Summary
Hier beschreiben wir ein optimiertes Direktreprogrammierungssystem für Melanozyten und ein hocheffizientes, konzentriertes Virusverpackungssystem, das eine reibungslose direkte Reprogrammierung gewährleistet.
Abstract
Der Funktionsverlust der Melanozyten führt zu Vitiligo, was die körperliche und geistige Gesundheit der betroffenen Personen ernsthaft beeinträchtigt. Derzeit gibt es keine wirksame Langzeitbehandlung für Vitiligo. Daher ist es unerlässlich, eine bequeme und wirksame Behandlung für Vitiligo zu entwickeln. Die Technologie der regenerativen Medizin zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten scheint eine vielversprechende neuartige Behandlung der Vitiligo zu sein. Dies beinhaltet die direkte Umprogrammierung der Hautzellen des Patienten in funktionelle Melanozyten, um den Verlust von Melanozyten bei Patienten mit Vitiligo zu lindern. Diese Methode muss jedoch zuerst an Mäusen getestet werden. Obwohl die direkte Reprogrammierung weit verbreitet ist, gibt es kein klares Protokoll für die direkte Reprogrammierung in Melanozyten. Darüber hinaus ist die Anzahl der verfügbaren Transkriptionsfaktoren überwältigend.
Hier wird ein konzentriertes Lentivirus-Verpackungssystemprotokoll vorgestellt, um Transkriptionsfaktoren zu erzeugen, die für die Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten ausgewählt wurden, einschließlich Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 und Snai2. Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus wurden mit dem konzentrierten Lentivirus für all diese Transkriptionsfaktoren für die direkte Reprogrammierung der MEFs in induzierte Melanozyten (iMels) in vitro infiziert. Darüber hinaus wurden diese Transkriptionsfaktoren gescreent und das System für die direkte Reprogrammierung auf Melanozyten optimiert. Die Expression der charakteristischen Melaninmarker in iMels auf Gen- oder Proteinebene war signifikant erhöht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten auf Melanozyten eine erfolgreiche neue therapeutische Strategie für Vitiligo sein könnte und den Mechanismus der Melanozytenentwicklung bestätigt, der die Grundlage für eine weitere direkte Reprogrammierung von Fibroblasten in Melanozyten in vivo bilden wird.
Introduction
Vitiligo ist eine Hautkrankheit, die die körperliche und geistige Gesundheit der betroffenen Personen ernsthaft beeinträchtigt. Aus verschiedenen Gründen, einschließlich metabolischer Anomalien, oxidativem Stress, Bildung von Entzündungsmediatoren, Zellablösung und Autoimmunreaktion, gehen die funktionellen Melanozyten verloren und die Sekretion von Melanin wird gestoppt, was zur Entwicklung von Vitiligo 1,2 führt. Dieser Zustand tritt häufig auf und ist besonders problematisch im Gesicht. Die Hauptbehandlung ist die systemische Verwendung von Kortikosteroiden und Immunmodulatoren. Phototherapie kann für systemische oder lokale Krankheiten verwendet werden, und es gibt chirurgische Behandlungen, wie perforierte Hauttransplantation und autologe Melanozytentransplantation 3,4,5. Patienten, die medikamentöse Therapie und Phototherapie anwenden, sind jedoch anfällig für Rückfälle, und diese Behandlungen haben schlechte langfristige therapeutische Wirkungen. Die chirurgische Behandlung ist traumatisch und nur mäßig wirksam 2,6. Daher ist eine neue und wirksame therapeutische Strategie für Vitiligo erforderlich.
Die Reprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) kehrt diese Zellen von ihrem terminalen Zustand in einen pluripotenten Zustand um, ein Prozess, der durch die Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc7 vermittelt wird. Aufgrund der Möglichkeit der Tumorigenität und der langen Produktionszeit ist diese Technologie jedoch auf Skepsis gestoßen, wenn sie auf klinische Umgebungen angewendet wird8. Die direkte Reprogrammierung ist eine Technologie, die einen Typ einer Terminalzelle in einen anderen Typ einer Terminalzelleverwandelt 9. Dieser Prozess wird durch geeignete Transkriptionsfaktoren erreicht. Verschiedene Zellen wurden bereits erfolgreich direkt umprogrammiert, darunter Kardiomyozyten10, Neuronen 11 und Cochlea-Haarzellen12. Einige Forscher haben sogar Hautgewebe direkt in situ umprogrammiert, das zur Wundheilung genutzt werden kann13. Zu den Vorteilen einer direkten Reprogrammierung gehören reduzierte Wartezeiten und Kosten, ein geringeres Krebsrisiko, weniger ethische Probleme und ein besseres Verständnis des Mechanismus, der der Bestimmung des Zellschicksals zugrunde liegt9.
