הקרנת בדיקת ההתקף המושרה בחום על מסך מחשב כדי לקבל חומרת התקפי התקף.
- תן ציונים לעכבר בודד המציג התנהגות התקפים הנגרמת על ידי חום באמצעות סולם ראסין שונה13 כפי שתואר על ידי מחקרים קודמים13,14. ראה טבלה 1 לקבלת פרטים.
- אם עכבר, בעודו חווה התקפים הנגרמים על ידי חום, מראה רק הנהון בראש, תן לו ציון של 2. אם עכבר מתחיל פרק התקף עם הנהון ראש אבל גם מציג clonus הקדמי, נופל, ו / או קופץ לתת לו ציון של 5.
- רשום את הניקוד המרבי עבור כל עכבר באמצעות סולם ראסין ששונה13 כמתואר לעיל.
- התווה גרף פיזור של ציוני ראסין מרביים המוצגים על ידי כל העכברים בגנוטיפ נתון.
- מבחינה סטטיסטית להשוות ציוני ראסין מקסימליים בין קבוצות עכבר שונות כשיטה כדי לקבוע את חומרת התקפים התנהגותיים כגון התקפים הנגרמים על ידי חום.
הערה: ציוני ראסין מועילים כדי להשוות מאפייני תפיסה בין קבוצות עכברים מוטנטיות שונות או גנוטיפים שונים. זה צפוי כי העכברים מסוג בר לא יעבור התקפים הנגרמים על ידי חום ולא היה צריך להיחשב עבור השוואות ציון ראסין. - בהתבסס על תכנון ניסיוני, בצע ניתוח סטטיסטי מתאים כדי לקבוע אם אחוז העכברים המציגים התקפים בין עכברים מסוג בר לעכברים מוטנטיים, וערכי טמפרטורת סף התפיסה הממוצעת שלהם שונים באופן משמעותי זה מזה.
| ציון ראסין | מאפייני התקף | ||
| 0 | אין התקפים | ||
| 1 | תנועות הפה והפנים | ||
| 2 | הנהון ראש | ||
| 3 | קלונוס קדמי, בדרך כלל איבר אחד | ||
| 4 | קלונוס פורלימב עם גידול | ||
| 5 | התקף טוניק-קלוני כללי, גידול, קפיצה, נפילה | ||
טבלה 1: ראסין מבקיע.
Representative Results
מודלים של בעלי חיים עם מוטציות התקפים חום צפויים לעבור התקפים הנגרמים בחום בטמפרטורות גוף גבוהות שאינן גורמות להתקפים אצל בני זוג מסוג המלטה הפראית. מוטציות SCN1A קושרו עם התקפים חום, כולל K1270T GEFS + חולים, המציגים הן התקפים כלליים חום והן afebrile afebrile כללית7. הקרננו CRISPR שנוצר SCN1A K1270T GEFS + עכברים מוטנטיים שתוארו לאחרונה במחקר14 להתרחשות של התקפי חום בשני רקעים גנטיים - התקפים עמידים בפני התקפים 129X1 / SvJ (129X1) והתקף רגיש C57BL / NJ (B6N) רקעים. גיל תואם בני זוג המלטה מסוג בר בתא החום של העכבר אשר אינם מכילים מוטציות GEFS + ולכן, אינם צפויים להפגין התקפים הנגרמים על ידי חום, שימש כקבוצת הביקורת. קצב שינוי טמפרטורת הגוף לאורך זמן הוערך על ידי התוויית טמפרטורת גוף ממוצעת של עכברים שנרשמה כל דקה במהלך הבדיקה. לא היה הבדל בקצב השינוי בטמפרטורת הגוף בין עכברים מוטנטיים הטרוזיגוס לבין בני זוג מסוג אשפה פראית שנבדקו ברקעים גנטיים של 129X1 ו-B6N (איור 2B,C). זה מצביע על כך thermoregulation אינו שונה K1270T GEFS + עכברים מוטנטיים הטרוזיגוס.
