Summary
Her præsenterer vi en protokol til isolering af kerner af høj kvalitet fra frosne musenyrer, der forbedrer repræsentationen af medullære nyrecelletyper og undgår genekspressionsartefakter fra enzymatisk vævsdissociation.
Abstract
Nyrerne regulerer forskellige biologiske processer såsom vand, elektrolyt og syre-base homeostase. Fysiologiske funktioner i nyrerne udføres af flere celletyper arrangeret i en kompleks arkitektur på tværs af organets kortikondedullære akse. Nylige fremskridt inden for enkeltcelletranskriptomics har fremskyndet forståelsen af celletypespecifik genekspression i nyrefysiologi og sygdom. Imidlertid kræver enzymbaserede vævsdissociationsprotokoller, som ofte anvendes til enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq), for det meste frisk (ikke-arkiveret) væv, introducerer transkriptionelle stressresponser og favoriserer udvælgelsen af rigelige celletyper i nyrebarken, hvilket resulterer i en underrepræsentation af celler i medulla.
Her præsenterer vi en protokol, der undgår disse problemer. Protokollen er baseret på kerneisolering ved 4 °C fra frosset nyrevæv. Kerner er isoleret fra et centralt stykke af musenyren, der består af cortex, ydre medulla og indre medulla. Dette reducerer overrepræsentationen af kortikale celler, der er typiske for helnyreprøver til fordel for medullære celler, således at data vil repræsentere hele kortikodedullaksen ved tilstrækkelig overflod. Protokollen er enkel, hurtig og tilpasningsdygtig og giver et skridt i retning af standardisering af enkeltkerner transkriptomik i nyreforskning.
Introduction
Nyrer viser en meget kompleks vævsarkitektur. De består af funktionelt og anatomisk forskellige segmenter langs en kortikodedullær akse og medierer biologiske funktioner, såsom regulering af ekstracellulært væskevolumen, elektrolytbalance eller syre-base homeostase1.
Fremskridt inden for enkeltcelletranskriptomik har muliggjort dybdegående karakterisering af komplekse væv og fremskyndet forståelsen af segment- og celletypespecifik genekspression i nyrefysiologi, udvikling og sygdom 2,3,4.
Imidlertid viser de enzymbaserede dissociationsprotokoller, der ofte anvendes til scRNA-seq, flere ulemper og begrænsninger. Afhængigt af protokollen genererer de transkriptionelle stressresponser og vævsdissociationsbias mod kortikale celletyper, der er lettere at dissociere, 5,6. Selvom protokoller, der bruger koldaktive proteaser til embryonale nyrer, er i stand til at afbøde stressrelaterede transkriptionelle ændringer, undlader de at overvinde dissociationsbias mod kortikale celler og kan muligvis ikke let tilpasses forskellige slags syge nyrevæv7. Desuden er enkeltcellemetoder ikke let kompatible med frosne vævsprøver, idet deres anvendelse hovedsagelig begrænses til ikke-arkiveret, frisk væv, hvilket gør vævsindsamlingen til en begrænsende faktor6.
Enkeltkerne RNA-sekventering (snRNA-seq) kan omgå disse begrænsninger 8,9. Her præsenterer vi en protokol for kerneisolering fra en central skive frosset voksent musenyrevæv (figur 1)10. Vores protokol er enkel og giver en standardiseret tilgang til opnåelse af RNA-sekventeringsbiblioteker med en afbalanceret repræsentation af forskellige nyrecelletyper til eksperimentelle modeller, der ikke involverer stærke regionale vævsændringer. I sidstnævnte tilfælde kan vores protokol også udføres med hele nyrerne.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med dyrevelfærdsloven (TierSchG) og dyrevelfærdsforsøgsdyreforordningen (TierSchVersV) og blev godkendt af lokale myndigheder og dyrevelfærdsofficererne på vores institution (MDC).
1. Vævsforberedelse
- Forbered en 6-brønds plade indeholdende 2 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS) pr. Brønd for hver nyre, der opnås. Forbered en 6-brønds plade indeholdende 2 ml RNA-stabiliseringsopløsning pr. Brønd og nyre. Forafkøl begge plader på is.
- Aflive en 3- til 6 måneder gammel C57BL/6-hanmus. Placer musen på en dissekeringsbakke, fastgør ekstremiteterne og steriliser maven med 70% ethanol.
