Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Глобальная идентификация сетей котрансляционного взаимодействия путем селективного профилирования рибосом

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62878
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

Котрансляционные взаимодействия играют решающую роль в модификациях зарождающейся цепи, нацеливании, складывании и сборке путей. Здесь мы описываем селективное профилирование рибосом, метод in vivo, прямого анализа этих взаимодействий в модели eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

В последние годы стало очевидно, что рибосомы не только расшифровывают нашу мРНК, но и направляют появление полипептидной цепи в переполненную клеточную среду. Рибосомы обеспечивают платформу для пространственного и кинетически контролируемого связывания мембранно-целевых факторов, модифицирующих ферментов и складных шаперонов. Недавно было обнаружено, что даже сборка в олигомерные комплексы высокого порядка, а также этапы формирования белково-белковой сети координируются с синтезом.

Здесь мы описываем селективное профилирование рибосом, метод, разработанный для захвата котрансляционных взаимодействий in vivo. Мы подробно расскажем о различных этапах очистки аффинности, необходимых для захвата рибосомно-зарождающихся цепных комплексов вместе с котрансляционными интеракторами, а также об извлечении мРНК, исключении размера, обратной транскрипции, глубоком секвенировании и шагах анализа больших данных, необходимых для расшифровки котрансляционных взаимодействий в почти кодонном разрешении.

Introduction

Selective Ribosome Profiling (SeRP) является единственным методом на сегодняшний день, который захватывает и характеризует котрансляционные взаимодействия in vivo прямым образом 1,2,3,4,5,6. SeRP позволяет глобально профилировать взаимодействия любого фактора с трансляцией рибосом в близкое к кодону разрешение 2,7.

Метод основан на мгновенном замораживании растущих клеток и сохранении активной трансляции. Клеточные лизаты затем обрабатывают РНКазой I для переваривания всех мРНК в клетке, за исключением защищенных рибосомами фрагментов мРНК, называемых «следами рибосом». Затем образец разбивается на две части; одна часть непосредственно используется для выделения всех клеточных рибосомных следов, представляющих всю текущую трансляцию в клетке. Вторая часть используется для аффинно-очистки специфического подмножества рибосом, связанных с интересующим фактором, например: модифицирующими ферментами, транслокационными факторами, складчатыми шаперонами и комплексосборочными взаимодействиями. Аффинно-очищенные рибосомные следы в совокупности называются интерактомом. Затем мРНК, защищенные рибосомами, извлекаются и используются для генерации библиотеки кДНК с последующим глубоким секвенированием.

Сравнительный анализ общих образцов транслейтома и интерактома позволяет идентифицировать все орфы, которые связаны с интересующим фактором, а также охарактеризовать каждый профиль взаимодействия орф. В этом профиле сообщается о точных последовательностях начала и окончания зацепления, из которых можно вывести декодированные кодоны и соответствующие остатки возникающей полипептидной цепи, а также об изменениях скорости рибосом во время взаимодействия 7,8. На рисунке 1 протокол показан в виде схемы.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор протокола SeRP. Этот протокол может быть выполнен в полном объеме в течение 7-10 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Генерация штаммов для селективного профилирования рибосом

ПРИМЕЧАНИЕ: Selective Ribosome Profiling (SeRP) - метод, который опирается на аффинную очистку интересующих факторов для оценки их способа взаимодействия с рибосомами-зарождающимися цепными комплексами. Гомологичная рекомбинация9, а также методы на основе CRISPR/Cas910 используются для слияния различных интересующих факторов с метками для аффинной очистки. Такими метками являются GFP, для очистки аффинности GFP-ловушки, TAP-tag для очистки бусин IgG-Sepharose, а также AVI-Tag, очищенный авидином или стрептавидином, чтобы перечислить несколько успешных примеров последних лет.

  1. Выполняйте анализы роста или функциональные анализы, чтобы подтвердить, что маркировка не влияет на функцию белков. Следует оценить терминальную маркировку N' и C'.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рибосомы (рРНК), а также многие рибосомно-связывающие домены в различных факторах сильно заряжены, что делает высокозаряженные метки (такие как полигистидин) непригодными для использования, поскольку это может привести к ложному обнаружению или изменению режима связывания.

2. Рост культуры

  1. Культивируют построенные дрожжевые культуры (на основе штамма BY4741), содержащие желаемые меченые белки, либо в жидкой среде, богатой экстрактом дрожжей-пептон-декстрозой (YPD), либо в минимальной среде синтетической декстрозы (SD) (1,7 г/л дрожжевого азотного основания с сульфатом аммония или 1,7 г/л дрожжевой азотной основы без сульфата аммония с 1 г/л глутаминовой кислоты натрия, 2% глюкозы и дополненной полной или соответствующей смесью аминокислот).
  2. Вырастите 250-500 мл клеточной культуры до 0,5 ОД600 (середина бревна) при 30 °C в соответствующей среде.

