Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62878
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

In de afgelopen jaren is het duidelijk geworden dat ribosomen niet alleen ons mRNA decoderen, maar ook de opkomst van de polypeptideketen in de drukke cellulaire omgeving begeleiden. Ribosomen bieden het platform voor ruimtelijk en kinetisch gecontroleerde binding van membraan-targeting factoren, het modificeren van enzymen en het vouwen van chaperonnes. Zelfs de assemblage in oligomere complexen van hoge orde, evenals eiwit-eiwitnetwerkvormingsstappen, werden onlangs ontdekt om te worden gecoördineerd met synthese.

Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode die is ontwikkeld om co-translationele interacties in vivo vast te leggen. We zullen de verschillende affiniteitszuiveringsstappen beschrijven die nodig zijn voor het vastleggen van ribosoom-ontluikende ketencomplexen samen met co-translationele interactoren, evenals de mRNA-extractie, grootte-uitsluiting, reverse transcriptie, deep-sequencing en big-data-analysestappen, die nodig zijn om co-translationele interacties in bijna-codonresolutie te ontcijferen.

Introduction

Selective Ribosome Profiling (SeRP) is tot op heden de enige methode die co-translationele interacties, in vivo, op een directe maniervastlegt en karakteriseert 1,2,3,4,5,6. SeRP maakt globale profilering van interacties van elke factor mogelijk met het vertalen van ribosomen in bijna codonresolutie 2,7.

De methode is gebaseerd op het flashvriezen van groeiende cellen en het behoud van actieve translatie. Cellysaten worden vervolgens behandeld met RNase I om al het mRNA in de cel te verteren, behalve ribosoom-beschermde mRNA-fragmenten die "ribosoomvoetafdrukken" worden genoemd. Het monster wordt vervolgens in twee delen gesplitst; een deel wordt direct gebruikt voor de isolatie van alle cellulaire ribosomale voetafdrukken, die alle lopende vertaling in de cel vertegenwoordigen. Het tweede deel wordt gebruikt voor de affiniteitszuivering van de specifieke subset van ribosomen geassocieerd met een factor van belang, bijvoorbeeld: het modificeren van enzymen, translocatiefactoren, vouw chaperonnes en complex-assemblage interacties. De affiniteitsgezuiverde ribosomale voetafdrukken worden gezamenlijk het interactoom genoemd. Vervolgens worden de ribosoombeveiligde mRNA's geëxtraheerd en gebruikt voor het genereren van cDNA-bibliotheken, gevolgd door diepe sequencing.

Vergelijkende analyse van de totale translatoom- en interactoommonsters maakt het mogelijk om alle orfs te identificeren die verband houden met de factor van belang, evenals karakterisering van elk orf-interactieprofiel. Dit profiel rapporteert de precieze betrokkenheids- en beëindigingssequenties waaruit men de gedecodeerde codons en de respectieve residuen van de opkomende polypeptideketen kan afleiden, evenals op de ribosoomsnelheidsvariaties tijdens de interactie 7,8. Figuur 1 geeft het protocol weer als een schema.

Figure 1
Figuur 1: Een overzicht van het SeRP-protocol. Dit protocol kan in zijn geheel binnen 7-10 dagen worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Het genereren van stammen voor selectieve ribosoomprofilering

OPMERKING: Selective Ribosome Profiling (SeRP) is een methode die vertrouwt op affiniteitszuivering van factoren van belang, om hun interactiewijze met ribosomen-ontluikende ketencomplexen te beoordelen. Homologe recombinatie9, evenals CRISPR / Cas910-gebaseerde methoden worden gebruikt om verschillende factoren van belang te fuseren met tags voor affiniteitszuiveringen. Dergelijke tags zijn GFP, voor GFP-trap affiniteitszuiveringen, TAP-tag voor IgG-Sepharose kralenzuiveringen en AVI-Tag gezuiverd door avidin of streptavidin, om een paar succesvolle voorbeelden van de afgelopen jaren op te sommen.

  1. Voer groei- of functionele testen uit om te valideren dat tagging geen invloed had op de eiwitfunctie. N' versus C' terminal tagging moet worden geëvalueerd.
    OPMERKING: De ribosomen (rRNA), evenals veel ribosoombindende domeinen in verschillende factoren, zijn sterk geladen, waardoor sterk geladen tags (zoals polyhistidine) onprefereerbaar zijn om te gebruiken, omdat dit kan leiden tot valse ontdekking of veranderde bindingsmodus.

2. Cultuurgroei

  1. Cultiveer de geconstrueerde gistculturen (gebaseerd op de stam BY4741), die de gewenste gelabelde eiwitten bevatten, in vloeibaar gist-extract-pepton-dextrose (YPD)-rijk medium, of in synthetisch dextrose (SD) minimaal medium (1,7 g/ L giststikstofbasis met ammoniumsulfaat of 1,7 g / L giststikstofbasis zonder ammoniumsulfaat met 1 g / L mononatriumglutamaatzuur, 2% glucose en aangevuld met een volledig of geschikt mengsel van aminozuren).
  2. Kweek 250-500 ml celcultuur tot een 0,5 OD600 (mid-log), bij 30 °C, in een geschikt medium.

