Summary
Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.
Abstract
Mitocondrial Ca2+ desempenha um papel crítico no controle do tampão citosolico Ca2+, metabolismo energético e transdução de sinal celular. A sobrecarga do Ca2+ mitocondrial contribui para várias condições patológicas, incluindo neurodegeneração e morte celular apoptótica em doenças neurológicas. Aqui apresentamos um tipo celular específico e mitocôndrias visando abordagem molecular para imagem mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo. Construímos plasmídeos de DNA codificando mitocôndrias com alvo genético de indicadores Ca2+ codificados geneticamente (GECIs) GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) com promotores específicos de astrócitos e neurônios gfaABC1D e CaMKII e sequência de alvo de mitocôndrias (mito-). Para imagens mitocondriais in vitro Ca2+, os plasmídeos foram transfectados em astrócitos e neurônios cultivados para expressar GCaMP5G/6s. Para imagens in vivo mitocondrial Ca2+, vetores virais associados a Adeno (AAVs) foram preparados e injetados nos cérebros do camundongo para expressar GCaMP5G/6s em mitocôndrias em astrócitos e neurônios. Nossa abordagem fornece um meio útil para a imagem mitocondrial Ca2+ dinâmica em astrócitos e neurônios para estudar a relação entre a sinalização citosolic e mitocondrial Ca2+, bem como interações astrócito-neurônio.
Introduction
Mitocôndrias são organelas subcelulares dinâmicas e são consideradas como potências celulares para produção de energia. Por outro lado, as mitocôndrias podem levar o Ca2+ à matriz em resposta aos aumentos locais ou citosóicos ca2+. A absorção mitocondrial Ca2+ afeta a função mitocondrial, incluindo processos metabólicos como reações no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e fosforilação oxidativa, e regula as proteínas sensíveis ca2+em condições fisiológicas1,2,3,4. A sobrecarga mitocondrial Ca2+ também é determinante para a morte celular, incluindo necrose e apoptose em vários distúrbios cerebrais5,6,7. Causa a abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTPs) e a liberação do cofator caspase, que iniciam a morte celular apoptótica. Por isso, é importante estudar melhor a dinâmica mitocondrial ca2+ e o manuseio em células vivas para entender melhor a fisiologia celular e a patologia.
Mitocôndrias mantêm a matriz Ca2+ homeostase através de um equilíbrio entre a absorção de Ca2+ e o efflux. A captação mitocondrial Ca2+ é mediada principalmente por semportadores mitocondriais Ca2+ (MCUs), enquanto o efflux Mitocondrial Ca2+ é mediado pelos trocadores Na+-Ca2+-Li+ (NCLXs) e pelos trocadores H+/Ca2+ (mHCXs)8. O equilíbrio pode ser perturbado através da estimulação de receptores acoplados de proteína G (GPCRs)9. Mitocondrial Ca2+ homeostasis também é afetada pelo tampão mitocondrial pela formação de complexos insolúveis xCa2+-xPO4x-xOH8.
Alterações intracelulares e mitocondriais na concentração de Ca2+ ([Ca2+]) podem ser avaliadas por indicadores fluorescentes ou luminescentes Ca2+. A vinculação ca2+ aos indicadores causa modificações espectrais, permitindo o registro de celular gratuito [Ca2+] em tempo real em células ao vivo. Atualmente, dois tipos de sondas estão disponíveis para monitorar as alterações do Ca2+nas células: indicadores químicos orgânicos e indicadores ca2+ (GECIs) codificados geneticamente. Geralmente, diferentes variantes com diferentes afinidades ca2+ (baseadas em Kd),propriedades espectrais (comprimentos de onda de excitação e emissão), faixas dinâmicas e sensibilidades estão disponíveis para as questões biológicas sob investigação. Embora muitos indicadores orgânicos sintéticos Ca2+ tenham sido utilizados para imagens citosócidas Ca2+, apenas alguns podem ser carregados seletivamente na matriz mitocondrial para imagem mitocondrial Ca2+, sendo Rhod-2 o mais utilizado (para revisões ver10,11). No entanto, o Rhod-2 tem uma grande desvantagem de vazamento durante experimentos de longo curso; além disso, é particionada entre mitocôndrias, outras organelas e o citosol, dificultando as medições absolutas em diferentes subcomentamentos. Em contraste, usando promotores específicos do tipo celular e sequências de segmentação de compartimentos subcelulares, os GECIs podem ser expressos em diferentes tipos de células e compartimentos subcelulares para imagens Ca2+ específicas para células e compartimentos in vitro ou in vivo. Os indicadores GCaMP Ca2+ baseados em intensidade de comprimento único surgiram recentemente como principais GECIs12,13,14,15,16. Neste artigo, fornecemos um protocolo para a segmentação de mitocôndrias e expressão específica do tipo celular de GCaMP5G e GCaMP6s (GCaMP5G/6s) em astrócitos e neurônios, e a absorção mitocondrial ca2+ de imagem nesses tipos de células. Usando este protocolo, a expressão de GCaMP6G/6s em mitocôndrias individuais pode ser revelada, e a absorção do Ca2+ em resolução mitocondrial única pode ser alcançada em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo.