- Åbn maven op til brystkassen ved hjælp af tang og saks. Løft tarmen og andre organer til siden og fjern nyrerne ved omhyggeligt at skære urinlederen, nyrearterien og venen med en saks. Vask nyrerne i den tidligere tilberedte, iskolde 1x PBS og fjern renal fascia og eventuelt resterende fedt fra nyrerne, indtil alt hvidt væv er fjernet (figur 2A).
- Placer nyren på en kold dissekeringsplade og brug en skarp skalpel eller barberblad til at opnå en midterste skive på 1-2 mm. Sørg for, at vævsstykket indeholder hele kortikodedullaksen (figur 2B). Brug mikrodissektionssaks og tang til omhyggeligt at trimme cortex fra siderne af midterstykket. Inden for det dissekerede vævsstykke skal de tre segmenter cortex, ydre medulla og indre medulla være tydeligt synlige (figur 2C).
BEMÆRK: Skiven bør ikke overstige en tykkelse på 2 mm eller en vægt på 20 mg for at sikre tilstrækkelige buffermængder til effektiv vævslyse og for at minimere omgivende baggrunds-RNA i cDNA-bibliotekerne. Ambient RNA spilder sekvenskapacitet, da det ikke er forbundet med enkeltkerner. - Nyrestykket overføres til den tidligere fremstillede RNA-stabiliseringsopløsning og inkuberes i 24 timer ved 4 °C for at undgå RNA-nedbrydning. Efter 24 timer fjernes RNA-stabiliseringsopløsningen, og vævet opbevares ved -80 °C indtil yderligere anvendelse. Fjern forsigtigt overskydende opløsning med silkepapir.
2. Isolering af kerner
- Trin til rengøring og klargøring
- Rengør bordplader og pipetter med 70 % ethanol og RNase-dekontamineringsopløsning.
- Rengør et rundbundet 2 ml vævssliberør og matchende støderglas A og B med RNase-dekontamineringsopløsning efterfulgt af 70 % ethanol og RNasefrit vand (1 sliberør og stødersæt pr. prøve). Lad det tørre helt.
- Centrifugen forafkøles til 4 °C.
- Mærk og forafkøl tre 15 ml opsamlingsrør, et 1,5 ml opsamlingsrør, et 5 ml fluorescensaktiveret cellesorteringsrør (FACS) og et tørt sliberør til hver prøve på is.
- Forberedelse af buffer
- Ribonukleosid-vanadylkompleksets stamopløsning opvarmes til 65 °C, indtil den er rekonstitueret til en grøn-sort, klar opløsning i overensstemmelse med producentens anvisninger. 11
- Der fremstilles 1x PBS indeholdende 4 % bovint serumalbumin (BSA) som beskrevet i tabel 1A. Derudover skal du forberede 1x PBS med 0,04% BSA (tabel 1B). Begge opløsninger filtreres ved hjælp af et 0,2 μm overfladeaktivt stoffrit celluloseacetat (SFCA) membransprøjtefilter, og opbevares på is indtil yderligere brug.
- Forbered kernernes lysbuffer 1 (NLB1, tabel 1C). Der tilsættes 4 ml EZ-lysisbuffer til kernelysebuffer 2 (NLB2, tabel 1D) og 2 ml 0,04 % BSA/PBS til kernerne, suspensionsbuffer (NSB, tabel 1E) til 15 ml rør. Tilføj RNase-hæmmeropløsningen til NLB2 og NSB direkte før brug som angivet nedenfor i protokollen. Opbevares på is indtil videre brug.
- Forbered EZ-lysebuffer med 10% saccharose (saccharosegradientbuffer, tabel 1F). Bland godt og filtrer bufferen i et frisk 15 ml rør ved hjælp af et 0,2 μm SFCA membransprøjtefilter. Opbevares på is indtil videre brug.
- Vævshomogenisering og cellelyse
BEMÆRK: For at minimere RNA-nedbrydning udføres alle trin på is. Kværnrøret, petriskålen og alle buffere skal forkøles. Alle resuspensionstrin udføres ved omhyggeligt pipettering af kernesuspensionen. Undlad at hvirvel prøven for at undgå forskydningskræfter og beskadigelse af kerner.- Tag det frosne nyrestykke og overfør det til en 60 mm polystyren petriskål på is indeholdende 1 ml NLB1.
