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Neuroscience

In vivo Metodi per valutare la funzione e la struttura delle cellule gangliari retiniche e del nervo ottico in animali di grandi dimensioni

Published: February 26, 2022 doi: 10.3791/62879
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Qui mostriamo diversi test in vivo (potenziale evocato visivo flash, elettroretinogramma pattern e tomografia a coerenza ottica) in macaco di capra e rhesus per comprendere la struttura e la funzione del nervo ottico e dei suoi neuroni.

Abstract

Il nervo ottico raccoglie i segnali degli assoni dalle cellule gangliari retiniche e trasmette il segnale visivo al cervello. I grandi modelli animali di lesioni del nervo ottico sono essenziali per tradurre nuove strategie terapeutiche dai modelli di roditori all'applicazione clinica a causa delle loro somiglianze più strette con gli esseri umani in termini di dimensioni e anatomia. Qui descriviamo alcuni metodi in vivo per valutare la funzione e la struttura delle cellule gangliari retiniche (RGC) e del nervo ottico (ON) in animali di grandi dimensioni, tra cui il potenziale evocato visivo (VEP), l'elettroretinogramma pattern (PERG) e la tomografia a coerenza ottica (OCT). Sia la capra che il primate non umano sono stati impiegati in questo studio. Presentando questi metodi in vivo passo dopo passo, speriamo di aumentare la riproducibilità sperimentale tra diversi laboratori e facilitare l'uso di grandi modelli animali di neuropatie ottiche.

Introduction

Il nervo ottico (ON), costituito da assoni delle cellule gangliari retiniche (RGC), trasmette il segnale visivo dalla retina al cervello. Le malattie ON, come il glaucoma, la neuropatia ottica traumatica o ischemica, spesso causavano una degenerazione irreversibile di ON / RGC e una devastante perdita visiva. Sebbene attualmente ci siano molte scoperte nella rigenerazione ON e nella protezione RGC nei modelli di roditori1,2,3,4,5,6, i trattamenti clinici per la maggior parte delle malattie ON sono rimasti essenzialmente gli stessi nell'ultimo mezzo secolo con esiti insoddisfacenti7,8 . Per colmare il divario tra la ricerca di base e la pratica clinica, gli studi traslazionali che utilizzano modelli animali di grandi dimensioni di malattie ON sono spesso necessari e utili a causa della loro più stretta somiglianza anatomica con gli esseri umani rispetto ai modelli di roditori.

I macachi di capra e rhesus sono due grandi specie animali utilizzate nel nostro laboratorio per modellare la malattia ON dell'uomo. La dimensione del bulbo oculare di una capra, ON, e la struttura adiacente (cavità orbitale e nasale, base cranica, ecc.) è simile a quella di un essere umano basato sulla SCANSIONE TC del cranio9. Pertanto, il modello di capra offre l'opportunità di valutare e perfezionare i dispositivi terapeutici o le procedure chirurgiche prima dell'uso nell'uomo. Il macaco rhesus, come primate non umano (NHP), ha un sistema visivo unico simile all'uomo che non esiste in altre specie10,11. Inoltre, le risposte fisiopatologiche alle lesioni e ai trattamenti nella NHP sono molto simili a quelle degli esseri umani12.

I test in vivo per valutare longitudinalmente la struttura e la funzione dell'ON e dell'RGC sono importanti negli studi su animali di grandi dimensioni. L'elettroretinogramma di pattern (PERG) è stato utilizzato per valutare la funzione RGC. Il potenziale evocato visivo flash (FVEP) riflette l'integrità della via retino-genicolo-corticale nel sistema visivo. Pertanto, PERG combinato con FVEP può riflettere la funzione ON9,13,14 . La tomografia a coerenza ottica retinica (OCT) può mostrare la struttura retinica con un'elevata risoluzione temporale e spaziale, che consente la misurazione dello spessore del complesso gangliare retinico (GCC)9,15. Per gli esami elettrofisiologici in questo studio, il monitoraggio dei segni vitali (tasso di calore, tasso di violazione, pressione sanguigna) e del livello di saturazione di ossigeno (SpO2) prima del test sono cruciali poiché questi parametri hanno potenti impatti sul flusso sanguigno oculare e quindi sulla funzione del sistema visivo. Tuttavia, non abbiamo monitorato i segni vitali durante l'esecuzione dell'imaging retinico OCT per motivi di semplicità. Secondo il nostro studio precedente9, lo spessore del GCC misurato dall'imaging retinico OCT è abbastanza stabile, con un coefficiente di variazione intersessione vicino al 3%. Questi test in vivo nel macaco di capra e rhesus sono stati descritti in dettaglio nel nostro studio precedente9. Qui presentiamo questi metodi per contribuire ad aumentare la trasparenza sperimentale e la riproducibilità.

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Protocol

Gli esperimenti sono stati condotti rigorosamente in conformità con le linee guida ARRIVE e la guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso di animali da laboratorio e aderiscono ai protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Wenzhou Medical University (WMU) e del Joinn Laboratory (Suzhou). Le capre Saanen maschio, di età compresa tra 4 e 6 mesi con peso di 19-23 kg, sono state ospitate nella struttura per animali WMU. I macachi Rhesus maschi, di età compresa tra 5 e 6 anni con un peso di 5-7 kg, sono stati ospitati nella struttura per animali di Joinn. Tutti gli animali sono stati mantenuti in una stanza climatizzata a temperatura controllata (21 ± 2 °C) sotto un ciclo di luce di 12 ore / 12 ore di buio con cibo ad libitum.