Obwohl die direkte Reprogrammierungsmethode weit verbreitet ist, gibt es derzeit keine definitive Methode zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten, insbesondere wegen der zahlreichen Transkriptionsfaktoren, dieals 14,15 zu betrachten sind. Die Transkriptionsfaktoren Mitf, Sox10 und Pax3 wurden zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten14 verwendet. Im Gegensatz dazu wurde die Kombination von MITF, PAX3, SOX2 und SOX9 in einer anderen Studie15 auch für die direkte Reprogrammierung von Hautzellen in menschliche Melanozyten verwendet. In diesem Protokoll wurde trotz der Verwendung einer anderen Screening-Methode das gleiche Ergebnis mit der Kombination von Mitf, Sox10 und Pax3 zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten erzielt, wie zuvorbeschrieben 14. Die Entwicklung eines Systems zur Erzeugung von Melanozyten aus anderen Hautzellen kann ein Schema für die Umwandlung anderer Hautzellen von Vitiligo-Patienten in Melanozyten liefern. Daher ist es entscheidend, eine einfache und effiziente Methode für diese direkte Reprogrammierung zu konstruieren, um Melanozyten erfolgreich zu erzeugen.
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Protocol
Diese Arbeit wurde vom Laboratory Animal Management and Use Committee an der Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010) genehmigt. Die Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den Standards durchgeführt, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International) festgelegt wurden. Es gab keine Experimente mit Menschen, so dass diese Arbeit keine Genehmigung der Ethikkommission für Humanforschung benötigte. Weitere Informationen zu Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle .
1. Aufbau eines konzentrierten Lentivirus-Verpackungssystems für Transkriptionsfaktoren
- Produktion des konzentrierten Virus (Abbildung 1A, B)
- Platte 1,5 × 106 HEK-293T-Zellen in eine 60 mm Schale und Kultur dieser Zellen mit normalem Medium (siehe Tabelle 1) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2.
HINWEIS: Wenn das Virus in Chargen verpackt werden muss, kann eine 100-mm-Zellkulturschale verwendet werden (Details siehe Tabelle 2). - Stellen Sie nach 24 h sicher, dass die HEK-293T-Zellen am Tag der Transduktion einen Konfluenz von 80-90% erreicht haben, und ersetzen Sie das Medium durch 3,5 ml DMEM (150 μL DMEM pro 1 cm2). Lassen Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für2 h.
HINWEIS: Das Ersatzmedium muss serumfrei sein, damit die Zellen für eine bessere Plasmidtransfektion "ausgehungert" werden können. - Herstellen der Mischung von Plasmiden (Mischung A), die 3 μg der Zielplasmide von Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 oder Snai2 enthält; 1 μg des Verpackungsplasmids PMD2. G und 2 μg des Verpackungsplasmids PSPAX2. Machen Sie das Volumen von Mix A bis 150 μL mit serumfreiem DMEM aus. Bereiten Sie die Mischung des Transfektionsreagenzes (Mischung B) durch Zugabe von 12 μL des Transfektionsreagenzes vor (das Volumen ist doppelt so groß wie die Gesamtmasse aller Plasmide) und machen Sie das Volumen von Mischung B bis 150 μL mit serumfreiem DMEM aus.
HINWEIS: Bei der Zubereitung der Mischungen ist es wichtig, Flüssigkeit langsam hinzuzufügen, um Luftblasen zu vermeiden. - Kombinieren Sie Mix A und Mix B, nachdem Sie sie 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen haben. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20-30 Minuten, um den Transfektionskomplex zu bilden.
- Nehmen Sie die HEK-293T-Zellen aus dem Inkubator, ersetzen Sie das Medium durch DMEM + 2% FBS, fügen Sie die Mischung aus Schritt 1.1.4 tropfenweise hinzu und mischen Sie die Flüssigkeit vorsichtig.
- Nach 8 h wechseln Sie das Medium mit 3,5 ml normalem Medium. Nach dem Wechseln des Mediums sammeln Sie den Virusüberstand alle 24 h und 48 h.
- Mischen Sie die Virusüberstände, die zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gesammelt wurden. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 4 °C. Führen Sie den Überstand durch 0,45-μm-Filter und sammeln Sie ihn in einem sterilen 50-ml-Konusrohr.