- Hak vævet grundigt med et barberblad eller skalpel (figur 3A).
- Afskær spidsen af en 1 ml pipettespids, og overfør hakket væv og buffer til kværnrøret. Sørg for at overføre alle vævsstykker. Vask petriskålen 5-10 gange med bufferen, hvis det er nødvendigt.
- Homogeniser suspensionen på is ved langsomt at bevæge støderen A, 25x op og ned i kværnrøret. Undgå luftbobler forårsaget af hurtig bevægelse (figur 3B).
- Homogenatet ledes gennem en 100 μm si i et forkølet 15 ml opsamlingsrør, og filteret vaskes med yderligere 1 ml NLB1.
- Vask kværnrøret med kold EZ-kerner, og kassér bufferen.
- Overfør homogenatet tilbage i kværnrøret og homogeniser suspensionen på is ved langsomt at bevæge støderen B, 15x op og ned i kværnrøret. Undgå luftbobler forårsaget af hurtig bevægelse (figur 3C).
- Homogenatet overføres til et forkølet 15 ml opsamlingsrør. Vask kværnrøret med yderligere 2 ml NLB1, og sørg for at overføre alle vævsfragmenter til opsamlingsrøret. Inkuber homogenatet (samlet volumen på 4 ml) i 5 minutter på is for at lyse cellerne.
- Oprensning af kerner
- Homogenatet ledes gennem en 40 μm sil ind i et forkølet 15 ml opsamlingsrør. Drej opsamlingsrøret i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C i en centrifuge med en svingende skovlrotor. I mellemtiden tilsættes RNase-hæmmeropløsning til NLB2 (tabel 1D).
- Supernatanten fjernes uden at forstyrre pelletsen. Opslæv forsigtigt pelleten i 4 ml NLB2.
- Underlæg forsigtigt affjedringen med en 1 ml pude af saccharosegradientbuffer. Der centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C i en centrifuge med en svingende skovlrotor. I mellemtiden tilsættes RNase-hæmmeropløsning til NSB (tabel 1E).
- Efter centrifugeringen fjernes forsigtigt opsamlingsrøret fra centrifugen, og pas på ikke at forstyrre de to lag, når opsamlingsrøret håndteres. Cellerester er synlige mellem de to lag. Supernatanten fjernes forsigtigt, begyndende med resterne. Den resterende supernatant fjernes uden at forstyrre kernepillen, og pelletpen resuspenderes forsigtigt i 1 ml NSB.
BEMÆRK: Resuspensionsvolumenet afhænger af mængden af væv, der anvendes til isoleringen, og pelletstørrelsen, der opnås efter det sidste centrifugeringstrin. Volumenet skal muligvis tilpasses det forventede antal kerner. - Homogenatet ledes gennem en 20 μm sil ind i det forkølede 5 ml FACS-opsamlingsrør.
3. Sortering af kerner
- Der tilsættes 20 μL 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) pr. ml NSB til en slutkoncentration på 2 μM til homogenatet i FACS-opsamlingsrøret og blandes forsigtigt. Inkuber i 5 min på is.
- Forbered det forkølede 1,5 ml opsamlingsrør med 20 μL 4% BSA /1x PBS, og tilsæt 0,5 μL RNase-hæmmeropløsning til en slutkoncentration på 1 E/μL. Fortsæt straks med sorteringen.
- Sorter kernerne ved hjælp af en cellesorterer.
- Kernesuspensionen blandes kort, inden FACS-opsamlingsrøret indsættes i sorteringsmaskinen.
- Indstil en første port P1 baseret på fremadrettet spredning (FSC) og sidespredning (SSC) for at udelukke snavs og aggregater (figur 4A).
- For at udelukke tomme eller beskadigede kerner og multiplaletter skal du indstille en efterfølgende gate baseret på DAPI-området versus DAPI-højden (DAPI-A vs DAPI-H) (figur 4B).
- Enkeltkerner sorteres i 1,5 ml opsamlingsrør indeholdende 4% BSA/1x PBS med 1 E/μL RNase-hæmmeropløsning fremstillet i 3.2.