1. Potenziale evocato visivo flash (FVEP) nella capra

  1. Anestesia generale
    1. Radere i capelli del garretto con un rasoio elettronico.
    2. Preparare la pelle strofinando con alcool al 70% tre volte per pulire la pelle, quindi esporre la vena sottocutanea.
    3. Inserire un catetere venoso periferico per via endovenosa (0,9 mm x 25 mm), quindi iniettare atropina (0,025 mg/kg) e propofol (5 mg/kg).
    4. Intubare la capra con un tubo tracheale di 6 mm e collegarla a un respiratore artificiale.
    5. Mantenere l'anestesia con il 3,5% di isoflurano in ossigeno ad una portata costante di 2 L/min.
      NOTA: La capra si riprende dall'anestesia indotta dal propofol in pochi minuti, quindi sii veloce a intubare la capra.
  2. Monitoraggio cardiopolmonare
    1. Posizionare il sensore di temperatura sotto la linguetta.
    2. Collegare il pulsossimetro all'estremità prossimale dell'orecchio.
    3. Legare il bracciale per la pressione sanguigna alla base della coscia.
    4. Blocca le clip ECG sugli arti di conseguenza.
      NOTA: La frequenza cardiaca normale delle capre è di 68-150 bpm. A causa dell'uso dell'anestesia gassosa, la frequenza cardiaca delle capre aumenterà. Pertanto, la nostra frequenza cardiaca durante l'ispezione è di 170 ± 30 bpm. La pressione sanguigna sistolica delle capre in condizioni normali è di 110-130 mmHg e la pressione sanguigna diastolica è di 50-60 mmHg. Nello stato di inalazione di ossigeno, la saturazione di ossigeno nel sangue della capra può sempre essere mantenuta al 99%. La frequenza respiratoria delle capre in anestesia è sincronizzata con quella del ventilatore, che è di 10 respiri / min. Poiché la temperatura è stata misurata da sotto la lingua della capra, non dalla temperatura interna, la temperatura della capra è generalmente di 35 ± 2 °C.
  3. Impianto di viti craniche e posizionamento di elettrodi
    1. Rasare i capelli con un clipper. Disinfettare la pelle al centro dell'osso frontale strofinando con un batuffolo di cotone imbevuto di betadina e alcol al 70% tre volte.
    2. Utilizzare viti e forbici sterilizzate.
      NOTA: Autoclave tutti gli strumenti chirurgici per la sterilizzazione (121 °C, 20 min).
    3. Fare un'incisione cutanea di 5 mm per esporre l'osso frontale con una forbice oftalmica, quindi impiantare una vite sterilizzata al centro dell'osso frontale usando un cacciavite.
    4. Rasare i capelli e disinfettare la pelle sull'osso occipitale centrale tra due orecchie con betadina e alcol al 70%, una seguita dall'altra, tre volte.
    5. Fare un'incisione cutanea di 5 mm per esporre l'osso occipitale con una forbice oftalmica, quindi impiantare una vite sterilizzata al centro dell'osso occipitale.
      NOTA: l'elettrodo dell'ago di terra viene inserito per via sottocutanea sotto la vite cranica frontale. Gli elettrodi attivi e di riferimento sono collegati rispettivamente alle viti occipitali e frontali con clip a coccodrillo per ridurre l'impedenza dell'elettrodo16.
  4. Preparazione animale
    1. Utilizzare un panno antiurto per coprire l'occhio e fissare con la benda per rattoppare un occhio.
    2. Applicare colliri anestetici topici (collirio proparacaina cloridrato) su entrambi gli occhi. Le pupille bilaterali sono dilatate dalla somministrazione topica di colliri midriatici con tropicamide (5%) e fenilefrina (5%).
    3. Posizionare la testa della capra nello stimolatore Ganzfeld e attenuare la luce ambientale.
      NOTA: È stato riscontrato che le capre possono mantenere una buona fissazione del bulbo oculare in anestesia, quindi non è richiesto alcun intervento aggiuntivo per l'operazione di fissazione del bulbo oculare.
    4. Coprire lo stimolatore e la testa di capra con una coperta nera per 5 minuti per l'adattamento.
    5. Utilizzare lo speculum palpebrale per esporre la congiuntiva bulbare. Piegare l'anello superiore, tirare la palpebra superiore verso l'alto e inserire l'anello superiore prima nel sacco congiuntivale della palpebra superiore e poi nella palpebra inferiore in modo simile.
    6. Premere il pulsante Impedenza per controllare l'impedenza di contatto elettrodo-tessuto e i valori di impedenza verranno visualizzati in ciascun canale.
    7. Assicurarsi che l'impedenza sia inferiore a 10 kΩ per ciascun elettrodo per evitare interferenze elettromagnetiche da altri dispositivi elettrici nella stessa stanza.
      NOTA: se è superiore a 10 kΩ, ricollegare o sostituire l'elettrodo. L'impedenza può apparire anormalmente alta se il letto chirurgico metallico elettrico, dove si trova la capra, è collegato. L'impedenza deve differire di meno di 1 kΩ tra gli elettrodi attivi e di riferimento per ridurre le interferenze elettriche17.
    8. Premere il pulsante Oscillografo per controllare il rumore di base senza stimolazione luminosa.
      NOTA: se si verifica un rumore di base elevato, scollegare tutti gli altri dispositivi elettrici nella stessa stanza e spegnere i telefoni cellulari. Se il problema di base persiste, passare al passaggio 1.3.10. per verificare se è possibile suscitare una tipica forma d'onda FVEP. In caso contrario, riprogrammare il test FVEP in un altro momento.
    9. Avviare la registrazione FVEP scegliendo l'intensità luminosa di 0,025, 0,5 e 3,0 cd·s/m2, rispettivamente nella casella di sfondo bianco nell'angolo in alto a destra. Quindi, premere il pulsante Esame . Si noti che la registrazione FVEP ad ogni intensità luminosa viene eseguita due volte.
      NOTA: se le due forme d'onda appaiono ovviamente diverse, è necessaria un'altra ripetizione.
    10. Inumidire la cornea con colliri lacrimali artificiali, se appare asciutta sulla fotocamera a infrarossi.
      NOTA: monitorare la posizione dell'occhio dalla telecamera a infrarossi incorporata prima di registrare per assicurarsi che lo sguardo visivo sia corretto e che la pupilla sia completamente esposta (in modo che la dimensione del campo di uno stimolo flash sia di 90 °. La posizione degli occhi di una capra anestetizzata può essere regolata ruotando la testa di conseguenza. Sulla base della nostra osservazione, il vagabondaggio dello sguardo si verifica raramente durante la registrazione FVEP (~ 10 min) in capra in anestesia generale9. Quindi non c'è bisogno di mettere in pausa e ri-regolare lo sguardo durante la registrazione.
    11. Ripetere i passaggi precedenti per l'occhio controlaterale.
    12. Cessare l'alimentazione di isoflurano e aumentare leggermente il volume di marea sul ventilatore per aiutare la capra a riprendersi dall'anestesia generale.
    13. Dopo l'anestesia generale, trattare la capra con gentamicina (4 mg / kg, IM) e ceftiofur sodico (una cefalosporina, 2 mg / kg, IM) per prevenire l'infezione.
  5. Misurazione FVEP e analisi quantitativa
    NOTA: come mostrato nella Figura 1A, i primi picchi positivi e negativi nella forma d'onda FVEP sono designati come P1 e N1 e il secondo picco positivo come P2. Il tempo implicito tipico di P1, N1 e P2 è di circa 40, 60 e 120 ms, rispettivamente. Le ampiezze P1 e P2 sono misurate dalla depressione della forma d'onda N1 ai picchi delle forme d'onda P1 e P2, rispettivamente.
    1. In caso di lesione monoculare, utilizzare il confronto interoculare di ampiezza e tempo implicito per ridurre la variazione di intersessione e aumentare la sensibilità17.