HINWEIS: Das bei 24 h gesammelte Virus kann bei 4 °C gelagert und mit dem um 48 h gesammelten Virus gemischt werden. - Konzentrieren Sie den Virusüberstand durch Zentrifugieren bei 6000 × g bei 4 °C über Nacht (~16 h). Stellen Sie sicher, dass das Viruspellet nach dem Zentrifugieren am Boden des konischen Röhrchens sichtbar ist.
- Gießen Sie den Überstand langsam aus. Lösen Sie das Viruspellet in einem Volumen des normalen Mediums auf, das 1/100 des Volumensdes Virusüberstands beträgt. Mit einer P1000-Mikropipette vorsichtig auf und ab pipettieren, bis eine homogene Mischung erhalten wird. Teilen Sie das konzentrierte Virus nach Bedarf in Mikrozentrifugenröhrchen auf. Bei −80 °C lagern.
HINWEIS: Das Virus wird mit dieser Methode 100x konzentriert. Das konzentrierte Virus (100x) kann >1 Jahr bei −80 °C gelagert werden. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Virus.
- Platte 1,5 × 106 HEK-293T-Zellen in eine 60 mm Schale und Kultur dieser Zellen mit normalem Medium (siehe Tabelle 1) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2.
- Nachweis des konzentrierten Virustiters (Abbildung 1C)
- Platte 1 × 10 5 HEK-293T-Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Denken Sie daran, eine gut als Negativkontrolle hinzuzufügen. Kultivieren Sie diese Zellen mit normalem Medium bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2.
- 0,1 μL oder 0,2 μL fluoreszierendes konzentriertes Virus (100x) zu jeder Vertiefung nach 24 h hinzufügen und 4 ng/μL des kationischen polymeren Transfektionsreagenzes zu jeder Vertiefung hinzufügen. Etwa 8-12 h nach der Infektion das Medium durch normales Medium ersetzen.
HINWEIS: Um die Genauigkeit und Effizienz der Fluoreszenzerkennung zu gewährleisten, muss die Infektionsrate 10-30% betragen. Die Zugabe von 0,1 μL oder 0,2 μL des fluoreszierenden konzentrierten Virus kann die Infektionseffizienz in diesem Bereich aufrechterhalten. Der konzentrierte Virustiter kann mindestens 1 × 108 Transduziereinheiten (TU)/ml erreichen. - Waschen Sie das Geschirr etwa 48 Stunden nach der Infektion mit 1 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um abgestorbene Zellen zu entfernen.
- Trypsinisieren Sie diese Zellen mit 250 μL 0,05% Trypsin-EDTA pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte für 1 min bei Raumtemperatur. Bei 200 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand entfernen.
- Resuspendiert das Zellpellet in 1 ml PBS, fügt die Suspension zu einem 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen hinzu und erkennt die Infektionseffizienz der Virusfluoreszenz (grün fluoreszierendes Protein, GFP +) mittels Durchflusszytometrie.
- Berechnen Sie den konzentrierten Virustiter nach folgender Formel: 105 (Zellvolumen) × Infektionsrate (GFP+%)/hinzugefügtes Virusvolumen (0,1 μL oder 0,2 μL).
2. Direkte Reprogrammierung von Fibroblasten auf Melanozyten (Abbildung 2A)
- Beschichten Sie eine Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte mit 1 ml 0,1% iger Gelatinelösung bei Raumtemperatur für 15-30 min. Stellen Sie sicher, dass der Brunnen vollständig mit der 0,1% igen Gelatinelösung bedeckt ist. Saugen Sie die 0,1% ige Gelatinelösung nach dem Überziehen ab.
HINWEIS: Bereiten Sie 0,1% ige Gelatinelösung (100 ml) wie folgt vor: 0,1 g Gelatinepulver werden in 100 ml Reinstwasser in einer Autoklavglasflasche gelöst und dann bei 4 °C für nicht mehr als 2 Monate gelagert. - Platte 5 × 104 MEFs in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, die mit0,1% Gelatine beschichtet ist (wie in Schritt 2.1), und diese Zellen mit normalem Medium bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 über Nacht kultivieren.
- Bestätigen Sie nach 24 h, dass die MEFs einen Zusammenfluss von 40-50% erreicht haben. Ersetzen Sie das Medium durch ein normales Medium.
- Nehmen Sie am Tag 0 das konzentrierte Virus aus dem Gefrierschrank und schmelzen Sie das Virus auf Eis. Berechnen Sie das Volumen des hinzuzufügenden Virus anhand von Gl. (1). Fügen Sie das konzentrierte Virus für die sechs Transkriptionsfaktoren Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 und Snai2 (siehe Materialtabelle) entsprechend dem berechneten Volumen zu jeder Vertiefung hinzu und fügen Sie dann 4 μg / ml des kationischen polymeren Transfektionsmittels hinzu.
