Summary
Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca2+ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.
Abstract
El Ca2+ mitocondrial desempeña un papel fundamental en el control de la amortiguación citosólica del Ca2+, el metabolismo energético y la transducción de señales celulares. La sobrecarga de Ca2+ mitocondrial contribuye a diversas afecciones patológicas, incluida la neurodegeneración y la muerte celular apoptótica en enfermedades neurológicas. Aquí presentamos un enfoque molecular específico de tipo celular y dirigido a mitocondrias para imágenes mitocondriales de Ca2+ en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Construimos plásmidos de ADN que codifican indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI) GCaMP5G o GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dirigidos a mitocondrias con promotores específicos de astrocitos y neuronas gfaABC1D y CaMKII y secuencia dirigida a mitocondrias (mito-). Para las imágenes mitocondriales in vitro de Ca2+, los plásmidos se transfectaron en astrocitos y neuronas cultivados para expresar GCaMP5G/6s. Para las imágenes mitocondriales in vivo de Ca2+, se prepararon vectores virales adenoasociados (AVA) e inyectaron en los cerebros de los ratones para expresar GCaMP5G/6s en mitocondrias en astrocitos y neuronas. Nuestro enfoque proporciona un medio útil para obtener imágenes de la dinámica mitocondrial de Ca2 + en astrocitos y neuronas para estudiar la relación entre la señalización citosólica y mitocondrial de Ca2 +, así como las interacciones astrocito-neurona.
Introduction
Las mitocondrias son orgánulos subcelulares dinámicos y se consideran como las centrales eléctricas celulares para la producción de energía. Por otro lado, las mitocondrias pueden absorber Ca2+ a la matriz en respuesta a las elevaciones locales o citosólicas de Ca2+. La absorción mitocondrial de Ca2+ afecta la función mitocondrial, incluidos los procesos metabólicos como las reacciones en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa, y regula las proteínas sensibles al Ca2+en condiciones fisiológicas1,2,3,4. La sobrecarga mitocondrial de Ca2+ también es un determinante para la muerte celular, incluyendo necrosis y apoptosis en diversos trastornos cerebrales5,6,7. Provoca la apertura de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTPs) y la liberación del cofactor caspasa, que inician la muerte celular apoptótica. Por lo tanto, es importante estudiar la dinámica y el manejo del Ca2+ mitocondrial en las células vivas para comprender mejor la fisiología y la patología celular.
Las mitocondrias mantienen la homeostasis de Ca2+ de la matriz a través de un equilibrio entre la absorción de Ca2+ y el eflujo. La absorción mitocondrial de Ca2+ está mediada principalmente por uniportadores mitocondriales de Ca2+ (MCU), mientras que el eflujo mitocondrial de Ca2+ está mediado por los intercambiadores Na+-Ca2+-Li+ (NCLX) y los intercambiadores H+/ Ca2 + (mHCX)8. El equilibrio puede ser perturbado a través de la estimulación de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR)9. La homeostasis mitocondrial de Ca2+ también se ve afectada por la amortiguación mitocondrial por la formación de complejos insolubles xCa2+-xPO4x-xOH8.