2. PVEP nel macaco rhesus

NOTA: i VEP pattern potrebbero essere suscitati nei macachi rhesus9 e sono più stabili dei VEP Flash in ampiezza e tempo implicito17. Pertanto, il PVEP è stato utilizzato per rilevare l'integrità della via retino-genicolo-corticale nei primati non umani.

  1. Preparazione animale
    1. Anestetizzare la scimmia con isoflurano (1,5%-2%) dopo induzione con Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamina/zolazepam).
    2. Posizionare l'elettrodo di terra sterilizzato sul lobo dell'orecchio. Inserire gli elettrodi attivi e di riferimento sterilizzati per via sottocutanea lungo la linea mediana rispettivamente all'osso frontale e occipitale.
    3. Applicare lo speculum palpebrale per esporre la congiuntiva bulbare.
    4. Utilizzare nastro adesivo nero opaco per rattoppare l'occhio controlaterale.
  2. Registrazione PVEP
    1. Premere il pulsante Impedenza per controllare l'impedenza di contatto elettrodo-tessuto e i valori di impedenza saranno mostrati in ciascun canale; assicurarsi che sia inferiore a 10k Ω. In caso contrario, ricollegare o sostituire l'elettrodo.
    2. Controllare i valori di impedenza nella finestra di prova dell'impedenza e assicurarsi che l'impedenza differisca di meno di 1 kΩ tra gli elettrodi attivi e di riferimento per ridurre le interferenze elettriche17.
    3. Premere il pulsante Oscillografo per controllare il rumore di base senza stimolazione.
      NOTA: se c'è un grande rumore di base, scollegare tutti gli altri dispositivi elettrici nella stessa stanza e spegnere i telefoni cellulari. Se il problema di base persiste, ripetere il test PVEP in un altro giorno.
    4. Registrare le risposte PVEP dell'occhio senza patch scegliendo l'intensità luminosa di 0,5 e 1,0 ciclo/grado, rispettivamente nella casella di sfondo bianco nell'angolo in alto a destra, quindi premere il pulsante Esame .
      NOTA: per ogni registrazione, vengono calcolate in media 64 tracce per produrre una forma d'onda. Per ogni frequenza vengono acquisite almeno due registrazioni per verificare la riproducibilità dei segnali PVEP.
    5. Ripetere la procedura per l'occhio controlaterale.
    6. Una volta fatto, cessare la fornitura di isoflurano per svegliare la scimmia.
    7. Dopo l'anestesia generale, trattare la scimmia con gentamicina (4 mg/kg IM) e ceftiofur sodico (2 mg/kg IM) per prevenire l'infezione.
  3. Misurazione PVEP e analisi quantitativa
    1. Come mostrato nella Figura 1B, i primi picchi negativi e positivi nella forma d'onda PVEP sono stati designati come N1 e P1, che in genere si verificano a circa 50 e 90 ms. L'ampiezza P1 viene misurata dalla depressione di N1 al picco di P1.
    2. In caso di lesione monoculare, utilizzare il confronto interoculare di ampiezza e tempo implicito per contribuire a ridurre la variazione di intersessione e aumentare la sensibilità17.