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Protocol
Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Missouri-Columbia.
1. Construção de plasmídeos de DNA
NOTA: Para imagens in vitro e in vivo, plasmídeos de DNA codificam GCaMP5G/6s com promotores específicos de astrócitos e neurônios e sequências de alvo mitocondrial.
- Inserir matriz mitocondrial (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 no clon sites de regência EcoRI e BamHI na espinha dorsal do vírus associado ao adeno (AAV) plasmídeo pZac2.1 para obter plasmídeos contendo gfaABC1D promotor astrocítico ou promotor neuronal caMKII18,19,20.
- Subclone GCaMP5G/6s nos locais de clonagem BamH I e Não 1 nos plasmídeos acima para obter novos plasmids pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5 G/6s e pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s que visam a expressão transgênica em mitocôndrias em astrócitos e neurônios20,21 (Figura 1A).
- Prepare os plasmídeos de DNA pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s para transfecção para estudo in vitro (Seção 2). Produzir vetores AAV com sorotipo 5 para astrócitos e sorotipo 9 para neurônios para o estudo in vivo 18 (Seção 3).
2. Imagem mitocondrial in vitro Ca2+ em astrócitos e neurônios
- Prepare os astrócitos primários do córtex de camundongos neonatais P1 e neurônios primários do córtex dos embriões E15-1618,22,23,24, e cultue-os em deslizamento de vidro de 12 mm de diâmetro em placas de 24 poços usando o DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e meio basal neuronal (NBM) contendo 2% de B27, respectivamente.
- Transfeito astrócitos maduros e neurônios com pZac-gfaABC1D-GCaMP6s e pZac-CaMKII-GCaMP5G plasmídeos usando reagente de transfecção à base de lipídio para expressar GCaMP6s nas mitocôndrias de astrócitos e GCaMP5G nas mitocôndrias dos neurônios18,20,21. Transfectar células em cada poço com 0,5 μg de DNA, e alterar o meio 6 h depois.
NOTA: Os astrócitos e neurônios estão prontos para a imagem 1-2 dias após a transfecção. - Realize imagens in vitro mitocondrial Ca2+ 1-2 dias após a transfecção.
- Transfira as tampas de vidro cultivadas com astrócitos ou neurônios para a câmara de perfusão PH-1 sob uma epifluorescência ou dois microscópios de fótons.
- Estimule a absorção mitocôndrial ac2+ com 100 μM ATP em ACSF, ou estimule mitocôndrias neuronais com 100 μM de glutamato/10 μM glycina20,25 (Figura 2 e Figura 3).
NOTA: As alterações de solução do ACSF para o ACSF contendo GLinato/glinato/glico são controladas por um sistema de perfusão ALA-VM821. A velocidade da mudança da solução é controlada a 1-2 mL/min ajustando uma válvula.
3. In vivo mitocondrial Ca2+ imagem em astrócitos e neurônios
- Preparações AAV.
- Prepare os seguintes vetores de vírus adeno associados à adenina (rAAV) usando os plasmídeos de DNA preparados na seção 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vetores.
NOTA: Neste experimento, os vetores rAAV do sorotipo 5 foram preparados para expressar GCaMP5G em mitocôndrias em astrócitos e vetores rAAV do sorotipo 9 foram preparados para expressar GCaMP6s em mitocôndrias em neurônios.
- Prepare os seguintes vetores de vírus adeno associados à adenina (rAAV) usando os plasmídeos de DNA preparados na seção 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vetores.
- Injeção de AAV estereutribicic.
- Anestesiar o rato com 3% de isoflurano.