Zellzahl (5 × 104) × 30 (Multiplizität der Infektion, MOI)/Virustiter (1) - Entfernen Sie am Tag 1, 8-12 h nach der Infektion, das Medium, das das Virus enthält, und ersetzen Sie es durch frisches normales Medium, während Sie 0,5 μg / ml Puromycin hinzufügen, um stabile infizierte Zelllinien zu screenen.
- Ersetzen Sie am Tag 2, 48 h nach der Infektion, das überstehende Medium schrittweise durch das Umprogrammierungsmedium. Ändern Sie zunächst 1/4des gesamten mittleren Volumens und addieren Sie 3 μM CHIR99021.
- Wechseln Sie von Tag 3 bis Tag 7 je nach Zustand der Zellen das Medium, indem Sie das Reprogrammiermedium schrittweise durch einen höheren Anteil des Reprogrammiermediums (siehe Tabelle 1) ersetzen, und wechseln Sie innerhalb von 5 Tagen zum vollständigen Reprogrammiermedium.
HINWEIS: Während dieser Zeit müssen Puromycin und CHIR99021 täglich angewendet werden. Viele tote Zellen erscheinen am ersten und zweiten Tag des Wechsels des Reprogrammiermediums. Dies ist normal, da sich die Zellen allmählich an die Transformation anpassen. Daher muss das Medium schrittweise gewechselt werden, um die gesunde Proliferation der Zellen zu gewährleisten. - Um die Zellen zu passieren, fügen Sie 500 μL 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen für 3 Minuten bei Raumtemperatur zu verdauen. Wenn ~ 60% der Zellen aufgewachsen sind, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie normales Medium hinzufügen, das 2x das Volumen des Verdauungsenzyms beträgt. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ml sterilen konischen Röhrchen, zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Zellpellet mit dem Reprogrammiermedium und plattieren Sie die Zellen in einer 60 mm sterilen Schale mit einer Dichte von 3 × 104/cm2. Kultivieren Sie diese Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igenCO2-Inkubator.
HINWEIS: Von Tag 8 bis Tag 21 werden diese Zellen alle 3-5 Tage subkultiviert und in 60 mm sterilen Schalen kultiviert, um sich auszudehnen. Sie können kultiviert werden, um mindestens Passage 5 zu erreichen.
3. Optimierung zur direkten Reprogrammierung und Identifikation
- Screening auf die optimierten Transkriptionsfaktoren
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.7, und reduzieren Sie jedes Mal einen der sechs Transkriptionsfaktoren. Infizieren Sie die MEFs mit dem Virus mit Kombinationen von fünf Transkriptionsfaktoren.
- Sieben Tage nach der Infektion extrahieren Sie die RNA dieser Zellen16 und analysieren Sie die Expressionsniveaus ihrer melanozytären Gene mit Reverse-Transkription PCR (RT-PCR)17 , um nach den Transkriptionsfaktoren mit dem größten Einfluss auf die Umwandlung in Melanozyten zu suchen, indem Sie sie nacheinander entfernen (Abbildung 3A).
- Verwenden Sie die drei wichtigsten Transkriptionsfaktoren, die die Umwandlung in Melanozyten beeinflussen, um die MEFs zu infizieren. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.7.
HINWEIS: Sieben Tage nach der Infektion sollten die melanozytären Gene in diesen transformierten Zellen nachweisbar sein (Abbildung 3B). Primer-Informationen für die iMels-Charakterisierung sind in Tabelle 3 enthalten.
- Identifizierung induzierter Melanozyten (iMels)
- Verwenden Sie die Immunfluoreszenzfärbung18 , um zu überprüfen, ob die iMels melanozytäre Proteine, einschließlich TYRP-1 und DCT, exprimieren (Abbildung 4A).
- Melanin-spezifische 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA)-Färbung (Abbildung 4B)
- 4% Paraformaldehyd (10 ml) wie folgt herstellen: 0,4 g Paraformaldehydpulver in 10 mL PBS auflösen. Stellen Sie die Lösung 2 h lang in einen Ofen bei 56 °C, um die Auflösung zu fördern.
HINWEIS: Die Lösung kann nicht länger als einen Monat bei 4 °C gehalten werden. - Die iMels in einer 30 mm Schüssel anfassen und zweimal mit vorgewärmtem PBS abwaschen. Fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen für 20 min zu fixieren, und waschen Sie die Schüssel 3 Mal mit PBS.