3. Modello ERG (PERG) in capra

NOTA: Nello studio precedente, non è stata osservata alcuna diafonia interoculare del segnale PERG nelle capre, quindi le risposte PERG possono essere registrate contemporaneamente da entrambi gli occhi9.

  1. Preparazione all'esame
    1. Anestetizzare la capra usando xilazina (3 mg / kg, IM) e posizionarla su un tavolo d'esame.
    2. Posizionare un sensore di temperatura sotto la lingua della capra.
    3. Collegare il pulsossimetro all'estremità prossimale dell'orecchio della capra.
    4. Legare il bracciale per la pressione sanguigna alla coscia.
    5. Blocca le clip ECG sugli arti di conseguenza.
    6. Per ridurre l'impedenza dell'elettrodo, posizionare una vite cranica sterilizzata sull'osso frontale e collegarsi all'elettrodo di terra con una clip a coccodrillo.
    7. Posizionare due elettrodi di riferimento dell'ago sterilizzati per via sottocutanea 1 cm dietro il canthi laterale su entrambi i lati.
    8. Utilizzare lo speculum palpebrale per esporre la congiuntiva bulbare.
    9. Posizionare due elettrodi di registrazione ERG-Jet disinfettati al centro delle cornee bilaterali dopo l'applicazione topica di lacrima artificiale.
    10. Posizionare due monitor LED da 47,6 cm x 26,8 cm davanti a entrambi gli occhi con una distanza di visione di 50 cm.
    11. Regolare ogni monitor in modo che sia parallelo al piano pupillare sullo stesso lato e allineare il centro del monitor al piano pupillare.
    12. Assicurarsi che la scacchiera di inversione del contrasto (frequenza temporale, 2,4 Hz) sia visualizzata su entrambi i monitor e abbia un rapporto di aspetto massimo di 4:3, impostato dalle impostazioni dell'apparecchiatura.
    13. Assicurarsi che il contrasto tra le pedine bianche e nere rimanga del 96% e che la luminanza media sia di 200 cd/m2 (Candela per metro quadrato), che viene controllata dal misuratore di luminanza.
      NOTA: Secondo ISCEV, una luminanza fotopica media di 40-60 cd/m2 è richiesta negli esseri umani17. In un altro studio che ha utilizzato il modello di topi, il modello è rimasto ad una luminanza media di 800 cd / m2,18. Una dimensione del campo di almeno 15° nella sua dimensione più stretta è necessaria per un test PERG standard nell'uomo17. Regolare la posizione dell'elettrodo corneale se non si trova al centro della superficie corneale.
  2. Registrazione PERG
    1. Attenuare la luce ambientale e premere il pulsante Impedenza per controllare l'impedenza di contatto elettrodo-tessuto. I valori di impedenza verranno visualizzati in ciascun canale.
    2. Controllare i valori di impedenza in Impedance Test Window e assicurarsi che l'impedenza sia inferiore a 10 kΩ. In caso contrario, ricollegare o sostituire l'elettrodo.
    3. Premere il pulsante Oscillografo per controllare il rumore di base senza stimolazione luminosa.
      NOTA: Prestare attenzione a proteggere i fragili elettrodi di registrazione ERG-Jet. Il rumore di base in PERG è solitamente inferiore a quello in FVEP in capra.
    4. Avvia la registrazione PERG da entrambi gli occhi contemporaneamente alle frequenze spaziali di 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 e 12,6 cicli / grado consecutivamente. Per ogni frequenza spaziale, 64 tracce sono mediate per produrre una lettura.
    5. Infine, spegnere il monitor per registrare PERG senza stimoli visivi come controllo negativo.
      NOTA: i segnali PERG sono solitamente stabili e non necessitano di ripetizione.
    6. Rimuovere la vite del cranio anteriore e svegliare la capra iniettando Idzoxan (1,5 mg/kg), che è un antagonista della xilazina.
    7. Dopo anestesia generale, trattare la capra con gentamicina (4 mg/kg IM) e ceftiofur sodico (2 mg/kg IM) per prevenire l'infezione.
  3. Misura PERG e analisi quantitativa
    1. Impostare il filtro passa-banda su un intervallo compreso tra 1 e 75 Hz. Per PERG a 3,0 cpd, il filtro passa-banda è impostato su un valore compreso tra 1 e 50 Hz per attenuare la traccia senza comprometterne l'ampiezza.
    2. Come mostrato nella Figura 1C, i primi picchi positivi e negativi nella forma d'onda sono designati come P1 (tipicamente intorno a 25 ms) e N1 (tipicamente intorno a 55 ms). L'ampiezza PERG viene misurata da N1 a P1.
    3. In caso di lesione monoculare, utilizziamo il confronto interoculare di ampiezza e tempo implicito per contribuire a ridurre la variazione dell'intersessione e ridurre la sensibilità17.