Los cambios intracelulares y mitocondriales en la concentración de Ca2+ ([Ca2+]) pueden evaluarse mediante indicadores fluorescentes o luminiscentes de Ca2+. La unión de Ca2+ a los indicadores provoca modificaciones espectrales, lo que permite el registro de células libres [Ca2+]en tiempo real en células vivas. Actualmente hay dos tipos de sondas disponibles para monitorear los cambios de Ca2+ en las células: indicadores químicos orgánicos e indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI). En general, diferentes variantes con diferentes afinidades de Ca2+ (basadas en Kd),propiedades espectrales (longitudes de onda de excitación y emisión), rangos dinámicos y sensibilidades están disponibles para las preguntas biológicas bajo investigación. Aunque se han utilizado muchos indicadores sintéticos orgánicos de Ca2+ para imágenes de Ca2+ citosólico, solo unos pocos pueden cargarse selectivamente en la matriz mitocondrial para imágenes mitocondriales de Ca2+, siendo Rhod-2 el más utilizado (para revisiones ver10,11). Sin embargo, Rhod-2 tiene un gran inconveniente de fuga durante los experimentos de largo plazo; además, se divide entre mitocondrias, otros orgánulos y el citosol, dificultando las mediciones absolutas en diferentes subcompartimentos. Por el contrario, mediante el uso de promotores específicos de tipo celular y secuencias de orientación de compartimentos subcelulares, los GECI se pueden expresar en diferentes tipos de células y compartimentos subcelulares para imágenes de Ca2+ específicas de células y compartimentos in vitro o in vivo. Los indicadores GCaMP Ca2+ basados en la intensidad de fluorescencia de longitud de onda única han surgido recientemente como los principales GECI12,13,14,15,16. En este artículo, proporcionamos un protocolo para la orientación de las mitocondrias y la expresión específica del tipo celular de GCaMP5G y GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) en astrocitos y neuronas, y la obtención de imágenes de la absorción mitocondrial de Ca2 + en estos tipos de células. Usando este protocolo, se puede revelar la expresión de GCaMP6G/6s en mitocondrias individuales, y se puede lograr la absorción de Ca2+ en resolución mitocondrial única en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo.
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Protocol
Los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Missouri-Columbia.
1. Construcción de plásmidos de ADN
NOTA: Para imágenes in vitro e in vivo, se construyen plásmidos de ADN que codifican GCaMP5G/6s con promotores específicos de astrocitos y neuronas y secuencias de orientación mitocondrial.
- Insertar la secuencia dirigida a la matriz mitocondrial (MM) (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 en los sitios de clonación EcoRI y BamHI en la columna vertebral del plásmido del virus adenoasociado (AAV) pZac2.1 para obtener plásmidos que contengan promotor astrocítico gfaABC1D o promotor neuronal CaMKII18,19,20.
- Subclón GCaMP5G/6s en los sitios de clonación BamH I y Not 1 en los plásmidos anteriores para obtener nuevos plásmidos pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s y pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s que se dirigen a la expresión transgénica en mitocondrias en astrocitos y neuronas20,21 (Figura 1A).
- Preparar plásmidos de ADN pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G y pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s para transfección para estudio in vitro (Sección 2). Producir vectores AAV con serotipo 5 para astrocitos y serotipo 9 para neuronas para estudio in vivo 18 (Sección 3).
2. Imágenes de Ca2+ mitocondrial in vitro en astrocitos y neuronas
- Preparar astrocitos primarios de la corteza de ratones neonatales P1 y neuronas primarias de la corteza de embriones E15-1618,22,23,24,y cultivarlos en fundas de vidrio de 12 mm de diámetro en placas de 24 pocillos utilizando el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y medio basal neuronal (NBM) que contiene 2% de B27, respectivamente.
- Transfectar astrocitos y neuronas maduras con plásmidos pZac-gfaABC1D-GCaMP6s y pZac-CaMKII-GCaMP5G utilizando reactivo de transfección basado en lípidos para expresar GCaMP6s en las mitocondrias de los astrocitos y GCaMP5G en las mitocondrias de las neuronas18,20,21. Transfecta células en cada pozo con 0,5 μg de ADN, y cambia el medio 6 h más tarde.
NOTA: Los astrocitos y las neuronas están listos para la obtención de imágenes 1-2 días después de la transfección. - Realizar imágenes mitocondriales in vitro de Ca2+ 1-2 días después de la transfección.
- Transfiera los cubrehojas de vidrio cultivados con astrocitos o neuronas a la cámara de perfusión PH-1 bajo un microscopio de epifluorescencia o dos fotones.