- Bereiten Sie 0,1% DOPA-Färbungslösung (10 ml) kurz vor Gebrauch vor, indem Sie 0,01 g L-DOPA-Pulver in 10 ml PBS auflösen. Legen Sie die Lösung für 30 min in ein Wasserbad bei 37 ° C; Schütteln Sie es mehrmals, um die Auflösung zu fördern.
- Fügen Sie 1 ml frisch zubereitete 0,1% DOPA-Färbelösung hinzu. In einem Ofen bei 37 °C für 2-5 h inkubieren. Wenn keine braun-schwarzen Partikel vorhanden sind, inkubieren Sie bei 37 °C für weitere 2 h, jedoch nicht für >5 h. Überprüfen Sie die Proben alle 30 Minuten.
- Waschen Sie das Geschirr 3 Mal mit PBS für jeweils 1 Minute. Färben Sie den Kern mit 1 ml Hämatoxylin-Färbelösung für 2 min.
- Für die Langzeitlagerung dehydrieren Sie die Proben mit 95% Ethanol für 3 min und dann 100% Ethanol für 5 min. Verschließen Sie die Schale mit Xylol und neutralem Balsam.
- 4% Paraformaldehyd (10 ml) wie folgt herstellen: 0,4 g Paraformaldehydpulver in 10 mL PBS auflösen. Stellen Sie die Lösung 2 h lang in einen Ofen bei 56 °C, um die Auflösung zu fördern.
- Melanin-spezifische Masson-Fontana-Färbung (Abbildung 4B)
- Platte iMels in einer 30 mm Schale und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 20 min; Waschen Sie das Geschirr 3 Mal mit PBS.
- Fügen Sie 1 ml Lösung A (Ammoniaksilberlösung) aus dem Masson-Fontana-Färbeset hinzu (siehe Materialtabelle), legen Sie die Schale in eine dunkle Schachtel und stellen Sie die dunkle Box für 15-40 min in einen Ofen bei 56 ° C.
HINWEIS: Wenn braun-schwarze Partikel nach 15 min im Ofen nicht sichtbar sind, geben Sie die Proben in den 56 ° C-Ofen zurück, um die Inkubation fortzusetzen, jedoch nicht für >40 Minuten. Etwas Wasser kann in die dunkle Box gegeben werden, um ein Austrocknen zu verhindern. - Aspirationslösung A und das Gericht 5-6 mal mit destilliertem Wasser waschen, jeweils 1-2 min.
- Fügen Sie 1 ml Lösung B (Hypolösung) aus dem Masson-Fontana-Färbeset hinzu und lassen Sie die Schale bei Raumtemperatur für 3-5 Minuten stehen.
- Sauglösung B an und spülen Sie das Geschirr 3 Mal, jeweils 1 min mit Leitungswasser ab.
- Fügen Sie 1 ml Lösung C (neutraler roter Farbstoff) aus dem Masson-Fontana-Färbeset hinzu und lassen Sie die Schale bei Raumtemperatur für 3-5 Minuten stehen.
- Aspirationslösung C und waschen Sie das Gericht 3 Mal mit destilliertem Wasser, jeweils 1 min.
- Fügen Sie 1 ml 100% Ethanol für eine schnelle Dehydratisierung hinzu und saugen Sie das Ethanol nach 3 Minuten ab.
HINWEIS: Gebeizte Proben können nach dem Verschließen mit Xylol und neutralem Balsam lange gelagert werden.
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Representative Results
Dieser Artikel enthält die Protokolle eines konzentrierten Lentivirus-Verpackungssystems zur Herstellung von Lentiviren von Transkriptionsfaktoren für die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten zu Melanozyten und Protokolle für das Screening auf Transkriptionsfaktoren und die direkte Reprogrammierung von Melanozyten aus MEFs.
Der Erfolg der konzentrierten Lentivirusproduktion wurde durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität von GFP (Abbildung 1A) oder durch Durchflusszytometrie (Abbildung 1B) nach der Infektion von HEK-293T-Zellen für 48 h mit unkonzentriertem Lentivirus (1x) und konzentriertem Lentivirus (100x) bewertet. Der Titer des konzentrierten Virus betrug 108 TU/ml oder mehr, was relativ hoch ist (Abbildung 1C).
Die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten zu Melanozyten erfolgt durch die Infektion mit dem Transkriptionsfaktor Lentivirus und die Transformation mit dem optimierten Reprogrammierungsmedium. Das Schema für die Generierung von iMels aus MEFs ist in Abbildung 2A dargestellt. Die Zellmorphologie ändert sich allmählich während der direkten Reprogrammierung. Zellsynapsen verlängern sich und Zellkerne vergrößern sich. Diese Zellen altern jedoch allmählich nach ~ Tag 20 (~ 5 Passagen) (Abbildung 2B).