4. PERG nel macaco rhesus

NOTA: Non è chiaro se ci sia una diafonia interoculare del segnale PERG nel macaco rhesus, quindi le risposte PERG da entrambi gli occhi vengono registrate separatamente.

  1. Preparazione all'esame
    1. Anestetizzare la scimmia con isoflurano (1,5%-2%) dopo iniezione di Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamina/zolazepam) e intubazione tracheale.
    2. Posizionare un elettrodo di terra sterilizzato per via sottocutanea sull'osso frontale. Inserire un elettrodo di riferimento dell'ago sterilizzato per via sottocutanea, 1 cm dietro il canto laterale sullo stesso lato.
    3. Posizionare un elettrodo di registrazione ERG-Jet disinfettato sulla cornea centrale dopo l'applicazione topica di lacrima artificiale.
      NOTA: Regolare la posizione dell'elettrodo corneale, se non è al centro della superficie corneale.
    4. Utilizzare nastro adesivo nero opaco per rattoppare un occhio.
    5. Posizionare un monitor (47,6 x 26,8 cm) a una distanza di visualizzazione di 50 cm.
    6. Assicurarsi che il monitor sia regolato in modo che sia parallelo al piano pupillare. Allineate il centro del monitor al piano pupillare.
    7. Assicurarsi che la scacchiera in bianco e nero si inverta a una frequenza di 2,4 Hz e che le proporzioni siano 4:3, impostate dalle impostazioni dell'apparecchiatura.
    8. Assicurarsi che il contrasto tra le pedine bianche e nere sia del 96% e che la luminanza media rimanga di 200 cd/m2, che viene controllata dal misuratore di luminanza.
  2. Registrazione PERG
    1. Attenuare la luce ambientale e controllare l'impedenza di contatto elettrodo-tessuto.
    2. Assicurarsi che l'impedenza sia inferiore a 10 kΩ. In caso contrario, ricollegare o sostituire l'elettrodo.
    3. Controllare il rumore di base senza stimolazione luminosa.
    4. Applicare una patch a un occhio e avviare la registrazione PERG dall'altro occhio a frequenze spaziali di 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 e 12,6 cicli / grado consecutivamente.
    5. Ripetere i passaggi 4.2.1-4.2.4 per l'occhio controlaterale.
    6. Cessare la fornitura di isoflurano per risvegliare la scimmia.
    7. Dopo l'anestesia generale, trattare la scimmia con gentamicina (4 mg/kg IM) e ceftiofur sodico (2 mg/kg IM) per prevenire l'infezione.
  3. Misura PERG e analisi quantitativa
    1. Come mostrato nella Figura 1D, i primi picchi positivi e negativi nella forma d'onda sono designati come P1 (in genere intorno a 40 ms) e N1 (in genere intorno a 85 ms). L'ampiezza PERG viene misurata da N1 a P1.
    2. In caso di lesione monoculare, utilizziamo il confronto interoculare di ampiezza e tempo implicito per contribuire a ridurre la variazione dell'intersessione e aumentare la sensibilità17.