4. Kvalitetskontrol
- Den endelige kernekoncentration måles under et fluorescensmikroskop eller i et automatiseret tællekammer i mindst to uafhængige tællinger, og suspensionskvaliteten vurderes (figur 5).
BEMÆRK: Optimale koncentrationer er mellem 700 - 1.200 kerner / μL. Lavere cellekoncentrationer såsom 700 kerner / μL kan være at foretrække, da resulterende cDNA-biblioteker indeholdt mindre omgivende baggrunds-RNA (transkripter, der ikke er forbundet med individuelle kerner). - Beregn det krævede volumen af kernesuspension til den ønskede genopretning af sekventerede enkeltkerner. For at undgå nukleiaggregering og RNA-nedbrydning fortsættes straks til biblioteksforberedelse.
Representative Results
For at bestemme udførelsen af vores protokol brugte vi 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Gene Expression Kit v3.1 til biblioteksforberedelse og analyserede snRNA-seq-dataene med Seurat -pakken12,13.
Figur 6 viser resultater fra et repræsentativt snRNA-seq-bibliotek. For at vurdere kvaliteten af vores kerner plottede vi antallet af gener mod antallet af transkripter (defineret af unikke molekylære identifikatorer (UMI'er)) farvet af brøkdelen af mitokondrielæsninger (figur 6A). Kerner af god kvalitet viser generelt et højere antal læsninger, korrelerer UMI- og gennumre og lave mitokondrielæsningsfraktioner.
Til den efterfølgende analyse blev kerner med mindre end 500 eller mere end 4000 tællede gener eller mere end 5% mitokondrielt RNA udelukket (n = 828). Kun gener udtrykt i mindst tre kerner blev inkluderet. Vi påviste i alt ca. 20.000 gener i de resterende 6.000 kerner med 1.600 mediangener og 2.800 mediane UMI'er pr. kerne (figur 6B).
Clustering var baseret på meget variable gener. Vi identificerede i alt 18 klynger. Celleidentiteter blev kommenteret baseret på kendte markørgener (ikke vist). Underklynger af en celletype blev opsummeret til en klynge, hvilket resulterede i i alt 11 forskellige celletyper: podocytter, proksimal tubuli (PT), tynd lem (tL), tyk stigende lem (TAL), distal indviklet tubuli (DCT), forbindelsesrør (CNT), opsamling af kanalhovedstol og interkalerede celler (CD-PC, A-IC, B-IC), dybt medullært epitel i bækkenet (DMEP) og endotel. Genekspressionsmønstre af klyngeberigede markører blev visualiseret i et prikplot (figur 6C) og celletypeklynger i et t-distribueret stokastisk naboindlejringsplot (t-SNE) (figur 6D).
For at vurdere celletypefordelinger i vores prøve blev procentdelen af hver celletype beregnet (figur 6E) og brugt til at bestemme forholdet mellem PT og TAL. PT er hovedsageligt placeret i nyrebarken og ofte overrepræsenteret i nyre-enkeltcelledatasæt, da celler i PT er lette at adskille og meget rigelige i hele nyreprøver. TAL strækker sig derimod over hele den ydre medulla14. Således repræsenterer forholdet mellem PT- og TAL-fraktioner et godt mål for berigelse af medullære celletyper i et nyre-enkeltcelledatasæt. Generelt varierede PT/TAL-forholdet i enkeltcellede helnyredatasæt fra 8 (upublicerede data fra koldproteasebehandlet helnyrevæv) til 45 for enzymatisk dissocieret væv10,14,15. I snRNA-seq-datasættet, der præsenteres her, var vi i stand til at nå et PT / TAL-forhold på 2. Dette resultat illustrerer, at fjernelse af overskydende cortex under vævsdissektion kombineret med snRNA-seq resulterer i en markant forbedret nyrecelletyperepræsentation.