3. Клеточный сбор и лизис

  1. Быстрый сбор клеток вакуумной фильтрацией на нитроцеллюлозной блоттинговой мембране 0,45 мкм со стеклянной системой фильтрации (стеклянный фильтродержатель со стеклянной воронкой 1 л, вакуумным основанием и колпачком, экран из нержавеющей стали, прокладка и пружинный зажим, 90 мм; колба для заземления 1 л).
  2. Вспышка замораживает собранные клетки, соскребая гранулированные ячейки шпателем и сразу же погружая их в заполненную жидким азотом трубку объемом 50 мл.
    ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Клетки могут храниться при -80 °C в течение 3-4 недель.
  3. Выполняют клеточный лизис криогенным измельчением в смесительной мельнице: дважды по 2 мин при 30 Гц, с 1 мл лизисного буфера (см. табл. 1). Охладить в жидком азоте между измельчениями.
Реагент Количество на образец (мкл) Конечная концентрация
10 мг/мл CHX (циклогексимид) 220 0,5 мг/мл
1M Трис-HCl pH 8.0 88 20 мМ
3 млн кКл 205.7 140 мМ
1М МгCl2 26.4 6 мМ
1М ПМСФ 4.4 1 мМ
НП-40 4.4 0.10%
Ингибитор протеазы 2 таблетки
ДНКаза I 8.8 0,02 ЕД/мл
Заключительный том 4,400

Таблица 1: Рецепт лизисной буферной мастер-смеси.

ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лизиса может быть изменен, чтобы содержать больше ингибиторов протеазы (таких как бестатин, лейпептин, апротинин и т. Д.), Если интересующий белок очень нестабилен, но важно избегать ЭДТА, чтобы поддерживать малые и большие субъединицы рибосомы, собранные во время следующих этапов. По аналогичным причинам всегда поддерживать не менее 6 мМMgCl2 в буферном растворе.

ВНИМАНИЕ: HCl обладает высокой коррозионной активностью, а PMSF токсичен. Носите перчатки и обращайтесь с осторожностью.

  1. Центрифуга в течение 2 мин при 30 000 х г, 4 °C для очистки лизата и сбора супернатанта.

4. Очистка рибосомно-зарождающихся цепных комплексов для SeRP

  1. Для каждого эксперимента разделите супернатант на две части; каждый в отдельной микроцентрифужной пробирке: общий образец РНК (~200 мкл) и образец иммуноочистки (IP) (~700 мкл) образцы транслейтома.
  2. Обработка общего образца РНК
    1. Переварить общий образец РНК с использованием 10 ЕД РНКазы I в течение 25 мин при 4 °C; вращение со скоростью вращения со скоростью вращения 30 об/мин с помощью вращающейся стойки для смешивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия пищеварения могут быть откалиброваны с использованием полисомного профилирования, чтобы обеспечить отсутствие пика переваривания или недоваривания моносом.
    2. Приготовьте мастер-микс сахарозной подушки, как описано в таблице 2.
Реагент Количество на образец (мкл) Конечная концентрация
50% сахароза 200 25%
1M Трис-HCl pH 8.0 8 20 мМ
3 млн кКл 18.7 140 мМ
1М МгCl2 4 10 мМ
100 мг/мл CHX 0.4 0,1 мг/мл
Ингибитор протеазы 1 таблетка
Заключительный том 400

Таблица 2: Рецепт мастер-микса для сахарозной подушки.

  1. Загрузите образец на 400 мкл сахарозной подушки и центрифуги в роторе TLA120 в течение 90 мин при 245 000 х г и при 4 °C.
  2. Быстро удалите супернатант с помощью вакуумного насоса и наложите гранулы с буфером лизиса 150 мкл. Повторно суспендировать гранулы путем встряхивания в течение 1 ч при 4 °C и при 300 об/мин.
  3. Повторное суспендирование остаточной гранулы путем пипетки и переноса в новую трубу объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 100-200 мкг общей РНК обычно достаточно для рибосомного профилирования общего транслейлома. Можно добавить стадию истощения рРНК, чтобы уменьшить загрязнение рРНК, которая является наиболее распространенным загрязнителем рибосомно-зарождающихся цепных комплексов аффинности очистки11 (см. обсуждение для получения дополнительной информации).
  1. Обработка образца иммуноочистки
    1. Промыть 100-400 мкл аффинно-связывающей матрицы (1:1 бусины, конъюгированные антителами в 70% EtOH) на образец с буфером лизиса 3 х 1 мл (без ДНКазы I и ингибиторов протеазы); повторно суспендируют матрицу сродства в буфере лизиса, а затем вращают со скоростью 30 об/мин с вращающейся стойкой смеси при 4 °C в течение 5 мин. Осаждение центрифугированием в течение 30 с при 3 000 х г, 4 °C. Отбросьте верхнюю жидкость. Повторите три раза.
    2. Переваривайте образцы иммуноочищения, используя 10 ЕД на единицу А260 нм РНКазы I вместе с аффинно-связывающей матрицей (например, 100-400 мкл GFP-TRAP на образец).
    3. Вращайте в течение 25 мин при 30 об/мин с помощью вращающейся стойки для смешивания, чтобы связать белок с матрицей сродства при 4 °C.
    4. Подготовьте мастер-смесь буфера для стирки, как описано в таблице 3.
Реагент Количество на образец (мкл) Конечная концентрация
10 мг/мл CHX 50 0,1 мг/мл
1M Трис-HCl pH 8.0 100 20 мМ
3 млн кКл 233 140 мМ
1М МгCl2 50 10 мМ
1М ПМСФ 5 1 мМ
НП-40 0.5 0.01%
Ингибитор протеазы 2 таблетки
50% глицерина 1,000 10%
Заключительный том 5,000

Таблица 3: Рецепт мастер-микса для промывки буфера.