5. PTOM nella capra

  1. Preparazione animale
    1. Anestetizzare la capra usando xilazina (3 mg / kg, IM) e quindi intubare.
    2. Dilatare la pupilla per somministrazione topica di collirio midriatico con tropicamide (5%) e fenilefrina (5%).
    3. Utilizzare lo speculum palpebrale per esporre completamente la pupilla.
    4. Posiziona la testa della capra sul mentoniera.
      NOTA: Sebbene l'anestesia con gas non venga eseguita, intubare regolarmente la capra per proteggere le vie aeree dalla compressione del mentoniera.
  2. Imaging dello Strumento di personalizzazione di Office
    NOTA: l'imaging OCT retinico viene eseguito utilizzando il sistema OCT a una lunghezza d'onda di 870 nm in questo studio. La risoluzione assiale ottica dello scanner OCT è di 12 μm. La modalità di scansione circolare viene utilizzata per scansionare la testa del nervo ottico (ONH) con la modalità ad alta risoluzione. 100 fotogrammi sono mediati per ottimizzare la qualità dell'immagine. La guida dettagliata alla formazione è disponibile online (vedi Tabella dei materiali).
    1. Scansione iniziale dello Strumento di personalizzazione di Office (esame di base)
      1. Fare clic sul pulsante Start per accedere all'interfaccia di rilevamento. Attendere che la macchina finisca di caricare, quindi premere il pulsante giallo Start per avviare l'imaging.
      2. Allineare la capra con la telecamera a infrarossi per centrare l'ONH nell'immagine confocale di oftalmoscopia laser a scansione (cSLO) modificando la posizione della testa.
      3. Regolare il joystick per illuminare uniformemente l'intera immagine a infrarossi per migliorare la qualità dell'immagine.
      4. Spostare il joystick in avanti fino a visualizzare un'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office retinica verticale sullo schermo verticale.
      5. Modificare il joystick in modo che abbia un'immagine OCT retinica uniformemente densa e posizionata orizzontalmente.
      6. Premere il pulsante sul joystick per catturare automaticamente l'immagine e tenere premuto il joystick per mantenere la qualità dell'immagine sullo schermo dell'immagine dal vivo fino al completamento dell'acquisizione dell'immagine. Quindi, premere Acquisisci.
      7. Risvegliare la capra iniettando Idzoxan (1,5 mg/kg), che è un antagonista della xilazina.
        NOTA: Centrare l'ONH nell'esame di base aiuta ad allineare la scansione di base e la scansione di follow-up in base alla nostra esperienza.
    2. Scansione dello Strumento di personalizzazione di Office di follow-up
      1. Selezionare un'immagine iniziale dello Strumento di personalizzazione di Office di alta qualità; Fate clic con il pulsante destro del mouse e selezionate Imposta riferimento (Set Reference).
      2. Avviare l'imaging dello Strumento di personalizzazione di Office come indicato in precedenza.
      3. Premere il pulsante Follow-up per consentire la corrispondenza automatica della scansione corrente con la scansione di riferimento.
      4. Una volta abbinato (l'anello di scansione circolare diventa verde), premere il pulsante sul joystick per attivare il tracciamento automatico in tempo reale.
      5. Risvegliare la capra iniettando Idzoxan (1,5 mg/kg ), che è un antagonista della xilazina.
        NOTA: per facilitare il processo di corrispondenza, (1) spostare l'ONH nella finestra live ruotando la testa di conseguenza o (2) ruotare l'ONH nella finestra live inclinando la testa per rendere l'immagine cSLO corrente più simile all'immagine di base. Questo riflesso vestibolo-oculare funziona bene in anestesia xilazina19.
  3. Misurazione DELLO STRUMENTO PER LOC
    1. Fare clic sul pulsante Misurazione per accedere alla finestra di misurazione.
    2. Scegli lo strumento gomma e cancella la linea RNFL, che viene automaticamente etichettata dal programma.
    3. Scegliete lo strumento Disegno linea per delineare manualmente il limite tra IPL e INL (Figura 2).
      NOTA: lo spessore del GCC in sei regioni peripapillari (T, TS, TI, N, NS, NI) e lo spessore medio del GCC intorno all'ONH (G) possono essere letti sullo schermo (Figura 2). Il test dello studente, ANOVA unidirezionale o ANOVA bidirezionale può essere utilizzato per quantificare i dati OCT in caso di distribuzione normale.

6. PTOM nel macaco rhesus

  1. Eseguire l'imaging OCT retinico nel macaco rhesus utilizzando la stessa attrezzatura e procedura eseguita nel caso della capra.

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Representative Results

La Figura 1A mostra i risultati rappresentativi di FVEP nella capra. Sebbene le forme d'onda con la stessa intensità del flash abbiano una somiglianza relativa, raccomandiamo comunque di esaminare le forme d'onda due volte. Le onde elettromagnetiche generate dai dispositivi elettronici interferiranno con i segnali elettrici raccolti, con conseguente elevato rumore di base e scarsa ripetibilità della forma d'onda. Pertanto, si raccomanda di assicurarsi che non vi siano dispositivi elettronici ridondanti collegati all'ambiente circostante durante l'esame elettrofisiologico per evitare tali interferenze e si raccomanda di ripetere almeno due misurazioni per determinare la stabilità e la ripetibilità dei risultati sperimentali. Quando si rattoppano entrambi gli occhi, le forme d'onda sono totalmente piatte su entrambi gli occhi, il che dimostra che le forme d'onda stanno certamente generando dal nostro stimolo flash. La Figura 1B mostra i risultati rappresentativi del PERG nella capra. Grazie alla sua stabilità e all'elevato segnale, acquisiamo una forma d'onda affidabile solo per una misurazione temporale a ciascuna frequenza spaziale. Con l'aumentare della frequenza spaziale, la dimensione della scacchiera supererà gradualmente il riconoscimento degli occhi della capra. Quindi possiamo vedere che a 12,7 cpd, la forma d'onda PVEP è scesa molto. Analogamente a FVEP, la forma d'onda scompare quando chiudiamo lo schermo. La Figura 1C mostra i risultati rappresentativi del PVEP nel macaco rhesus. Ripetiamo la misurazione due volte ad ogni frequenza spaziale. All'aumentare della frequenza spaziale, l'ampiezza diminuirà. Ciò è dovuto al fatto che la frequenza spaziale supera la percezione dell'occhio. La Figura 1D mostra i risultati rappresentativi del PERG nel macaco rhesus. Il motivo per cui l'ampiezza diminuisce con la frequenza spaziale è lo stesso descritto sopra. Quando si analizzano questi dati, è possibile scegliere di analizzare l'ampiezza tra i picchi e le depressioni o il tempo di latenza dei picchi o dei minimi come le statistiche.