- Estimular la absorción astrocítica mitocondrial de Ca2+ con 100 μM de ATP en ACSF, o estimular las mitocondrias neuronales con 100 μM de glutamato/10 μM de glicina20,25 (Figura 2 y Figura 3).
NOTA: Los cambios en la solución de ACSF a ACSF que contienen ATP y glutamato/glicina están controlados por un sistema de perfusión ALA-VM821. La velocidad del cambio de solución se controla a 1-2 ml/min ajustando una válvula.
3. Imágenes mitocondriales in vivo de Ca2+ en astrocitos y neuronas
- Preparaciones AAV.
- Preparar los siguientes vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) utilizando los plásmidos de ADN preparados en la sección 1: vectores rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G y rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
NOTA: En este experimento, se prepararon vectores rAAV del serotipo 5 para expresar GCaMP5G en mitocondrias en astrocitos y vectores rAAV del serotipo 9 para expresar GCaMP6s en mitocondrias en neuronas.
- Preparar los siguientes vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) utilizando los plásmidos de ADN preparados en la sección 1: vectores rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G y rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
- Inyección estereotáxica de AAV.
- Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano.
NOTA: Más tarde durante la cirugía, los niveles de isoflurano se reducen al 2%. - Después de que el ratón alcance un nivel quirúrgico de anestesia, según lo determinado por el pellizco de la cola y el dedo del pie, afeite el cabello sobre el sitio de la cirugía, la corteza motora o somatosensorial, con un recortador de cabello.
- Coloque el mouse en el dispositivo estereotáxico del mouse y fije la cabeza con barras para los oídos. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para protegerlos durante la cirugía. Use una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 °C durante toda la cirugía.
NOTA: Realice la cirugía utilizando procedimientos asépticos. Todas las herramientas quirúrgicas deben esterilizarse en autoclave o en un esterilizador de cuentas calientes. - Después de montar el ratón en el dispositivo estereotáxico, esterilice el cuero cabelludo con exfoliantes alternados a base de yodo y etanol al 70% tres veces. Haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo para exponer el sitio de inyección.
- Abra la piel en el eje bregma-lamda y cree un orificio de rebabas de ~ 1 mm de diámetro con un taladro de alta velocidad en la ubicación de inyección prevista del motor o la corteza somatosensorial.
- Utilice una jeringa Hamilton de 33 G que contenga virus adenoasociados (vectores rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x 1011 GC] o vectores rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 1011 GC]) para inyectar hasta 1 μL de virus en el área objetivo.
NOTA: Por ejemplo, para la administración viral cortical, inyecte la solución del virus a dos profundidades en varios pasos. Primero, inserte la aguja a una profundidad de 1 mm desde la duramadre y espere 5 minutos para que el cerebro se recupere. Luego, mueva la aguja hasta ~ 700 μm de profundidad e inyecte 500 nL de la solución de virus a una velocidad de inyección de 10 nL / s usando una jeringa hamilton controlada por un controlador de bomba de microjeringa. Después de completar la inyección, espere 5 minutos para permitir que el virus se difunda en el cerebro. Luego, mueva la aguja hasta el segundo lugar de inyección a una profundidad de 300 μm. Aquí, inyecte 500 nL adicionales de la solución del virus. Espere 10 minutos para permitir que el virus se difunda en el cerebro. - Cierre el cuero cabelludo y la piel con un adhesivo tisular. Deje que los ratones se recuperen en la almohadilla térmica. Envíe los ratones de regreso a la instalación de animales después de la recuperación.
- Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano.
- Intalación de ventana craneal e imágenes in vivo de dos fotones (2-P) de señales mitocondriales de Ca2+.
NOTA: La implantación de la ventana craneal se realiza 3 semanas después de la inyección de AAV sobre la corteza motora o somatosensorial26,27,28,29. El carprofeno (10 mg/kg) se inyecta por vía subcutánea para aliviar el dolor potencial antes de la cirugía. Los procedimientos quirúrgicos de ventana craneal son idénticos a los procedimientos quirúrgicos de inyección de AAV y se realizan en condiciones asépticas.- Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano.
NOTA: Esta es la dosis inicial y se reduce al 2% para la cirugía más adelante. Durante la toma de imágenes, se utiliza una inyección intraperitoneal (IP) de 130 mg de ketamina/10 mg de xilazina/kg de peso corporal disuelto en ACSF para la anestesia. - Coloque el mouse en el dispositivo estereotáxico del mouse y fije la cabeza con barras para los oídos. Aplique ungüento oftálmico en los ojos. Use una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 °C durante toda la cirugía.
NOTA: Todas las herramientas quirúrgicas deben ser esterilizadas. - Haga una incisión de 5-8 mm de largo en la línea media del cuero cabelludo y retire un colgajo de piel con un par de tijeras.
- Después de exponer el cráneo, realice una craneotomía de 2.0-3.0 mm de diámetro utilizando un taladro de alta velocidad sobre el área inyectada por el virus (es decir, la corteza motora o la corteza somatosensorial, Figura 1B). Primero, haga cuatro agujeros pequeños y luego perfore a lo largo de un círculo que conecte los agujeros. Luego, levante y retire el hueso con tijeras afiladas y retírelo. La duramadre expuesta se puede quitar o mantener intacta para la impantación de la ventana craneal.
- Coloque una cubierta de vidrio de 3-5 mm de diámetro que lleve una silicona transparente sobre la craneotomía. Use un palillo de dientes para empujar la ventana craneal suavemente sobre la superficie del cerebro. Luego, selle el borde con una pequeña cantidad de adhesivo de silicona.
NOTAS: Alternativamente, en lugar de disco de silicona, se puede usar un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1.2% entre el vidrio de la cubierta y el tejido cerebral. - Finalmente, selle los bordes de la cubierta con cemento dental. Tenga cuidado de aplicar el cemento ligeramente en el borde de la ventana craneal para una unión fuerte. Coloque una placa de cabeza de metal hecha a medida en el cráneo con cemento dental.
NOTA: La placa de metal se utiliza para fijar la cabeza del ratón a la etapa del microscopio 2-P durante la sesión de imágenes(Figura 1C). - Agregue 0,5 ml de solución de ACSF sobre la cubierta de la ventana craneal para la inmersión en agua durante la toma de imágenes.
- Realizar imágenes time-lapse in vivo 2-P de mito-GCaMP5G en astrocitos y mito-GCaMP6s en neuronas con longitud de onda de 910 nm a través de la ventana craneal(Figura 1C)18,20,27.
NOTA: Durante la toma de imágenes, los ratones están en la almohadilla térmica para mantener la temperatura fisiológica. Los ratones serán sacrificados inmediatamente después de que se complete la sesión de imágenes. - Etiquetar astrocitos in vivo con sulforhodamine 101 (SR101) cuando sea necesario determinar la colocalización.
- Al final del paso 3.3.4, aplicar 100 μL de 100 μM SR101 en ACSF sobre la superficie cortical durante 1-5 min.
- Enjuague la superficie con ACSF para lavar el SR101 sin encuadernar. Utilizando imágenes 2-P, el co-etiquetado de mito-GCaMP5G y SR101 en astrocitos se puede observar 45-60 minutos más tarde (Figura 4A).
- Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano.
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Representative Results
El objetivo de este estudio fue proporcionar una metodología para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca2+ utilizando GECI en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Aquí se presentan los resultados de las imágenes mitocondriales de Ca2+ in vitro e in vivo.
Señalización in vitro mitocondrial de Ca2+ en astrocitos y neuronas cultivadas
La absorción mitocondrial de Ca2+ en los astrocitos puede ser provocada por la aplicación de ATP, y la absorción mitocondrial de Ca2+ en las neuronas puede ser provocada por la aplicación de glutamato y glicina a través de un sistema de perfusión. La Figura 2 y la Figura 3 muestran que GCaMP6s se expresa en astrocitos cultivados y GCaMP5G en neuronas, respectivamente. La absorción mitocondrial de Ca2+ en los astrocitos fue provocada por 100 μM de ATP con resolución mitocondrial única(Figura 2B-D). La absorción mitocondrial de Ca2+ en las neuronas fue provocada por 100 μM de glutamato y 10 μM de glicina con resolución mitocondrial única(Figura 3B-D).
Imágenes 2-P in vivo de la expresión mitocondrial de GCaMP5G o 6S en astrocitos y neuronas
La obtención de imágenes se realiza mediante la recopilación de imágenes 2-P in vivo de lapso de tiempo de señales de fluorescencia mitocondrial en astrocitos y neuronas con un sistema de microscopio Ultima 2-P. Utilizamos una longitud de onda de excitación de 880-910 nm. La Figura 4 muestra la expresión de GCaMP5G en mitocondrias en astrocitos en la corteza del ratón. La expresión específica de astrocitos de GCaMP5G se confirmó mediante colocalización de SR101 con GCaMP5G con resolución mitocondrial única(Figura 4A),y se pueden observar cambios espontáneos de Ca2+ en mitocondrias individuales(Figura 4B-E). La Figura 5A muestra la expresión neuronal específica de mito-GCaMP6 colocalizados con el marcador neuronal NeuN. La fluorescencia de mito-GCaMP6s en neuronas muestra morfología mitocondrial en dendritas (Figura 5B). Se pueden observar aumentos espontáneos de Ca2+ mitocondrial en las dendritas (Figura 5C-F).
Análisis de señales mitocondriales de Ca2+
Cuantificar las señales fluorescentes calculando las intensidades medias de píxeles del cuerpo celular o mitocondrias individuales en astrocitos y neuronas utilizando un software de análisis de imágenes. Ca2+ cambia con el tiempo (t) se expresa como valores de F/Fo (t) versus tiempo, donde Fo es el fondo restado de fluorescencia basal y F es la línea de base restada fluorescencia cambio20,21. Utilice los valores máximos de F/Fo para comparar la amplitud de las señales de Ca2+.
Figura 1: Construcciones deADN para la expresión transgénica dirigida a mitocondrias específicas de astrocitos y neuronas, e imágenes 2-P in vivo. (A) Construcciones de ADN de indicadores de Ca2+ GCaMP5G o GcaMP6s codificados genéticamente en plásmido pZac2.1 con promotores gfaABC1D (arriba) y CaMKII (bajo) para la entrega a la matriz mitocondrial astrocítica y neuronal, respectivamente. La orientación mitocondrial se logra utilizando una secuencia específica (mito) de matriz mitocondrial (MM) anexada al extremo N de las proteínas fluorescentes. (B) Una craneotomía sobre la corteza de un ratón. (C) El cráneo de un ratón está unido a una placa de metal conectada al poste fijado en la etapa del microscopio 2-P. El recuadro muestra la ventana craneal con una placa de metal unida al cráneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen mitocondrial ca2+ de astrocitos cultivados. (A-B) Imagen 2-P de un astrocito que expresa mito-GCaMP6s (A) y su respuesta a la estimulación de 100 μM ATP en el momento indicado (B). (C) Imágenes de mito-GCaMP6s en las cuatro mitocondrias individuales (en A, círculos) en los diferentes momentos después de la estimulación con ATP. (D) Los cursos de tiempo de la fluorescencia mito-GCaMP6s cambian, trazados como ΔF / Fo, en las cuatro mitocondrias individuales después de la estimulación con ATP. La flecha roja indica la hora de inicio de las imágenes. La escala pseudocolor es una representación lineal de la intensidad de fluorescencia en esta y otras figuras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:Imágenes mitocondriales de Ca2+ de neuronas cultivadas. (A-B) Una imagen 2-P de la neurona que expresa mito-GCaMP5G (A) y su respuesta a 100 μM de glutamato y 10 μM de glicina en el momento indicado (B). (C) Imágenes de mito-GCaMP5G en las cuatro mitocondrias individuales (en A, círculos) en diferentes momentos después de la estimulación con glutamato. (D) Los cursos de tiempo de la fluorescencia mito-GCaMP5G cambian en las cuatro mitocondrias individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes 2-P in vivo de señalización mitocondrial de Ca2+ en astrocitos. (A) Imágenes 2-P de mito-GCaMP5G expresando astrocitos colocalizados con SR101. (B-C) Imagen 2-P de un astrocito que expresa mito-GCaMP5G para el análisis del aumento espontáneo de Ca2+. (C-E) Imágenes de mito-GCaMP5G en las cuatro mitocondrias individuales en el astrocito (en B, círculos) en los diferentes momentos (C) y los cursos temporales de los cambios de fluorescencia mito-GCaMP5G, trazados como ΔF / Fo, en las cuatro mitocondrias individuales (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imagen 2-P in vivo de la señalización mitocondrial de Ca2+ en neuronas. (A) Colocalización de GCaMP6s (superior) con marcador neuronal NeuN (medio) en el cerebro. (B) Imágenes de alta resolución de dendritas que expresan GCaMP6s con morfología mitocondrial (indicadas por *s). (C) GCaMP6s expresados en mitocondrias neuronales. (D-F) Análisis del aumento espontáneo de Ca2+ mitocondrial en las neuronas. Imagen pseudocolor 2-P de las mitocondrias expresando mito-GCaMP6s en C en diferentes momentos (D). Imágenes de mito-GCaMP6s en las cuatro mitocondrias individuales en C (círculos) en los diferentes momentos (E-F) y los cursos de tiempo de los cambios de fluorescencia de mito-GCaMP6s, trazados como ΔF / Fo, en las cuatro mitocondrias individuales (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película: El Ca2+ mitocondrial aumenta en función de los cambios de fluorescencia GCaMP5G en respuesta a 100 μM de ATPen astrocitos cultivados. Haga clic aquí para descargar esta película.
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Discussion
En este artículo, proporcionamos un método y protocolo para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca2 + en astrocitos y neuronas. Implementamos estrategias específicas de mitocondrias y tipo de célula para expresar GECI GCaMP5G/6s. Para dirigirnos a GCaMP5G/6s en mitocondrias, incluimos una secuencia dirigida a mitocondrias en los plásmidos. Para expresar GCaMP5G/6s en astrocitos y neuronas in vivo,insertamos un promotor específico de astrocitos gfaABC1D y un promotor específico de neuronas CaMKII en los plásmidos. La expresión específica de tipo celular de GCaMP5G/6s en astrocitos y neuronas puede confirmarse mediante el marcado SR101 en astrocitos y la inmunotinción de neuronas con NeuN. A partir de nuestros datos, estas estrategias proporcionan un enfoque específico de tipo celular confiable para imágenes mitocondriales de Ca2 + en astrocitos y neuronas in vivo.
Un problema potencial para la expresión de GECI es que podría causar un almacenamiento en búfer de Ca2+, ya que puede reducir el Ca2+ libre por la unión de Ca2+. Otro problema al que se puede prestar atención es la cantidad de virus inyectado. Es posible que no se identifiquen células individuales que expresan GECI si se inyecta un virus excesivo. Estos problemas se pueden mejorar de manera efectiva al reducir el título de AAV. El fotoblanqueo también podría ser un problema. Teóricamente, todos los indicadores fluorescentes están sujetos a fotoblanqueo. Los GCaMP5G/6 son bastante estables, pero se blanquearán bajo la exposición continua a la luz de excitación. Una práctica general para evitar el fotoblanqueo es reducir el tiempo de exposición del tejido a la luz láser al tiempo que se garantiza que se recoja suficiente fluorescencia. Esto se puede lograr si se utilizan PMT de alta sensibilidad y objetivos de alta transmisión de luz. El fotoblanqueo también se puede reducir cerrando el obturador entre las imágenes.
En nuestros resultados de imágenes 2-P in vivo, se pueden observar aumentos mitocondriales espontáneos tanto en astrocitos como en neuronas. En particular, estos transitorios mitocondriales Ca2+ tienen largas duraciones(Figura 4E y Figura 5E),consistentes con un informe reciente de Gobel et al.30. El mecanismo subyacente de este fenómeno no está claro, pero vale la pena seguir adelante. Para el aumento de Ca2+ citosólico, los astrocitos y las neuronas tienen diferentes mecanismos. Las estimulaciones del receptor de proteína G causan un aumento de Ca2 + en ER en los astrocitos, mientras que las activaciones de los canales de Ca2 + dependientes de voltaje o los receptores de glutamato causan un aumento citosólico de Ca2 + en las neuronas, que pueden ser absorbidas por las mitocondrias. En nuestro estudio anterior20,encontramos que cuando mito-GCaMP5G fue cotransfectado con astrocitos cultivados con IP3 5-fosfatasa (5ppasa), el aumento de Ca2+ mitocondrial inducido por ATP podría ser abolido en gran medida. Sin embargo, los dos mutantes de la 5ppasa, es decir, R343A y R343A/R350A 5ppasa, que carecen de actividad enzimática, no afectaron el aumento mitocondrial de Ca2+ después de la estimulación con ATP. Estos resultados indican que los niveles citosólicos y mitocondriales de Ca2+ están altamente acoplados, probablemente debido a la íntima conexión física entre el RE y las mitocondrias en los astrocitos, con el citosol sirviendo como un conducto intermediario para la entrega de Ca2+. También encontramos que la estimulación del glutamato causó un aumento mitocondrial de Ca2 + en las neuronas, lo que sugiere que los receptores de glutamato desempeñan un papel en la entrada de Ca2 + desde el espacio extracelular. En el futuro, será interesante estudiar los aumentos de Ca2+ mitocondriales impulsados sensorialmente en astrocitos y neuronas.
Nuestro enfoque se puede utilizar para obtener simultáneamente imágenes de señales citosólicas y mitocondriales de Ca2+ en el mismo tipo de célula cuando se expresan dos GECI de diferentes longitudes de onda de fluorescencia, por ejemplo, una florescencia roja GECI RCaMP en citoplasma y GCaMP en mitocondrias, o viceversa31. Este enfoque también se puede utilizar para el estudio in vivo de las interacciones astrocito-neurona en fisiología y patología con GCaMP expresado en astrocitos y RCaMP en neuronas, o viceversa.
GCaMP es un GECI de fluoróforo de longitud de onda única basado en GFP. Actualmente, los GCaMP son los indicadores Ca2+ más preferidos debido a su alta relación señal-ruido (SNR) y grandes rangos dinámicos (DR). Recientemente, los sensores jGCaMP7, la versión optimizada de GCaMP6, se informaron con una sensibilidad mejorada a los picos individuales16. Los sensores GCaMP7 se pueden subclonar fácilmente en nuestros plásmidos para obtener imágenes mitocondriales de Ca2+. En resumen, las estrategias que presentamos aquí se pueden utilizar para obtener imágenes de la captación y manejo de Ca2+ mitocondrial en neuronas y astrocitos con sensibilidad suficiente para resolver los cambios de Ca2+ a nivel mitocondrial único in vivo. Este protocolo representa un medio útil para estudiar la señalización citosólica y mitocondrial de Ca2+ en astrocitos y neuronas, así como las interacciones astrocito-neurona.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) otorga R01NS069726 y R01NS094539 a SD. Agradecemos a Erica DeMers por la grabación de audio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