NOTA: Mais tarde, durante a cirurgia, os níveis de isoflurane são reduzidos para 2%. - Depois que o camundongo atinge um nível cirúrgico de anestesia, conforme determinado por pinça de cauda e dedo do pé, raspe o cabelo sobre o local da cirurgia, córtex motor ou somatosensorial, com um aparador de cabelo.
- Posicione o mouse no dispositivo estereotaxic do mouse e fixe a cabeça com barras de ouvido. Aplique pomada oftalmológica nos olhos para protegê-los durante a cirurgia. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C durante toda a cirurgia.
NOTA: Realizar cirurgia utilizando procedimentos assépticos. Todas as ferramentas cirúrgicas precisam ser esterilizadas por autoclaving ou por um esterilizador de contas quentes. - Depois que o mouse é montado no dispositivo estereotaxico, esterilize o couro cabeludo com esfoliação alternada à base de iodo e 70% de etanol três vezes. Faça uma incisão no meio do couro cabeludo para expor o local da injeção.
- Corte a pele no eixo bregma-lamda e crie um orifício de rebarba de ~1 mm de diâmetro com uma broca de alta velocidade no local de injeção pretendido do motor ou córtex somatosensorial.
- Use uma seringa Hamilton de 33 G contendo vírus associado ao adeno (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G vetores [1 x 1011 GC] ou rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vetores [1 x 1011 GC]) para injetar até 1 μL de vírus na área alvo.
NOTA: Por exemplo, para o parto viral cortical, injete a solução do vírus em duas profundidades em várias etapas. Primeiro, insira a agulha a uma profundidade de 1 mm da dura e deixe 5 minutos para o cérebro se recuperar. Em seguida, mova a agulha até ~700 μm de profundidade e injete 500 nL da solução do vírus a uma velocidade de injeção de 10 nL/s usando uma seringa hamilton controlada por um controlador de bomba de microsinga. Depois que a injeção for concluída, espere 5 minutos para permitir que o vírus se difunda no cérebro. Em seguida, mova a agulha até o segundo local de injeção a uma profundidade de 300 μm. Aqui, injete mais 500 nL da solução do vírus. Espere 10 minutos para permitir que o vírus se difunda no cérebro. - Feche o couro cabeludo e a pele usando um adesivo de tecido. Deixe os ratos se recuperarem na almofada de aquecimento. Mande ratos de volta para a instalação animal após a recuperação.
- Anestesiar o rato com 3% de isoflurano.
- Intstallação de janela cranial e imagem in vivo de dois fótons (2-P) de sinais mitocondriais Ca2+.
NOTA: A implantação da janela craniana é feita 3 semanas após a injeção de AAV sobre o córtex motor ou somatosensorial26,27,28,29. O carprofeno (10 mg/kg) é injetado subcutâneamente para aliviar a dor potencial antes da cirurgia. Os procedimentos cirúrgicos da janela craniana são idênticos aos procedimentos cirúrgicos de injeção de AAV e são realizados em condições assépticas.- Anestesiar o rato com 3% de isoflurano.
NOTA: Esta é a dose inicial e reduza para 2% para a cirurgia mais tarde. Durante a imagem, uma injeção intraperitoneal (IP) de 130 mg de cetamina/10 mg de xilazína/kg de peso corporal dissolvido em ACSF é usada para anestesia. - Posicione o mouse no dispositivo estereotaxic do mouse e fixe a cabeça com barras de ouvido. Aplique pomada oftálmica aos olhos. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C durante toda a cirurgia.
NOTA: Todas as ferramentas cirúrgicas precisam ser esterilizadas. - Faça uma incisão de 5-8 mm de comprimento na linha média do couro cabeludo e remova uma aba de pele usando um par de tesouras.
- Após a exposição do crânio, realize craniotomia de 2,0-3,0 mm de diâmetro usando uma broca de alta velocidade sobre a área injetada pelo vírus (ou seja, córtex motor ou córtex somatosensorial, Figura 1B). Primeiro, faça quatro pequenos furos, e depois faça um círculo conectando os buracos. Em seguida, levante e remova o osso com uma tesoura afiada e retire. A dura-máter exposta pode ser removida ou mantida intacta para impantação da janela craniana.
- Coloque uma tampa de vidro de 3-5 mm de diâmetro carregando um silicone transparente sobre a craniotomia. Use um palito para empurrar a janela craniana suavemente para a superfície do cérebro. Em seguida, sele a borda com uma pequena quantidade de adesivo de silicone.