Ein Transkriptionsfaktor wurde jeweils aus dem ursprünglichen Satz von sechs Transkriptionsfaktoren (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 und Snai2) entfernt, um den Transkriptionsfaktor mit dem größten Einfluss auf die Neuprogrammierung zu bestimmen. Die Entfernung von Mitf, Pax3 oder Sox10 führte zum Schweigen der Expression der melanozytären Gene Tyr, Tyrp1 und Mlana (Abbildung 3A), was darauf hindeutet, dass diese drei Transkriptionsfaktoren den größten Einfluss auf die Umwandlung von Fibroblasten in Melanozyten hatten. Die Expression von melanozytären Genen, die durch direkte Reprogrammierung mit drei Transkriptionsfaktoren induziert wurden, war höher als die aller sechs Transkriptionsfaktoren (Abbildung 3B).
Schließlich wurden die Eigenschaften der iMels identifiziert, die durch die Verwendung dieses optimierten Systems der direkten Reprogrammierung erhalten wurden. Die Expression melanozytischer Marker (TYR, TYYP1) wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen (Abbildung 4A). Melanin-spezifische Färbemethoden, einschließlich DOPA- und Masson-Fontana-Färbungen, zeigten ebenfalls positive Ergebnisse (Abbildung 4B).
Abbildung 1: Produktion des konzentrierten Virus und Abschätzung des Titers . (A) Fluoreszenzintensität von GFP nach Infektion von HEK-293T-Zellen mit unkonzentriertem Lentivirus (1x) und konzentriertem Lentivirus (100x) (B) Vergleich der Infektionsraten von unkonzentriertem Lentivirus (1x) und konzentriertem Lentivirus (100x), wie sie durch Durchflusszytometrie nachgewiesen wurden. (C) Titerschätzung des konzentrierten Lentivirus. Maßstabsstäbe = 250 μm. Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; TU = transducing units. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Generierung von iMels aus MEFs. (A) Schematische Darstellung der iMels-Generierung. (B) Veränderungen in der Zellmorphologie während der Umwandlung von MEFs in iMels bei direkter Reprogrammierung am Tag 0, Tag 3, Tag 10 und Tag 20+. Maßstabsstäbe = 100 μm. Abkürzungen: iMels = induzierte Melanozyten; MEFs = embryonale Fibroblasten der Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Screening auf optimierte Transkriptionsfaktoren. (A) qRT-PCR der Tyr- , Tyrp1- und Mlana-mRNA-Spiegel in Zellen, die mit fünf Transkriptionsfaktoren transduziert wurden (einer der ursprünglichen sechs Transkriptionsfaktoren wurde entfernt). MEF + EV und MEF + 6F werden als Negativkontrolle bzw. Positivkontrolle verwendet. Die mRNA-Expression wird auf die Gapdh-Expression normiert. (B) qRT-PCR von Tyr, Tyrp1 und Mlana mRNA-Spiegeln in Zellen, die mit den ursprünglichen sechs Transkriptionsfaktoren und mit drei Transkriptionsfaktoren transduziert wurden. MEF, MEF + EV und MMC werden als Leer-, Negativ- bzw. Positivkontrolle verwendet. Die mRNA-Spiegel werden auf Gapdh-Spiegel normalisiert. Alle Werte sind Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten. Die Primersequenzen sind in Tabelle 3 dargestellt. Abkürzungen: qRT-PCR = quantitative reverse-transcription PCR; MEF = embryonale Fibroblasten der Maus; MEF+EV = embryonale Fibroblasten der Maus + leerer Vektor; MMC = Mausmelanozyten; 6F = sechs Transkriptionsfaktoren, die Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 und Snai2 umfassen; 3F: drei Transkriptionsfaktoren, die Mitf, Pax3 und Sox10 umfassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Funktionelle Identifizierung von iMels. (A) Immunfärbung melanozytischer Marker (TYR, TYYP1) in iMels. Maßstabsleiste = 50 μm. Siehe die Materialtabelle für die Verdünnung der in dieser Studie verwendeten Antikörper. (B) Masson-Fontana-Färbung und DOPA-Färbung. MEF und die Melan-a-Zelllinie werden als Negativkontrolle bzw. Positivkontrolle verwendet. Maßstabsleiste = 50 μm. Abkürzungen: iMels = induzierte Melanozyten; DOPA = 3,4-Dihydroxyphenylalanin; MEF = Maus embryonaler Fibroblast. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Komponenten | Dosis (Konzentration, Volumen) | Endkonzentration | |