Figur 1: Skematisk oversigt over arbejdsgangen. Protokollen består af fire hovedtrin, der omfatter vævsdissektion efterfulgt af kerneisolering, kernesortering og en endelig renheds- og koncentrationsvurdering. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nyredissektion og vævspræparation . (A) Repræsentativt billede af dissekeret hel nyre. De stiplede linjer angiver de snit, der kræves for at opnå en midterste skive på 1-2 mm med en repræsentation af alle nyrecelletyper. (B) Repræsentativt billede af opnået midterste skive. De stiplede linjer angiver snittene til cortex trimning fra siden. (C) Repræsentativt billede af centralt nyrestykke med trimmet cortex. Cortex (C), ydre medulla (OM) og indre medulla (IM) er tydeligt synlige. Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vævshomogenisering og kerneoprensning . (A) Repræsentativt billede, der viser tilstrækkeligt hakket nyrevæv. Skalastang = 500 μm. (B) Homogenat efter første homogeniseringstrin (25 slag med stød A, 2 ml sliberør). (C) Homogenat efter andet homogeniseringstrin (15 slag med støder, B, 2 ml sliberør). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Gating strategi for kernesortering. (A ) En første gate P1 blev indstillet baseret på forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC) for at udelukke vragrester og aggregater. (B ) En efterfølgende port baseret på DAPI-Area (DAPI-A) vs DAPI-Height (DAPI-H) udelukkede tomme eller beskadigede kerner og multipla. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Nuclei suspension før og efter kernesortering. (A, C) DAPI-farvede kerner (blå). (B, D) Overlejring af DAPI og brightfield (BF) kanal. Før sortering (øverste panel) indeholder kernesuspensionen celleaffald og aggregater (mærket med hvide pilespidser). Efter sortering (nederste panel) vises kernesuspensionen meget renere. Eksempler på DAPI-farvede kerner er mærket med sorte pilespidser. Kerner af god kvalitet fremstår runde og glatte med en intakt membran og er godt adskilt, mens kerner af dårlig kvalitet fremstår rynkede og viser tab af kernemembranen. Skalabjælke = 250 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kvalitetskontrol og analyse af et repræsentativt snRNA-seq-datasæt. (A) Antal gener (nGene) plottet mod antallet af unikke molekylære identifikatorer (nUMI) farvet af fraktionen af mitokondrielæsninger (percent.mt). Kerner af lav kvalitet svarer til plottets nederste venstre kvadrant (n = 828) og blev udelukket fra efterfølgende analyse. (B) Fordeling og median af nGene og nUMI påvist pr. kerne i snRNA-seq-datasættet, svarende til 6,177 kerner (> 500 gener). Biblioteker blev sekventeret til en mediandybde på ~ 8.200 kortlagte læsninger pr. Kerne. (C) Prikplot, der viser genekspressionsmønstre for klyngeberigede markører (x-akse) for individuelle celletyper (y-akse). Prikkens størrelse svarer til andelen af celler, der udtrykker det angivne gen. Farven svarer til det gennemsnitlige udtryk. (D) T-distribueret stokastisk naboindlejring (t-SNE) plot af identificerede celletyper. (E) Celletypefordeling i snRNA-seq-datasæt. PT, proksimal tubuli; tL, tyndt lem; TAL, tykt stigende lem, DCT, distal indviklet rør; CNT, tilslutning af rør; CD-PC, opsamling af kanalhovedceller; A-IC, interkalerede celler af type A; B-IC, interkalerede celler af type B; DMEP, dybt medullært epitel af bækkenet. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagens | Endelig koncentration | Volumen (ml) | ||
| A) 4 % BSA/PBS | ||||
| Fosfatbufret saltvand (PBS) med 10% bovin albumin | 4% | 2 | ||
| PBS (fosfatbufret saltvand) 1X uden calcium eller magnesium | - | 3 | ||
| B) 0,04 % BSA/PBS | ||||
| 4 % BSA/PBS | 0.04 % | 0.5 | ||
| PBS (fosfatbufret saltvand) 1X uden calcium eller magnesium | - | 49.5 | ||
| c) Nuclei Lysis Buffer 1 (NLB1) | ||||
| Nuklear EZ lysis buffer | - | 4 | ||
| RiboLock RNase-hæmmer (40 E/μL) | 1 U/μL | 0.1 | ||
| Ribonukleosid-vanadylkompleks (200 mM) | 10 mM | 0.2 | ||
| d) Nuclei Lysis Buffer 2 (NLB2) | ||||
| Nuklear EZ lysis buffer | - | 4 | ||