NOTAs: Alternativamente, em vez de disco de silicone, 1,2% de baixo gel de ponta de fusão pode ser usado entre o vidro de cobertura e o tecido cerebral. - Por fim, sele as bordas do deslizamento com cimento dental. Tome cuidado para aplicar o cimento ligeiramente na borda da janela craniana para uma ligação forte. Coloque uma placa de metal personalizada no crânio com cimento dental.
NOTA: A placa metálica é usada para fixar a cabeça do mouse ao estágio do microscópio 2-P durante a sessão de imagem(Figura 1C). - Adicione 0,5 mL de solução ACSF sobre o deslizamento de cobertura na janela craniana para imersão de água durante a imagem.
- Realize o time-lapse in vivo 2-P de imagem de mito-GCaMP5G em astrócitos e mito-GCaMP6s em neurônios com comprimento de onda de 910 nm através da janela craniana(Figura 1C)18,20,27.
NOTA: Durante a imagem, os ratos estão na almofada de aquecimento para manter a temperatura fisiológica. Os ratos serão sacrificados imediatamente após a sessão de imagem ser concluída. - Rotular astrócitos in vivo com sulforhodamina 101 (SR101) quando for necessário determinar a colocalização.
- Ao final da etapa 3.3.4, aplique 100 μL de 100 μM SR101 em ACSF na superfície cortical por 1-5 min.
- Enxágüe a superfície com ACSF para lavar o SR101 desvinculado. Utilizando imagens 2-P, a co-rotulagem de mito-GCaMP5G e SR101 em astrócitos pode ser observada 45-60 min depois(Figura 4A).
- Anestesiar o rato com 3% de isoflurano.
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Representative Results
O objetivo deste estudo foi fornecer uma metodologia para a imagem mitocondrial Ca2+ sinais utilizando GECIs em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo. Os resultados das imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ são apresentados aqui.
Sinalização mitocondrialin vitro Ca2+ em astrócitos e neurônios cultivados
A absorção mitocondrial Ca2+ em astrócitos pode ser provocada pela aplicação atp, e a absorção mitocondrial Ca2+ em neurônios pode ser provocada pela aplicação de glutamato e glicato através de um sistema de perfusão. A Figura 2 e a Figura 3 mostram que gCaMP6s é expresso em astrócitos cultos e GCaMP5G em neurônios, respectivamente. A absorção mitocondrial Ca2+ em astrócitos foi provocada por 100 μM ATP com resolução mitocondrial única(Figura 2B-D). As captações mitocondriais Ca2+ nos neurônios foram provocadas por 100 μM de glutamato e 10 μM de glycina com resolução mitocondrial única(Figura 3B-D).
Imagem in vivo 2-P de expressão mitocondrial de GCaMP5G ou 6S em astrócitos e neurônios
A imagem é feita coletando lapso de tempo em imagens 2-P vivo de sinais de fluorescência mitocondrial em astrócitos e neurônios com um sistema de microscópio Ultima 2-P. Usamos comprimento de onda de excitação 880-910 nm. A Figura 4 mostra expressão de GCaMP5G em mitocôndrias em astrócitos no córtex do rato. A expressão específica do astrócito de GCaMP5G foi confirmada pela colocalização do SR101 com GCaMP5G com resolução mitocondrial única(Figura 4A),e podem ser observadas alterações espontâneas de Ca2+ nas mitocôndrias individuais (Figura 4B-E). A Figura 5A mostra expressão específica do neurônio de mito-GCaMP6s colocalized com marcador neuronal NeuN. A fluorescência das mito-GCaMP6s nos neurônios mostra morfologia mitocondrial em dendritos(Figura 5B). Podem ser observados aumentos mitocondriais espontâneos Ca2+ em dendritos(Figura 5C-F).
Análise dos sinais mitocondriais Ca2+
Quantifique os sinais fluorescentes calculando as intensidades médias de pixels do corpo celular ou mitocôndrias individuais em astrócitos e neurônios usando um software de análise de imagem. As alterações de ca2+ (t) são expressas como valores F/Fo (t) versus tempo, onde Fo é a fluorescência de linha de base subtraída de fundo e F é a mudança de fluorescência subtraída da linha de base20,21. Use os valores de pico F/Fo para comparar a amplitude dos sinais ca2+.
Figura 1: Construções de DNA para a expressão transgênica específica de astrócito e neurônio, e in vivo 2-P imaging. (A) Construções de DNA de indicador Ca2+ geneticamente codificado GCaMP5G ou GcaMP6s em pZac2.1 plasmid com gfaABC1D (up) e CaMKII (baixo) para entrega à matriz mitocondrial astrócito e neuronal, respectivamente. O direcionamento mitocôndria é alcançado usando uma sequência específica de matriz mitocondrial (MM) anexada ao N-terminus das proteínas fluorescentes. (B) Uma craniotomia sobre o córtex de um rato. (C) O crânio de um rato é anexado a uma placa de metal conectada ao poste fixado no estágio do microscópio 2-P. A entrada mostra a janela craniana com uma placa de metal presa ao crânio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem mitocondrial Ca2+ de astrócitos cultivados. (A-B) Uma imagem 2-P de um astrócito expressando mito-GCaMP6s(A) e sua resposta à estimulação de 100 μM ATP no momento indicado(B). (C) Imagens de mito-GCaMP6s nas quatro mitocôndrias individuais (em A, círculos) nos diferentes momentos após a estimulação atp. (D) Os cursos de tempo da fluorescência mito-GCaMP6s mudam, traçados como ΔF/Fo, nas quatro mitocôndrias individuais após estimulação ATP. A seta vermelha indica o tempo de partida da imagem. A escala pseudocolorida é uma representação linear da intensidade da fluorescência nesta e em outras figuras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem mitocondrial Ca2+ de neurônios cultivados. (A-B) Uma imagem 2-P de mito-GCaMP5G expressando neurônio (A) e sua resposta a 100 μM glutamato e 10 μM de gliccina no tempo indicado(B). (C) Imagens de mito-GCaMP5G nas quatro mitocôndrias individuais (em A, círculos) em diferentes momentos após a estimulação do glutamato. (D) Os cursos de tempo da fluorescência mito-GCaMP5G mudam nas quatro mitocôndrias individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: In vivo 2-P imagem de sinalização mitocondrial Ca2+ em astrócitos. (A) imagens 2-P de mito-GCaMP5G expressando astrócitos colocados com SR101. (B-C) imagem 2-P de um astrócito expressando mito-GCaMP5G para análise de aumento espontâneo de Ca2+. (C-E) Imagens de mito-GCaMP5G nas quatro mitocôndrias individuais no astrócito (em B, círculos) nos diferentes momentos (C) e os cursos de tempo de mudanças de fluorescência mito-GCaMP5G, traçadas como ΔF/Fo, nas quatro mitocôndrias individuais (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: In vivo 2-P imagem de sinalização mitocondrial Ca2+ em neurônios. (A) Colocalização de GCaMP6s (superior) com marcador neuronal NeuN (meio) no cérebro. (B) Imagens de alta resolução de dendritos expressando GCaMP6s com morfologia mitocondrial (indicada por *s). (C) GCaMP6s expressos em mitocôndrias neuronais. (D-F) Análise do aumento espontâneo mitocondrial Ca2+ nos neurônios. Imagem pseudocolor 2-P das mitocôndrias expressando mito-GCaMP6s em C em diferentes momentos(D). Imagens de mito-GCaMP6s nas quatro mitocôndrias individuais em C (círculos) nos diferentes momentos (E-F) e os cursos de tempo de mudanças de fluorescência mito-GCaMP6s, traçadas como ΔF/Fo, nas quatro mitocôndrias individuais(F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme: Mitocondrial Ca2+ aumenta com base nas mudanças de fluorescência GCaMP5G em resposta a 100 μM ATPem astrócitos cultos. Por favor clique aqui para baixar este Filme.
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Discussion
Neste artigo, fornecemos um método e protocolo para imagens mitocondrial Ca2+ sinais em astrócitos e neurônios. Implementamos estratégias específicas de segmentação de mitocôndrias e tipo celular para expressar GECI GCaMP5G/6s. Para atingir GCaMP5G/6s em mitocôndrias, incluímos uma sequência de metas de mitocôndrias nos plasmídeos. Para expressar GCaMP5G/6s em astrócitos e neurônios in vivo,inserimos um promotor específico de astrócito gfaABC1D e promotor específico de neurônios CaMKII nos plasmídeos. A expressão específica do tipo celular de GCaMP5G/6s em astrócitos e neurônios pode ser confirmada pela rotulagem SR101 em astrócitos e imunostaining de neurônios com NeuN. A partir de nossos dados, essas estratégias fornecem uma abordagem específica do tipo celular confiável para a imagem mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios in vivo.
Um problema potencial para a expressão GECI é que ele pode causar buffering Ca2+, uma vez que pode reduzir ca2+ livre por ligação Ca2+. Outro problema que pode ser prestado atenção é a quantidade de vírus injetado. Células individuais expressando GECI podem não ser identificadas se um vírus excessivo for injetado. Esses problemas podem ser efetivamente amenizados reduzindo o título da AAV. Fotobleaching também pode ser um problema. Teoricamente, todos os indicadores fluorescentes estão sujeitos a fotobleaching. GCaMP5G/6s são bastante estáveis, mas eles vão branquear sob exposição contínua à luz excitação. Uma prática geral para evitar fotobleaching é reduzir o tempo de exposição do tecido à luz laser, ao mesmo tempo em que garante a coleta de fluorescência suficiente. Isso pode ser alcançado se forem utilizados PMTs de alta sensibilidade e objetivos de transmissão de alta luz. Fotobleaching também pode ser reduzido fechando o obturador entre imagens.
Em nossos resultados de imagens in vivo 2-P, aumentos mitocondriais espontâneos podem ser observados tanto em astrócitos quanto em neurônios. Notavelmente, esses transitórios mitocondriais Ca2+ têm longas durações(Figura 4E e Figura 5E),consistentes com um relatório recente de Gobel et al.30. O mecanismo subjacente deste fenômeno não é claro, mas vale a pena ser perseguido mais adiante. Para o aumento citosolístico Ca2+, astrócitos e neurônios têm mecanismos diferentes. Estimulações receptoras de proteína G causam aumento de Ca2+ no ER em astrócitos, enquanto as ativações de voltagem fechadas canais Ca2+ ou receptores de glutamato causam aumento citosolico Ca2+ nos neurônios, que podem ser tomados por mitocôndrias. Em nosso estudo anterior20,descobrimos que quando mito-GCaMP5G foi cotransfectado com IP3 5-fosfattase (5ppase) astrócitos cultivados, o aumento mitocondrial ca2+ induzido por ATP poderia ser amplamente abolido. No entanto, os dois mutantes do 5ppase, ou seja, R343A e R343A/R350A 5ppase, que carecem de atividade enzimática, não afetaram o aumento mitocondrial ca2+ após estimulação ATP. Esses resultados indicam que os níveis citositários e mitocondriais Ca2+ são altamente acoplados, provavelmente devido à conexão física íntima entre o ER e mitocôndrias em astrócitos, com o citosol servindo como um conduíte intermediário para a entrega de Ca2+. Também descobrimos que a estimulação do glutamato causou o aumento mitocondrial ca2+ nos neurônios, sugerindo que os receptores de glutamato desempenham um papel na entrada de Ca2+ do espaço extracelular. No futuro, será interessante estudar aumentos mitocondriais mitocondriais de ca2+ orientados sensoriais em astrócitos e neurônios.
Nossa abordagem pode ser usada para imagem simultaneamente de sinais citoitários e mitocondriais Ca2+ no mesmo tipo de célula quando dois GECIs de diferentes comprimentos de onda de fluorescência são expressos, por exemplo, um florescince vermelho GECI RCaMP em citoplasma e GCaMP em mitocôndrias, ou vice-versa31. Essa abordagem também pode ser utilizada para o estudo in vivo de interações astrocito-neurônios em fisiologia e patologia com GCaMP expresso em astrócitos e RCaMP em neurônios, ou vice-versa.
GCaMP é um GECI de comprimento de onda único baseado em GFP. Atualmente, os GCaMPs são os indicadores Ca2+ mais preferidos devido à sua alta relação sinal-ruído (SNR) e grandes faixas dinâmicas (DR). Recentemente, os sensores jGCaMP7, a versão otimizada do GCaMP6, foram relatados com maior sensibilidade aos picos individuais16. Os sensores GCaMP7 podem ser facilmente subclodidos em nossos plasmídeos para imagens mitocondriais Ca2+. Em resumo, as estratégias aqui apresentadas podem ser utilizadas para a imagem mitocondrial Ca2+ de captação e manuseio em neurônios e astrócitos com sensibilidade suficiente para resolver as alterações ca2+ em nível mitocondrial único in vivo. Este protocolo representa um meio útil para estudar a sinalização citosolística e mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios, bem como interações astrócito-neurônio.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde de Distúrbios Neurológicos e AVC (NINDS) concede R01NS069726 e R01NS094539 à SD. Agradecemos a Erica DeMers pela gravação de áudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
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