3. Celverzameling en lysis

  1. Verzamel snel cellen door vacuümfiltratie op een nitrocellulose blotting membraan van 0,45 μm met een glasfiltersysteem (glazen filterhouder met 1 L glazen trechter, vacuümvoet en dop, roestvrijstalen scherm, pakking en veerklem, 90 mm; geslepen kolf 1 L).
  2. Flash bevries de verzamelde cellen, door de gepelletiseerde cellen met een spatel te schrapen en ze onmiddellijk onder te dompelen in een met vloeibare stikstof gevulde buis van 50 ml.
    STOPPUNT: De cellen kunnen maximaal 3-4 weken bij -80 °C worden bewaard.
  3. Voer cellyse uit door cryogene maling in een mengmolen: tweemaal gedurende 2 minuten bij 30 Hz, met 1 ml van de lysisbuffer (zie tabel 1). Koel af in vloeibare stikstof tussen de frezen.
Reagens Hoeveelheid per monster (μL) Eindconcentratie
10 mg/ml CHX (cycloheximide) 220 0,5 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0 88 20m
3M KCl 205.7 140m
1m mgcl2 26.4 6mM
1M PMSF 4.4 1 mM
Np-40 4.4 0.10%
Proteaseremmer 2 tabletten
DNase I 8.8 0,02 U/ml
Eindvolume 4,400

Tabel 1: Recept voor de lysis buffer master mix.

OPMERKING: Lysisbuffer kan worden gewijzigd om meer proteaseremmers te bevatten (zoals bestatine, leupeptine, aprotinine, enz.) in het geval dat het eiwit van belang zeer onstabiel is, maar het is belangrijk om EDTA te vermijden om de kleine en grote subeenheden van het ribosoom te behouden die tijdens de volgende stappen zijn samengesteld. Om soortgelijke redenen moet u altijd ten minste 6 mM MgCl2 in de bufferoplossing bewaren.

LET OP: HCl is zeer corrosief en PMSF is giftig. Draag handschoenen en hanteer met zorg.

  1. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 30.000 x g, 4 °C om het lysaat te verwijderen en supernatant te verzamelen.

4. Zuivering van ribosoom-ontluikende ketencomplexen voor SeRP

  1. Verdeel voor elk experiment het supernatant in twee delen; elk in een andere microcentrifugebuis: totaal RNA-monster (~ 200 μL) en immunozuivering (IP) monster (~ 700 μL) translatoommonsters.
  2. Verwerking van het totale RNA-monster
    1. Vergist het totale RNA-monster met 10 U RNase I gedurende 25 minuten bij 4 °C; roteren bij 30 RPM met een roterend mixrek.
      OPMERKING: De spijsvertering kan worden gekalibreerd met behulp van polysoomprofilering om ervoor te zorgen dat er geen over- of ondervertering van monosomen piekt.
    2. Bereid de sucrosekussenmastermix zoals beschreven in tabel 2.
Reagens Hoeveelheid per monster (μL) Eindconcentratie
50% sucrose 200 25%
1M Tris-HCl pH 8,0 8 20m
3M KCl 18.7 140m
1m mgcl2 4 10m
100 mg/ml CHX 0.4 0,1 mg/ml
Proteaseremmer 1 tablet
Eindvolume 400

Tabel 2: Recept voor sucrose kussen master mix.

  1. Laad het monster op 400 μL van het sucrosekussen en centrifugeer in een TLA120-rotor gedurende 90 minuten bij 245.000 x g en bij 4 °C.
  2. Verwijder het supernatant snel met een vacuümpomp en leg pellets over elkaar met een lysisbuffer van 150 μL. Resuspendeer de pellets door gedurende 1 uur te schudden bij 4 °C en bij 300 RPM.
  3. Resuspendeer de resterende pellet door pipetteer en breng over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
    OPMERKING: 100-200 μg totaal RNA is meestal voldoende voor ribosoomprofilering van het totale translatoom. Men kan rRNA-depletiestap toevoegen om rRNA-verontreiniging te verminderen, wat de meest voorkomende verontreiniging is van ribosoom-ontluikende ketencomplexen affiniteitszuiveringen11 (zie discussie voor meer details).
  1. Verwerking van het immunozuiveringsmonster
    1. Was 100-400 μL van de affiniteitsbindende matrix (1:1 antilichaam-geconjugeerde kralen in 70% EtOH) per monster met 3 x 1 ml lysisbuffer (zonder DNase I en proteaseremmers); resuspendeer de affiniteitsmatrix in de lysisbuffer en roteer vervolgens op 30 RPM met een roterend mengrek bij 4 °C gedurende 5 min. Neerslaan door centrifugeren gedurende 30 s bij 3.000 x g, 4 °C. Gooi de bovenste vloeistof weg. Herhaal dit drie keer.
    2. Verwerk immunozuiveringsmonsters met behulp van 10 U per A260 nm-eenheid RNase I, samen met affiniteitsbindende matrix (bijvoorbeeld 100-400 μL GFP-TRAP per monster).
    3. Draai gedurende 25 minuten bij 30 RPM met een roterend mengrek om het eiwit te binden aan de affiniteitsmatrix, bij 4 °C.
    4. Bereid het wasbuffermengsel zoals beschreven in tabel 3.
Reagens Hoeveelheid per monster (μL) Eindconcentratie
10 mg/ml CHX 50 0,1 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0 100 20m
3M KCl 233 140m
1m mgcl2 50 10m
1M PMSF 5 1 mM
Np-40 0.5 0.01%
Proteaseremmer 2 tabletten
50% glycerol 1,000 10%
Eindvolume 5,000

Tabel 3: Recept voor de wasbuffer master mix.