| Normales Medium (100 ml) | DMEM/HOHE GLUKOSE | 89 ml | |
| Wärmeinaktiviertes FBS | 10 ml | ||
| Antibiotika (Pen / Streptokokken) | 10000 U/ml, 1 ml | 100 U/ml | |
| Umprogrammiermedium (100 ml) | RPMI-1640 | 88 ml | |
| Wärmeinaktiviertes FBS | 10 ml | ||
| Rekombinanter menschlicher SCF | 200 μg/ml, 50 μL | 100 ng/ml | |
| Rekombinanter Mensch bFGF | 4 μg/ml, 250 μL | 10 ng/ml | |
| Rekombinantes Humaninsulin | 10 mg/ml, 50 μL | 5 μg/ml | |
| EDN3 Mensch | 100 μM, 100 μL | 0,1 μM | |
| Cholera-Toxin | 0,3 mg/ml, 0,56 μL | 20 pM | |
| Phorbol 12-Myristat 13-acetat (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| Hydrocortison | 100 μg/ml, 500 μL | 0,5 μg/ml | |
| Adenin | 40 mg/ml, 60 μL | 24 μg/ml |
Tabelle 1: Komponenten normaler und neu programmierender Medien.
| Kulturgericht | Aussaatdichte (Zellen/Schale) | Mittel (ml) | Plasmid-System | Transfektionsreagenz (μL) | ||
| Zielplasmid (μg) | PMD2. G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 Millimeter | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 Millimeter | 1,5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 Millimeter | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Tabelle 2: Einzelheiten des Lentivirus-Verpackungssystems.
| RT-PCR Primer | |
| Ziel | Primer-Sets |
| Gapdh | Weiterleitung: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| Rückseite: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| Tyr | Vorwärts: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| Rückseite: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 | Vorwärts: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Rückseite: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| Mlana | Weiter: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| Rückseite: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
Tabelle 3: Informationen zur Grundierung
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Discussion
Die Qualität des Virus ist entscheidend für den Erfolg der direkten Reprogrammierung auf Melanozyten in diesem Protokoll. Die Methode zum Verpacken und Konzentrieren von Viren in diesem Protokoll ist einfach und leicht zu wiederholen und stützt sich nicht auf ein anderes konzentriertes Hilfsreagenz. Dieses Protokoll kann in den meisten Labors erfolgreich befolgt werden. Um die Qualität des konzentrierten Virus zu gewährleisten, bedürfen die folgenden Punkte besonderer Aufmerksamkeit. Einer ist der Zellstatus von HEK-293T. Obwohl HEK-293T-Zellen unsterbliche Zellen sind, müssen die Zellen, die zur Herstellung des konzentrierten Virus verwendet werden, gesunde Zellen innerhalb von 10 Passagen sein (der Titer nimmt mit höheren Passagen ab).
Ein weiterer kritischer Punkt ist der Anteil des verwendeten Transfektionsreagenzes (in diesem Fall Lipofectamin). Da Zellen nach Zugabe des Transfektionsreagenzes beschädigt werden, muss das Verhältnis des Reagenzes zu Plasmiden wiederholt überprüft werden, um den optimalen Zustand der Zellen und die Qualität des Virus zu gewährleisten. Das Verhältnis von 2:1 von Transfektionsreagenzien zu Plasmiden eignet sich am besten für HEK-293T-Zellen zum Verpacken des Virus in diesem System. Darüber hinaus erfordern alle Schritte eine schonende Handhabung während des gesamten Prozesses. Da Viruspartikel nach der Beschichtung, die den Virustiter beeinflusst, absorbiert werden können, ist es nicht ratsam, die Schale beim Verpacken des Virus mit einer Matrix zu beschichten. Aufgrund der Möglichkeit der Ablösung von HEK-293T muss der Überstand vorsichtig ausgetauscht werden, insbesondere wenn nach dem Sammeln des Virusüberstands nach 24 h frisches Medium hinzugefügt wird. Einige andere Überlegungen umfassen die Zelldichte, die Länge der Transfektionszeit und den Serumgehalt im Medium. Dies sind wichtige Fragen, die sich auf die Transfektionseffizienz auswirken. Die in diesem Protokoll vorgestellten Bedingungen sind am besten geeignet, basierend auf Ergebnissen, die nach vielen wiederholten Experimenten erzielt wurden.