כל העכברים המוטנטיים ההטרוזיגוסיים מ-129X1 (n = 15) או B6N (n = 9) רקעים גנטיים הציגו התקפים הנגרמים מחום (איור 2D). אף אחד מהעכברים הפראיים ברקע המועשר של 129X1 (n = 13) לא הפגין התקפים הנגרמים בחום (איור 2D). לעומת זאת, שליש מהעכברים שנבדקו (n = 3 מתוך 9 העכברים) ברקע B6N הרגיש להתקף הציגו התקפים הנגרמים על ידי חום. השוואה סטטיסטית מראה כי אחוז העכברים המוטנטיים ההטרוזיגוסיים שהפגינו התקפים הנגרמים על ידי חום היה גבוה משמעותית מהעכברים המקבילים שלהם בסוג הפראי בהתאמה הן ברקע הגנטי של 129X1 והן ברקע הגנטי B6N (איור 2D, הבדיקה המדויקת של פישר, 129X1 p < 0.0001; B6NJ p = 0.009). טמפרטורת סף ההתקף הממוצעת בין העכברים המוטנטיים ההטרוזיגוס ברקע הגנטי של 129X1 ו- B6N הייתה דומה. 129X1 עכברים מוטנטיים יש טמפרטורת סף התקפים ממוצעת של 42.6 ± 0.20 °C (60 °F), אשר לא היה שונה באופן משמעותי מטמפרטורת סף ההתקפים הממוצעת של 42.7 ± 0.06 °C (0.06 °F) נראה בעכברים B6N (איור 2E; מבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג, p = 0.782). חשוב לציין שטמפרטורת סף ההתקפים הממוצעת של שלושה עכברים מסוג B6N שהפגינו התקפים הנגרמים על ידי חום הייתה 43.7 ± 0.08 מעלות צלזיוס וגבוהה משמעותית מסף ההתקפים הממוצע של 42.7 ± 0.06 °C שהוצגו על ידי עכברי מוטציה הטרוזיגוס B6N (איור 2E, מבחן t של סטודנט לא מזווג דו-זנבי, p < 0.0001).
חזית פרספקס של החדר מאפשרת לבצע הקלטות וידאו רציפה במהלך הבדיקה שניתן להשתמש בהן מאוחר יותר כדי להבקיע עבור חומרת ההתקפים בכל עכבר בסולם ראסין שונה כמתואר בעבר 14,20. במהלך בדיקה טיפוסית, עכברים מוטנטיים הטרוזיגוס יציגו התקפים הנגרמים על ידי חום עם ווקאליזציה ו /או הנהון ראש (ציון ראסין 2), ומעבר מהיר לקלונוס קדמי, נופלים בצד, קופצים, הרחבה אחורית, ו / או התקפי טוניק / קלוני כלליים (ציון ראסין 3-5) כאשר טמפרטורת הגוף הגיעה לכ -42 מעלות צלזיוס . ציון ראסין המרבי מייצג את התנהגות ההתקפים החמורה ביותר הנגרמת מחום בקרב העכברים המוטנטיים. הציון המרבי של עכברי מוטציה הטרוזיגוס 129X1 ברקע מועשר 129X1 (n = 15) אינו שונה מעכברים מוטנטיים הטרוזיגוס ב B6N (n = 9) רקע גנטי (איור 2F; מבחן מאן-וויטני, עמ' > 0.9999). זה מצביע על כך שמאפייני התנהגות התקפים הנגרמים מחום בעכברים מוטנטיים K1270T GEFS+ אינם תלויים ברקע המתח.
יחד, הנתונים מראים כי כל העכברים המוטנטיים מציגים התקפים הנגרמים על ידי חום בתדירות דומה, טמפרטורת סף התקפים וחומרת התקפים התנהגותית באופן בלתי תלוי במתח. רוב בני הזוג המלטה בר סוג לא להפגין התקפים כאלה ב או מתחת 44 °C (64 °F). כשליש מעכברי השליטה בטבע ברקע B6N רגיש להתקף אכן הציגו התקפים הנגרמים על ידי חום (אולי בשל השפעות רקע גנטיות) אך טמפרטורת סף ההתקפים הייתה גבוהה משמעותית בהשוואה לעכברים מוטנטיים באותו רקע. תוצאות אלה מצביעות על כך שעכברים מוטנטיים ברקע גנטי B6N רגישים להתקפים הנגרמים על ידי חום בסף טמפרטורה נמוך יותר עקב המוטציה SCN1A GEFS + שהם מחזיקים. לכן, באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להעריך התקפים הנגרמים על ידי חום בעכברים מוטנטיים אפילפסיה ולהבדיל מעכברי בן זוג מסוג אשפה פראית, אשר אינם עוברים התקפים הנגרמים בחום או מציגים התקפי חום בטמפרטורות גבוהות משמעותית.
איור 2: עכברים מוטנטיים מפגינים התקפים הנגרמים מחום. (א) פרוטוקול החימום להקרנה התנהגותית של התקפים הנגרמים על ידי חום בעכברים. (B-C) טמפרטורת גוף ממוצעת של עכברים לאורך זמן בסוגי בר (Scn1a+/+ - משולשים שחורים) ומוטנט הטרוזיגוס (Scn1aKT/+ - עיגולים כתומים) עכברים בשני רקעים גנטיים 129X1 ו- B6N, בהתאמה. (ד) אחוז העכברים המראים התקפים הנגרמים על ידי חום בשני הרקעים הגנטיים. עכברים מסוג בר (Scn1a+/+) והטרוזיגוס (Scn1aKT/+) מיוצגים על ידי פסים שחורים וכתומים, בהתאמה. מוטציות הטרוזיגוס ברקעים של 129X1 ו- B6N מוצגות בברים מלאים כתומים ובפסים כתומים עם פסים שחורים, בהתאמה. (E) סף טמפרטורת התפיסה להתקפים הנגרמים על ידי חום בעכברים מסוג בר (Scn1a+/+) ובמוטציה הטרוזיגוסית (Scn1aKT/+) בשני הזנים. (F) התפלגות פיזור של עשרות ראסין מקסימליות של התקפים הנגרמים בחום המוצגים על ידי עכברים הטרוזיגוס (Scn1aKT/+) בשני הרקעים הגנטיים. כל נקודה מייצגת את ציון ראסין המרבי בעכבר יחיד. מספר בעלי החיים בכל גנוטיפ מוצג בתוך סוגריים. הנתונים המוצגים בחלוניות B-F הם ממוצעים ±-S.E..M. נתון זה משתנה מאיור 3 בדאס ואח', 2021, eNeuro14. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לסנן להתרחשות של התקפים הנגרמים בחום בעכברים, המקבילה ההתנהגותית של התקפים חום בחולים אנושיים. הבדיקה מעריכה מספר פרמטרים - כולל אחוז העכברים המציגים התקפים, סף התקפים, חומרת התקפים בסולם ראסין, על מנת להשוות את הרגישות של קבוצות עכברי בקרה ובדיקה לעלייה בטמפרטורת הגוף.
צעד קריטי בפרוטוקול זה כרוך בהגברת החום בתא תוך ניטור רציף של טמפרטורת הגוף של העכבר. זה הכרחי כי טמפרטורת הגוף המרבית העכברים יחוו בבדיקות אלה הוא 44 °C (65 °F) כי בעלי חיים מסוג בר יכול לעבור התקפים הנגרמים בחום בטמפרטורות הגוף >44 °C (65 °F). טיפול מקדים עם הרדמה כללית או משככי כאבים עשוי להפחית את טמפרטורת הגוף הליבה של בעלי חיים או להפריע thermoregulation, אשר בתורו היה לבלבל איסוף נתוני טמפרטורת סף התקפים. לפיכך, עכברים תחת פרוטוקול סינון זה לא יכלו להיות מסופקים עם סוכנים אלה במהלך חלון הניסיון של 30 דקות. כל ההליכים חייבים להיות מאושרים על ידי ועדת IACUC של המוסד. כדי להבטיח ניטור רציף של טמפרטורת הגוף הליבה של העכבר במהלך הבדיקה, הדבק בבטחה את בדיקת הטמפרטורה הפי הטבעתית לזנב העכברים. אם במהלך הבדיקה, טמפרטורת הגוף של העכבר נמצאה להישאר ללא שינוי במשך פרקי זמן ממושכים גם לאחר הגדלת הטמפרטורה של תא העכבר, להבטיח כי בדיקת הטמפרטורה רקטלית לא יצאה מהעכבר או מחובר באופן רופף לזנב.
רקע גנטי של מודלים עכבר יכול להשפיע על הרגישות למוטציה SCN1A והתקפים הנגרמים פרמקולוגית18,25,26,27. כפי שנדון בתוצאות לעיל, הרקע הגנטי של העכברים יכול להשפיע על הרגישות שלהם להתקפים הנגרמים על ידי חום. Scn1a עכברי מוטציה K1270T GEFS+ נבדקו בשני רקעים גנטיים - 129X1 ו- B6NJ, ואחוז קטן של עכברים מסוג בר (33%) ברקע B6NJ הרגיש להתקף, נצפו גם הם עוברים התקפים הנגרמים מחום. עם זאת, בהשוואה לעכברי Scn1aKT/+ מוטציה הטרוזיגוס, העכברים הפראיים מסוג B6NJ חוו התקפים הנגרמים בחום בסף טמפרטורה גבוה משמעותית. זה מאשר כי המוטציה הגנטית (Scn1a K1270T) שהוצגה על ידי CRISPR נוק-אין הופכת את העכברים המוטנטיים רגישים יותר להתקפים הנגרמים על ידי היפרתרמיה.
ישנם מספר יתרונות של אימוץ פרוטוקול זה, אשר מסוכמים להלן. ראשית, בניגוד לשימוש בזרם של אוויר יבש או מנורות מחוממות, אוויר כפוי מבוקר טמפרטורה שהוקם בתוך חלל סגור מספק לנסיין שליטה רבה יותר על חימום זירת הבדיקה בקצב הרצוי. ניתן לשנות בקלות את השלבים בפרוטוקול החימום כדי להגדיל /להקטין את הטמפרטורה ההתחלתית, משך כל שלב וכו 'כדי לסנן עכברים ישנים יותר שהם מכרסמים כבדים יותר או גדולים יותר כגון חולדות. שנית, ניטור רציף של טמפרטורת הגוף של העכבר באמצעות הבדיקה רקטלית המצורפת, נותן מידע רב ערך על קצב שינוי טמפרטורת הגוף בעכבר בודד, לאורך הבדיקה. זה מאפשר לנסיין להתבונן מקרוב כי קצב שינוי הטמפרטורה בעכבר אינו עולה על 0.25-0.5 ° C / min (אשר עשוי להיות מלחיץ עבור בעלי החיים), בעת התאמת פרוטוקול זה לזירות בדיקה אחרות. חשוב לציין, קצב השינוי בטמפרטורת הגוף לאורך זמן בקבוצות עכברים שונות יכול לשפוך אור על יכולתם thermoregulate יכול להיות מועיל כדי להבין אם התקף חום גרימת מוטציות גם לשנות thermoregulation בעכברים. שלישית, ניטור טמפרטורת גוף רציף מבטיח כי מדידות טמפרטורת סף ההתקף באמצעות פרוטוקול זה מדויקות, שכן הן נרשמות במקביל להתקף ההתקף הראשון שחווה העכבר. אם טמפרטורת הגוף של החיה אינה מנוטרת ברציפות או שטמפרטורת סף ההתקפים נמדדת לאחר הוצאת החיה מזירת הניסוי, ערכי סף התפיסה עשויים להשתנות בהתאם לזמן שנדרש לטיפול בהתקפי פוסט העכברים. לבסוף, שיטה זו עוקפת את הצורך להשתמש בשיטות פולשניות כדי לגרום לחום (על ידי הזרקת פתוגנים) בעכברים כדי לחקות התקפים חום אצל חולים אנושיים.
אחת המגבלות של פרוטוקול זה היא שקשה לסנן עכברים צעירים (פחות מ- P30 בגיל) להתקפים הנגרמים על ידי חום. הפרוטוקול פותח כדי לסנן את הרגישות של עכברים בוגרים (P30-P40 ומעלה) להתקפים הנגרמים על ידי חום או היפרתרמיה. מניסיוננו, עכברי הבר הצעירים יותר, במיוחד אלה השוקלים מתחת ל -15 גרם, נוטים יותר לעבור התקפים הנגרמים על ידי חום, אשר יכול להיות בגלל מנגנוני תרמורגציה מפותחים, מתח תרמי פיזיולוגי, או שילוב של שניהם. לפיכך, אין זה אידיאלי לבצע את מסך ההתקף המושרה בחום על עכברים צעירים באמצעות פרוטוקול זה.
מחקרים עתידיים המשלבים ניטור EEG תוך חשיפת העכבר להתקפים הנגרמים בחום יכולים לשפוך אור על דפוסי התקפי EEG של התקפים הנגרמים על ידי חום, בדומה למחקר קודם19. ניתן לעקוב אחר פעילות עצבית באזורים מסוימים במוח העכבר על ידי שילוב של גישות אופטוגנטיות ומחקרים מבוססי אימונוהיסטוכימיה לאחר קצירת רקמת המוח. כמו כן, ניתן להעריך את ההשפעות של דיאטות מגבילות כגון דיאטה קטוגנית על הפחתת התקפים חום על ידי חשיפת עכברים מוזן קטוגניים ועכברים רגילים המוזנים בצ'או לפרוטוקול תפיסה הנגרמת בחום. באופן דומה, ניתן לפתח פרדיגמות סינון תרופות אפילפסיה כדי לבדוק ולזהות תרופות אנטי-אפילפטיות מועמדות המשפרות או מדכאות התקפים הנגרמים על ידי חום בעכברים הניזונים מסמים או מטופלים בהשוואה לעכברי האכלה או בקרה.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לקונור ג'יי סמית על עזרתו בבניית תא החום המותאם אישית של העכבר. אנו מכירים בסיועם של חברי המעבדה של או'דאוד, לישה זנג ואנדרו סלגאדו לתקנון פרוטוקול החימום בשלבים המוקדמים של פיתוח הבדיקה. אנו מודים גם לדני בנבידס וקומר פרינבאם על הקלטת וידאו חלקים מההליך הניסיוני של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH (NS083009) שהוענק למשרד ההגנה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axial fan | Farnam | AF20-200-120-xx10-3.1 | Farnam custom products -Axial Fan Heater with Fan |
| Digital temperature controller | Inkbird | ITC-100RH | Inkbird digital PID temperature controller ITC-100RH with K thermocouple |
| Mouse rectal temperature probe | ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc | RET-3 | Mouse rectal temperature probe with thermometer |
References
- Hirtz, D., et al. How common are the 'common' neurologic disorders. Neurology. 68, 326-337 (2007).
- Catterall, W. A. Sodium Channel Mutations and Epilepsy. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies. , Center for Biotechnology Information. US. Internet (2012).
- Mantegazza, M., Broccoli, V. SCN 1A /Na V 1.1 channelopathies: Mechanisms in expression systems, animal models, and human iPSC models. Epilepsia. 60, (2019).
- Stafstrom, C. E. Persistent Sodium Current and Its Role in Epilepsy. Epilepsy Currents. 7, 15-22 (2007).
- Schutte, S. S., Schutte, R. J., Barragan, E. V., O'Dowd, D. K. Model systems for studying cellular mechanisms of SCN1A-related epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115, 1755-1766 (2016).
- Wei, F., et al. Ion Channel Genes and Epilepsy: Functional Alteration, Pathogenic Potential, and Mechanism of Epilepsy. Neuroscience Bulletin. 33, 455-477 (2017).
- Abou-Khalil, B., et al. Partial and generalized epilepsy with febrile seizures plus and a novel SCN1A mutation. Neurology. 57, 2265-2272 (2001).
- Zhang, Y. -H., et al. Genetic epilepsy with febrile seizures plus: Refining the spectrum. Neurology. 89, 1210-1219 (2017).
- Patterson, K. P., et al. Enduring memory impairments provoked by developmental febrile seizures are mediated by functional and structural effects of neuronal restrictive silencing factor. Journal of Neuroscience. 37, 3799-3812 (2017).
- Rossi, M. A. SCN1A and febrile seizures in mesial temporal epilepsy: An early signal to guide prognosis and treatment. Epilepsy Currents. 14, 189-190 (2014).
- Zhang, Y., et al. Altered gut microbiome composition in children with refractory epilepsy after ketogenic diet. Epilepsy Research. 145, 163-168 (2018).
- Meng, H., et al. The SCN1A mutation database: Updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype. Human Mutation. 36, 573-580 (2015).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Das, A., et al. Interneuron dysfunction in a new mouse model of SCN1A GEFS. eNeuro. , (2021).
- Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigations. 123, 1798-1808 (2013).
- Martin, M. S., et al. Altered function of the SCN1A voltage-gated sodium channel leads to gamma-aminobutyric acid-ergic (GABAergic) interneuron abnormalities. Journal of Biological Chemistry. 285, 9823-9834 (2010).
- Rubinstein, M., et al. Dissecting the phenotypes of Dravet syndrome by gene deletion. Brain. 138, 2219-2233 (2015).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nature Neuroscience. 9, 1142-1149 (2006).
- Dutton, S. B. B., et al. Early-life febrile seizures worsen adult phenotypes in Scn1a mutants. Experimental Neurology. 293, 159-171 (2017).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Oakley, J. C., Cho, A. R., Cheah, C. S., Scheuer, T., Catterall, W. A. Synergistic GABA-enhancing therapy against seizures in a mouse model of Dravet Syndrome. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 345, 215-224 (2013).
- Ricobaraza, A., et al. Epilepsy and neuropsychiatric comorbidities in mice carrying a recurrent Dravet syndrome SCN1A missense mutation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Warner, T. A., Liu, Z., Macdonald, R. L., Kang, J. -Q. Heat induced temperature dysregulation and seizures in Dravet Syndrome/GEFS+ Gabrg2+/Q390X mice. Epilepsy Research. 134, 1-8 (2017).
- Eun, B. -L., Abraham, J., Mlsna, L., Kim, M. J., Koh, S.
- Miller, A. R., Hawkins, N. A., McCollom, C. E., Kearney, J. A. Mapping genetic modifiers of survival in a mouse model of Dravet syndrome. Genes Brain and Behavior. 13, 163-172 (2013).
- Mistry, A. M., et al. Strain- and age-dependent hippocampal neuron sodium currents correlate with epilepsy severity in Dravet syndrome mice. Neurobiology of Disease. 65, 1-11 (2014).
- Ogiwara, I., et al. Nav1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation. Journal of Neuroscience. 27, 5903-5914 (2007).