  1. Was de affiniteitsbindende matrix driemaal met 1 ml wasbuffer, telkens gedurende ~1 min, draaiend in het mengrek bij 30 RPM, bij 4 °C.
  2. Neerslaan door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C. Gooi de bovenste vloeistof weg.
  3. Was nog twee keer in een wasbuffer van 1 ml, telkens gedurende 5 minuten, draaiend in het mengrek bij 30 rpm, bij 4 °C.
  4. Neerslaan door centrifugeren gedurende 30 s bij 3.000 x g en 4 °C.
  5. Gebruik 50 μL kralen voor eiwitelutie met dezelfde hoeveelheid 2x monsterbuffer. Gebruik de rest van de kralen voor RNA-extractie.
  6. Centrifugeer gedurende 30 s bij 3.000 x g, 4 °C om de kralen te pelleteren en gooi de bovenste vloeistof weg.
  7. Bevries in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C. Gebruik deze monsters voor latere RNA-extractie.
    STOPPLAATS: Monsters kunnen 's nachts of langer bij -80 °C worden bewaard. Dit kan een pleisterplaats zijn.
  8. Beoordeel het succes van de affiniteitszuivering stap door western blot of Coomassie kleuring met aliquots (~ 10% van het volume, na mengen) van elke stap. Gebruik altijd mock IP op een niet-getagde WT-stam als controle voor niet-specifieke binding aan de affiniteitsmatrix.
    OPMERKING: Hoge niet-specifieke achtergrond kan worden overwonnen door extra wasstappen met toenemende zout- / wasmiddelconcentraties. Voorbijgaande interactie kan worden gestabiliseerd door verschillende cross-linking middelen behandeling, bijvoorbeeld paraformaldehyde (PFA) behandeling van levende cellen - het toevoegen van 0,4% -1% PFA aan de groeimedia gedurende 2-5 min, gevolgd door glycine (0,3 M) blussen gedurende 3 minuten, wordt sterk aanbevolen.
    LET OP: Paraformaldehyde is vermoedelijk carcinogeen. Omdat paraformaldehyde snel verdampt en corrosief is, werk je in een chemische veiligheidskap en draag je twee lagen handschoenen.

5. cDNA-bibliotheekvoorbereiding voor diepe sequencing

  1. RNA-extractie
    OPMERKING: Werk met RNase-vrije antiaanbaksbuizen van 1,5 ml om mogelijke RNA- of DNA-uitputting te voorkomen.
    1. Ontdooi de monsters van stap 4.2.5 en 4.3.12 op ijs en resuspensiemonsters met 10 mM Tris-HCl pH 7.0 tot een eindvolume van 700 μL.
      LET OP: Zuurfenol en chloroform zijn vluchtig en schadelijk. Werk in een chemische veiligheidskap.
    2. Voeg 40 μL 20% SDS toe aan 0,7 ml Totale RNA- of IP-elutie. Een paar keer sluiten en omkeren. Eiwitprecipitatie moet de monsters wit maken.
    3. Voeg 0,75 ml voorverwarmd zuurfenol: chloroform toe aan monsters. Sluit de buizen goed af en schud in een thermische menger bij 1.400 RPM gedurende 5 min en bij 65 °C. Koel monsters op ijs gedurende 5 minuten.
    4. Centrifugeer de buis uit stap 5.1.3. bij 20.000 x g gedurende 2 min. Breng de bovenste waterige laag over in een verse buis en voeg er 0,7 ml zuur-fenol:chloroform aan toe.
    5. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, af en toe vortexing. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 20.000 x g. Breng de bovenste waterige laag over in een verse buis en voeg er 0,6 ml chloroform en vortex aan toe.
    6. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 20.000 x g. Breng de bovenste waterige laag over in een verse buis.
    7. Precipiteer nucleïnezuren door toevoeging van 78 μL 3 M NaOAc, pH 5,5, 2 μL GlycoBlue en 0,75 ml isopropanol. Vortex grondig gedurende 5 min. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij -80 °C of 16 h bij -20 °C.
    8. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 20.000 x g en bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Was de pellets met ijskoude 0,75 ml 80% ethanol. Keer de buisjes om voor een grondige wasbeurt. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant vervolgens weg.
    9. Draai af op 450 x g, 4 °C gedurende 20 s en verwijder de resterende ethanol en gooi de vloeistoffen weg. Droog de pellet met een open deksel gedurende 5 min bij 65 °C. Resuspensie van de monsters als volgt: voor IP resuspensie het monster in 10 μL van 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Voor totale translatoomanalyse resuspenseer het monster in 20 μL van 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      STOPPUNT: RNA kan maandenlang bij -80 °C worden bewaard.
  2. Kwantificeer de totale RNA-concentratie door fluorometrie
    OPMERKING: Alle volgende materialen en oppervlakken moeten RNase-vrij zijn terwijl de cDNA-bibliotheek wordt voorbereid op de volgende generatie sequencing. Draag bij het hanteren van RNA-monsters handschoenen.
    1. Verdun 1 μL zuurfenol-geëxtraheerd totaal RNA in 9 μL van 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kwantificeren met behulp van een fluorometer, zoals aangegeven op de website van de fabrikant.
    2. Verdun de monsters die 50 μg RNA bevatten met 10 μL van 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      OPMERKING: Meet geen IP-monsters, gebruik alles voor de volgende stap.
  3. Gelzuiver ribosoom beschermde voetafdrukfragmenten
    1. Stel een 15% TBE-ureum polyacrylamide gel in en dompel onder in 1x TBE loopbuffer. Voer gedurende 30 minuten op 200 V voordat het monster wordt geladen. Voeg aan elk monster 20 μL 2x TBE-ureummonsterbuffer toe.
      OPMERKING: De verwachte bandgrootte is ongeveer 25-35 nt.
    2. Ontdooi een DNA-ladder van 10 bp en denaturatiemonsters (geen ladder) bij 80 °C gedurende 2 minuten en koel vervolgens op ijs. Laad elk monster op elke andere rijstrook. Laat de gel 50-70 min op 200 V lopen.
    3. Verdun 6 μL SYBR Gold (10.000 x concentraat) in 60 ml 1x TBE buffer en beits tijdens het schudden in lichtbeschermde dozen gedurende 15-20 minuten. Bereid tijdens het kleuren van de gel een steriel scalpel en 0,5 ml gelbrekerbuisjes in gelabelde tubes van 1,5 ml.
    4. Snijd de gewenste banden weg met een steriel scalpel (gebruik een vers scalpel of reinig goed tussen de monsters) en plaats elk gelstuk in een gel-breaker tube.
    5. Maak een afbeelding van de gel om er zeker van te zijn dat er geen monsterresten in de gel achterblijven.
    6. Centrifugeer de buisjes met gesneden plakjes op 20.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en breng de resterende gelstukken over van de gelbrekerbuis naar de buis van 1,5 ml.
    7. Voeg 0,5 ml 10 mM Tris toe, pH 7,0. Schud in een thermische menger bij 1.400 RPM gedurende 10 min bij 70 °C.
    8. Breng over in een celluloseacetaatkolom met een pipetpunt met brede boring en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
    9. Breng de doorstroom over naar een nieuwe buis van 1,5 ml en koel op ijs.
    10. Om de nucleïnezuren neer te slaan, voegt u toe: 550 μL IPA, 55 μL 3 M NaOAc en 2 μL GlycoBlue en vortex om grondig te mengen. Breng de monsters gedurende ten minste 1 uur op -80 °C.
    11. Centrifugeer gedurende ten minste 1 uur bij 20.000 x g en 4 °C en gooi het bovennatuurlijke middel weg. Was de pellets met 0,75 ml ijskoude 80% ethanol. Keer de buizen om voor een grondige wasbeurt totdat de pellets van de bodem scheiden. Centrifugeer opnieuw bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
    12. Draai af op 450 x g, 4 °C gedurende 20 s en verwijder de resterende ethanol. Droog de pellets met een open deksel gedurende 5 min bij 65 °C.
    13. Voeg 15 μL 10 mM Tris, pH 7,0 toe en resuspenseer de pellets grondig. Draai af op 450 x g, 4 °C gedurende 20 s en breng het monster over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
      STOPPUNT: Gezuiverd RNA kan enkele maanden bij -80 °C worden bewaard.
  4. Defosforylering
    1. Gebruik 3 μL van de volgende mix voor elk monster: Voeg 1 μL RNase-remmer toe aan 2 μL 10x T4 polynucleotidekinasereactiebuffer zonder ATP. Voeg 2 μL T4 polynucleotidekinase toe aan elk monster. Pipetteer voorzichtig om goed te mengen en incubeer op 37 °C gedurende 2 uur, zonder te schudden.
    2. Om het enzym te inactiveren, incubeer het monster bij 75 °C gedurende 10 minuten en spint u het monster bij 450 x g, 4 °C, gedurende 20 s. Voeg 0,5 ml 10 mM Tris toe, pH 7,0.
    3. Om nucleïnezuur neer te slaan, voegt u 2 μL GlycoBlue, 550 μL IPA en 55 μL 3 M NaOAc toe.
    4. Vortex om de monsters grondig te mengen en gedurende ten minste 1 uur bij -80 °C af te koelen.
      STOPPLAATS: Monsters kunnen 's nachts of langer bij -80 °C worden bewaard.
    5. Herhaal stap 5.3.11-5.3.13.
      STOPPUNT: Gedefosforyleerd RNA kan maandenlang bij -80 °C worden bewaard.
  5. Kwantificering met behulp van een bioanalyzer
    1. Maak een 1:4 verdunning van elk RNA-monster door 1 μL monster en 4 μL DEPC-behandeld water te mengen.
      LET OP: DEPC is een carcinogeen. Draag handschoenen en werk voorzichtig.
    2. Voer een Bioanalyzer Small RNA Chip/TapeStation uit. Volg het protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: De verwachte ribosoom-beschermde RNA-fragmentgrootte is ongeveer 28-30 nt.
  6. Ligate 3' einde met Linker-1
    1. Verdun 5 pmol van kleine RNA-fragmenten tot 10 μL met 10 mM Tris, pH 7,0. Denaturatiemonsters bij 80 °C gedurende 2 minuten en koelen af op ijs.
    2. Bereid het basismengsel zoals beschreven in tabel 4 en gebruik 29 μL per monster.
Reagens Hoeveelheid per monster (μL) Eindconcentratie
50% steriel gefilterde PEG 8000 16 20%
DMSO 4 10%
10× T4 RNA ligase 2 buffer 4 1x
SUPERase-In RNase-remmer 2 2 U
10 mM geadenyleerde linker 3-L1 0.1 25 μM
DEPC-behandeld water 2.9
Eindvolume 29