Bei der direkten Reprogrammierung auf Melanozyten ist es wichtig, den Zustand der ursprünglichen Zell-MEFs und die Dichte der MEFs, die für die direkte Reprogrammierung verwendet werden, zu berücksichtigen. Bevor mit der direkten Neuprogrammierung begonnen wird, müssen MEFs in unbeschichteten Zellkulturschalen kultiviert werden. Zellen in der Proliferationsphase (40-50% Konfluenz) sollten für die direkte Reprogrammierung ausgewählt werden; Die Infektionseffizienz nimmt mit zunehmender Zelldichte ab. Die umprogrammierten Zellen müssen in gelatinebeschichteten Kulturschalen plattiert werden.
Die Zeitspanne, die das Virus benötigt, um Zellen zu infizieren, ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Eine zu lange Infektionszeit beeinträchtigt das Überleben der Zellen, während eine zu kurze Infektionszeit die Effizienz verringert. Es wurde festgestellt, dass acht Stunden für das konzentrierte Virus geeignet sind, MEFs in diesem Protokoll zu infizieren. Der letzte kritische Punkt ist die richtige Art und Weise, das Umprogrammiermedium zu ändern. Die MEF müssen sich an ein neues Medium anpassen. Der Zustand der Zellen muss jeden Tag überprüft werden, und das Medium muss sorgfältig entsprechend dem Zellstatus gewechselt werden. Ein zu schneller Wechsel des Reprogrammiermediums führt dazu, dass eine große Anzahl von Zellen abstirbt.
Bei der Kultivierung und Subkulturation von iMels ist die Durchgangsdichte der Zellen entscheidend. iMels benötigen eine relativ hohe Dichte, um das Wachstum aufrechtzuerhalten. Zellsynapsen sollten für die normale Proliferation dieser Zellen miteinander in Kontakt stehen. Wenn die Dichte zu niedrig ist, können sich die Zellen nicht mehr vermehren. Hier erwies sich die Dichte von 3 × 104/cm2 als geeignete Durchgangsdichte für iMels. Nach 5 Passagen beginnen die iMels zu altern (Abbildung 2B); Das Melanin ist zu diesem Zeitpunkt reifer, und die resultierenden Zellen können für Immunfluoreszenz, DOPA oder Masson-Fontana-Färbung verwendet werden. Frühere Passagen von Zellen können für die RT-PCR verwendet werden, da sich die Expression von Genen in einem relativ frühen Stadium ändert.
Obwohl die direkte Reprogrammierung weithin untersucht wird, gibt es wenig Forschung über die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten zu Melanozyten. Verschiedene Studien haben unterschiedliche Transkriptionsfaktoren14,15 verwendet, was zu viel Verwirrung geführt hat. Dieses Protokoll erklärt, wie man qualitativ hochwertige konzentrierte Viren erzeugt und mehrere Transkriptionsfaktoren untersucht, um die wichtigsten für die direkte Reprogrammierung auf Melanozyten auszuwählen. Das Medium wurde in diesem Protokoll mit Ernährungsfaktoren für die direkte Reprogrammierung auf Melanozyten ergänzt (Tabelle 2). Schließlich wurden funktionelle iMels erfolgreich identifiziert. Das klare und optimierte Melanozyten-Direktprogrammierungssystem könnte neue Behandlungsstrategien für Depigmentierungskrankheiten wie Vitiligo liefern.
Es gibt jedoch noch einige Einschränkungen für die in diesem Artikel vorgestellte Technologie. Erstens ist es schwierig, die Effizienz dieses Protokolls abzuschätzen. Die CRISPR-Cas9-Genbearbeitung könnte mit diesem Protokoll kombiniert werden, um melanozytäre Gene wie Tyr oder Tyrp-1 in die Anfangszellen einzuklopfen, um den Prozentsatz der induzierten Zellen während des Reprogrammierungsprozesses zu beobachten. Darüber hinaus kann das in diesem Protokoll verwendete Lentivirus-Einführungssystem das Risiko einer Genrekombination und Insertionsmutationbergen 19. In Zukunft könnten effizientere und sicherere Einführungsmethoden eingesetzt werden, wie z.B. nicht-virale rekombinante Proteinexpressionsvektoren oder mRNA-Vektoren. Das Experiment in diesem Protokoll befindet sich noch im In-vitro-Stadium. Der nächste Schritt besteht darin, die Melanozyten direkt in vivo neu zu programmieren, wodurch nicht pigmentierte Haut pigmentiert wird, und das direkte Reprogrammierungssystem zu verwenden, um eine wirksame Behandlung von Vitiligo zu entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82070638 und 81770621) und der Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
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