| RiboLock RNase-hæmmer (40 E/μL) | 1 U/μL | 0.1 | ||
| e) buffer til suspension af kerner (NSB) | ||||
| 0,04 % BSA/PBS | - | 2 | ||
| RiboLock RNase-hæmmer (40 E/μL) | 1 U/μL | 0.05 | ||
| f) buffer for saccharosegradient (10 % saccharose) | ||||
| Vægt 1 g saccharose | ||||
| Opløs i 6 ml nuklear EZ-lysebuffer | ||||
| Fyld op til 10 ml med nuklear EZ-lysebuffer | ||||
| Filtrer gennem et 0,2 μm sprøjtefilter ind i et friskt rør | ||||
Tabel 1: Opløsningsopskrifter: (A) Fremstilling af 4% BSA/1x PBS. Filtrer ved hjælp af et 0,2 μm SFCA-membransprøjtefilter, og hold det på is indtil brug. (B) Præparat af 0,04% BSA/1 x PBS. Filtrer ved hjælp af et 0,2 μm SFCA-membransprøjtefilter, og hold det på is indtil brug. c) Fremstilling af kerner 1 (NLB1). Angivne mængder leveres pr. Prøve. Opbevares på is indtil brug. d) Fremstilling af nuclei lysis buffer 2 (NLB2). Angivne mængder leveres pr. Prøve. Tilføj RiboLock RNase-hæmmer til NLB2 direkte før brug som angivet i protokollen. Opbevares på is indtil brug. e) Fremstilling af buffer til suspension af kerner (NSB). Angivne mængder leveres pr. Prøve. Tilføj RiboLock RNase-hæmmer til NSB direkte før brug som angivet i protokollen. Opbevares på is indtil brug. f) Fremstilling af stødpude for saccharosegradient. Filtrer ved hjælp af et 0,2 μm SFCA-membransprøjtefilter, og hold det på is indtil brug.
Discussion
Enkeltcelletranskriptomics fremmer forståelsen af celletypespecifik genekspression i nyrefysiologi og sygdom. Her leverede vi en enkel og reproducerbar metode til at isolere enkeltkerner af høj kvalitet fra frosset musenyrevæv til snRNA-seq på en standardiseret måde.
For snRNA-seq er det afgørende at bruge kerner af høj kvalitet som input til biblioteksgenerering og for at undgå RNA-nedbrydning under vævsbehandling. Derfor er inkubation af vævsstykker i RNA-stabiliseringsopløsning umiddelbart efter dissektion afgørende for at beskytte og stabilisere cellulært RNA og gør det muligt at opbevare prøver ved - 80 ° C på ubestemt tid. Ved anvendelse af denne protokol på frosset væv uden RNA-stabiliseringsopløsningsbehandling, såsom arkivmateriale, kræves en prøvekørsel, og RNA-kvaliteten skal vurderes, da vi observerede et signifikant tab af RNA-integritet i snapfrosset væv uden forudgående inkubation i RNA-stabiliseringsopløsning.
Generelt er passende prøvehåndtering afgørende for at maksimere genvindingen af intakte, enkelte kerner. Alle trin i opslæmningen skal udføres omhyggeligt ved pipettering for at undgå forskydningsspænding og fysisk skade. Buffere til den endelige kerneresuspension og kernesortering bør indeholde BSA for at undgå kernetab og aggregering.
Buffervolumener i denne protokol er optimeret til meget små vævsprøver (~15 mg). Det er afgørende at sikre fuldstændig cellelyse og tilstrækkelig vask til at generere suspensioner af høj kvalitet. Større vævsblokke eller hele nyreprøver vil resultere i for høje kernekoncentrationer, der fører til klumpning og aggregering, høj overflod af omgivende RNA og generelt dårlig suspensionskvalitet. Hvis større prøver eller andet væv behandles, anbefales det stærkt at udføre prøvekørsler for at bestemme optimale buffervolumener for minimale omgivende RNA-niveauer. Kerne- og RNA-kvalitet og koncentrationer skal undersøges nøje, da overbelastning resulterer i generelt dårlig ydeevne.
Derudover påvirker store mængder celleaffald, der forårsager høje niveauer af omgivende RNA, der ikke er forbundet med enkeltkerner, sekventeringsresultaterne negativt. Afklaring af kernesuspensionen ved centrifugering gennem en saccharosepude afbøder dette problem til en vis grad, men det kan også føre til bias i celletyperepræsentation ved modselektion mod tætte, små kerner, der f.eks. er til stede i immunceller16. Hvis dette giver anledning til bekymring, bør saccharosegradienten udelades. I modsætning hertil fandt vi, at flowcytometri baseret på DAPI-farvning var afgørende for at reducere mængden af celleaffald for at producere en enkeltkernesuspension af høj kvalitet.
Isolering af enkeltkerner har betydelige fordele sammenlignet med enkeltcellemetoder8. Det er kompatibelt med korrekt frosset væv, hvilket gør vævssamlingen mere fleksibel og omgår behovet for enzymbaseret vævsdissociation, som kan introducere transkriptionelle stressresponser 6,17. Desuden overvinder det dissociationsbias, der favoriserer udvælgelsen af let dissocierbare celletyper i nyrebarken, hvilket kan føre til en underrepræsentation af medullære celletyper i nogle enzymbaserede tilgange 5,6,10.
Brug af et centralt nyrestykke i stedet for hele nyrevæv sparer yderligere ressourcer og korrigerer for overrepræsentation af rigelige celletyper som beskrevet tidligere10. Afhængigt af den undersøgte musemodel eller fænotype kan det dog være en fordel at bruge hele nyreprøver i stedet for en enkelt midterste skive. Hele nyreprøver kan være mere repræsentative for ægte celleproportioner eller ændringer, der forekommer i hele nyrerne, mens en trimmet midterste skive viste sig fordelagtig for medullære fænotyper, eller når prøvematerialet var begrænset. Denne beslutning er derfor meget brugerspecifik og bør overvejes nøje.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Scientific Genomics Platform på Max Delbrück Center for Molecular Medicine i Helmholtz Association, Berlin for teknisk support.
JL og KMSO blev støttet af German Research Foundation (DFG) Research Training Group GRK 2318 og af Research Unit FOR 2841. KMSO blev støttet af Collaborative Research Grant 1365. AB blev støttet med midler fra Gottfried Wilhelm Leibniz-prisen fra DFG, der blev tildelt NR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell sorter | - | - | For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000015 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope. |
| 4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) | Biotrend | 40043/b | Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM. |
| D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free | VWR | 0335-500G | |
| DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22431021 | |
| Ethanol, 70 % | - | - | |
| FACS tubes | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma-Aldrich | D8938-1SET | |
| Minisart Syringe Filters 0.2 µm | Sartorius | 16534-GUK | |
| Nuclease-free Water | Invitrogen | AM9937 | |
| Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma-Aldrich | NUC-101 | Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation. |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Petri dishes, polystyrene 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| pluriStrainer Mini 100 µm | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| pluriStrainer Mini 20 µm | pluriSelect | 43-10020-40 | |
| pluriStrainer Mini 40 µm | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL) | Falcon | 352099 | |
| Razor blades | - | - | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | EO0384 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C. |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | |
| RNase AWAY | Fisher Scientific | 11952385 |
References
- Thomas, R. S. Kidney modeling and systems physiology. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 1 (2), 172-190 (2009).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Park, J., Liu, C. L., Kim, J., Susztak, K. Understanding the kidney one cell at a time. Kidney International. 96 (4), 862-870 (2019).
- Clark, A. R., Greka, A. The power of one: advances in single-cell genomics in the kidney. Nature Reviews Nephrology. 16 (2), 73-74 (2020).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Muto, Y., et al. Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney. Nature Communications. 12 (1), 2190 (2021).
- Hinze, C., et al. Kidney single-cell transcriptomes predict spatial corticomedullary gene expression and tissue osmolality gradients. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (2), 291 (2021).
- Berger, S. L. Isolation of cytoplasmic RNA: ribonucleoside-vanadyl complexes. Methods in Enzymology. 152, 227-234 (1987).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al.
- Park, J., et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease. Science. 360 (6390), 758-763 (2018).
- Kirita, Y., Wu, H., Uchimura, K., Wilson, P. C., Humphreys, B. D. Cell profiling of mouse acute kidney injury reveals conserved cellular responses to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15874-15883 (2020).
- Schneeberger, S., et al. The neuroinflammatory interleukin-12 signaling pathway drives Alzheimer's disease-like pathology by perturbing oligodendrocyte survival and neuronal homeostasis. bioRxiv. , 441313 (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