Tabel 4: Recept voor 3' end ligation master mix.

  1. Voeg 1 μL T4 RNA ligase 2 toe en pipetteer voorzichtig om goed te mengen. Incubeer bij 23 °C gedurende 2 uur.
  2. Om de nucleïnezuren neer te slaan, voegt u toe: 550 μL IPA, 500 μL 10 mM Tris, pH 7,0, 55 μL van 3 M NaOAc en 2 μL GlycoBlue. Vortex om grondig te mengen en plaats de monsters minstens 1 uur bij -80 °C.
    STOPPLAATS: Bewaar de monsters bij -80 °C 's nachts of langer.
  3. Herhaal stap 5.3.2-5.3.12.
  4. Resuspendeer de pellet in 6 μL van 10 mM Tris, pH 7,0. Draai af bij 450 x g, 4 °C gedurende 20 s, en breng het monster over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
    STOPPLAATS: Monsters kunnen maandenlang bij -80 °C worden bewaard.
  1. Gelzuivering van 3' gekoppelde voetafdrukken
    1. Stel een 10% TBE-ureum polyacrylamide gel in en dompel onder in 1x TBE loopbuffer. Voer gedurende 30 minuten op 200 V voordat het monster wordt geladen. Voeg aan elk monster 6 μL 2x TBE-ureummonsterbuffer toe.
      OPMERKING: De verwachte bandgrootte is ongeveer 71-73 nt.
    2. Herhaal stap 5.3.2-5.3.13.
      STOPPLAATS: Monsters kunnen maandenlang bij -80 °C worden bewaard.
  2. Omgekeerde transcribeer 3ʹ gekoppelde voetafdrukfragmenten om ssDNA te genereren
    1. Bereid een hoofdmengsel zoals beschreven in tabel 5 en gebruik 3 μL per monster.
Reagens Hoeveelheid per monster (μL) Eindconcentratie
10 mM dNTPs 1 0,5 mM
25 μM linker L(rt) 0.5 625 nM
DEPC-behandeld water 1.5
Eindvolume 3

Tabel 5: Recept voor de reverse transcriptie buffer master mix voorafgaand aan de denaturatie van nucleïnezuren.

  1. Vortex en spin het monster.
  2. Incubeer monsters bij 65 °C gedurende 5 min.
  3. Koel monsters op ijs.
  4. Bereid een hoofdmengsel zoals beschreven in tabel 6 en gebruik 6 μL per monster. Vortex en spin het monster. Voeg 1 μL Superscript III toe aan elk monster en pipetteer voorzichtig om goed te mengen en incubeer gedurende 30 minuten bij 50 °C.
Reagens Hoeveelheid per monster (μL) Eindconcentratie
5× FS-buffer 4 1x
SUPERase-In RNase-remmer 1 2 U
DTT 0,1 m 1 5mM
Eindvolume 6

Tabel 6: Recept voor de reverse transcriptie buffer master mix na denaturatie van nucleïnezuren.

  1. Voeg 2,3 μL 1 N NaOH toe, die RNA hydrolyseert en de reverse transcriptie dooft.
    LET OP: NaOH is zeer corrosief. Draag handschoenen en oogbescherming.
  2. Incubeer gedurende 15 minuten bij 95 °C, totdat het monster roze wordt.
  3. Stel een 10% TBE-ureum polyacrylamide gel in en dompel onder in 1x TBE loopbuffer. Voer gedurende 30 minuten op 200 V voordat het monster wordt geladen. Voeg aan elk monster 23 μL 2x TBE-ureummonsterbuffer toe.
    OPMERKING: De verwachte DNA-bandgrootte is 115-117 nt.
  4. Herhaal stap 5.3.2-5.3.12.
  5. Resuspendeer de pellet in 15 μL van 10 mM Tris, pH 8,0. Draai af op 450 x g, 4 °C gedurende 20 s en breng het monster over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
    STOPPLAATS: Monsters kunnen maandenlang bij -80 °C worden bewaard.
  1. ssDNA circulaireisatie
    1. Bereid de volgende basismix voor en laad 4 μL per monster, zoals beschreven in tabel 7.
Reagens Hoeveelheid per monster (μL) Eindconcentratie
10× CircLigase II buffer 2 1x
5 M Betaïne (optioneel) 1 0,25 m
50 mm MnCl2 1 2,5 mM
Eindvolume 4

Tabel 7: Recept voor ssDNA circularisatie master mix.

  1. Voeg 1 μL CircLigase II ssDNA ligase toe aan elk monster en incubeer gedurende 1 uur bij 60 °C.
    OPMERKING: De efficiëntie van deze stap kan worden verhoogd door 1 μL CircLigase II ssDNA ligase na 1 uur incubatie aan elk monster toe te voegen.
  2. Inactiveer het enzym door gedurende 10 minuten bij 80 °C te broeden.
  3. Koel af op ijs en ga verder met PCR-versterking of bewaar bij -80 °C.
    STOPPUNT: Monsters kunnen jarenlang bij -80 °C worden bewaard.
  1. PCR-versterking
    1. Bereid de volgende PCR-mastermix voor en laad 82 μL per monster, zoals beschreven in tabel 8.
Reagens Hoeveelheid per monster (μL) Eindconcentratie
DEPC-behandeld water 61.6
5× Phusion HF reactiebuffer 17.6 1x
10 mM dNTPs 1.8 200 μM
100 μM PCR voorwaartse primer 0.2 225 nM
HF Phusion polymerase | 0.8 1,6 U
Eindvolume 82

Tabel 8: Recept voor PCR-versterkingsmastermix.

  1. Voeg aan elke buis met mastermix 5 μL gecirculeerd DNA toe.
    OPMERKING: Bewaar de rest van de gecirculeerde DNA-monsters bij -80 °C.
  2. Voeg een andere 1 μL van 20 μM PCR reverse barcode primer toe aan elk monster (zie tabel 9) en vortex om grondig te mengen.
  3. Aliquot elke buis in vier afzonderlijke PCR-buizen, elk zal worden gebruikt voor een ander aantal PCR-cycli.
  4. Voer een PCR-reactie uit volgens het volgende programma, zoals beschreven in tabel 10.
Cyclus Denaturatie (98 °C) Gloeien (60 °C) Uitschuiven (72 °C)
1 30 s
2-16 10 s 10 s 5 s

Tabel 10: PCR-programma voor PCR-reactie.

  1. Verwijder na cycli 8, 9, 10 en 11 PCR-buizen (voor IP-monsters variëren de cycli van 9 tot 15) als eerste poging. Pauzeer na elke cyclus het programma, haal er een aliquot uit en zet het in de ijskast en hervat het programma vervolgens snel.
    OPMERKING: Het aantal cycli moet worden aangepast op basis van de hoeveelheid gecirculeerd DNA in elke reactie. Zie figuur 4 voor een voorbeeld en verdere verduidelijking.
  2. Voeg aan elke reactie van 17 μL 3,5 μL 6x DNA-ladende kleurstof toe.
  3. Ontdooi een 10 bp DNA ladder.
  4. Voor groottescheiding door gel-elektroforese dompelt u 8% TBE polyacrylamide onder in 1x TBE-loopbuffer en laadt u de monsters van elk verschillend cyclusnummer in aangrenzende putten en laat u de gel gedurende 50 minuten bij 180 V lopen.
  5. Verdun 6 μL SYBR Gold (10.000 x concentraat) in 60 ml 1x TBE buffer en beits tijdens het schudden in lichtbeschermde dozen gedurende 15-20 minuten.
  6. Bereid tijdens het kleuren van de gel een steriel scalpel en 0,5 ml gelbrekerbuisjes in gelabelde tubes van 1,5 ml.
  7. Maak een afbeelding van de gekleurde nucleïnezuren.
  8. Snijd de gewenste band met een verwachte bandgrootte van 174-176 bp met het steriele scalpel en plaats de gelplak in de bereide gelbrekerbuis van 0,5 ml (reinig grondig tussen de monsters en gebruik RNase-inactiverend middel, of schakel over op een nieuw mes).
  9. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 20.000 x g en 4 °C en breng vervolgens de resterende gelstukken over van de gelbrekerbuis van 0,5 ml naar de buis van 1,5 ml.
  10. Voeg 500 μL 10 mM Tris, pH 8,0 toe en schud in een thermische menger bij 1.400 RPM gedurende 10 min en 70 °C.
  11. Breng de opgeloste gel over in een celluloseacetaatkolom met een pipetpunt met brede boring.
  12. Centrifugeer de kolom gedurende 3 minuten bij 20.000 x g en 4 °C en breng de doorstroom over naar een nieuwe buis van 1,5 ml en koel op ijs.
  13. Om het nucleïnezuur neer te slaan, voegt u toe: 550 μL IPA, 32 μL van 5 M NaCl, 1 μL van 0,5 M EDTA en 2 μL GlycoBlue en vortex om grondig te mengen.
  14. Bewaar de monsters gedurende ten minste 1 uur bij -80 °C of -20 °C 's nachts.
    STOPPLAATS: Monsters kunnen 's nachts of langer bij -80 °C worden bewaard.
  15. Herhaal stap 5.3.11-5.3.12.
  16. Resuspend in 11 μL van 10 mM Tris, pH 8,0. Draai af op 450 x g, 4 °C gedurende 20 s en breng het monster over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
    STOPPUNT: Monsters kunnen jarenlang bij -80 °C worden bewaard.
  1. Kwantificeer de grootteverdeling door Bioanalyzer
    1. Maak een 1:4 verdunning van elk monster door 1 μL monster te mengen met 4 μL met DEPC-behandeld water.
    2. Voer de Bioanalyzer Small RNA Chip uit. Volg het protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: De verwachte lengte is 175 ± 5 bp.
  2. Kwantificeer DNA-concentratie door fluorometer
    1. Voer een dsDNA-concentratiecontrole met hoge gevoeligheid uit met een fluorometer volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Multiplex- en sequentiemonsters volgens de Illumina-aanbevelingen (Index Adapters Pooling Guide12).

6. Data-analyse

  1. Voer een analyse uit zoals beschreven in het aanvullende bestand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zoals geïllustreerd in het stroomschema van dit protocol (figuur 1), werden cellen gekweekt tot logfase en vervolgens snel verzameld door filtratie en gelyseerd door cryogene slijping. Het lysaat werd vervolgens in tweeën gedeeld: een voor totale ribosoom-beschermde mRNA-voetafdrukken en de andere voor geselecteerde ribosoom-beschermde mRNA-voetafdrukken, waarop we affiniteitszuivering uitvoerden om de gelabelde eiwit-ribosoom-ontluikende ketencomplexen naar beneden te halen. We zorgden voor gelabelde eiwitexpressie en het succes van de pull-down door western blot-analyse, zoals te zien is in figuur 2. We hebben de isolatie van ribosoombeschermde voetafdrukken gevalideerd, die meestal 20-45 nt lang zijn door kleine RNA-elektroforese (2100 BioAnalyzer-systeem), waardoor 5-10 nt verschuiving in groottedetectie mogelijk is, volgens de systeemhandleiding (figuur 3). Vervolgens hebben we een cDNA-bibliotheek gegenereerd voor diepe sequencing en big-data-analyse. Houd er bij het genereren van de cDNA-bibliotheek rekening mee dat ondercycli kan leiden tot een lage opbrengst (zoals te zien is in rijstrook 2 in figuur 3), maar herversterking is mogelijk om de gegenereerde bibliotheek te herstellen. Overcycli kunnen optreden wanneer PCR-primers uitgeput zijn, maar de reactie gaat door. Wanneer dNTP's nog steeds aanwezig zijn, verloopt de reactie en genereert langere PCR-artefacten met chimere sequenties als gevolg van PCR-producten die zichzelf13 prikken (zoals te zien is in rijstroken 3-4 in figuur 3, aangegeven door het zichtbare uitstrijkje). Als de concentratie van de dNTP's ook beperkend wordt, kunnen producten verschijnen die wijzen op de aanwezigheid van heteroduplexen die bestaan uit slechts gedeeltelijk homologe bibliotheekfragmenten. Figuur 4 fungeert als referentie, waarbij baan 2 een optimale versterking vertegenwoordigt en baan 3 een acceptabele versterking. Monsters van rijstroken 4 en 5 (cycli 10 en 11) mogen niet worden gebruikt vanwege de mogelijkheid om PCR-duplicaten en artefacten te introduceren. De gegenereerde bibliotheek werd verder gevalideerd door dna-elektroforese met hoge gevoeligheid (hetzelfde BioAnalyzer-systeem werd gebruikt) voor exacte grootteverdeling en kwantificering (figuur 5). Na 3' end linker ligatie, reverse transcriptie en PCR-versterking wordt een cDNA-lengteverdeling als zodanig verwacht, met een scherpe piek rond 175 nt.

We hebben adapters en barcodes uit de gesequencede bibliotheek bijgesneden en verwijderd, en alleen de reads tussen 20 en 45 nt werden geselecteerd voor verdere analyse. Figuur 6 toont de resulterende lengteverdeling. De reads werden onderverdeeld in verschillende groepen van: coderende sequenties, introns en intergene sequenties (figuur 7), en verder geclassificeerd zoals weergegeven in figuur 8.

De uiteindelijke analyse voor detectie en karakterisering van co-translationele interacties werd uitgevoerd op basis van de verrijking van ribosoom-beschermde mRNA-fragmenten, waardoor de grafieken in figuur 9 werden geproduceerd. We vergeleken de genormaliseerde ribosoombezetting (bij elk nucleotide langs elke orf) van het totale translatoom met het overeenkomstige geselecteerde translatoom (ontluikend-interactoom). Per nucleotide vergelijking elimineert vertaalsnelheden artefacten. De reproduceerbaarheid tussen biologische replicaties werd geëvalueerd door Pearson-correlatie (drempel > 0,6). We presenteren selectieve ribosoomprofielen, waarbij co-translationele interacties van Vma2p met drie eiwitten worden geanalyseerd: het ribosoom-geassocieerde chaperonne Ssb1p, Pfk2p (fosfoructokinase) en Fas1p (vetzuursynthase), waarbij elk eiwit C' terminaal wordt getagd door GFP. We voerden het protocol uit in biologische replicaties. Figuur 9 A, D en G toont het experimentele schema van elke affiniteitszuivering. Vervolgens tonen we de ribosoombezetting van totale translatomen in vergelijking met Ssb1-interactomen langs de Vma2p-orf, coderend voor een subeenheid van de vacuolaire H +-ATPase (figuur 9 B, E en H). Ten slotte voerden we ratio-gebaseerde ribosoomverrijkingsprofilering (IP/Totaal) uit op elke ribosoompositie in [codon/aa] langs de orf (figuur 9 C, F en I). Het vergelijken van de co-translationele interacties van deze drie eiwitten met Vma2p, dat wordt gesynthetiseerd door het ribosoom, onthulde dat Ssb1-chaperon de ontluikende Vma2p op vier verschillende regio's langs de orf betrekt, omdat we vier significante verrijkingspieken door SeRP identificeerden. Anders toont Pfk2p slechts één significante verrijkingspiek, zoals geïdentificeerd door SeRP, in een andere positie dan de co-translationele chaperone Ssb1. Analyse van Fas1 co-translationele interacties met ontluikende Vma2p detecteerde geen significante verrijking. De vergelijking van deze op ratio gebaseerde verrijkings ribosoomprofielen toont dus de kracht van dit protocol in detectie en karakterisering van verschillende co-translationele interacties in bijna codon-resolutie.

Figure 2
Figuur 2: Representatief western blot resultaat na affiniteitszuivering van BY4741 stam met HA-gelabelde Naa10. Representatief western blot resultaat na affiniteitszuivering van BY4741 stam met HA-gelabelde Naa10 met een band rond 27,8 kDa, terwijl het wild-type, als negatieve controle, geen band vertoont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatief BioAnalyzer resultaat na voetafdrukisolatie en RNA-extractie met zuur-fenol:chloroform, en een gemiddelde grootte van 25 nt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve gel-elektroforese van PCR-amplificatie. Representatieve gel-elektroforese van PCR-versterking met banen 2-5 geladen met PCR-producten van cycli 8-11 en ladders aan beide zijden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatief BioAnalyzer-resultaat verkregen na de oprichting van een cDNA-bibliotheek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Verwachte lengteverdeling van reads na het verwijderen van de adapters met Cutadapt (verwijder reads korter dan 20 of langer dan 45). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Verwacht uitlijningssuccespercentage na het verwijderen van niet-coderende RNA-reads met Bowtie2 en het gebruik van TopHat om de resterende reads uit te lijnen met verschillende organismen. Het monster werd genomen van S. cerevisiae (een gemuteerde variant van BY4741). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Een grafiek gegenereerd met RiboToolkit die de verwachte codering versus niet-coderingsverhouding van uitgelijnde leesbewerkingen weergeeft na gebruik van Bowtie2 om rRNA-elementen in de reads te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Co-translationele interacties van drie verschillende eiwitten: Ssb1p, Pfk2p en Fas1p met Vma2p, dat wordt gesynthetiseerd door het ribosoom, geanalyseerd door SeRP. Alle y-assen worden weergegeven in reads per million (RPM) reads. (A, D, G) Experimenteel schema van SeRP van respectievelijk Ssb1p, Pfk2p en Fas1p C' terminaal gelabeld door GFP. (B, E, H) Ribosoombezetting langs de orf van totale translatomen in vergelijking met respectievelijk Ssb1, Pfk2p en Fas1p interactomen (in biologische replicaties). (C, F, I) Gemiddelde verrijking van Ssb1p, Pfk2p en Fas1p (IP/Total ratio) op elke ribosoompositie in [codon/aa] langs de orf, respectievelijk. Variatie tussen biologische replicaties wordt aangegeven door het gearceerde gebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 9: 3' Linker- en primersequenties. 3' Linker L1: Linker 3-L1 met 5ʹ adenylering en 3ʹ dideoxy-cytidine unieke moleculaire identifiers ('NN...') (RNase-vrije HPLC-zuivering; Reverse transcription linker: reverse transcriptie (L(rt)) met 5ʹ gefosforyleerde, unieke moleculaire identifiers (RNase-vrije HPLC-zuivering); PCR forward primer: PCRf; HPLC gezuiverd. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend dossier. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijft het protocol de Selective Ribosome Profiling-benadering voor het vastleggen van co-translationele interacties in bijna codonresolutie. Naarmate het ribosoom stijgt als een hub voor het coördineren van de ontluikende ketenopkomst in het overvolle cytoplasma, is dit een cruciale methode om de verschillende co-translationele interacties te identificeren en te karakteriseren die nodig zijn om een functioneel proteoom te garanderen, evenals voor het bestuderen van verschillende ziekten. Tot op heden is SeRP de enige methode die deze interacties op een directe manier kan vastleggen en karakteriseren, in vivo 14,15,16.

De eerste en meest kritische stap is celverzameling en lysis. Het is noodzakelijk om binnen enkele seconden de voortdurende vertaling vast te leggen, door flash-freezing gevolgd door lysis in een bevroren toestand. Het verzamelen van cellen moet met spoed gebeuren om ribosomale afvloeiing te voorkomen en stresstranslationele reacties te induceren, die snel kunnen optreden. De tweede kritische stap is de affiniteitszuiveringsstap. Het is absoluut noodzakelijk om achtergrondbinding te verminderen door streng wassen en ervoor te zorgen dat de co-translationele interacties behouden blijven, wat kan worden vergemakkelijkt door in vivo cross-linking. Omdat dit protocol is gebaseerd op de zeer gevoelige NGS (Next Generation Sequencing), kan de hoge achtergrond in de eerste stappen worden versterkt in de volgende cDNA-bibliotheekvoorbereidingsstappen, wat leidt tot lage signaal-ruisverhoudingen.

Nucleasebehandeling, om alle niet-beschermde mRNA's te verteren, moet worden geëvalueerd door polysoomprofilering17 samen met een zorgvuldige evaluatie van de geïsoleerde ribosomale voetafdrukkengrootteverdeling (zoals hierboven beschreven) om over- of onder RNA-vertering te voorkomen. Kalibratie van nucleaseconcentratie en verteringstijden kan nauwkeurig voetafdrukherstel vergemakkelijken, omdat oververtering kan leiden tot ribosomale rRNA-vertering, wat leidt tot verlies van ribosoombeschermde voetafdrukken. Het is belangrijk op te merken dat ondervertering ook kan leiden tot lagere ontdekkingspercentages van ribosoombeveiligde voetafdrukken, omdat de cDNA-bibliotheekvoorbereidingsstappen, evenals de hier beschreven stappen voor gegevensanalyse, lange, onkarakteristieke lectuur weggooien.

Hoewel rRNA-uitputting niet altijd een kritieke stap vormt en niet verplicht is, heeft het enkele voordelen, zoals schonere monsters en daarom een hogere snelheid van genoom-in kaart gebrachte lezingen. Aan de andere kant is er de mogelijkheid van vooroordelen, omdat veel rRNA-uitputtingsprotocollen ook uitputting van de gewenste ribosoombeschermde fragmenten kunnen veroorzaken. Men moet ook rekening houden met de kosten van de rRNA-depletiekits. rRNA-depletie kan worden uitgevoerd na de ribosoom-voetafscheidingsstap of na de cDNA-circulalisatiestap.

cDNA-bibliotheekvoorbereidingsstappen zoals hier beschreven, zijn geoptimaliseerd voor lage mRNA-input, omdat de affiniteits- en ribosoomzuiveringsstappen de mRNA-inputhoeveelheid sterk verminderen, in vergelijking met RNA-seq-expressiestudies. Het opschalen van de initiële hoeveelheid celculturen kan het genereren van cDNA-bibliotheken aanzienlijk vergemakkelijken. Als alternatief kan elk cDNA-bibliotheekprotocol naar keuze passen bij de hier beschreven stappen voor affiniteitszuivering en voetafdrukisolatie. Het is belangrijk op te merken dat de nucleasebehandeling die de ribosomale voetafdrukken genereert, de resulterende mRNA-eindherstel vereist (cDNA-bibliotheekvoorbereiding, defosforyleringsstap) om het volgen van linkerligatiestappen in het cDNA-protocol dat hier in het protocol van uw keuze wordt beschreven, mogelijk te maken.

Tijdens de sequencing is het belangrijk om SeRP te onderscheiden van RNA-Seq, omdat de heterogeniteit van de gegenereerde bibliotheken sterk varieert, afhankelijk van de affiniteitsfactoren. Moleculaire chaperones en targetingfactoren zijn vaak promiscue in binding, interagerend met honderden of duizenden substraten tijdens de vertaling, wat leidt tot zeer diverse cDNA-bibliotheken. Zeer specifieke interactoren, zoals co-translationele complexe assemblage-interactoren, kunnen echter vaak leiden tot het genereren van veel minder diverse cDNA-bibliotheken. Pieken in diverse en niet-diverse bibliotheken op dezelfde baan kunnen de volgorde en het volgen van gegevensanalyseresultaten aanzienlijk verbeteren.

Een ander uniek kenmerk van SeRP is het vermogen om lokale variaties in ribosoombezettingen langs de orf vast te leggen, waardoor ribosomale verschuivingen in de vertaalsnelheid kunnen worden ontdekt die verband houden met elke reeks interacties. Het is daarom noodzakelijk om ribosoombezettingen in elk codon langs de orf te vergelijken om de verrijking correct te identificeren. Het gebruik van orfs-gemiddelden kan leiden tot verlies van voorbijgaande interacties of valse ontdekking.

Correct gebruik van de SeRP-methode opent vele co-translationele paden naar directe analyse, het ontdekken van nieuwe mechanistische kenmerken en nieuwe ribosoom-geassocieerde factoren, waardoor een revolutie teweegkomt in het eiwit-biosyntheseveld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

We willen alle lableden bedanken voor de vruchtbare discussies en Muhammad Makhzumy voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door ISF (Israeli Science Foundation) subsidie 2106/20.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631 6×
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876 2×
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  3. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  4. Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast. Nature Protocols. , (2019).
  5. Knorr, A. G., et al. Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).
  6. Matsuo, Y., Inada, T. The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway. Cell Reports. 34 (12), (2021).
  7. Döring, K., et al. Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding. Cell. , (2017).
  8. Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting. Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).
  9. Janke, C., et al. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).
  10. Levi, O., Arava, Y. Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae. Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).
  11. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
  12. Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf (2019).
  13. Kanagawa, T. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).
  14. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), (2021).
  15. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  16. Joazeiro, C. A. P. Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).
  17. Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820 (2017).

Tags

Biologie Nummer 176
Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, … More

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter