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Cancer Research

절제된 고형 종양 균질화의 미토콘드리아 기능의 분석 적 결정

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62875
Automatic Translation
1,2,3, 1, 2,4, 1,3
1Integrated Physiology and Molecular Medicine Laboratory, Pennington Biomedical Research Center, 2Clinical Oncology and Metabolism, Pennington Biomedical Research Center, 3Department of Nutrition, Case Western Reserve University, 4Department of Clinical Nutrition, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

우리는 신선한 종양 균질화에서 미토콘드리아 산화 인산화 및 전자 전달 용량을 평가하기 위한 실용적인 프로토콜 및 분석 접근법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 암 개시, 진행 및 치료 반응에 기여하는 다양한 미토콘드리아 기능을 조사하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다.

Abstract

미토콘드리아는 에너지 생산, 반응성 산소 종 조절 및 거대 분자 합성을 통해 암의 발병 및 진행에 필수적입니다. 미토콘드리아의 유전적 및 기능적 적응은 종양 환경에 대한 확산 및 전이성 전위 잠재력을 유발합니다. DNA와 RNA 염기서열 분석의 출현은 종양 발생의 유전 중재자의 평가에 중요한 장벽을 제거했습니다. 그러나 현재까지 종양 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 방법론적 접근법은 여전히 애매하며 타당성을 제한하는 기술적 숙련도가 필요하며 궁극적으로 실험 및 임상 설정 모두에서 진단 및 예후 값을 감소시다. 여기서, 우리는 고해상도 호흡법을 사용하여 갓 절제된 고형 종양 균질화에서 산화 인산화(OXPHOS) 및 전자 전달(ET) 용량의 비율을 정량화하는 간단하고 신속한 방법을 간략하게 설명합니다. 프로토콜은 종 및 종양 모형에 걸쳐 재보적으로 적용될 수 있을 뿐만 아니라 미토콘드리아 ET 통로의 다양성을 평가하기 위하여 적응될 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 발광 B 유방암을 가진 마우스가 OXPHOS를 통해 아데노신 삼위산염을 생성하기 위하여 간결한 에 결함이 있는 니코틴아마미드 adenine dinucleotide 연결호흡 및 의존을 전시한다는 것을 보여줍니다.

Introduction

모든 세포는 분자 에너지 통화인 아데노신 트리호스페이트(ATP)를 생산하고 섭취해야 할 필요성에 의해 밀접하게 연결됩니다. 세포 돌연변이가 종양의 형성을 초래함에 따라, 미토콘드리아는 비암조직1,2,3과일반적으로 구별되는 에너지 생산의 다양화를 통해 생존을 보장한다. 이와 같이, 종양 유형, 암 개시, 진행 및 치료 반응의 분류를 용이하게 하기 위해 미토콘드리아 호흡 기능의 신속하고 깊은 프로파일링을 위한 중요한 필요성이 있다.

OXPHOS에 대한 1차 기판은 세포 투과성이 없기 때문에 절제된 조직 표본의 호흡 기능은 그대로 평가될 수 없다. 이러한 한계를 극복하기 위해 미토콘드리아는 절연, 화학 적 투과성 또는 기계적 균질화에 의해 제조 될 수 있습니다. 미토콘드리아 절연은 호흡기 기능의 평가를 위한 금 본위제로 오랫동안 간주됩니다. 그러나, 그것은 조직의 다량을 필요로하고, 시간이 많이 소요되며, 미토콘드리아4의특정 분획에 대한 가능한 선택 편향으로 낮은 항복이다. 과미성화는 플라즈마 멤브레인5를선택적으로 저하시키는 온화한 세제에 대한 조직 섹션 또는 섬유 번들의 기계적 분리 및 노출로 구성된다. 개별 섬유 번들이 따로 놀릴 수 있기 때문에 투과는 골격 및 심장 근육과 같은 현저한 조직에서 자주 사용됩니다. 격리에 비해, 투과성 생성은 그들의 네이티브 세포 환경 및 물리적 양식 5에서 더 많은 미토콘드리아를산출합니다. 과미성비화는 종양6,7 및 태반8과같은 다른 조직에서 성공적으로 적용되었습니다. 그러나, 퍼미빌리화섬유 제제의 재현성은 해부 및 산소 요구 사항의 일관성으로 인해 확산한계를극복하기 위해 어려울 수 있다 9. 추가적으로, 과소 섬유는 조밀하게 세포및 높게 섬유성인 특정 종양 모형에서 부적당할 지도 모릅니다. 조직 균질화는 플라즈마 멤브레인의 기계적 중단을 통해 생성되며 미토콘드리아 수율 및무결성(10)의관점에서 과구 섬유와 유사하다. 조직 균질화는 또한 산소 확산의 한계를 최소화하고 기계적힘(11,12)의최적화를 통해 조직 유형 전반에 걸쳐 용이하게 사용될 수 있다.

여기서, 우리는 신선하게 절제된 고형 종양 균질화에서 산화 인산화(OXPHOS) 및 전자 전달(ET) 용량의 비율을 정량화하는 간단하고 신속한 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 기악 설정 및 교정에 대한 사전 지식이 필요하지만 클라크 형 전극, 해마 분석기 또는 플레이트 판독기를 사용하여 유사하게 조정할 수있는 Oxygraph-2k (O2k) 고해상도 호흡을 사용하여 신선한 조직을 평가하기 위해 최적으로 설계되었습니다. 프로토콜은 종 및 종양 모형에 걸쳐 재보적으로 적용될 수 있을 뿐만 아니라 미토콘드리아 ET 통로의 다양성을 평가하기 위하여 적응될 수 있습니다.

Protocol

동물과 관련된 모든 실험과 절차는 페닝턴 생물 의학 연구 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 시약 준비.

  1. EO771 세포 성장 매체는 10mHEPES, 10% 태아소 혈청(FBS), 1% 페니실린-연쇄상구균(100 U/mL), 0.2% 암포테리신 B를 준비한다.
  2. 1000mL 유리 비커로 생검 보존(BIOPS) 용액 1L을 준비합니다.
    1. Na2ATP (5.77 mM 최종 농도)의 3.180 g을 추가합니다.
    2. MgCL2·6H2O(6.56 mM 최종 농도)의 1.334 g를 추가합니다.
    3. 타우린 2.502 g(최종 농도 20m)를 추가합니다.
    4. Na2인광크레아틴(15mM 최종 농도)의 3.827 g를 추가합니다.
    5. 이미다졸 (20 mM 최종 농도)의 1.362 g를 추가합니다.
    6. 디티오스레이톨(.5mM 최종 농도)의 0.077 g를 추가합니다.
    7. MES 수화물 9.76 g(50mM 최종 농도)를 추가합니다.
    8. H2O의 800mL를 추가하고 30°C에서 자기 교반기로 성분을 혼합합니다.
    9. 100mMK2EGTA(7.23m 최종 농도)의 72.3mL를 추가합니다.
      1. H2O의100mL에 EGTA 7.608 g와 KOH 2.3 g를 녹입니다.
      2. pH를 5M KOH로 7.0으로 조정하고 H2O로최대 200mL의 볼륨을 가져옵니다.
    10. 100mM CaK2EGTA(2.77m 최종 농도)의 27.7mL를 추가합니다.
      1. H2O의200mL에 EGTA 7.608 g를 녹이고 80°C(100mM 최종 농도)로 가열한다.
      2. 뜨거운 100 m EGTA 용액의 200 mL에 CaCO3의 2.002 g를 용해하십시오.
      3. 지속적으로 교반하는 동안, KOH2.3g을 추가하고 7.0으로 pH를 조정합니다.
    11. pH를 23°C(0°C에서 pH 7.1)에서 6.75로 조정하여 5M KOH로 조정합니다. H2O로 최대 980mL의 볼륨을 가져와 용액을 혼합합니다. pH를 다시 한 번 확인하고 필요한 경우 조정하고 최종 볼륨을 최대 1,000mL까지 물로 가져옵니다.
    12. Aliquot BIOPS는 원추형 튜브 (15 mL 또는 50 mL)로 저장하고 사용할 때까지 -20 ° C에 저장합니다. 사용하기 직전에 한 번만 해동하십시오.
  3. 1000mL 유리 비커에 미토콘드리아 호흡 배지(MiR05) 1L을 준비한다.
    1. EGTA 0.190 g(0.5mM 최종 농도)를 추가합니다.
    2. MgCL2·6H2O(3mM 최종 농도)의 0.610 g를 추가합니다.
    3. 타우린 2.502 g(최종 농도 20m)를 추가합니다.
    4. KH2PO4 (10 mM 최종 농도)의 1.361 g를 추가합니다.
    5. HEPES 4.77 g(최종 농도 20m)를 추가합니다.
    6. D-수크로오스 37.65 g(110mM 최종 농도)를 추가합니다.
    7. H2O의 800mL를 추가하고 30°C에서 자기 교반기로 성분을 혼합합니다.
    8. 0.5M 락토바이오닉산(60mM 최종 농도)의 120mL를 추가합니다.
      1. H2O의 100mL에 락토바이오닉산 35.83g을 녹입니다.
      2. pH를 5M KOH로 7.0으로 조정하고 H2O로최대 200mL의 볼륨을 가져옵니다.
    9. 용액을 혼합하고 pH를 5M KOH로 7.1로 조정합니다.
    10. 50mL 원물 튜브에서 본질적으로 지방산이 없는 BSA(1g/L 최종 농도)의 무게1g을 계량합니다. 9단계에서 튜브까지 pH 7.1 용액의 40mL를 넣고 부드럽게 섞어 거품을 피하십시오. 용존BSA를 9단계에서 남은 pH 7.1 용액으로 옮기고 부드럽고 지속적으로 저어줍니다. pH를 다시 한 번 확인하고 필요한 경우 조정하고 H2O로 최종 볼륨을 최대 1000mL까지 가져옵니다.
    11. 50mL 원판 튜브로 MiR05 배지를 알리쿼트하고 사용할 때까지 -20 °C에 저장합니다. 사용하기 직전에 한 번만 해동하십시오.
  4. 기판, 분리기 및 억제제를 준비합니다.
    1. 0.8 M 말레이트 준비: H2O의4mL에 L-Malic acid 536.4 mg을 녹여 서 5M KOH를 pH 7로 중화하고 H2O. 알리쿼트로 나누어 최대 5mL의 부피를 알리쿼트로 나눈 다음 -20 °C에 저장합니다.
    2. 1M 피루바테 준비: 550 mg의 피루빅 산 나트륨 소금을 H2O. 4m L에 5M KOH로 중화하고 H2O.로 최대 5mL의 부피를 알리쿼트에 넣고 -20°C에 보관합니다.
    3. 준비 0.5 M ADP (아데노신 5′-디포스페이트): H2O.의 4mL에 ADP 나트륨 소금 1.068 g을 녹여 5 M KOH로 중화하고 H2O.가 알리쿼트에 나누어 최대 5mL의 부피를 가져온 다음 -20 °C에 저장하십시오.
    4. 준비 2 M 글루타메이트: H2O의8mL에 L-글루타믹 산 모노하이드레이트 3.7426 g를 5M KOH로 중화하고 H2O.로 최대 10mL의 부피를 알리쿼트로 나눈 다음 -20°C에 보관합니다.
    5. 4m 사이토크롬 c준비 : H2O의1mL에 50 mg의 사이토크롬 c를 녹인 다음 -20°C에 보관하십시오.
    6. 준비 1 M Succinate: Succinate 디소나트륨 소금 육각형 의 2.701 g를 H2O. 중화 1 N HCl로 중화하고 H2O. 알리쿼트로 나누어 최대 10mL의 부피를 -20 °C에 저장하십시오.
    7. 1m FCCP(카보닐 시안화-4-(트리플루오로메톡시)페닐하이드라존을 준비하십시오: 순수 에탄올 10mL에 2.54 mg의 FCCP를 용해하십시오. 알리쿼트로 나눈 다음 -20°C에 보관합니다.
    8. 150 μM 로테네네 준비: 10mL의 순수 에탄올에 3.94 mg의 로테네네를 녹여 1mM 스톡을 준비하소서, 소용돌이가 완전히 용해될 때까지 준비한다. 1m 로테네 주식 농도의 225 μL을 순수 에탄올 1.275mL로 희석하여 150 μM 로테네론의 1.5mL를 만듭니다. 빛으로부터 보호하고 알리쿼트로 나눈 다음 -20°C에 보관하십시오.
    9. 준비 125 μM Antimycin A: 11 mg의 안티마이신 A를 순수 에탄올 4mL에 녹여 5mM 의 재고 농도를 3mM 의 5m 의 정량 농도로 희석하여 순수 에탄올의 975 μL을 순에 탄올의 975 μL로 희석하여 0.125 mM 항미암제1m의 1mL를 만들고 C-20°C에서 1mL를 만듭니다.
    10. 0.8 M 아스코르바테 준비: 아스코르바테 나트륨 소금 1.584g을 H2O.8mL에 아스코르브산으로 조정하고 H2O. 빛으로부터 보호, 알리따로 나누어 -20°C로 최대 10mL의 부피를 데우십시오.
    11. 준비 0.2 M TMPD (tetramethyl-p-phenylenediamine): DMSO의 987.5 μL에서 TMPD의 32.85 mg을 용해. 0.8 M 아스코르베이트(아스코르베이트 10mM 최종 농도)의 12.5 μL을 추가합니다. 빛으로부터 보호하고 알리쿼트로 나눈 다음 -20°C에 보관하십시오.
    12. 4M 나트륨 아지드 준비: H2O의10mL에 아지드 나트륨 2.6g을 녹여 알리쿼트로 나누고 -20°C에 보관하십시오.

2. 종양 성장

  1. RPMI 1640 성장 매체에서 EO771 세포를 성장시키고 5% CO2로37°C 가습된 인큐베이터에서 세포를 유지한다.
  2. 단독 4 주 된 여성 C57BL/6J 마우스, 12 h 빛에 21-22 °C에서 유지: 어두운 주기. 생쥐에게 음식과 물에 대한 광고 리비툼 액세스를 제공합니다.
  3. 일단 마우스가 10주에 도달하면 암세포 이식을 위해 세포와 마우스를 준비하십시오.
    1. 세포를 트립시화하고, 성장 매체로 트립신을 비활성화하고, 원심분리기 세포는 실온에서 5분 동안 500 x g로 비활성화합니다. 슈퍼나탈을 흡인시키고 세포 펠릿(필요에 따라)을 미디어에 배부하고 결합한다. trypan blue를 사용하여 실행 가능한 세포를 계산하고 1:1:1 미디어/ 지하 멤브레인 매트릭스/PBS 용액으로 총 60 μL의 부피로 1 x 106 세포의 세포 희석을 준비합니다. 지하 멤브레인 매트릭스가 추가되면 잘 섞어서 세포 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오. 주사기를 60μL의 셀 서스펜션으로 채우고 얼음 위에 놓습니다. 효율적으로 작업하고 준비의 1.5 시간 이내에 마우스에 세포를 주입.
    2. 이소플루란 흡입에 의해 마우스를 마취 (유도에 대한 3 %-5 %, 유지 보수에 대한 1 %-3 %). 오른쪽 4일과 5일 잉게인 유방 땀샘 사이면도. 정형 화 EO771 세포 현탁액과 마취 마우스를 주입.
  4. 전자 캘리퍼를 사용하여 4주 동안 일주일에 두 번 종양 성장을 모니터링하고 측정합니다. 부검에서, 절제, 무게, 다음 종양 (또는 최소 60 mg 종양 섹션)을 즉시 얼음 차가운 생검의 10 mL에 배치합니다. 젖은 얼음에 튜브를 유지합니다.

3. 악기 설정 및 교정

  1. MiR05 배지를 37°C 의 수조에서 데워보시면 됩니다.
  2. Oroboros O2k 시스템을 켜고 DATLAB 소프트웨어를 열고 사용자를 입력하거나 선택합니다. O2k에 연결하려면 클릭하십시오. O2k 구성을 확인하고 올바른 계측기가 Power-O2k에 라벨이 부착되고 각 챔버가 올바른 산소 센서에 해당하는지 확인하십시오. 확인을 클릭합니다. O2k 제어 창이 열리면 시스템 탭 에서 블록 온도를 37 °C로 설정하고, 교반기 속도는 두 챔버에 대해 750 rpm으로 설정하고, ND 데이터 기록 간격을 2.0 s로 설정합니다. 챔버 박스의 교반기 전원과 조명을 모두 확인하십시오. 산소, O2 탭에서 센서에 대한 게인을 1 V/μA로 설정(구기기 모델에 대해 게인을 조정해야 할 수 있음), 편광 전압을 800mV로 설정한 다음 O2k에 연결한 다음 클릭합니다. 새 실험 파일이 열리면 파일이름을 지정하고 저장을 클릭합니다. 실험이 활성화되면 프로토콜 선택 창이 열립니다. 사용자 지정 SUIT(기판 분리억제제 적정)를 실행하려면 취소를 클릭합니다.
  3. 프로토콜 선택을 따라 샘플 창이 열려 실험 코드, 샘플 유형, 코호트, 샘플 코드, 샘플 번호 및 하위 샘플 번호를 입력합니다. mL당 종양 균주 농도를 mg 및 입력하도록 장치를 할당합니다(챔버당 양은 자동으로 채워집니다). 표시된 매체가 MiR05이고 챔버 볼륨이 2.00 mL인지 확인합니다. 하단 상자에 필요에 따라 주석을 추가하고 확인을 클릭합니다.
  4. 스토퍼를 제거하고 챔버에서 70 % 에탄올을 흡인하십시오. 챔버 내부에 노출되는 멤브레인에 가깝게 흡입하지 마십시오. 순수한 물로 네 번 헹구고 2.25 mL의 MiR05로 챔버를 채웁니다.
  5. 센서 테스트: F9을 클릭하여 교반기를 30초 동안 끕드합니다. 교반기 바가 다시 켜지면 O2 경사면이 각 챔버에서 단일 유수 학적으로 빠르게 증가하도록하십시오. 챔버가 센서 테스트에 실패하면 전기 연결을 확인하고 염이 축적된 경우 청소하십시오. 테스트를 반복합니다. 센서가 계속 테스트에 실패하면 편광 산소 센서(POS) 커넥터를 제거하여 멤브레인을 검사합니다. 멤브레인에 가시적 손상이 있으면, 무거운 산화 또는 상당한 기포 축적이 관찰되고, 실험 절차를 중단하고, 계측기 서비스를 진행한다.
  6. 산소 교정: 정확한 호흡 측정을 얻기 위해 산소 교정을 수행합니다.
    1. 비틀기 동작으로 스토퍼를 볼륨 보정 위치에 천천히 삽입합니다. 스토퍼의 우물에서 수집 주입 모세관을 통해 배출 된 과잉 배지에서 사이펀. 비틀기 동작으로 스토퍼를 들어 올려 스토퍼-스페이서 공구에 단단히 맞도록 하여 최종 공기 평형(30-45분)을 위해 액체 상 위에 가스 부피를 남깁니다.
    2. 이 기간 동안 달성된 정상 상태를 사용하여 산소 센서를 보정하여 정확한 호흡 측정을 얻습니다. O2 경사 neg. (산소의 음수 경사)는 0 ± 2 pmol/s/mL입니다. 값이 오후 2pmol/s·mL보다 높으면 챔버를 청소하고 새로 해동된 MiR05로 보충하십시오. 경사가 불안정하면 계측기 서비스로 진행합니다.
    3. 일정한 상태를 달성한 후O2 농도 곡선을 선택하고 시프트 키와 왼쪽 클릭 마우스 버튼을 눌러 곡선의 꾸준한 영역을 강조 표시합니다. 영역이 선택되면 F5를클릭하고 드롭다운 화살표로 공기 교정 마크를 선택하고 교정을 클릭하고 클립보드에 복사합니다.
  7. 기악 배경 보정(선택 사항)
    1. 공기 교정 후 플럭스 배경 평형(~15분)에 대한 액체 상 위에 가스 부피가 없는지 확인하고 챔버를 완전히 닫습니다.
      참고: 이 기간 동안 달성된 정상 상태 속도는 도구 적 배경을 나타내며 결과 데이터에서 빼어 분석 정밀도를 향상시킬 수 있습니다. O2 경사 neg.는 처음에는 약간 증가하고 ± 2에서 4 pmol / s/mL 사이에 고원이 증가합니다.
    2. 값이 높은 경우 (>6 pmol/s·mL), 잠재적인 생물학적 오염이 있다. 이 경우 챔버를 청소하고 갓 해동 된 MiR05로 보충하십시오. 정상 상태가 달성되면 O2 경사 neg. 커브를 선택하고 Shift 키를 누르고 마우스 버튼을 왼쪽 단추를 눌러 곡선의 꾸준한 영역을 강조 표시합니다.
    3. 지역을 선택한 후 F5를클릭하고, 드롭다운 화살표가 있는 기준선 보정 상자와 기준선 표시를 선택하고 확인을 클릭합니다.

4. 종양 균등제 준비

  1. MiR05 1mL이 들어 있는 유리 균질화제와 젖은 얼음위에 단단히 끼우는 유리 유봉을 놓습니다.
  2. 연구 결과의 시간에, 얼음 차가운 페트리 접시에 BIOPS의 1 mL에 조직을 놓습니다.
  3. 조직을 깨끗하고 해부하여 수용성 물질을 최대화하고 괴사 영역을 피하고 한계 종양 조직을 제거합니다. 해부 현미경, 메스, 외과 핀셋을 사용하여 모발, 괴사 조직, 말초 결합 및 혈관 조직 및 인접 지방을 제거하십시오. 해부 동안 얼음 차가운 생검에 종양을 유지 주의하십시오.
  4. 종양을 작은 조각으로 자르고 (각각 ~ 5-10 mg) 나머지 종양 조각을 얼음에 보관한 10 mL의 BIOPS에 다시 놓습니다. 필요한 경우 나중에이 조직을 사용하여 추가 준비를하십시오.
    참고: 샘플이 BIOPS에 완전히 잠긴 시간을 최소화하기 위해 다음 단계를 신속하게 수행합니다. 샘플이 MiR05에 배치되면 시간이 본질입니다. 준비된 균주를 가능한 한 빨리 교정된 챔버로 조심스럽게 이동합니다.
  5. 티슈 섹션을 필터 용지에 조심스럽게 배치하고, 작은 플라스틱 타르 계량 보트에 놓고, 초기 젖은 무게를 기록합니다. 사용하지 않은 조각을 BIOPS의 10mL 원추형 튜브에 다시 배치하여 지속적인 보존을 위해 합니다.
  6. 조직 섹션을 MiR05가 함유된 얼음 차가운 균질화제로 잠급니다.
  7. 유리 유봉 (클리어런스 범위 0.09-0.16 mm)을 사용하여 5-7 다운 - 업 스트로크를 완료하여 종양 조직을 부드럽게 방해합니다. 각 스트로크에 대해 유봉을 시계 방향으로 시계 반대 방향으로 3번 회전시키면서 유봉을 3번 더 밀어 내고 유봉을 다시 당깁니다. 조직이 스트로크 사이에 균질화의 바닥에 정착할 수 있도록 허용하지만 발포를 방지하기 위해 유체 부피 위에 유봉을 완전히 가져 오지 않도록하십시오.
    참고: 생성된 균동화는 최소한의 고체 조직 잔재로 흐려야 합니다.
  8. 15mL 원피스 튜브에 동형어를 붓고 얼음 위에 놓습니다.
  9. 페일과 균질화로 신선한 MiR05의 파이펫 1-3 mL은 남은 조직 균질화를 세척합니다. MiR05 세척을 동종 구균이 들어 있는 원색 튜브에 붓습니다. 유봉및 균질제 세척을 2-3회 반복하여 균류의 완전한 전달을 보장합니다. 세설 단계에서 시료를 과도하게 희석시키지 않도록 목표 농도와 필요한 부피를 명심하십시오.
  10. 조직 균질화 농도를 정확하게 계산하려면 균질화 및 균질화된 균질화 물질(즉, 결합 조직)에 대해 신중하게 검사합니다.
    1. 핀셋으로 도달할 수 없는 균질화 물질로부터 비균질화 물질을 제거하려면 MiR05를 균질화에 추가하고 피펫으로 부피(조직 포함)를 흡인하고 내용물들을 페트리 접시로 옮다.
    2. 균질화되지 않은 물질을 균질화 물질(원물 관 의 바닥에 큰 조각으로 정착)하려면 파이펫으로 큰 조각을 흡인하고 원물 튜브의 조직 캡에 놓습니다.
    3. 핀셋으로 페트리 접시 또는 원모 튜브 캡에서 조직을 제거하고 필터 용지에 얼룩. 원추형 튜브 캡의 나머지 동형어를 원추형 튜브에 다시 넣고 캡을 한 다음 혼합합니다.
    4. 균질화제를 재검사하고 균질화되어 추가적인 비균질화 물질에 대해 재검사하고, 필요에 따라 물질을 제거하기 위해 4.10.1-4.10.3 단계를 반복한다.
  11. 균질화로부터 회수된 비균질화 물질의 질량을 계량및 기록한다. 전달된 심하게 손상되지 않은 조직에 대한 균형 제제를 검사합니다. 균질화되지 않은 조각을 제거하고 필요에 따라 무게.
  12. 최종 샘플 중량을 계산하기 위해 초기 습식 중량에서 계량 보트, 균질화 및 균질화(필요한 경우)에서 회수된 조직 중량을 빼는 다.
  13. 최종 샘플 중량을 사용하여 MiR05를 추가하여 원하는 농도로 동종포네이트를 가져옵니다(최적화 실험에 대한 자세한 내용은 5단계 참조).
  14. 동형모의 무게와 준비되면 가능한 한 빨리 분석진행합니다. 샘플이 기기로 전송될 때까지 젖은 얼음에 보관하십시오.

5. 기판, 분리기, 억제제 적정 프로토콜 (SUIT)

  1. 기기가 보정되고 샘플이 준비되면 비틀기 동작으로 스토퍼를 제거하고 챔버에서 MiR05를 흡인하십시오(챔버 내부에 노출된 멤브레인을 피하십시오). 동종균을 잘 섞고 챔버에 균주2.25 mL을 추가합니다. 여러 챔버에 하나의 균주를 추가하는 경우, 파이펫 1 mL각 챔버에 한 번에 동일한 조직 분포를 보장하기 위해 균주를 혼합하는 동안. 이벤트의 이름을 지정하고 타임 스탬프를 클릭한 다음 확인을 클릭합니다.
  2. 무딘 18 G 바늘을 사용하여 레귤레이터 와 가스 튜브와 산소 탱크에서 산소로 50 mL 주사기를 채웁니다. 챔버를 ~500 μM 산소로 과산소화합니다. 이를 위해 챔버에 직접 산소를 주입하십시오. 스토퍼를 느슨하게 삽입하고 산소가 ~ 480 μM에 도달 할 때까지 닫을 때까지 기다립니다. 비틀기 동작으로 챔버를 천천히 닫고 호흡이 평형 (~15-20 분)을 허용합니다. 필요한 경우 스토퍼 중앙 모세관을 MiR05로 채웁니다.
  3. OXPHOS 및 ET(전자 전달 상태) 용량의 분석 결정 N-연결 및 NS 연결 및 CIV(복합 IV) 활동: 전용 현미경 고지를 사용하여 기판, 단자 및 억제제를 완전히 폐쇄된 챔버에 주입합니다. 각 주입을 사용하여 F4를 클릭하여 각 챔버의 이벤트를 실시간으로 이름과 타임 스탬프를 찍습니다. 연구 전반에 걸쳐, 필요에 따라 O2 농도 및 O2 경사 neg. 스케일을 조정하기 위해 F6를 선택합니다. 각 주입 후, 주사기를 3회 물(수용성 화합물용) 또는 70% 에탄올(에탄올 또는 DMSO에 용존하는 화합물의 경우)으로 세척한다.
    참고: N-연결: 정의된 NADH 생성 기판 조합에 의해 지원되는 O2 플럭스, NS-링크: O2 플럭스는 정의된 NADH 생성 기판 조합의 수렴에 의해 지원되고 간결하게 합니다.
    1. 0.8M 말레이트(2mM 최종 농도)의 5μL을 추가하고 즉시 다음 주사로 진행합니다. 주사 주사기를 물에 3 번 씻으시면 됩니다.
    2. 즉시 1M Pyruvate (2.5 mM 최종 농도)의 5 μL을 추가하고 호흡이 안정 될 때까지 기다립니다. 주사 주사기를 물에 3 번 씻으시면 됩니다.
    3. 0.5M ADP(2.5mM 최종 농도)의 10μL을 추가하고 ADP 응답이 안정화될 때까지 기다립니다. 주사 주사기를 물에 3 번 씻으시면 됩니다.
      참고: 추가 ADP(2.5-10mMMMMMM)는 아데닐레이트 농도가 호흡기 플럭스에 제한되지 않도록 해야 할 수 있다.
    4. 2M 글루타민트(5mM 최종 농도)의 5μL을 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 주사 주사기를 물에 3 번 씻으시면 됩니다.
    5. 4m 사이토크롬 c(10μM 최종 농도)의 5μL을 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 주사 주사기를 물에 3 번 씻으시면 됩니다.
    6. 1 M Succinate (10 mM 최종 농도)의 20 μL을 추가하고 호흡이 안정 될 때까지 기다립니다. 주사 주사기를 물에 3 번 씻으시면 됩니다.
    7. 1mM FCCP (2-20 μM 최종 농도)의 적신 0.5-1 μL 증분과 각 주입 후 호흡이 안정화 될 때까지 기다렸다, 호흡의 추가 증가가 없을 때까지 계속. 에탄올 70%에서 주사 주사기를 3회 세척합니다.
    8. 150 μM 로테네네(150nM-2 μM 최종 농도)의 2μL을 추가하고 호흡이 안정화될 때까지 기다립니다. 로테논의 또 다른 1 μL을 추가하여 더 이상 억제가 되지 않도록 합니다. 호흡의 감소가 있는 경우에, 호흡에 있는 감소가 없을 때까지 추가 주사를 계속하십시오. 에탄올 70%에서 주사 주사기를 3회 세척합니다.
    9. 125 μM 안티마이신 A (125 nM-5 μM 최종 농도)의 2 μL을 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 안티마이신 A의 또 다른 1 μL을 추가하여 더 이상 억제가 되지 않도록 합니다. 호흡의 감소가 있는 경우에, 호흡에 있는 감소가 없을 때까지 추가 주사를 계속하십시오. 에탄올 70%에서 주사 주사기를 3회 세척합니다.
    10. 챔버의 산소 농도를 확인; 농도가 125 μM 미만인 경우 산소가 호흡 플럭스를 제한하지 않도록 실내 공기 또는 약간 과산소로재로 재산소화합니다. 0.8M 아스코르바테(2mM 최종 농도)의 5μL을 추가합니다. 에탄올 70%에서 주사 주사기를 3회 세척합니다.
    11. 즉시 0.2 M TMPD (1 mM 최종 농도)의 10 μL을 추가하여 호흡 속도가 느려질 때까지 기다립니다. 에탄올 70%에서 주사 주사기를 3회 세척합니다.
    12. 아스코르바테/TMPD 고원의 호흡 플럭스 시 즉시 4M 나트륨 아지드(50mM 최종 농도)의 25μL을 추가합니다. 에탄올 70%에서 주사 주사기를 3회 세척합니다.
    13. 스터디 종료 - 파일을 클릭, 저장 및 연결을 끊습니다. 9.2-9.3 단계 다음 챔버와 주사기를 계속 씻으려면 계속하십시오.

6. ADP 감도 프로토콜

  1. 기기가 보정되고 샘플이 준비되면 비틀기 동작으로 스토퍼를 제거하고 챔버에서 MiR05를 흡인하십시오 (챔버 내부에 노출 된 멤브레인을 피하십시오). 동종균을 잘 섞고 챔버에 균주2.25 mL을 추가합니다. 동일한 조직 분포를 보장하기 위해 균주를 혼합하면서 여러 챔버에 하나의 균주, 각 챔버에 한 번에 파이펫 1 mL을 추가한다고 가정해 봅시다. 이벤트의 이름을 지정하고 타임 스탬프를 클릭하려면 F4를 클릭하고 확인을 클릭합니다.
  2. 스토퍼를 삽입하고 비틀기 동작으로 천천히 챔버를 닫고 호흡이 평형 (~15-20 분)을 허용합니다. 필요한 경우 스토퍼 중앙 모세관을 MiR05로 채웁니다.
  3. 간결한 미토콘드리아 ADP 감도의 분석 적 결정: 각 주사와 함께 F4를 클릭하여 각 챔버의 이벤트를 실시간으로 이름과 시간 스탬프로 찍습니다. 연구 전반에 걸쳐, 필요에 따라 O2 농도 및 O2 경사 neg. 스케일을 조정하기 위해 F6를 선택합니다.
    1. 150 μM 로테네론 (150 nM 최종 농도)의 2 μL을 추가합니다.
    2. 즉시 1 M Succinate (10 mM 최종 농도)의 20 μL을 추가하고 호흡이 안정 될 때까지 기다립니다.
    3. 최대 응답률(VMAX;2.5-10 mM 최종 농도)에 도달할 때까지 하위 포화 농도를 단계적으로 첨가하여 ADP를 적시합니다.
      참고: ADP 농도의 작은 변화로 인해 주사 후 고원이 발생할 수 있으므로 각 고원 후 사출 농도가 증가하고 ADP 주입 농도의 접이 증가해도 호흡이 더 이상 증가하지 않을 때까지 적정을 계속합니다.

7. 권장 최적화 실험

  1. 프로토콜에 대한 최적의 동종 및 산소 농도를 결정합니다.
    1. 여러 조직 농도(예: 30 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2.5 mg/mL, 1 mg/mL, 1 mg/mL, 및/또는 0.5 mg/mL)에서 SUIT 프로토콜(Steps 5.1-5.3)을 수행합니다.
    2. 재산소의 빈도를 제한하면서 호흡 플럭스를 최대화하는 농도를 선택하십시오(1-2 이상). 더 빈번한 재산소가 필요한 경우, 동종기의 농도를 감소시다.
  2. 균질화로 최적의 스트로크 수를 결정합니다.
    1. 여러 수준의 균질화(예: 5스트로크, 10스트로크, 15스트로크, 20스트로크)에서 SUIT 프로토콜(단계 5.1-5.3)을 수행합니다.
    2. 문헌에 부족한 데이터가 종양 균주 제제를 사용하여 세포크롬 c의 백분율 증가의 임계값을 결정하기 때문에, 제한된 시토크롬 C 반응으로 준비를 선택하지만, 관심의 기판에 의해 활력을 구사하는 적절한 호흡을 선택한다.
  3. 정량적이고 재현 가능한 호흡 플럭스에 필요한 최적의 기판, ADP, 비커플러 및 억제제 농도를 결정합니다.
    1. 선택한 조직 농도(단계 7.1)에서 SUIT 프로토콜(단계 5.1-5.3.9)을 수행한다. 더 이상 반응이 관찰되지 않을 때까지 각 기판, 분리기, 억제제 및 ADP를 적시한다. 별도의 실험에서 아지드 나트륨으로 억제를 적시합니다.
      1. 0.8M 말레이트(2mM 최종 농도)의 5μL을 추가하고 즉시 다음 주사로 진행합니다.
      2. 1M 피루바테의 1 μL 증분을 적발하고 각 주사 후 호흡이 안정될 때까지 기다렸다가 호흡의 추가 증가가 없을 때까지 계속합니다.
      3. 0.5M ADP의 2 μL 증분과 호흡이 각 주사 후 안정화될 때까지 기다린 후, 호흡의 추가 증가가 없을 때까지 계속한다.
      4. 2M 글루타민트의 1 μL 증분을 적분하고 호흡이 각 주입 후에 안정될 때까지 기다렸다가 호흡의 추가 증가가 없을 때까지 계속합니다.
      5. 4m 사이토크롬 c(10μM 최종 농도)의 5μL을 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다.
      6. 1M Succinate의 5 μL 증분을 적분하고 각 주입 후에 호흡이 안정될 때까지 기다립니다, 호흡의 추가 증가가 없을 때까지 계속합니다.
      7. 0.5 M ADP의 5 μL 증분을 적분하고 각 주입 후 호흡이 안정화될 때까지 기다렸다가 호흡의 추가 증가가 없을 때까지 계속합니다.
      8. 1mM FCCP의 0.5 μL 증분과 호흡이 각 주사 후 안정화될 때까지 기다렸다가 호흡의 추가 증가가 없을 때까지 계속된다.
      9. 1μM 로테네톤의 1 μL 증분을 적분하고 각 주사 후 호흡이 안정될 때까지 기다렸다가 호흡의 감소가 없을 때까지 계속합니다.
      10. 1μM 안티마이신 A의 1 μL 증분의 적발하고 각 주입 후 호흡이 안정될 때까지 기다렸다가 호흡의 추가 감소가 없을 때까지 계속합니다.
      11. 0.8M 아스코르바테(2mM 최종 농도)의 5μL을 추가합니다.
      12. 즉시 0.2 M TMPD (.5 mM 최종 농도)의 5 μL을 추가하여 호흡 속도가 느려질 때까지 기다립니다. 별도의 실험에서 0.2 M TMPD(1mM 최종 농도)의 10 μL을 추가합니다.
      13. 별도의 실험에서는 아스코르바테/TMPD 고원의 호흡 플럭스 시 즉시 10 μL, 25 μL, 50 μL 및 100 μL 4M 나트륨 아지드(20mM, 50mMM, 100mMM, 100mMM MM 최종 농도)를 추가하였다.
    2. 실험의 타이밍을 개선하기 위해 첫 번째 주사 내에서 포화기 및 억제제 농도를 선택합니다. ADP를 사용하여 ADP 감도 평가를 기존 SUIT 프로토콜과 결합할 수 있습니다.
    3. 호흡 플럭스의 억제 없이 복용량 응답성을 입증 하는 하위 최대 결합 농도 사용.

8. 데이터 분석

  1. 슈트 분석
    1. 분석 감소를 위해 각 적정에서 정상 상태 또는 피크 속도를 선택하고 내보내기합니다.
    2. 티슈 mg당 초당 pmol O2로 데이터를 표현한다(pmol/s/mg).
    3. 각 속도(즉, ADP 의 첨가 후 얻은 정상 상태 비율)로부터 항마이신 A 무감각비율을 빼서 PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P 및 PMGS-E의 분석적 감소를 달성한다.
      참고: 오후: 피루바테 + 말레이트; PMG: 피루바테 + 말린 + 글루타민트; PMGS: 피루바테 + 말린 + 글루타민트 + 수치네이트; -L:누출 상태; -P: 산화 인산화 상태, -E: 전자 전송 상태.
    4. 피크 아스코르바테/TMPD 속도에서 나트륨 아지드 무감각 비율을 빼서 CIV-E의 분석적 감소를 달성한다.
    5. PMGS-E 속도에서 로테네 무감각 한 속도를 빼서 PMG-E의 분석 적 감소를 달성한다.
    6. 로테네민 무감각 속도로부터 항마이신 A 무감각 비율을 빼서 S-E의 분석적 감소를 달성한다.
    7. 다음 방정식에 의해 사이토크롬 c 제어 효율, 외부 멤브레인 의 마커 의 분석 적 감소를 달성하십시오.
      jc = (JCHNOc - JCHNO)/JCHNO)x 100
      식수에서, jc는 사이토크롬 c를첨가하면% 증가하며, JCHNOc는 시토크롬 c를첨가한 후 산소 플럭스이며, JCHNO는 시토크롬 c를첨가하기 전에 산소 플럭스이다.
  2. ADP 감도 분석
    1. 간결한 + 로테네네의 누설 속도에 대하여 ADP 민감도에 대한 운동학을 분석적으로 결정한다(조직 호모게네이트의 비율이 아님).
    2. 상대ADP 농도(X축)에 대해 O2 플럭스(Y축)를 플롯합니다. ADP 적정을 통해 달성된 최고 속도(Vmax)를결정합니다.
    3. 곡선 피팅 소프트웨어(PRISM, 버전 10.1)를 사용하여 Michaelis-Menten 역학을 결정하여 1/2 VMAX가 달성되는 ADP 농도(명백한 KM)를공개합니다.

9. 기악 품질 관리

  1. 원하는 산소 농도 범위(0-600 μM) 및 제로 교정을 통해 악기 O2 배경을 수행합니다.
    1. 전체 단계 3.1 및 3.2
    2. 스토퍼를 제거하고 챔버에서 70 % 에탄올을 흡인하십시오 (챔버 내부에 노출 된 멤브레인을 피하십시오). 더블 증류H2O로4회 헹구고, 2.25mL의 MiR05로 챔버를 채웁니다.
    3. 챔버를 ~600 μM 산소로 과산소화합니다.
    4. 스토퍼를 완전히 닫힌 위치에 천천히 삽입합니다. 주입 모세관을 통해 배출되고 스토퍼의 우물에서 채취된 과잉 배지에서 사이펀을 제거하여 산소 신호가 안정화되도록 허용한다(30-45분).
    5. 산소 보정을 수행하려면 산소 농도와 경사가 모두 안정된 영역을 선택하고 각 챔버에 대한 교정 창을 열고 R1 마크를 선택합니다.
    6. 물 0.5mL에 20 mg의 나트륨 하이드로설피티를 용해하여 디티오마이트 용액을 준비하십시오. 디티오나테가 산소에 노출되어 시간이 지남에 따라 산화됨에 따라 공기에 대한 노출을 제한하십시오.
    7. 산소 신호가 안정화되면 1 μL을 주입하고 산소 농도의 감소를 관찰하십시오. 필요에 따라 디티오네이트 솔루션의 효능을 조정합니다.
    8. 산소 농도를 각각 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM 및 0 μM로 낮추기에 충분한 디티오니트 솔루션을 주입하십시오. 각 주입에서 산소가 안정화되고 정상 상태 경사에 대한 마크를 선택할 수 있습니다. 산소 농도가 ~0 μM이되면 산소 농도를 표시하십시오.
    9. 악기 O2 배경 보정을 수행하려면 각 챔버의 플럭스/경사 창을 선택하고 O2 배경 교정을선택하고 관심 있는 표시를 보려면 교정을 클릭합니다.
    10. 제로 교정을 수행하려면 각 챔버에 대한 교정 창을 열고 디티오나테 적정 후 달성된 R0 마크를 선택합니다.
  2. 기기 청소
    1. 각 챔버를 순수한 물로 세 번 빠르게 헹구는다. 첫 번째 세척을 위해, 균형균을 흡인하고, 챔버를 물로 완전히 채운 다음 물을 흡입합니다. 두 번째 세척을 위해, 챔버를 채우십시오 3/4 물 전체, 주입 모세관을 통해 물을 강제로 스토퍼를 삽입, 주입 모세관을 통해 물의 일부를 흡인 한 다음 완전히 세척 하는 스토퍼를 제거.
    2. 챔버를 70% 에탄올로 5분 동안 씻으시면 됩니다.
    3. 싱크대 나 비커 위에, 순수한 물, 70 % 에탄올, 100 % 에탄올로 스토퍼를 청소하고, 세척 병을 사용하여 주입 모세 혈관을 통해 유체를 강제로.
    4. 각 챔버를 두 번 순수로 빠르게 헹구습니다.
    5. 15 분 동안 냉동 미토콘드리아, 세포 용해, 또는 살아있는 섬유 아세포의 ~ 2 mg을 포함하는 PBS의 2 mL로 챔버를 배양.
    6. 챔버를 순수한 물로 5분 2회 세척합니다.
    7. 챔버를 70% 에탄올로 5분 2회 세척합니다.
    8. 챔버를 100% 에탄올로 10분 동안 씻으실.
    9. 챔버를 70% 에탄올로 채웁니다.
      1. 연속 실험을 실행하는 경우, 챔버를 70% 에탄올로 5분 동안 방치한 다음 3.3단계로 계속 진행한다.
      2. 실험이 완료되면 스토퍼에 뚜껑을 닫고 기기를 끕니다.
  3. 각 사용 후, 주사 주사기를 제대로 청소하고 이월을 방지하기 위해 특정 화합물 사용에 전념 주사기를 유지합니다.
    1. 주사를 세척 유체에 삽입하고 주입 바늘을 완전히 침수합니다.
    2. 세척액을 주사기에 최대 부피로 끌어들입니다.
    3. 세척 용기에서 주사기를 제거하고 세척 액을 비커에 배출한 다음 종이 타월에 주사기를 부수습니다.
    4. 각 사용 후 가능한 한 빨리 9.3.1-9.3.3 단계를 반복합니다.

Representative Results

초기 연구 결과는 EO771 종양이 낮은 산화이고 이렇게 적당한 O2 플럭스 평가를 위한 높은 균질 농도를 요구했다는 것을 밝혔습니다. 최적화 실험은 연구를 위한 최적의 조직 균등포 농도 범위를 결정하기 위해 수행되었다. 종양 균질화는 처음에 40 mg/mL에서 제조된 다음 선형으로 희석하였다. 조직 질량으로 정규화된O2 플럭스는농도(그림 1A-D)에걸쳐 일관되었다. 40 mg/mL이 급속한 산소 고갈을 초래하고실험(도 1A)에적합하지 않은 것으로 관찰되었다. 산소 소비는 30 mg/mL 및 20 mg/mL로 실질적으로 둔화되었지만 기판 이나 ADP(그림 1B,C)가없는 상태에서 짧은 시간에 여전히 급격히 감소했습니다. 10 mg/mL 농도는 90분 더 긴 슈트 프로토콜을 지원하는 최적의 산소 소비율(도1D)을초래하였다.

SUIT 프로토콜은 NADH-및 간결한 OXPHOS 및 ET뿐만 아니라 CIV활동(그림 2A)을평가하는 데 사용되었습니다. Pyruvate 및 malate는 NADH를 통해 누출 (L)을 구동하는 ADP의 부재에 조직 호모전에 첨가되었다. 포화 ADP는 최대 NADH 연결 OXPHOS (P)를 구동하기 위해 추가된 다음 글루타민트를 첨가했습니다. 사이토크롬 c는 외부 막 무결성을 보장하기 위해 첨가되었다; 호흡률의 증가는 모든샘플(도 2B)에서20% 미만이었다. NADH 연결 기판에 대한 반응이 매우 낮을 때, 시토크롬 c 방출은 또한 간결하고 로테톤의 존재에서 평가되고 최소한의 사이토크롬 c 자극(도2B)을관찰하였다. 흥미롭게도, NADH-연결된 OXPHOS는 EO771종양(도 2C)에서무시할 수 있었다. 그런 다음 수치네이트는 피루바테, 말린, 글루타민트의 존재에 첨가되어 간결한 탈수소효소를 통해 전자흐름을 자극했다. FCCP는 EO771 종양에서 산화가 아닌 인산화가호흡(도 2C)으로제한되었다는 것을 밝혀낸 최대 전자 흐름(E)을 구동하기 위해 적정하였다. 로테네안 과 항마이신 A는 각각 복잡한 I와 복잡한 III를 억제하기 위해 적정하였다. 아스코르베이트와 TMPD는 CIV를 통해 최대 전자 흐름을 구동하기 위해 첨가되었고, 이는 나트륨 아지드에 의해 억제된다. 표 1은 도 2C에플롯된 호흡기 파라미터를 양량화하기 위해 원시 데이터(표2)의분석 적 감소 방정식을 도시한다. 전반적으로, 종양 균등호흡프로파일(도 2C)은종양내 N-및 S-연결된 기판에 의해 지원되는 감소된 최대 전자 전달을 제외하고 이식되지 않은 디지토닌-투과성 EO771 세포(도2D)와유사하다.

NADH-연결된 호흡은 무시할 수 있었기 때문에, 간결한 호흡 운동은 최대 속도(VMAX)가달성될 때까지 서브 포화 ADP의 단계별 적정에 의해 더 평가되었다(그림3A,3B). 간결한 + 로테네네의 존재시 ADP의 반최대 농도(KM)는37.5 μM이었고 VMAX는 ~10.5 pmol/s/mg(도3C)이었다. 따라서, 상대적으로 가난한 산화 속도에도 불구 하 고, EO771 종양 ADP에 매우 민감한 상대적으로 낮은 ADP 농도에서 지속적인 ATP 합성.

추출을 위해 원시 데이터의 적절한 영역을 선택하는 것은 실험의 재현성과 정확한 정량화에 매우 중요합니다. 사이토크롬 c의경우, 주사 직전의 정상 상태에서 마크를 선택해야한다(도 4A,마크 1). O2 플럭스가 안정되지 않는 기간(약 5-10분)이 뒤따를 수 있는 초기 사출 아티팩트가 종종 있습니다. 시토크롬 c 효율의 평가는O2 플럭스가 안정화되면 추가 선택을 함으로써 이루어진다(도4A,마크 2). 기판, ADP 또는 대부분의 억제제의 첨가 후 선택은 주사 유물 이후에 이루어지고 일단O2 플럭스가 안정화되면(도4B). 최대 결합되지 않은 호흡을 결정하는 데 사용되는 선택은 종종 최종 주입이 아닌 FCCP의 적정 시 달성된 피크증가(도 4C)에이루어진다. TMPD에 대한 선택은 아스코르베이트와 TMPD가 추가된 후 호흡의 최대증가(도 4D,마크 1)에 이루어진다. 이 피크 직후, 억제제, 아지드 나트륨이 첨가되어 호흡을 빠르게 감소시킬 뿐만 아니라 종종 주사 유물이 억제된 호흡속도(도4D)보다낮습니다. 억제제 마크는 주사 아티팩트(도4D,마크 2)직후에 이루어진다. O2 플럭스일반적으로 안정화되지 않고 계속 감소합니다.

표 1: 호흡기 표기막 및 분석 파생. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 발광 B 유방 종양균질의 샘플 및 호흡 특성. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 1
도 1: 종양 균등포 농도의 최적화. O2 플럭스(red) 및O2 농도(파란색)에서 제조된 유방 종양 균질화(A)40 mg/mL,(B)30 mg/mL,(C)20 mg/mL,(D)10 mg/mL에서 제조하였다. 톰: 조직 균모 호흡. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: OXPHOS 및 ET 용량의 평가는 갓 절제된 종양 균질화에서 고해상도 호흡학에 의한 평가. (A)기판, 억제제, 비커플기 프로토콜의 과정을 통해 산소 소비(red) 및 농도(blue)의 대표적인 플롯. PM: 피루바테 + 말레이트, D: ADP, G: 글루타메이트, c: 사이토크롬 c,S: 수치네이트, F: FCCP, 로트: 로테논, 아마: 안티마이신 A, Asc/TMPD: 아스코르바테/테트라메틸-phenyleniamine. (B)시토크롬 c를첨가하면O2 플럭스의 퍼센트 증가. (C-D) Malate, pyruvate, 글루타민트에 의해 지원되는 호흡은 ADP, FCCP 및 아스코르바테/TMPD의 존재에서 간결하게(C)EO771 유래 종양 균질화 및(D)비 이식 EO771 디포닌-퍼메아빌화 세포. 톰: 조직 균모 호흡; PM: 피루바테 + 말레이트; PMG: 피루바테 + 말린 + 글루타민트; PMGS: 피루바테 + 말린 + 글루타민트 + 수치네이트; CIV: 복잡한 IV; -L: 누출 상태; -P: 산화 인산화 상태, -E: 전자 전송 상태; N-연결: 정의된 NADH 생성 기판 조합에 의해 지원되는 O2 플럭스; NS 연결: 정의된 NADH 생성 기판 조합및 간결함의 수렴에 의해 지원되는 O2 플럭스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: EO771 유방 종양은 높은 ADP (아데노신 5′-디포스페이트) 감도를 나타냈다. (A)S-연결된 ADP 적정 프로토콜 을 통하여 산소 소비(red) 및 농도(blue)의 대표적인 플롯. 톰: 조직 균모 호흡; S/로트: 수치네이트/로테네네; D: ADP. (B)로테네론의 존재와 ADP의 농도 증가 (0 μM ADP = S/Rot-L)의 증가 농도에서 간결에 의해 지원되는 호흡. (C)간결한 + 로테네론의 존재에서 ADP의 최대값(VMAX)및 반최대 농도(KM). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 대표적인 추적은 데이터 추출을 위한 원시 O2 플럭스의 마크 선택을 보여주는 것입니다. (A)Cytochrome c 선택:O2 플럭스가 안정화되면 주입 후 Cytochrome c 주입 및 선택 번호 2 전에 선택 번호 1. c 사이토크롬 c. (B)기판, ADP 및 억제제 선택:O2 플럭스가 안정화된 주사 후 선택 번호 1(이 대표적인 플롯에서 간결). S: 수치네이트. (C)언커플러 선택: 선택 번호 1 은 분리기 적정 시 호흡이 최대 증가합니다. 이 대표적인 FCCP 적정 플롯에서 세 번째 주사는 호흡을 약간 감소시켜 선택에 사용되지 않습니다. F: ACCP. (D)TMPD 선택: 아스코르베이트 및 TMPD 주사 후 호흡의 피크 증가에 선택 번호 1. 나트륨 아지드 선택: 호흡이 처음에 감소할 때 급성 주사 유물 후 선택 번호 2. As/Tm: 아스코르베이트/TMPD; 아즈드: 아지데. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

암에서 미토콘드리아 호흡을 평가하는접근법은 주로 시험관 내 모델(13,14,15,16)으로제한되었다. 화학적 투과성6,7,17을사용하여 종양에서 미토콘드리아 호흡을 측정하는 데 있어 일부 성공이 달성되었지만, 보편적으로 적용되고 종양 유형 전반에 걸쳐 비교할 수 있는 균일한 금표준 접근법은 없습니다. 또한 일관된 데이터 분석 및 보고가 부족하여 데이터 일반화성과 재현성이 제한됩니다. 본 원에 설명된 방법은 미토콘드리아호흡(18)을 측정하기 위한 간단하고 비교적 빠른 접근법을 제공하여 미토콘드리아 제제에서 갓 절제된 고형 종양 시편으로부터 제조한다. 종양은 정형소 이식된 뮤린 루미날 B, ERα-음성 EO771유방암세포(19)로부터성장하였다.

조직 취급에 대한 부지런함과 관리는 산소 소비율의 정확성과 정상화를 크게 향상시킬 것입니다. 조직과 미토콘드리아는 시료가 차갑게 유지되지 않거나, 보존 매체에 일관되게 침수되지 않거나, 지나치게 처리되어 최적이 아닌 루틴 및 OXPHOS 비율을 초래하는 경우 쉽게 손상될 수 있다. 추가적으로, 균질화 조직의 정확한 젖은 무게는 이것이 1 차적인 정규화 방법이기 때문에 중요한 중요성입니다. 구연산 신디하제활성(20)과같은 총 단백질 또는 미토콘드리아 특이적 마커와 같은 다른 정상화 방법이 고려될 수 있다. 추가적으로, 조직 이질성은 실험에 포함하기 위하여 종양 지구에 관하여 결정과 더불어 해결될 필요가 있을 것입니다 선행을 했습니다. 괴사, 섬유성 및 결합 조직은 균질화 및/또는 호흡을 잘 하지 않을 수 있으며 이러한 종양 부위를 의도적으로 분석하지 않는 한 피해야 합니다. 특히, 종양은 유형 및 절제 부위에 따라 매우 끈적거리며 정확한 계량 및 이송이 더 어려워질 수 있습니다. 균질화에 사용되는 뇌졸중의 수는 외부 미토콘드리아 막에 손상을 완화하면서 미토콘드리아의 완전한 준비를 보장하기 위해 최적화되어야한다.

향상된 정확도와 재현성을 위해, 우리는 균질 제제, 조직 농도 및 기질, 비 커플러, 억제제 농도에 대한 뇌졸중의 수에 대한 최적화 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 연구는 뇌졸중의 다른 수와 그들이 연구 내에서 사이토 크롬 c의 첨가에 반응하는 방법과 최대 미토콘드리아 호흡 용량 (21)을비교할 수 있습니다. 시토크롬 c 응답이 적다는 일반적인 수용이 있지만, 사이토크롬 c를 첨가한 후 산소 소비가 증가함에 따라 외부 미토콘드리아 막에 손상을 나타낼 수 있으며, 이 임계값이 모든 조직에 대해 어떤 기준인지에 관해서는 금본위제가 없으며 조직이 과로되거나 준비되지 않도록 실험적으로 조사되어야 한다. 이 종양 조직에서는~ 30% 미만의 사이토크롬 c 반응이 호흡기 기능을 손상시키지 않는 것으로 나타났다. Cytochrome c 사용은 시험이 양성인 경우에 호흡 용량의 정확한 정량화를 위해 중요하게 됩니다. 이 경우, 추가 보충 내인성 사이토크롬 c, 이는, 고갈하는 경우, 호흡 속도의 과소 평가를 일으킬 것이다.

조직 농도 적정 실험은 가능한 농도의 범위에 걸쳐 수행 될 수 있으며, 이상적으로, 연구 중에 조사 될 SUITs로 수행 될 것이다. 호흡 용량은 종양 유형 및 조성물에 따라 다릅니다. 따라서, 미토콘드리아 또는 높은 호흡 용량으로 조밀한 종양은 낮은 농도(0.5-5 mg/mL)를 필요로 한다. 미토콘드리아 또는 낮은 호흡 용량을 가진 종양은 더 높은 농도 (7-12 mg/mL)를 요구할 것입니다. 추가적으로, 길고 고도로 소모된 기질이 있는 SUITs는 챔버 또는 ADP 제한의 재산소화를 방지하기 위하여 더 적은 조직을 필요로 할 수 있습니다. 몇몇 조직은 산소 소비에 있는 선형 관계가 있을 것이고, 그 외는 특정 사격량에 향상된 감도 및 최대 산화를 보여줄 것입니다. 선택한 조직 농도는 산소 플럭스를 최대화하는 동시에 재산소 화 사건의 수를 제한하도록 최적화되어야 합니다. 또한, 농도 범위의 높은 끝에 대 한 필요 또는 목표를 과대 평가 하는 것이 좋습니다. 호흡 플럭스의 양에 필수적인 억제제는 미토콘드리아의 더 큰 풀에서 사용될 때 더 정확합니다.

또 다른 필수적인 고려 사항은 프로토콜 중에 사용되는 약물의 농도입니다. 동종 포진 농도의 변화는 최대 반응에 필요한 기판, 분리제 및 억제제의 농도를 변경할 수 있습니다. 따라서 최적의 농도 범위를 선택하면 SUIT 프로토콜에 필요한 용량을 테스트하는 실험이 수행되어야 합니다. 아데닐레이트 농도가 호흡기 플럭스에 제한되지 않도록 추가ADP를 추가할 수 있습니다. FCCP 또는 CCCP와 같은 화학 비커플러는 더 높은농도(22)에서호흡을 억제한다. 따라서, 최대 달성 속도를 드러내기 위해 소량으로 적정화하는 것이 필수적입니다. 로테네톤 및 항마이신 A와 같은 억제제는 첫 번째 주사 내에서 포화 시 가장 잘 사용됩니다. 최적의 농도는 예비 실험에서 결정되었지만, 우리는 또한 억제제에 대한 반응에서 치료 관련 차이를 관찰하고 따라서 종종 결과 요금이 정량화의 기초로 작용함에 따라 최대 억제를 입증하기 위해 억제제의 1 개의 추가 주입을 추가합니다. TMPD가 자동산화(23)를거치면서 아스코르베이트/TPMD의 화학적 억제는 정확한 분석 적 감소에 필수적이다. 우리는 산화 나트륨 아지드의 추가를 통해 아스코르바테/TMPD/사이토크롬 c의 자동 산화를 위해 통제, 설립 된 CIV 억제제. Km 연구의 경우, 간결한 단독으로 로테네를 첨가하면저농도(24)에서간결한 탈수소효소 활성을 억제할 수 있는 옥살로아세테이트 축적을 방지한다. ADP의 부피 및 농도는 일반적인 기판 조합에 미토콘드리아의 감도에 크게 의존한다. ADP에 매우 민감한 미토콘드리아 제제는 더 낮은 시작 농도를 필요로 합니다. 또한 pH에 주의를 기울여 검증된 화학 물질및 적절한 약물 제제, 해당되는 경우 빛에 대한 민감성 및 저장 온도는 성공적인 실험에 필수적입니다.

악기 설정 및 일상적인 관리는 이러한 실험의 성공을 위해 매우 중요합니다. 챔버의 적절하고 적절한 청소는 생물학적, 단백질, 억제제 또는 커플러 오염의 재현성 및 예방에 필수적입니다. 클라크형 전극 및 O2k 시스템은 소모품에 의존하는 플레이트 기반 시스템에 상당한 비용 이점인 유리 반응 챔버를 활용합니다. 그러나 유리 챔버는 적극적으로 세척되어야하며 후속 연구에서 억제제 오염의 원인이 될 수 있습니다. 세척 과정에서 미토콘드리아가 풍부한 표본을 가진 배양(예를 들어, 고립된 심장 또는 간 미토콘드리아)은 실험 오염의 위험을 줄일 수 있으며 희석 및 알코올 기반 세척 절차 이외에 권장됩니다. 연속 적인 연구가 실행 되는 경우, 에탄올과 미토 콘 드리 아와 청소 억제제 오염의 가능성을 최소화. 산소 센서의 교정은 산소의 일반적인 부분 압력에 비해 호흡의 정확한 측정을 얻기 위해 각 실험 전에 권장됩니다. 다중 교정이 가능하지 않은 경우, 세척 시술 후 산소 농도가 안정적이고 일관된 상태를 유지하면 하루에 하나의 교정이 충분할 수 있습니다.

상술한 절차는 이전에 설계및 최적화된 보존 용액 및 호흡 매체25,26,27을사용하여 종양 절제 후 4시간 이내에 종양 조직에서 산소 소비를 측정하기 위한 Oroboros O2k 계측기를 활용한다. 이 프로토콜의 여러 매개 변수는 후속 응용 프로그램에 대해 수정할 수 있습니다. 기기 설정 및 교정, 조직 준비에 사용되는 균질화, 최적의 균질화 및 챔버 산소 농도는 모두 산소 모니터링 잠재력을 가진 다른 기기에 사용하기 위해 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 균주를 추가할 때 챔버가 약간 과밀되어 챔버가 완전히 닫히면 챔버 모세관이 가득 찼습니다. 이것은 챔버에 약간의 산소를 소비하지만, 샘플 농도의 최적화와 함께, 우리는 시작 산소 수준을 결정하는이 소비를 설명 할 수 있습니다. 대안적으로, 샘플은 챔버가 닫히기 전에 주변 산소에서 평형화할 수 있지만, 이것은 종종 실험이 시작되기 전에 시간의 양을 증가시키고 기판의 추가를 지연시킬 것이다. 이 프로토콜에 사용되는 균질화는 널리 접근 할 수 있지만, 조직 분쇄기 또는 자동화 된 균질화 기법과 같은 다른 상업적 균질화 기술을 사용할 수있습니다(28).

또한, 조직 제제 및 기기 절차는 다양한 SUIT와 함께 다양한 커플링 및 통로 제어상태(29)에의해 호흡기 조절을 연구할 수 있다. 이러한 SUIT 프로토콜은 기능 용량을 측정하기 위해 개발되었으며, 따라서 잠재적인 내인성 기판의 기여는 용량 측정에 영향을 미치지 않습니다. 당사는 항마이신 A-로테논 또는 아지드 나트륨 민감성의 감산을 통해 항미토콘드리아 산소 소비 및/또는 잔류 소비를 적절히 고려합니다. 미토콘드리아는 조직 유형 및 손상성30,31에따라 장기간(>24h)에 대해 생검 또는 유사하게 구성된 보존 용액에서 실행 가능한 상태를 유지할 수 있다. 특정 기판의 OXPHOS가 다른 한계를 가질 수 있기 때문에 시간적 저장 제한을 결정하기 위해 사전에 연구를 수행할 수 있습니다. 이것은 실험이 조직 절제/생검의 몇 시간 안에 수행될 수 없는 경우에 필수적입니다. 37°C는 대부분의 포유류 시스템에서 호흡 기능의 평가를 위한 최적 및 생리학적 온도이다. 그러나, 분석 온도가평가(32)를방해하는 것처럼 보이는 경우, 적절한 응답성을 보장하기 위해 넓은 온도 범위(25-40°C)에 걸쳐 비교 연구가 수행될 수 있다. 도구 적 제약은 그러한 연구를 수행하는 능력을 제한 할 수 있습니다.

전술한 방법의 주요 제한은 1) 기계적 균질화를 통한 미토콘드리아에 대한 손상 가능성, 2) ATP 또는 기타 관심 변수의 동시 결정을 방해할 수 있는 호모게네이트 제제에서 ATPases 또는 기타 세포형 생화학물질의 존재가 존재하며 추가 적인 교정 방법 또는 억제제 사용이 필요할 수 있다33 및 3) 샘플당 많은 샘플 및/또는 여러 SUIT의 평가는 한 번에 두 개의 실험을 수용할 수 있으며 연속적인 실험 사이에 정리및 설정이 필요하기 때문에 시간이 많이 소요됩니다. 최적화 실험과 일관된 샘플 준비는 일관성 없는 데이터에 기여하는 상당한 미토콘드리아 손상을 최소화할 수 있습니다.

기존/대체 방법에 대하여 방법의 중요성은 개시 물질의 양, 미토콘드리아 분리의 도전 또는 투과 조직에 있는 기술적인 도전의 양에 비해 향상된 타당성입니다. 균질화의 준비는 더 빠르며, 산소는 거의 제한되지 않으며, 투과 조직에 비해 인력 간의 가변성에 덜 취약합니다. 중요한 것은, 거의 모든 견본 모형은 조직에 걸쳐 비교 분석을 허용하는 호모전 준비에 적합합니다. 고해상도 호흡법은 미토콘드리아 OXPHOS 및 ET의 금 표준 측정입니다. 전임상 및 임상암 연구에서 이 방법의 적용은 생체 내 연구를 전생체 연구로 확대할 수 있는 능력을 가지고 있다. 또한 임상 및 진단 설정에서 잠재적인 응용 프로그램을 제공합니다.

Disclosures

저자는이 작품과 관련된 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 동물 치료를위한 페닝턴 생물 의학 연구 센터 비교 생물학 핵심 직원에게 감사드립니다. 이 연구는 건강의 국가 학회보조금 U54GM104940 (JPK) 및 KL2TR003097 (LAG)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 동물과 관련된 모든 실험과 절차는 페닝턴 생물 의학 연구 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma-Aldrich M8250
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383
Amphotericin B Gibco 15290018
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Ascorbate Sigma-Aldrich A4544
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free Sigma-Aldrich 3117057001 Roche
BD 50 mL Luer-Lok Syringe Fisher Scientific 13-689-8
BD Vacutainer General Use Syringe Needles Fisher Scientific 23-021-020
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C4830
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C2506
Datlab 7.4 software Oroboros Instruments
Dimethylsulfoxide Amresco N182
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
D-Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Dumont # 5 Forceps Fine Science Tools 11251-30 Dumoxel, autoclavable
Dumont # 7 Forceps Fine Science Tools 11271-30 Dumoxel, autoclavable
Digital Calipers 150 mm/6 in World Precision Instruments 501601
EO771 cells CH3 BioSystems SKU: 94APV1-vial-prem Pathogen Tested
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378
Female C57BL/6J mice  Jackson Laboratory Stock #000664
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Imidazole Sigma-Aldrich 56750
Kimwipes Fisher Scientific 34120
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich G1626
Lactobionic acid Sigma-Aldrich L2398
Malate Sigma-Aldrich M6413
Matrigel Matrix Corning 354248
MgCl·6H2O Sigma-Aldrich M2670
Microsyringes Hamilton 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394
Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10023-03
Oxygraph-2k FluoRespirometer Oroboros Instruments 10003-01
PBS Gibco 10010023
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich P1767
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
RPMI 1640 Gibco 21875034
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Succinate (disodium) Sigma-Aldrich W327700
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Whatman Filter Paper, grade 5 Sigma-Aldrich 1005-090
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL Duran Wheaton Kimble 357424
Straight Tip Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5914SC
Non-Safety Scalpel No. 11 McKesson 1029065
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 Becton, Dickinson and Company 305109
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 Becton, Dickinson and Company 305195
BD 1mL Slip Tip Syringe Becton, Dickinson and Company 309659
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm Thermo Fisher Scientific 316060
Rodent Very High Fat Diet,  60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate Research Diet D12492
Pyrex Watch Glass, 100 mm Thermo Fisher Scientific S34819

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References

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암 연구 문제 174
절제된 고형 종양 균질화의 미토콘드리아 기능의 분석 적 결정
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