La figura 2 mostra i risultati rappresentativi dei PTOM nella capra. L'immagine più a sinistra mostra una fotografia del fondo oculare scattata da una fotocamera a infrarossi. Strettamente a destra c'è un tomogramma della retina, che mostra lo spessore complessivo della retina intorno all'ONH e lo spessore di ogni strato. Come mostrato nella foto, possiamo vedere chiaramente che le capre hanno vasi sanguigni retinici più grandi delle scimmie. I dischi verdi all'estrema destra sono un'analisi quantitativa dello spessore del GCC intorno all'ONH. G sta per generale, T sta per lato temporale, N sta per lato nasale, S sta per superiore e I sta per inferiore. Il carattere nero rappresenta il valore di misurazione dello spessore GCC in micrometri e il verde è il valore di misurazione di riferimento clinico per l'uomo, non come riferimento per questo esperimento.

Figure 1
Figura 1: Forme d'onda elettrofisiologiche rappresentative nei macachi di capra e rhesus. (A) Forme d'onda FVEP rappresentative a diverse intensità luminose da una singola capra all'interno della stessa sessione anestetica. (B,D) Forme d'onda PERG rappresentative a frequenze spaziali diverse da una singola capra (B) o macaco rhesus (D) all'interno della stessa sessione anestetica. (C) Forme d'onda PVEP rappresentative a frequenze spaziali diverse da un singolo macaco rhesus all'interno della stessa sessione anestetica. Il tempo implicito tipico di ogni forma d'onda è menzionato nella sezione Protocollo. n = 1 soggetto per ogni prova. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Risultati dello Strumento di personalizzazione di Office. Immagini rappresentative OCT retiniche intorno alla testa del nervo ottico (pannello di sinistra) e allo spessore del GCC in diverse regioni peripapillari (pannello di destra) in capra (A) e macaco rhesus (B). n = 1 soggetto per ogni prova. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo studio, presentiamo un protocollo di VEP, PERG e OCT in capra e macaco rhesus. Questi metodi in vivo possono essere applicati in modelli animali di grandi dimensioni di varie neuropatie ottiche, come il glaucoma, la neuropatia ottica ischemica o traumatica e la neurite ottica9.

PVEP è più stabile e sensibile di FVEP17; tuttavia, non può essere suscitato in goat9. Come tale, FVEP viene eseguito in capra e PVEP viene eseguito in macaco rhesus nel nostro laboratorio per valutare l'integrità della via retino-genicolo-corticale. Il meccanismo alla base dell'osservazione che il PERG, ma non il PVEP, può essere indotto nella capra non è ancora chiaro secondo le nostre conoscenze. È possibile che la funzione e la struttura del nervo ottico della capra possano essere diverse da quelle umane.

Poiché l'ampiezza di FVEP può essere influenzata dalle dimensioni pupillari e dalla luce ambientale, dilatiamo la pupilla e posizioniamo una coperta nera sopra la testa della capra durante la registrazione FVEP. Va notato che la dilatazione della pupilla non è necessaria per FVEP nelle cliniche17. Allo stesso modo, sebbene l'adattamento al buio non sia necessario per la registrazione FVEP nelle cliniche, abbiamo scoperto che un adattamento di 5 minuti alla luce ambientale prima della registrazione FVEP può aumentare la ripetibilità intrasessione in ampiezza.

Si pensa che il segnale PERG provenga dagli RGC e quindi la sua ampiezza potrebbe essere utilizzata per stimare la funzione degli RGC13,20. Rispetto ad alcuni componenti speciali del flash ERG, come la risposta di soglia scotopica (STR) e la risposta negativa fotopica (PhNR), PERG è più sensibile alla disfunzione RGC13. Le potenziali limitazioni del test PERG in questo studio sono le seguenti. Innanzitutto, ISCEV consiglia di utilizzare il classico stimolatore CRT (tubo catodico) per la registrazione PERG per mantenere costante la luminanza media. Tuttavia, il classico stimolatore CRT è meno disponibile rispetto al display a cristalli liquidi (LCD). Sebbene lo schermo lcd di solito presenti cambiamenti transitori della luminanza durante l'inversione del modello, causando potenzialmente artefatto di luminanza17, non ha contribuito all'ampiezza del PERG nella capra secondo la nostra precedente scoperta: l'ampiezza del PERG alla frequenza spaziale di 12,6 cpd è solitamente trascurabile rispetto a quelli a frequenze spaziali più basse9 . Un'altra limitazione è che non abbiamo corretto l'errore di rifrazione prima del test PERG per motivi di semplicità. Per compensare questa limitazione, l'ampiezza PERG di base deve essere registrata come riferimento.

Il nostro studio precedente aveva valutato e ottimizzato la variazione intra e inter sessione di VEP e PERG9. Abbiamo scoperto che rispetto alla xilazina, l'isoflurano ha portato a forme d'onda PERG più ripetibili ma più variabili nelle capre9. Pertanto, abbiamo utilizzato isoflurano nel test FVEP e xilazina nel test PERG e OCT nelle capre. Inoltre, rispetto a PERG, la registrazione VEP è potenzialmente più variabile. Pertanto, ripetiamo regolarmente la registrazione VEP ad ogni intensità luminosa o frequenza spaziale per verificare la variazione intrasessione. Al contrario, le forme d'onda PERG sono molto più stabili. Pertanto, generalmente non ripetiamo la registrazione PERG. Sebbene la registrazione ripetuta in un giorno diverso sullo stesso argomento sia generalmente raccomandata, non ripetiamo regolarmente la registrazione VEP o PERG sullo stesso argomento in un giorno diverso per motivi di semplicità ed etica animale. Tuttavia, le registrazioni FVEP e PERG senza ripetizione inter-sessione sono abbastanza sensibili da rilevare lesioni del nervo ottico secondo il nostro studio precedente9.

L'imaging OCT retinico è una tecnica comoda, affidabile e non invasiva per monitorare longitudinalmente e quantificare i cambiamenti dinamici nella struttura retinica. Rispetto a PERG e VEP, l'imaging OCT ha una ripetibilità intersessione molto migliore9. Inoltre, l'imaging OCT può catturare e quantificare tutta la fibra del nervo ottico in pochi minuti senza errori di campionamento, offrendo un'opportunità molto più economica ed efficace per esaminare la struttura retinica rispetto all'analisi istologica tradizionale. Tuttavia, la risoluzione spaziale dell'attuale imaging OCT è ancora troppo limitata per dire al singolo soma RGC o alla fibra del nervo ottico. Inoltre, va notato che un GCC più spesso misurato da OCT non significa necessariamente una retina interna più intatta perché l'ispessimento del GCC può essere causato da edema retinico o emorragia.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato dalle seguenti sovvenzioni: National Key R&D Program of China (2021YFA1101200); Progetto di ricerca medica di Wenzhou (Y20170188), National Key R&D Program of China (2016YFC1101200); Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (81770926; 81800842); Programma chiave di ricerca e sviluppo della provincia di Zhejiang (2018C03G2090634); e Key R & D Program del Wenzhou Eye Hospital (YNZD1201902). Lo sponsor o l'organizzazione di finanziamento non ha avuto alcun ruolo nella progettazione o nella conduzione di questa ricerca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
47.6 x 26.8 cm monitors DELL Inc. E2216HV The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd PVC 6.0 ensure the airway
alligator clip
atropine Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes Roland Consult Stasche&Finger GmbH 2300 La Chaux-De-Fonds ERG recording
eye speculum Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd ZYD020 open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system Heidelberg Engineering OCT system
Imaging (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane RWD Life Science Co., Ltd R510-22 isoflurane anesthesia
male Saanen goats Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode Roland Consult Stasche&Finger GmbH U51-426-G-D use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously BD shanghai Medical Device Co., Ltd 383019 intravenous access for atropine and propofol
propofol Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops SANTEN OY, Japan 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device Gotec Co., Ltd GT-2008V-III use for FVEP & PERG
xylazine Huamu Animal Health Products Co., Ltd. xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50 Virbac induce Isoflurane anesthesia in monkey

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References

  1. Benowitz, L., Yin, Y. Rewiring the injured CNS: lessons from the optic nerve. Experimental Neurology. 209 (2), 389-398 (2008).
  2. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  3. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
  4. Bei, F., et al. Restoration of visual function by enhancing conduction in regenerated axons. Cell. 164 (1-2), 219-232 (2016).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Yang, S. -G., et al. Strategies to promote long-distance optic nerve regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 119 (2020).
  7. Foroozan, R. New treatments for nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Neurologic Clinics. 35 (1), 1-15 (2017).
  8. Singman, E. L., et al. Indirect traumatic optic neuropathy. Military Medical Research. 3, 2 (2016).
  9. Zhang, Y., et al. In vivo evaluation of retinal ganglion cells and optic nerve's integrity in large animals by multi-modality analysis. Experimental Eye Research. 197, 108117 (2020).
  10. Tolbert, W. D., et al. From Rhesus macaque to human: structural evolutionary pathways for immunoglobulin G subclasses. mAbs. 11 (4), 709-724 (2019).
  11. Preuss, T., et al. Specializations of the human visual system: the monkey model meets human reality. , CRC Press. Boca Raton, FL. 231-259 (2004).
  12. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
  13. Porciatti, V. Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function. Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).
  14. Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. Assessing retinal ganglion cell damage. Eye. 31 (2), 209-217 (2017).
  15. Schuman, J. S., et al. Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).
  16. You, Y., et al. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).
  17. Odom, J. V., et al. ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update). Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).
  18. Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. eLife. 8, 45881 (2019).
  19. Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey. Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).
  20. Porciatti, V. The mouse pattern electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 145-153 (2007).

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Neuroscienze Numero 180
<em>In vivo</em> Metodi per valutare la funzione e la struttura delle cellule gangliari retiniche e del nervo ottico in animali di grandi dimensioni
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Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S.,… More

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S., Sun, J., Li, M., Xia, Y., Zhang, S., Wu, W., Zhang, Y. In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals. J. Vis. Exp. (180), e62879, doi:10.3791/62879 (2022).

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