  1. Трижды промывайте матрицу с аффинным связыванием 1 мл буфера для промывки, каждый раз в течение ~1 мин, вращаясь в стойке для смешивания при 30 об/мин, при 4 °C.
  2. Осаждение центрифугированием при 3 000 х г в течение 30 с при 4 °C. Отбросьте верхнюю жидкость.
  3. Промыть еще два раза в буфере для промывки 1 мл, каждый раз в течение 5 мин, вращая в стойке для смешивания при 30 об/мин, при 4 °C.
  4. Осаждение центрифугированием в течение 30 с при 3 000 х г и 4 °C.
  5. Используйте 50 мкл шариков для элюирования белка с таким же количеством 2-кратного буфера образца. Используйте остальные шарики для экстракции РНК.
  6. Центрифуга в течение 30 с при 3000 х г, 4 °C для гранулирования шариков и выброса верхней жидкости.
  7. Заморозить в жидком азоте и хранить при -80 °C. Используйте эти образцы для последующей экстракции РНК.
    ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение ночи или дольше. Это может быть остановочный пункт.
  8. Оцените успешность этапа аффинной очистки западным пятном или окрашиванием Кумасси аликвотами (~10% по объему, после смешивания) каждого этапа. Всегда используйте макет IP-адреса на штамме WT без тегов в качестве элемента управления для неспецифической привязки к матрице сходства.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокий неспецифический фон может быть преодолен дополнительными этапами промывки с увеличением концентрации соли/моющего средства. Транзиторное взаимодействие может быть стабилизировано лечением различными сшивающими агентами, например, обработкой параформальдегидом (PFA) живых клеток - добавление 0,4%-1% PFA в питательную среду в течение 2-5 мин с последующим гашением глицина (0,3 M) в течение 3 мин, настоятельно рекомендуется.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является подозреваемым канцерогеном. Поскольку параформальдегид быстро испаряется и является коррозионным, работайте в защитном кожухе и надевайте два слоя перчаток.

5. Подготовка библиотеки кДНК к глубокому секвенированию

  1. Экстракция РНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте с антипригарными трубками 1,5 мл без РНКазы, чтобы предотвратить возможное истощение РНК или ДНК.
    1. Разморозьте образцы с этапов 4.2.5 и 4.3.12 на льду и повторно суспендируйте образцы с 10 мМ Tris-HCl pH 7,0 до конечного объема 700 мкл.
      ВНИМАНИЕ: Кислота-фенол и хлороформ летучи и вредны. Работа в вытяжке с химической безопасностью.
    2. Добавьте 40 мкл 20% SDS к 0,7 мл total RNA или IP elutions. Закройте и переверните несколько раз. Осаждение белка должно сделать образцы белыми.
    3. Добавьте в образцы 0,75 мл предварительно нагретого кислотно-фенольного:хлороформа. Плотно запечатайте трубки и встряхните в термомешалке при 1 400 об/мин в течение 5 мин и при 65 °C. Охладите образцы на льду в течение 5 минут.
    4. Центрифугирование трубки с этапа 5.1.3. при 20 000 х г в течение 2 мин. Переложить верхний водный слой на свежий тюбик и добавить в него 0,7 мл кислоты-фенола:хлороформа.
    5. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, изредка вихрево. Центрифуга в течение 2 мин при 20 000 х г. Переложить верхний водный слой на свежий тюбик и добавить в него 0,6 мл хлороформа и вихря.
    6. Центрифуга в течение 1 мин при 20 000 х г. Переложить верхний водный слой на свежий тюбик.
    7. Осаждение нуклеиновых кислот путем добавления 78 мкл 3 M NaOAc, рН 5,5, 2 мкл GlycoBlue и 0,75 мл изопропанола. Тщательно вихрь в течение 5 мин. Инкубировать в течение не менее 1 ч при -80°С или 16 ч при -20°С.
    8. Центрифугу в течение 30 мин при 20 000 х г и при 4 °C и выбросьте супернатант. Гранулы промыть ледяным 0,75 мл 80% этанола. Переверните трубки для тщательной промывки. Центрифугу при 20 000 х г в течение 5 мин при 4 °С, а затем выбросьте надосадочную массу.
    9. Открутите при 450 х г, 4 °C в течение 20 с, удалите оставшийся этанол и выбросьте жидкости. Высушите гранулу открытой крышкой в течение 5 мин при 65 °C. Повторно суспендировать образцы следующим образом: для IP повторно суспендировать образец в 10 мкл 10 мМ Tris-HCl, рН 7,0. Для анализа общего транслейтома повторно суспендируют образец в 20 мкл 10 мМ Tris-HCl, рН 7,0.
      ТОЧКА ОСТАНОВКИ: РНК может храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев.
  2. Количественная оценка общей концентрации РНК с помощью флюорометрии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие материалы и поверхности должны быть свободны от РНКА при подготовке библиотеки кДНК к секвенированию следующего поколения. При работе с образцами РНК надевайте перчатки.
    1. Развести 1 мкл кислотной фенол-экстрагированной общей РНК в 9 мкл 10 мМ Tris-HCl, рН 7,0. Количественная оценка с помощью флуорометра, как указано на веб-сайте производителя.
    2. Разбавляют образцы, содержащие 50 мкг РНК, 10 мкл 10 мМ Tris-HCl, рН 7,0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не измеряйте образцы IP, используйте все для следующего шага.
  3. Гель-очистка рибосом защищенных фрагментов следов
    1. Установите 15% TBE-мочевинный полиакриламидный гель и погрузите в 1x TBE рабочий буфер. Работайте в течение 30 минут при напряжении 200 В перед загрузкой образца. К каждому образцу добавьте 20 мкл 2x буфера образцов TBE-мочевины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер полосы составляет около 25-35 нт.
    2. Разморозьте лестницу ДНК 10 бп и образцы денатуры (не лестницы) при 80 °C в течение 2 мин, а затем охладите на льду. Загрузите каждый образец на каждую другую полосу. Запускают гель в течение 50-70 мин при 200 В.
    3. Разбавить 6 мкл золота SYBR (концентрат 10 000 х) в 60 мл 1x TBE буфера и окрашивания при встряхивании в светонепроницаемых коробках в течение 15-20 мин. При окрашивании геля приготовьте стерильный скальпель и 0,5 мл гелеобразующих тюбиков в маркированных тюбиках по 1,5 мл.
    4. Иссейте нужные полосы стерильным скальпелем (используйте свежий или очистите хорошо между образцами) и поместите каждый кусочек геля в гелевое пробирку.
    5. Сделайте снимок геля, чтобы убедиться, что в геле не осталось остатков образца.
    6. Центрифугируют пробирки, содержащие нарезанные ломтики при 20 000 х г в течение 5 мин при 4 °С, и переложите оставшиеся кусочки геля из гелевой трубки в трубку 1,5 мл.
    7. Добавьте 0,5 мл 10 мМ Tris, рН 7,0. Встряхивайте в термомешалке при 1 400 об/мин в течение 10 мин при 70 °C.
    8. Переложить в колонну ацетата целлюлозы с широким отверстием пипетки и центрифугу при 20 000 х г в течение 3 мин при 4 °C.
    9. Перенесите поток в новую трубку объемом 1,5 мл и охладите на льду.
    10. Чтобы вывести в осадок нуклеиновые кислоты, добавьте: 550 мкл IPA, 55 мкл 3 M NaOAc и 2 мкл GlycoBlue и вихрь для тщательного смешивания. Поместите образцы при температуре -80 °C в течение не менее 1 ч.
    11. Центрифуга в течение не менее 1 ч при 20 000 х г и 4 °C и выбросьте супернатант. Промыть гранулы 0,75 мл ледяного 80% этанола. Переверните трубки для тщательной промывки, пока гранулы не отделятся от дна. Центрифугу снова при 20 000 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
    12. Открутите при 450 х г, 4 °C в течение 20 с и удалите оставшийся этанол. Высушите гранулы открытой крышкой в течение 5 мин при 65 °C.
    13. Добавьте 15 мкл 10 мМ Tris, рН 7,0 и тщательно суспендируйте гранулы. Открутите при 450 х г, 4 °C в течение 20 с и перенесите образец в новую трубку объемом 1,5 мл.
      ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Очищенная РНК может храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев.
  4. Дефосфорилирование
    1. Используйте 3 мкл следующей смеси для каждого образца: Добавьте 1 мкл ингибитора РНКАЗЫ в 2 мкл реакционного буфера 10x T4 полинуклеотидкиназы без АТФ. Добавьте 2 мкл полинуклеотидкиназы Т4 к каждому образцу. Пипетку аккуратно хорошо перемешать и инкубировать при 37 °С в течение 2 ч, не встряхивая.
    2. Чтобы инактивировать фермент, инкубируют образец при 75 °C в течение 10 мин и вращают вниз при 450 х г, 4 °C, в течение 20 с. Добавьте 0,5 мл 10 мМ Tris, рН 7,0.
    3. Для осаждения нуклеиновой кислоты добавляют 2 мкл GlycoBlue, 550 мкл IPA и 55 мкл 3 M NaOAc.
    4. Вихрь тщательно перемешать и охладить образцы при -80 °C в течение не менее 1 ч.
      ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение ночи или дольше.
    5. Повторите шаги 5.3.11-5.3.13.
      ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Дефосфорилированная РНК может храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев.
  5. Количественная оценка с помощью биоанализатора
    1. Сделайте разбавление 1:4 каждого образца РНК, смешивая 1 мкл образца и 4 мкл воды, обработанной DEPC.
      ВНИМАНИЕ: DEPC является канцерогеном. Надевайте перчатки и работайте осторожно.
    2. Запустите биоанализатор Малый чип РНК / TapeStation. Следуйте протоколу производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер фрагмента РНК, защищенной рибосомами, составляет около 28-30 нт.
  6. Ligate 3' конец с Linker-1
    1. Разводят 5 пмоль мелких фрагментов РНК до 10 мкл с 10 мМ Трис, рН 7,0. Денатурировать образцы при 80 °C в течение 2 мин и охлаждать на льду.
    2. Подготовьте мастер-микс, как описано в таблице 4 , и используйте 29 мкл на образец.
Реагент Количество на образец (мкл) Конечная концентрация
50% стерильно-фильтрованный PEG 8000 16 20%
ДМСО 4 10%
10× Т4 РНК лигазы 2 буфер 4 в 1 раз
Ингибитор SUPERase-In РНКАЗЫ 2 2 U
10 мМ аденилированный линкер 3-L1 0.1 25 мкМ
Вода, очищенная DEPC 2.9
Заключительный том 29

Таблица 4: Рецепт 3' конца лигирования мастер-микса.

  1. Добавьте 1 мкл Т4 РНК-лигазы 2 и пипетку осторожно, чтобы хорошо перемешать. Инкубировать при 23 °C в течение 2 ч.
  2. Чтобы вывести в осадок нуклеиновые кислоты, добавьте: 550 мкл IPA, 500 мкл 10 мМ Tris, рН 7,0, 55 мкл 3 M NaOAc и 2 мкл GlycoBlue. Вихрь тщательно перемешать и поместить образцы при -80 °C в течение 1 ч не менее.
    ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Храните образцы при температуре -80 °C в течение ночи или дольше.
  3. Повторите шаги 5.3.2-5.3.12.
  4. Повторно суспендировать гранулу в 6 мкл 10 мМ Трис, рН 7,0. Открутите при 450 x g, 4 °C в течение 20 с и перенесите образец в новую пробирку объемом 1,5 мл.
    ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.
  1. Гелевая очистка 3' связанных контуров
    1. Установите 10% TBE-мочевинный полиакриламидный гель и погрузите в 1x TBE рабочий буфер. Работайте в течение 30 минут при напряжении 200 В перед загрузкой образца. К каждому образцу добавьте 6 мкл 2x буфера образцов TBE-мочевины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер полосы составляет около 71-73 нт.
    2. Повторите шаги 5.3.2-5.3.13.
      ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.
  2. Обратная транскрибация 3ʹ связанных фрагментов следа для генерации ssDNA
    1. Приготовьте мастер-микс, как описано в таблице 5 , и используйте 3 мкл на образец.
Реагент Количество на образец (мкл) Конечная концентрация
10 мМ дНТП 1 0,5 мМ
25 мкМ линкер L(rt) 0.5 625 нМ
Вода, очищенная DEPC 1.5
Заключительный том 3

Таблица 5: Рецепт мастер-микса буфера обратной транскрипции перед денатурацией нуклеиновых кислот.

  1. Вихрь и вращение вниз образца.
  2. Инкубировать образцы при 65 °C в течение 5 мин.
  3. Охладите образцы на льду.
  4. Приготовьте мастер-микс, как описано в таблице 6 , и используйте 6 мкл на образец. Вихрь и вращение вниз образца. Добавьте 1 мкл надстрочного индекса III к каждому образцу и аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 30 мин при 50 °C.
Реагент Количество на образец (мкл) Конечная концентрация
5× буфер FS 4 в 1 раз
Ингибитор SUPERase-In РНКАЗЫ 1 2 U
Диагональ 0,1 М 1 5 мМ
Заключительный том 6

Таблица 6: Рецепт мастер-микса буфера обратной транскрипции после денатурации нуклеиновых кислот.

  1. Добавьте 2,3 мкл 1 N NaOH, который гидролизует РНК и гасит обратную транскрипцию.
    ВНИМАНИЕ: NaOH обладает высокой коррозионной активностью. Носите перчатки и защиту глаз.
  2. Инкубировать в течение 15 мин при 95 °C, пока образец не станет розовым.
  3. Установите 10% TBE-мочевинный полиакриламидный гель и погрузите в 1x TBE рабочий буфер. Работайте в течение 30 минут при напряжении 200 В перед загрузкой образца. К каждому образцу добавьте 23 мкл 2x буфера образцов TBE-мочевины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер полосы ДНК составляет 115-117 нт.
  4. Повторите шаги 5.3.2-5.3.12.
  5. Повторно суспендировать гранулу в 15 мкл 10 мМ Tris, рН 8,0. Открутите при 450 х г, 4 °C в течение 20 с и перенесите образец в новую трубку объемом 1,5 мл.
    ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.
  1. циркуляризация ssDNA
    1. Подготовьте следующую основную смесь и загрузите 4 мкл на образец, как показано в таблице 7.
Реагент Количество на образец (мкл) Конечная концентрация
10× буфер цирклигазы II 2 в 1 раз
5 M Бетаин (опционально) 1 0.25 млн
50 мМ МнКл2 1 2,5 мМ
Заключительный том 4

Таблица 7: Рецепт мастер-микса циркуляризации ssDNA .

  1. Добавляют 1 мкл цирклигазы II ssDNA лигазы к каждому образцу и инкубируют в течение 1 ч при 60 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность этой стадии может быть увеличена путем добавления 1 мкл цирклигазы II ssDNA лигазы к каждому образцу после инкубации через 1 ч.
  2. Инактивируют фермент путем инкубации при 80 °C в течение 10 мин.
  3. Охладить на льду и продолжить ПЦР-амплификацию или хранить при -80 °C.
    ОСТАНОВКА: Образцы могут храниться при -80 °C в течение многих лет.
  1. Амплификация ПЦР
    1. Подготовьте следующую основную смесь ПЦР и загрузите 82 мкл на образец, как описано в таблице 8.
Реагент Количество на образец (мкл) Конечная концентрация
Вода, очищенная DEPC 61.6
5× Фузионный HF реакционный буфер 17.6 в 1 раз
10 мМ дНТП 1.8 200 мкМ
100 мкМ ПЦР прямая праймер 0.2 225 нМ
КВ Фузионная полимераза 0.8 1.6 U
Заключительный том 82

Таблица 8: Рецепт мастер-микса для ПЦР-амплификации.

  1. К каждой трубке, содержащей мастер-микс, добавляют 5 мкл циркуляризированной ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните остальные циркулированные образцы ДНК при -80 °C.
  2. Добавьте к каждому образцу различный праймер с обратным штрих-кодом ПЦР объемом 1 мкл 20 мкМ (см. Таблицу 9) и вихрь для тщательного перемешивания.
  3. Aliquot каждая трубка в четыре отдельные ПЦР-трубки, каждая из которых будет использоваться для разного количества циклов ПЦР.
  4. Запустите реакцию ПЦР в соответствии со следующей программой, как описано в таблице 10.
Цикл Денатура (98 °C) Отжиг (60 °C) Расширение (72 °C)
1 30 с
2-16 10 с 10 с 5 с

Таблица 10: Программа ПЦР для реакции ПЦР.

  1. После циклов 8, 9, 10 и 11 удаляют трубки ПЦР (для образцов IP циклы варьируются от 9 до 15) в качестве первой попытки. После каждого цикла приостанавливайте программу, вынимайте одну аликвоту и кладите ее на лед, а затем быстро возобновляйте программу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество циклов должно быть скорректировано в зависимости от количества циркуляризированной ДНК в каждой реакции. Обратитесь к рисунку 4 для примера и дальнейших разъяснений.
  2. К каждой 17-мкл реакции добавляют 3,5 мкл 6-кратного ДНК-нагрузочного красителя.
  3. Разморозьте лестницу ДНК 10 bp.
  4. Для разделения размеров с помощью гель-электрофореза погрузьте 8% полиакриламид TBE в 1x TBE рабочий буфер и загрузите образцы каждого различного номера цикла в соседние скважины и запустите гель в течение 50 мин при 180 В.
  5. Разбавить 6 мкл золота SYBR (концентрат 10 000 х) в 60 мл 1x TBE буфера и окрашивания при встряхивании в светонепроницаемых коробках в течение 15-20 мин.
  6. При окрашивании геля приготовьте стерильный скальпель и 0,5 мл гелеобразующих тюбиков в маркированных тюбиках по 1,5 мл.
  7. Сделайте снимок окрашенных нуклеиновых кислот.
  8. Стерильным скальпелем нарежьте нужную полосу с ожидаемым размером полосы 174-176 bp и поместите ломтик геля в подготовленную гелеобразную трубку объемом 0,5 мл (тщательно очистите между образцами и используйте инактивирующий агент RNase или переключитесь на новое лезвие).
  9. Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 20 000 х г и 4 °C, а затем перенесите оставшиеся кусочки геля из гелеобразной трубки 0,5 мл в трубку 1,5 мл.
  10. Добавьте 500 мкл 10 мМ Tris, рН 8,0 и встряхните в термомешалке при 1 400 об/мин в течение 10 мин и 70 °C.
  11. Переложите растворенный гель на столб ацетата целлюлозы с широким отверстием пипетки.
  12. Центрифугируйте колонну в течение 3 мин при 20 000 х г и 4 °C и перенесите проточную трубу в новую трубку объемом 1,5 мл и охладите на льду.
  13. Чтобы вывести нуклеиновую кислоту в осадок, добавьте: 550 мкл IPA, 32 мкл 5 M NaCl, 1 мкл 0,5 M EDTA и 2 мкл GlycoBlue и вихрь для тщательного смешивания.
  14. Храните образцы в течение не менее 1 ч при -80 °C или -20 °C в течение ночи.
    ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение ночи или дольше.
  15. Повторите шаги 5.3.11-5.3.12.
  16. Повторное суспендирование в 11 мкл 10 мМ Tris, рН 8,0. Открутите при 450 х г, 4 °C в течение 20 с и перенесите образец в новую трубку объемом 1,5 мл.
    ОСТАНОВКА: Образцы могут храниться при -80 °C в течение многих лет.
  1. Количественная оценка распределения по размерам с помощью биоанализатора
    1. Сделайте разбавление 1:4 каждого образца, смешав 1 мкл образца с 4 мкл воды, обработанной DEPC.
    2. Запустите биоанализатор Малый чип РНК. Следуйте протоколу производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемая длина составляет 175 ± 5 bp.
  2. Количественная оценка концентрации ДНК с помощью флуорометра
    1. Выполните проверку концентрации dsDNA с высокой чувствительностью с помощью флуорометра в соответствии с рекомендациями производителя.
    2. Образцы мультиплексов и последовательностей в соответствии с рекомендациями Illumina (Index Adapters Pooling Guide12).

6. Анализ данных

  1. Выполните анализ, как описано в дополнительном файле.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как показано на блок-схеме этого протокола (рисунок 1), клетки выращивали до логарифмической фазы, а затем быстро собирали путем фильтрации и лизировали криогенным измельчением. Затем лизат был разделен на два: один для общих следов мРНК, защищенных рибосомами, а другой для выбранных следов мРНК, защищенных рибосомами, на которых мы выполнили аффинную очистку для снижения помеченных белково-рибосомно-зарождающихся цепей комплексов. Мы обеспечили экспрессию помеченного белка и успех анализа вытягивания с помощью вестерн-блоттинга, как видно на рисунке 2. Мы проверили выделение защищенных рибосом следов, которые обычно имеют длину 20-45 нт с помощью электрофореза малой РНК (система BioAnalyzer 2100), что позволяет обнаруживать сдвиг в размере 5-10 нт, согласно руководству по системе (рисунок 3). Затем мы создали библиотеку кДНК для глубокого секвенирования и анализа больших данных. При генерации библиотеки кДНК обратите внимание, что недостаточная цикличность может привести к низкому выходу (как видно на полосе 2 на рисунке 3), но возможно повторное усиление для восстановления сгенерированной библиотеки. Чрезмерная цикличность может произойти, когда праймеры ПЦР истощены, но реакция продолжается. Когда dNTP все еще присутствуют, реакция продолжается, генерируя более длинные артефакты ПЦР с химерными последовательностями из-за продуктов ПЦР, заправляющих себя13 (как видно на полосах 3-4 на рисунке 3, обозначенных видимым мазком). Если концентрация дНТП также становится предельной, могут появляться продукты, указывающие на наличие гетеродуплексов, состоящих только из частично гомологичных фрагментов библиотеки. Рисунок 4 выступает в качестве эталона, причем полоса 2 представляет оптимальное усиление, а полоса 3 - приемлемое усиление. Образцы из полос 4 и 5 (циклы 10 и 11) не должны использоваться из-за возможности введения дубликатов и артефактов ПЦР. Сгенерированная библиотека была дополнительно подтверждена высокочувствительным электрофорезом ДНК (использовалась та же система BioAnalyzer) для точного распределения размеров и количественной оценки (рисунок 5). После 3'-концевой лигирования линкера, обратной транскрипции и амплификации ПЦР ожидается распределение длины кДНК как таковое с резким пиком около 175 нт.

Мы обрезали и удалили адаптеры и штрих-коды из секвенированной библиотеки, и для дальнейшего анализа были выбраны только считывания между 20 и 45 нтами. На рисунке 6 показано результирующее распределение длины. Показания были разделены на различные группы: кодирующие последовательности, интроны и интергенные последовательности (рисунок 7) и далее классифицированы, как показано на рисунке 8.

Окончательный анализ для обнаружения и характеристики котрансляционных взаимодействий проводили на основе обогащения рибосомно-защищенных фрагментов мРНК, получив графики на рисунке 9. Мы сравнили нормализованное заполнение рибосом (на каждом нуклеотиде вдоль каждого орфа) общего транслейтома с соответствующим выбранным транслейломом (зарождающимся интерактомом). Сравнение по нуклеотидам исключает артефакты скорости трансляции. Воспроизводимость между биологическими репликами оценивали по корреляции Пирсона (пороговое > 0,6). Мы представляем селективные рибосомные профили, анализирующие котрансляционные взаимодействия Vma2p с тремя белками: рибосомно-ассоциированным шапероном Ssb1p, Pfk2p (фосфофруктокиназа) и Fas1p (синтаза жирных кислот), причем каждый белок C' терминально помечен GFP. Мы выполнили протокол в биологических репликах. Рисунок 9 A, D и G показывает экспериментальную схему очистки каждого аффинности. Далее мы показываем заполненность рибосом суммарных транслейломов по сравнению с интерактомами Ssb1 вдоль Vma2p orf, кодирующими субъединицу вакуолярной H+-АТФазы (рисунок 9 B, E и H). Наконец, мы выполнили профилирование рибосом на основе соотношения (IP/Total) в каждой позиции рибосомы в [кодоне/aa] вдоль орфа (рисунок 9 C, F и I). Сравнение котрансляционных взаимодействий этих трех белков с Vma2p, который синтезируется рибосомой, показало, что шаперон Ssb1 взаимодействует с зарождающимся Vma2p в четырех различных областях вдоль orf, поскольку мы определили четыре значительных пика обогащения SeRP. Иначе говоря, Pfk2p показывает только один значительный пик обогащения, идентифицированный SeRP, в другом положении по сравнению с котрансляционным шапероном Ssb1. Анализ котрансляционных взаимодействий Fas1 с зарождающимся Vma2p не обнаружил какого-либо значительного обогащения. Таким образом, сравнение этих рибосомных профилей обогащения на основе соотношения демонстрирует силу этого протокола в обнаружении и характеристике различных котрансляционных взаимодействий в близком к кодон-разрешении.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативный результат вестерн-блоттинга после аффинной очистки штамма BY4741 с HA-меткой Naa10. Репрезентативный результат западного пятна после аффинной очистки штамма BY4741 с HA-меткой Naa10 показывает полосу около 27,8 кДа, в то время как дикий тип, как отрицательный контроль, не показывает полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативный результат BioAnalyzer после выделения следа и экстракции РНК кислотой-фенолом:хлороформом и средним размером 25 нт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативный гель-электрофорез ПЦР-амплификации. Репрезентативный гель-электрофорез ПЦР-амплификации с полосами 2-5, нагруженными продуктами ПЦР из циклов 8-11, и лестницами с обеих сторон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативный результат BioAnalyzer, полученный после создания библиотеки кДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Ожидаемое распределение длин чтения после удаления адаптеров с Cutadapt (удаление показаний короче 20 или длиннее 45). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Ожидаемый процент успеха выравнивания после удаления некодирующих считываний РНК с Bowtie2 и использования TopHat для выравнивания оставшихся показаний для разных организмов. Образец был взят из S. cerevisiae (мутировавший вариант BY4741). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: График, сгенерированный с помощью RiboToolkit, представляющий ожидаемое и некодирующее соотношение выровненных считываний после использования Bowtie2 для удаления элементов рРНК в считываниях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Котрансляционные взаимодействия трех различных белков: Ssb1p, Pfk2p и Fas1p с Vma2p, который синтезируется рибосомой, анализируемой SeRP. Все оси y показаны в считывании считываний на миллион (RPM). (А, Д, Г) Экспериментальная схема SeRP Ssb1p, Pfk2p и Fas1p C' терминально помечена GFP соответственно. (В, Е, Н) Заполненность рибосом вдоль орфа общих транслейломов по сравнению с интерактомами Ssb1, Pfk2p и Fas1p соответственно (в биологических репликатах). (С, Ф, И) Среднее обогащение Ssb1p, Pfk2p и Fas1p (отношение IP/Total) в каждой позиции рибосомы в [кодоне/aa] вдоль orf, соответственно. На вариацию между биологическими репликами указывает затененная область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 9: 3' Последовательности компоновщика и грунтовки. 3' Linker L1: Linker 3-L1 с 5ʹ аденилированием и 3ʹ дидезокси-цитидин уникальными молекулярными идентификаторами ('NN...') (Очистка ВЭЖХ без РНКазы; Обратный транскрипционный линкер: обратная транскрипция (L(rt)) с 5ʹ фосфорилированными, уникальными молекулярными идентификаторами (очистка ВЭЖХ без РНКазы); ПЦР форвард праймер: PCRf; ВЭЖХ очищена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь протокол детализирует подход селективного профилирования рибосом для захвата котрансляционных взаимодействий в разрешении, близком к кодону. Поскольку рибосома поднимается как узел для координации появления зарождающейся цепи в переполненной цитоплазме, это является важным методом выявления и характеристики различных котрансляционных взаимодействий, необходимых для обеспечения функционального протеома, а также для изучения различных заболеваний. На сегодняшний день SeRP является единственным методом, который может фиксировать и характеризовать эти взаимодействия, прямым образом, in vivo 14,15,16.

Первым и наиболее важным этапом является сбор и лизис клеток. Крайне важно в течение нескольких секунд захватить непрерывный перевод путем мгновенного замораживания с последующим лизисом в замороженном состоянии. Сбор клеток должен проводиться с поспешностью, чтобы избежать рибосомного стока, а также индуцирования стрессовых трансляционных реакций, которые могут происходить быстро. Вторым критическим этапом является этап аффинной очистки. Крайне важно уменьшить фоновое связывание путем строгой стирки, обеспечивая при этом поддержание котрансляционных взаимодействий, что может быть облегчено с помощью перекрестного связывания in vivo . Поскольку этот протокол основан на высокочувствительном NGS (Next Generation Sequencing), высокий фон на первых шагах может быть усилен на следующих этапах подготовки библиотеки кдНК, что приводит к низкому соотношению сигнал/шум.

Лечение нуклеазами для переваривания всех незащищенных мРНК должно оцениваться путем полисомного профилирования17 вместе с тщательной оценкой распределения размеров изолированных рибосомных следов (как подробно описано выше), чтобы избежать чрезмерного или недостаточного переваривания РНК. Калибровка концентрации нуклеазы и времени переваривания может способствовать точному восстановлению следа, поскольку чрезмерное пищеварение может привести к перевариванию рибосомной рРНК, что приводит к потере следов, защищенных рибосомами. Важно отметить, что недостаточное пищеварение может также привести к снижению частоты обнаружения следов, защищенных рибосомами, поскольку этапы подготовки библиотеки кДНК, а также этапы анализа данных, описанные здесь, отбрасывают длинные, нехарактерные чтения.

Хотя истощение рРНК не всегда является критическим шагом и не является обязательным, оно имеет некоторые преимущества, такие как более чистые образцы и, следовательно, более высокая скорость считывания генома. С другой стороны, существует вероятность смещений, так как многие протоколы истощения рРНК могут также вызвать истощение желаемых фрагментов, защищенных рибосомами. Следует также учитывать стоимость наборов для истощения рРНК. Истощение рРНК может быть выполнено после стадии выделения рибосомно-ножного отпечатка или после стадии циркуляризации кДНК.

Этапы подготовки библиотеки кДНК, описанные здесь, были оптимизированы для низкого входа мРНК, поскольку этапы аффинности и очистки рибосом значительно уменьшают входное количество мРНК по сравнению с исследованиями экспрессии РНК-seq. Масштабирование начального количества клеточных культур может значительно облегчить генерацию библиотеки кДНК. В качестве альтернативы, любой выбранный протокол библиотеки кДНК может соответствовать этапам очистки аффинности и изоляции следа, описанным здесь. Важно отметить, что лечение нуклеазой, генерирующее рибосомные следы, требует результирующей репарации концов мРНК (подготовка библиотеки кдНК, стадия дефосфорилирования), чтобы обеспечить следующие этапы лигирования компоновщика в протоколе кДНК, описанном здесь в выбранном вами протоколе.

Во время секвенирования важно дифференцировать SeRP от RNA-Seq, так как гетерогенность генерируемых библиотек сильно варьируется в зависимости от факторов, помеченных аффинити. Молекулярные шапероны и целевые факторы часто более беспорядочны в связывании, взаимодействуя с сотнями или тысячами субстратов во время трансляции, что приводит к очень разнообразным библиотекам кДНК. Однако высокоспецифичные интеракторы, такие как котрансляционные сложные ассемблерные интеракторы, часто могут привести к созданию гораздо менее разнообразных библиотек кДНК. Всплеск разнообразных и неразнообразных библиотек на одной полосе может значительно улучшить последовательность и следование результатам анализа данных.

Еще одной уникальной особенностью SeRP является его способность улавливать локальные вариации в заполнении рибосом вдоль орфа , что позволяет обнаруживать рибосомные сдвиги в скорости трансляции, связанные с каждым набором взаимодействий. Поэтому крайне важно сравнить оккупантность рибосом в каждом кодоне вдоль орфа , чтобы правильно определить обогащение. Использование средних значений orfs может привести к потере переходных взаимодействий или ложному обнаружению.

Правильное использование метода SeRP открывает множество котрансляционных путей для прямого анализа, открывая новые механистические особенности, а также новые рибосомные факторы, революционизируя поле биосинтеза белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории за плодотворные дискуссии и Мухаммада Махзуми за критическое прочтение рукописи. Эта работа финансировалась грантом ISF (Израильский научный фонд) 2106/20.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631 6×
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876 2×
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  3. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  4. Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast. Nature Protocols. , (2019).
  5. Knorr, A. G., et al. Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).
  6. Matsuo, Y., Inada, T. The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway. Cell Reports. 34 (12), (2021).
  7. Döring, K., et al. Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding. Cell. , (2017).
  8. Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting. Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).
  9. Janke, C., et al. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).
  10. Levi, O., Arava, Y. Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae. Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).
  11. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
  12. Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf (2019).
  13. Kanagawa, T. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).
  14. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), (2021).
  15. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  16. Joazeiro, C. A. P. Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).
  17. Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820 (2017).

Tags

Биология выпуск 176
Глобальная идентификация сетей котрансляционного взаимодействия путем селективного профилирования рибосом
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, … More

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter