Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מודל עכברוש 6-הידרוקסידופמין של מחלת פרקינסון

Published: October 27, 2021 doi: 10.3791/62923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

מודל 6-hydroxydopamine (6-OHDA) שימש במשך עשרות שנים כדי לקדם את ההבנה של מחלת פרקינסון. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד לבצע נגעים nigrostriatal חד צדדיים בחולדה על ידי הזרקת 6-OHDA בחבילת המוח הקדמי המדיאלי, להעריך ליקויים מוטוריים, ולחזות נגעים באמצעות מבחן הצעדה.

Abstract

תסמינים מוטוריים של מחלת פרקינסון (PD)-ברדיקינזיה, אקנזיה, ורעד במנוחה- הם ההשלכות של ניוון עצבי דופאמין בסובסטנציה ניגרה pars compacta (SNc) וגירעון striatal דופאמין. מודלים של בעלי חיים שימשו באופן נרחב כדי לדמות פתולוגיה אנושית במעבדה. מכרסמים הם הדגמים בעלי החיים הנפוצים ביותר עבור PD בשל קלות הטיפול והתחזוקה שלהם. יתר על כן, האנטומיה והמנגנונים המולקולריים, התאיים והפרמקולוגיים של PD דומים במכרסמים ובבני אדם. עירוי של neurotoxin, 6-hydroxydopamine (6-OHDA), לתוך צרור המוח הקדמי המדיאלי (MFB) של חולדות משחזר את ההרס החמור של נוירונים דופאמין ומדמה תסמיני PD. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע את microinjection חד צדדי של 6-OHDA ב- MFB במודל חולדה של PD ומראה את הליקויים המוטוריים הנגרמים על ידי 6-OHDA ונגעים דופאמין חזוי באמצעות מבחן הצעד. 6-OHDA גורם לפגיעה משמעותית במספר השלבים המבוצעים עם חזית הנגד.

Introduction

המאפיינים הנוירופתולוגיים העיקריים של PD הם ניוון עצבי פרוגרסיבי כרוני של נוירונים דופאמין בסובסטנציה ניגרה pars compacta (SNc) ואת נוכחותם של גופים לוי המכילים חלבון α-סינוקלאין1. כמו נוירונים דופאמין SNc להקרין האקסונים שלהם לתוך הסטריאטום דרך המסלול nigrostriatal, ניוון עצבי של נוירונים ב SNc גורם גירעון דופאמין בסטריאטום2. היעדר דופמין בסטריאטום גורם לחוסר איזון בפעילותם של מסלולי הבקרה המוטורית הישירים והעקיפים, האחראים על הסימפטומים המוטוריים העיקריים של PD: אקנזיה (תנועה איטית), ברדיקינזיה (קושי בהתחלת תנועות), נוקשות שרירים ורעד במנוחה 3,4,5.

כמו המנגנונים המולקולריים והפיזיולוגיים המעורבים בהתפרצות של PD עדיין לא מובנים במלואם, טיפולים עיקריים זמינים כיום מבקשים להקל על הסימפטומים המוטוריים באמצעות פרמקותרפיות, גירוי מוחי עמוק6,7, טיפולים גנטיים8, השתלת תאים9. לכן, מחקר פרה קליני הוא בסיסי כדי להבהיר את המנגנונים המעורבים בהופעת PD ולגלות מתודולוגיות חדשות לאבחון מוקדם וטיפולים חדשים כדי למנוע או לעצור את ניוון של נוירונים מושפעים PD10.

מודלים של בעלי חיים שימשו באופן נרחב כדי לדמות פתולוגיה אנושית במעבדה, ותורמים לקידום הרפואה והמדע11,12,13,14. עם זאת, חשוב להדגיש כי הבחירה הנכונה של המודל החייתי היא בסיסית להצלחת המחקר. לכן, המודל החייתי חייב להיות מאומת בשלושה היבטים עיקריים: i) תוקף הפנים, שבו המודל החייתי חייב להיות בעל המאפיינים של הפתולוגיה האנושית; ii) תוקף קונסטרוקטיבי, שבו למודל החי חייב להיות בסיס תיאורטי מוצק; ו-iii) תוקף חזוי, שבו מודלים של בעלי חיים חייבים להגיב לטיפולים באופן דומה לטיפול קליני.

נכון לעכשיו, מספר בעלי חיים משמשים כמודלים בעלי חיים עבור PD. הקבוצות העיקריות כוללות יונקים, כגון מכרסמים, פרימטים, מיניפיגים, כלבים וחתולים, וקבוצות אחרות כגון דרוזופילה ודגי זברה. מכרסמים הם המודל החייתי הקלאסי ביותר עבור PD ואת הנפוץ ביותר בשל קלות הטיפול והתחזוקה שלהם. בנוסף, האנטומיה והמנגנונים המולקולריים, התאיים והפרמקולוגיים של PD דומים במכרסמים ובבני אדם15.

סקירה שפורסמה על ידי Kin ועמיתיו בשנת 2019 ניתחה את המתודולוגיות העיקריות של מודל בעלי חיים ששימשו ל- PD בשנות ה -2000 ומצאה כי המודל החייתי הנפוץ ביותר כלל רעלנים עצביים כגון 6-הידרוקסידופאמין (6-OHDA) ו 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרהידרופירידין (MPTP). שני neurotoxins לגרום dysregulation מיטוכונדריאלי בתאי עצב דופאמין במסלול nigrostriatal, המוביל למוות תאים16. מודל נפוץ נוסף כרוך במניפולציה גנטית באמצעות מוטציה בגנים ספציפיים המעורבים בהתפרצות של PD, גרימת dysregulation mitochondrial17. מודלים Neurotoxin משמשים בדרך כלל כדי להעריך ולהשוות טיפולית, ואילו מודלים גנטיים משמשים כדי ללמוד את הפיתוח של טיפולים מונעים PD15 אידיופתי.

MPTP neurotoxin התגלה כגורם לפרקינסון באמצע שנות השמונים לאחר ששבעה חולים השתמשו בחומר והפגינו תסמיני PD חמורים. בנוסף לתסמינים, המטופלים הגיבו לטיפול בסדר גמור, מה שגרם לחוקרים לקשר את המולקולה ישירות ל- PD. לאחר שהמקרה פורסם בשנת 1986, מספר חוקרים החלו להשתמש ב- MPTP במחקר PD פרה-קליני18. חוקרים מצאו כי בהיותה מולקולה ליפופילית, MPTP יכול לחצות את מחסום הדם - מוח (BBB) ולהומר ל- MPP +19. חומר רעיל זה מצטבר בתוך נוירונים וגורם נזק מורכב 1 של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלי, המוביל למוות של נוירונים דופאמין20.

מודל הנוירוטוקסין 6-OHDA שימש לראשונה כדי לגרום לניוון של נוירונים מונואמין של המסלול nigrostriatal בשנת 196821. מודל 6-OHDA משמש בדרך כלל כדי לגרום ניוון עצבי במסלול nigrostriatal כפי שהוא דופמין אנלוגי רעיל עבור תאים המכילים קטכולאמין. לאחר 6-OHDA נכנס למוח, זה עשוי להילקח על ידי טרנספורטר דופמין (DAT) נוירונים דופאמין, המוביל ניוון של מסלול nigrostriatal22. מכיוון ש-6-OHDA אינו חודר ל-BBB, יש לתת אותו ישירות באמצעות הזרקה סטריאוטקית תוך-מוחית23. מעכב ספיגה חוזרת של נוראדרנלין משולב לעתים קרובות עם microinjection 6-OHDA כדי לשמר סיבים noradrenergic ולספק ניוון סלקטיבי יותר של נוירונים דופאמין24.

לאחר DAT תופס 6-OHDA, זה יצטבר בציטוסול של נוירונים, לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS) ומוביל למוות תאים15. שלושה דגמי נגעים שונים של 6-OHDA משמשים לעתים קרובות: i) נגעים SNc25,26; ii) נגעים לסטריאטום27,28; ג. נגעים ל- MFB29,30. נגעים הנגרמים בסטריאטום גורמים לניוון איטי ומדרדר של נוירונים דופאמין ב- SNpc. לעומת זאת, נגעים הנגרמים ב- SNpc ו- MFB גורמים לניוון מהיר ומוחלט של נוירונים, מה שמוביל לתסמינים פרקינסון מתקדמים יותר31.

הזרקה חד-צדדית או דו-צדדית של 6-OHDA יכולה לגרום לניוון עצבי בתאי עצב דופאמין. 6-OHDA לא תמיד לגרום נזק חמור לנוירונים; לפעמים, ההזרקה גורמת לנזק חלקי, אשר משמש גם כדי לדמות את השלבים המוקדמים של PD32. ההזרקה החד-צדדית משמשת בדרך כלל בשל יכולתו של המודל להעריך את הליקויים המוטוריים של החיה ולחזות אובדן תאים באמצעות בדיקות כגון סיבוב המושרה באמפטמין/אפומורפין ומבחן הצעד29. זריקות דו-צדדיות משמשות ביותר להערכת זיכרון מרחבי וזיהוי33.

מבחן הסיבוב המושרה אמפטמין/אפומורפין הוא מבחן התנהגותי נפוץ לחזות אובדן תאים במסלול nigrostriatal. זה מוגדר כתהליך שבו ניהול חוזר ונשנה של אגוניסטים דופמין מוביל התעצמות של התנהגות סיבובית בבעלי חיים 6-OHDA-נגע34. התנהגות סיבובית מורכבת מכמת סיבוב סיבובי איפסילטרלי המושרה באמפטמין או מפניות קונטרלטרליות הנגרמות על ידי אפומורפין במכרסמים בעלי נגע חד-צדדי. התנהגות סיבובית הנגרמת על ידי סמים זכתה לביקורת מכיוון שהסבב אינו תואם לתסמיני PD בבני אדם ויכול להיות מושפע ממשתנים כגון סובלנות, רגישות ו"פרימינג"35.

פרימינג הוא אחד הגורמים הקריטיים ביותר במבחנים התנהגותיים אלה. כמה מקרים דווחו שבהם מנה אחת של בסדר גמור הובילה לכישלון בהתנהגויות סיבוביות36. בנוסף, גורם קריטי נוסף הקשור ליישום המשולב של הבדיקה המושרה אמפטמין ובדיקה הנגרמת על ידי אפומורפין לשימוש מקבילי הוא שהם מודדים נקודות קצה שונות בגלל מנגנוני פעולה שונים, המשקפים את ההשבתה של מנגנוני איתות ומסלולים שונים. יתר על כן, הבדיקה המושרה אמפטמין הוא מדויק יותר למדוד נגעים nigrostriatal מעל 50-60%, ואילו הבדיקה הנגרמת על ידי אפומורפין מדויקת יותר עבור נגעים מעל 80%37.

מבחן הצעדים התגלה כמבחן התנהגותי המצביע על ליקויים הקשורים ניוון נוירון דופאמין והשפעות טיפוליות. זה מאפשר ניתוח של אקנזיה הנגרמת על ידי נגע 6-OHDA בתאי עצב דופאמין ללא הליך הנגרמת על ידי סמים. יתר על כן, הבדיקה הוקמה היטב ובדרך כלל בשימוש מאז 1995, כאשר היא תוארה לראשונה על ידי Olsson et al.35. בשנת 1999, צ'אנג ואח ' 38 גם ניתח והשווה את הביצועים של חולדות במבחן הצעד עם רמת ניוון שנגרם על ידי 6-OHDA ומצא כי בעלי חיים שביצעו גרוע יותר במבחן הצעדה היה גם ניוון משמעותי יותר של נוירונים דופאמין.

מבחן הצעדה הוא שיטה מצוינת לחזות נזק nigrostriatal דופאמין חמור בחולדות נגע 6-OHDA. הראיות מצביעות על כך שהגירעונות המוטוריים מופיעים בקדמת הבמה הנגדית של עירוי 6-OHDA במהלך מבחן הצעדה כאשר מידת האובדן הדופאמין ב- SNc היא >90%39. מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים, המתודולוגיות והחומרים המשמשים לביצוע ניתוח סטריאוטקסי לעירוי חד-צדדי של 6-OHDA ל- MFB של חולדות וכיצד לחזות את הנגעים הדופאמין הנגרמים על ידי הרעלן באמצעות מבחן הצעדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים פעלו על פי העקרונות האתיים של המועצה הלאומית לבקרה על ניסויים בבעלי חיים (CONCEA) וחוק ארוקה (חוק 11.794/2008) ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (CEUA-FFCLRP/ USP (18.5.5.35.59.5).

1. הכנת סמים

  1. הרדמה עם קטמין/קסילאזין
    הערה: המינון של קטמין בשימוש הוא 70 מ"ג/ק"ג, ואת המינון של xylazine הוא 10 מ"ג/ק"ג.
    1. להכנת 1 מ"ל של הרדמה באמצעות פתרון קטמין 100 מ"ג / מ"ל ופתרון xylazine 20 מ"ג / מ"ל, לשלב 0.35 מ"ל של פתרון קטמין, 0.25 מ"ל של פתרון קסילאזין, ו 0.4 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית 0.9%. לנהל את הפתרון ההרדמה בנפח סופי של 2 מ"ל / ק"ג.
      הערה: קטמין יחד עם קסילאזין יכול לייצר הרגעה במשך 60-80 דקות. אם לבעל החיים עדיין יש רפלקסים (למשל, זריקת רגל אחורית ו/או רפלקס מהבהב), לתת 10% נוספים של המינון הפרטני.
  2. אימפרמין
    הערה: המינון האישי של imipramine בשימוש הוא 20 מ"ג/ק"ג.
    1. להכנת 1 מ"ל של פתרון imipramine 20 מ"ג / מ"ל, לשלב 20 מ"ג של imipramine ו 1 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. לנהל את פתרון imipramine בנפח סופי של 1 מ"ל / קילוגרם.
  3. Meloxicam
    הערה: המינון האישי של meloxicam בשימוש הוא 1 מ"ג/ק"ג.
    1. להכנת 1 מ"ל של תמיסת meloxicam 1 mg/mL, לשלב 0.05 מ"ל של meloxicam 2% ו 0.95 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. לנהל את פתרון meloxicam בנפח סופי של 1 מ"ל / קילוגרם פעם ביום במשך יומיים.
  4. חומצה אסקורבית 0.1%
    1. להכנת 1 מ"ל של 0.1% חומצה אסקורבית, לשלב 1 מ"ג של חומצה אסקורבית ו 1 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח סטרילית.
  5. 6-הידרוקסידופאמין (6-OHDA)
    הערה: 6-OHDA הוא רעלן עצבי המשמש להרוס באופן סלקטיבי דופאמין נוירונים noradrenergic במוח. יש להימנע ממגע ישיר עם העור והריריות של העיניים, האף והפה. בעת טיפול 6-OHDA, ללבוש כפפות ניטריל כפולות, חלוק מעבדה, שמלה חד פעמית, הגנה על העיניים, מסכה כירורגית או מגן פנים. נפח העירוי הכולל של הרעלן הוא 4 μL / בעלי חיים, ואת הסכום הבודד הוא 10 מיקרוגרם של 6-OHDA / בעלי חיים.
    1. כדי להכין 1 מ"ל של 6-OHDA בריכוז סופי של 2.5 מ"ג / מ"ל, לערבב 2.5 מ"ג של 6-OHDA ו 1 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח המכילה 0.1% חומצה אסקורבית (המתואר לעיל).
      הערה: 6-OHDA רגיש לאור ומתפרק מהר יותר כאשר הוא נחשף לאור בהיר. יש לטפל בו כראוי ולאחסן אותו בסביבה מוגנת מפני אור. אם צבע הפתרון אדמדם, מחק אותו.
  6. לידוקאין הידרוכלוריד (2%)
    1. הכן פתרון לידוקאין 2% ליישום מקומי לבעל החיים.
      הערה: המינון המרבי שניתן ליישם הוא 7 מ"ג/ק"ג.
  7. השעיה פולי-אנטיביוטית
    הערה: ההשעיה הפולי-אנטיביוטית עם סטרפטומיצינים ופנצילין (ראה טבלת החומרים) חייבת להיות מוכנה בזמן היישום עם כל נפח הדילול, שהאמפולה שלו מלווה את הבקבוקון עם האבקה.
    1. הסר את הדיסק המתכתי על פקק הגומי. לחטא את פקק הגומי עם אלכוהול.
    2. באמצעות מזרק עם מחט של 23 גרם, להזריק את הדילול לתוך הבקבוקון. הסר את המחט ולנער את הבקבוקון במרץ עד ההשעיה הוא הומוגני לחלוטין. להזריק קצת אוויר לתוך הבקבוקון ולמשוך את הנפח הרצוי של ההשעיה.
    3. לנהל זריקה תוך שרירית עמוקה, מושך את הבוכנה לפני הזרקת התרופה כדי להבטיח כי אין כלי דם הוא הגיע.
      הערה: נפח ההשעיה הסופי שיש להחיל הוא 0.5 מ"ל /ק"ג.

2. הכנת חומרים

הערה: בצע תמיד את ההוראות המופיעות עם גיליון נתוני בטיחות החומרים בעת טיפול בכימיקלים.

  1. מנגנון סטריאוטקסי
    1. מניחים את המכשיר הסטריאוטקסי על ספסל יציב ונקי עם תאורה נאותה לביצוע הניתוח. לחטא את המנגנון עם 70% אתנול.
    2. בדוק אם עמודות האוזן והחותכות של ההתקן מיושרות כראוי. מניחים שמיכה תרמית שבה החיה תוצב במהלך הניתוח כדי להתחמם במהלך ההליך. נטר את הטמפרטורה של החיה באמצעות בדיקה רקטלית מדויקת.
      הערה: השמיכה התרמית צריכה להיות בטמפרטורה של 37 °C (5 °F), כך החיה שומרת על טמפרטורת גוף של 37 °C (60 °F).
  2. מערכת מיקרו-עירוי
    1. מלא (70-80%) מזרק המילטון (50 μL או לפי הצורך) מחובר microtubing פוליאתילן ברמה רפואית ומחט עם מים מזוקקים כפולים (ddH2O) ולבדוק דליפות דרך המערכת.
    2. משוך אוויר דרך המערכת כך שבועת אוויר אחת מפרידה את ddH2O במזרק מפתרון 6-OHDA במיקרו-טיוב.
      הערה: הליך זה נמנע מזיהום מזרק המילטון עם 6-OHDA ומאפשר שימוש במספר חולדות באותו יום ניסיוני.
    3. מקם את מזרק המילטון על משאבת העירוי כך שהוא מחובר היטב ואת הבוכנה של המזרק מקביל למסגרת כי יזוז לדחוף אותו. הגדר את משאבת העירוי למהירות של 0.5 μL / min כך היישום הכולל של 4 μL של 6-OHDA נמשך 8 דקות. בדוק את מערכת העירוי על ידי אישור כי אין דליפות וכי עירוי מתרחשת על פי הזמן והנפח שנקבעו בעבר.
    4. חבר את מחט העירוי המחוברת למיקרו-צינור למנגנון בקצה הזרוע הסטריאוטקסית ובדוק שהמחט ממוקמת בזווית של 180° לפני השטח. ודא שהמחט ישרה ולא כפופה.
      הערה: בדוק את כל ההליכים המתוארים בזהירות כי אם אחד הפריטים במערכת העירוי לא עובד כראוי, זה עלול לסכן את ההצלחה של הניתוח.
  3. תפר
    1. השתמש תפר ניילון סטרילי שאינו נספג עם מחט 3/8 מעגל כדי לתפור את החתך לאחר הניתוח.
  4. אתר שחזור פוסט-כירורגי
    1. מניחים תיבת דיור נקייה ומעוקרת שבה ניתן לפקח על בעלי חיים עד להתאוששות מלאה (מגיבים למגע ומניפולציה). שים שמיכה תרמית בקופסה עבור thermoregulation.
      הערה: כמו thermoregulation חשוב, לכלול מקור חום משלים כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במידת הצורך.

3. הליך כירורגי

הערה: בפרוטוקול זה, עכברושים זכר בוגר Sprague-Dawley (200-250 גרם) נשמרו בתנאים מבוקרים של טמפרטורה (22 ± 2 °C (60 °F), חילופי אוויר (15-20 חילופים / שעה), ומחזורים כהים בהירים (12 שעות / 12 שעות), מקובצים בקופסאות עם 3 או 4 בעלי חיים, עם גישה חופשית למזון ומים.

  1. לשקול את בעלי החיים כדי לפקח על שינויים במשקל בימים שלאחר הניתוח. חשב את המינון של תרופות להינתן.
  2. לנהל imipramine intraperitoneally 30 דקות לפני הניתוח (~ 10-15 דקות לפני מתן הרדמה), באמצעות מחט 27 G ומזרק 1 מ"ל.
    הערה: imipramine יחסום את טרנספורטר noradrenaline (NAT) ולמנוע ספיגה 6-OHDA על ידי נוירונים noradrenergic, מה שהופך את הנגע סלקטיבי יותר נוירונים דופאמין40.
  3. לאחר 10-15 דקות של הממשל של imipramine, לנהל את הרדמה קטמין/ xylazine intraperitoneal באמצעות מחט 27 גרם ומזרק 1 מ"ל. חכה עד שהחיה תהיה מורדמת לחלוטין. ודא כי החיה נמצאת תחת הרדמה עמוקה כאשר החיה אינה מגיבה לצביטת רגל אחורית ואינה מראה רפלקס מצמוץ.
  4. לגלח את פרוות החולדה באזור הראש שבו החתך יתרחש.
  5. מקם את החולדה במנגנון הסטריאוטקסי.
    1. מקם את הראש מעל מוט החותכת ותקן את הסרגל 3.3 מ"מ מתחת לקו הבין-לאומי.
    2. מקם את מוטות האוזן, צד אחד בכל פעם. מקם את מוט החותכת ואת מוטות האוזן כך שהחלק העליון של הגולגולת יהיה ישר ומקביל לפני השטח.
    3. התאם את מהדק האף ובדוק שהראש מוצק ואינו זז לשני הצדדים.
  6. החל משחה עיניים סטרילית על עיני החולדה כדי למנוע קרניות להתייבש.
  7. החל povidone-יוד על האזור להיות חרות לחטא את האתר.
  8. החל לידוקאין מקומי עבור משכך כאבים של אזור החתך; אין לחרוג מ-7 מ"ג/ק"ג.
  9. לנהל את meloxicam תת עורית באמצעות מחט 27 G ומזרק 1 מ"ל.
    הערה: Meloxicam הוא משכך כאבים אנטי דלקתי nonsteroidal שיסייע החיה להתאושש לאחר הניתוח.
  10. לנהל את ההשעיה הפולי-אנטיביוטיקה תוך שרירית באמצעות מחט 23 G ומזרק 1 מ"ל.
    הערה: ההשעיה הפולי-אנטיביוטית ניתנת כטיפול מניעתי כדי למנוע זיהומים חיידקיים אפשריים בהתאוששות שלאחר המוות.
  11. בדוק כי החיה נמצאת במצב של הרדמה עמוקה על ידי בדיקת רפלקסים מצמוץ או רפלקסים גפיים אחוריים על ידי צביטת הכף האחורית עם פינצטה.
  12. עם אזמל, לבצע חתך של ~ 1.5 ס"מ באזור שבו המיקרו-מניפולציה תתרחש.
    הערה: טכניקות סטריליות מיושמות מנקודה זו עד לסגירת הפצע.
  13. נקו את אזור הגולגולת עם מטליות כותנה וניצני כותנה עד שניתן יהיה לראות את ברגמה ולמבדה. סמן את הברגמה ואת למבדה עם עט דק מעוקר.
  14. ודא כי הקואורדינטות הגב-גחון (DV) של ברגמה ולמבדה דומות. אם הם שונים, התאם מחדש את החולדה במנגנון הסטריאוטקסי מכיוון שראש החולדה אינו ממוקם כראוי.
  15. שים לב לקואורדינטות הקדמיות (AP) והמדיולטרליות (ML) של ברגמה.
  16. עבור לקואורדינטות AP ו- ML של MFB הנכון על פי 41: AP: -4.3 מ"מ, ML: 1.6 מ"מ מברגמה.
  17. סמן את האזור של trepanation עם עט דק מעוקר.
  18. עם מקדחה מעוקרת, לאט לאט לנקב את הגולגולת של החיה, דואג לא לפצוע את הדורה מאטר.
  19. מקם את מחט המיקרו-חדירה על דורה מאטר ושים לב לקואורדינטות ה- DV. קח מחט דקה וקרע בעדינות את הדורה מאטר. הכנס את המחט לקואורדינטת ה- DV (8.3 מ"מ גחון) של ה- MFB, שם יתקיים המיקרו-נגיחה.
  20. הפעל את משאבת המיקרו-חדירה כדי לשחרר את פתרון 6-OHDA לתוך ה- MFB. כאשר המיקרו-נגיחה תסתיים, בדוק את מזרק המילטון כדי לראות אם 4 μL של 6-OHDA הוזרק.
    הערה: המיקרו-חדירה אמורה להימשך 8 דקות.
  21. לאחר מתן של 6-OHDA, לחכות 10 דקות לפני הסרת המחט כדי למנוע זרימה אחורית של התרופה. הסר את מחט המיקרו-חדירה באיטיות ממוחו של בעל החיים.
  22. לחטא את אזור החתך שוב עם povidone-יוד.
  23. תפר את אזור החתך עם ~ 3-4 קשרים כירורגיים.
    הערה: הקשר לא צריך להיות חזק מדי או רופף מדי.
  24. הסר את החולדה מהמנגנון הסטריאוטקסי והנח אותו בקופסה נקייה להתאוששות על השמיכה התרמית עד שהחיה התאוששה לחלוטין מהרדמה. שימו לב לבעל החיים כל 15 דקות עד שהוא ער לחלוטין מהרדמה.

4. הליכים לאחר הניתוח

  1. עקוב אחר משקל החיות בארבעת הימים הבאים לאחר הניתוח. לטפל בהם עם meloxicam תת עורית פעם ביום במשך יומיים לאחר הניתוח, התאמת המינון עבור המשקל של כל יום.
    הערה: יש להעריך את כל בעלי החיים לצורך במשככי כאבים ביום השלישי לאחר הניתוח.
  2. בדוק את החתכים מדי יום במשך ארבעה ימים לפחות כדי לוודא שהם לא נגועים. חפש חום, נפיחות, כאב, פריקה ואדמומיות עד שהחתכים יחלימו.
  3. בדוק את התיאבון ואת צריכת המים על ידי ניטור משקל הגוף של החיה. תן מזון רטוב כדי לעודד את בעלי החיים לאכול. שים לב למצב הכללי של הגוף, לגישה ולניידות מדי יום במשך ארבעה ימים לפחות לאחר הניתוח. הסר את התפרים 7-10 ימים לאחר הניתוח.
    הערה: יש להרדים בעלי חיים אם מגיעים לנקודות הקצה המוגדרות בהליכים האתיים.

5. מבחן דריכה

  1. הדרכה
    הערה: יש לאמן את בעלי החיים במשך שלושה ימים לפני הבדיקה. על פי הפרוטוקול המתואר להלן, אימון צריך להתרחש פעמיים ביום, פעם בבוקר ופעם אחר הצהריים, או עם מרווח של לפחות 2 שעות בין מפגשים. עקוב אחר השעה באמצעות טיימר.
    1. יום 1
      1. בפגישה הראשונה, להתמודד עם החולדה על ידי החזקתו בכפפות במשך ~ 1-2 דקות כדי לאפשר לחולדה להכיר את המטפל / הנסיין.
      2. בפגישה השנייה, לסירוגין בין החזקת החולדה במשך 20 שניות והנחתו על שולחן הפרוטוקול במשך 20 שניות. חזור על שלב אימון זה במשך 3 דקות כדי להכיר את החולדה עם ההתקנה הניסיונית למבחן הצעדה.
    2. יום 2
      1. בפגישה הראשונה, מניחים את שתי נקבות החולדה על שולחן הפרוטוקול על ידי החזקת כפותיה האחוריות ובחזרה ביד אחת. הטה את העכברוש כלפי מטה עם הראש כלפי מטה בזווית של 45° אל פני השטח השטוחים של שולחן הפרוטוקול. הזז אופקית על השולחן מקצה לקצה, ומאפשר לחולדה לדרוך על השולחן עם שתי כפות הרגליים (לכסות 90 ס"מ ב 4 s). להחזיק את החולדה בכפפות במשך 10 שניות, ומאפשר לו לנוח; חזור על דפוס זה במשך 3 דקות.
      2. בפגישה השנייה, הניחו קדמת הבמה אחת של החולדה על שולחן הפרוטוקול על ידי החזקת הפתח השני ביד אחת והחזקת גב החולדה וכפות הרגליים האחוריות ביד השנייה (ראו שלב 5.1.2.1). הזז אופקית על השולחן מקצה לקצה ב 4 s, ומאפשר החולדה לדרוך עם כף הרגל החופשית שלה. החזק את החולדה בכפפות במשך 10 שניות, ומאפשר לה לנוח, ולחזור עם עוד forepaw, ואחריו את תקופת המנוחה. חזור על דפוס זה, לסירוגין בין שני forepaws, ולנוח במשך 3 דקות.
      3. חזור על שלב האימון 3 פעמים במשך 1 דקות כל אחד.
    3. יום 3
      1. בהפעלה הראשונה, בצע את ההליך המתואר בשלב 5.1.2.2 עבור קדימה אחת. חזור על הפעולה עם קדמתן נוספת, ואחריה תקופת המנוחה. חזור על דפוס זה, לסירוגין בין שני forepaws, ולנוח במשך 3 דקות.
      2. בהפעלה השנייה, בצע את ההליך המתואר בשלב 5.1.2.2.
  2. מבחן
    הערה: מבחן הצעדה מבוצע לפני הניתוח, 2 ו 4 שבועות לאחר ניתוח סטריאוטקסי, כדי להעריך את האקנזיה של הקדמי הנגדי ואת הפגיעה האפשרית הנגרמת על ידי 6-OHDA.
    1. החזק את החולדה בזווית של 45° אל פני השטח, משתק את גפיו האחוריות ומאפשר רק לאחד הקדמיים לנוח על הרציף, כפי שהוסבר לעיל, ליום 3 של אימון.
    2. גררו את החולדה קדימה למרחק של 90 ס"מ ב-4 שניות, כאשר כף הרגל הימנית או השמאלית מונחת על פני השטח.
    3. רשום הערות וכימת את מספר הצעדים להתאמת כף היד הננקטים עם כל כף רגל לכל כיוון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכת נגע דופאמין
מבחן הצעדה מאפשר הערכה של האקינזיה של הגפיים הקדמיות בניגוד לנגע ובחירת בעלי חיים עם נגע אפשרי של המסלול הניגרוסטריאטלי המושרה על ידי עירוי 6-OHDA (איור 1). ההשוואה בין הביצועים של מבחן הצעדים הנגדי לפני ההפסקה ושבועיים וארבעה שבועות לאחר הניתוח חשפה אינטראקציה (F2,74 = 93.63; p < 0.0001; דו-כיווני חוזר על עצמו - צעדים חוזרים ונשנים ANOVA) בין זמן (לפני, 2, ו 4 שבועות לאחר הניתוח) וטיפול (ניתוח מזויף ו 6-OHDA-נגע). הבדיקה שלאחר הוק של Bonferroni הראתה ירידה משמעותית במספר הצעדים המנוגדים לנגיעה בבעלי חיים המקבלים 6-OHDA ב- MFB הנכון בהשוואה לבעלי החיים המופעלים בזיוף בשבוע השני והרביעי לאחר הניתוח (p < 0.0001) (איור 1). התוצאות היו עקביות עם אלה של מחקרים קודמים35.

חשוב לציין כי כאשר הנגע הדופאמין אינו שלם, תוצאות מבחן הצעדים לא יגיעו למידת ההצלחה של התוצאות המוצגות במחקר זה. מחקר שפורסם בעבר ביצע את מבחן הצעד ואת immunohistochemistry של טירוזין הידרוקסילאז (TH) עם בעלי חיים עם נגע דופאמין חלקי לאחר ביצוע ניתוח למיקרו-הזדקנות של 6-OHDA בעקבות אותו פרוטוקול המשמש במחקר זה. מציאתם של גירעון חלקי במבחן הצעד (4-8 צעדים) היא תוצאה של נגע דופאמין חלקי של ~ 60% של הנוירונים39.

Figure 1
איור 1: הערכה של מבחן צעדים מנוגד לפני ואחרי ההפצה לעירוי חד-צדדי של 6-OHDA או רכב לתוך MFB הנכון. הנתונים מראים כי לבעלי חיים המקבלים 6-OHDA הייתה ירידה משמעותית במספר הצעדים עם הנגד הקדמי הקדמי לנגע בשבוע השני והרביעי לאחר הניתוח (****p < 0.0001 לעומת פוסט-כירורגיה מזויפת; אמצעים חוזרים ונשנים דו-כיווניים ANOVA, Bonferroni post-hoc). נתונים המבוטאים כממוצע ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע. הרכב הוא תמיסת מלח 0.9% המכילה 0.1% חומצה אסקורבית. התוצאות מבוססות על 14 בעלי חיים בקבוצת המזויפים ו-25 בעלי חיים בקבוצת 6-OHDA. קיצורים: P = presurgery. 2 = שבועיים לאחר הניתוח. 4 = ארבעה שבועות לאחר הניתוח; 6-OHDA = 6-הידרוקסידופאמין; MFB = חבילת מוח קדמית מדיאלית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ההשוואה בין הביצועים של מבחן ההקדמה לקדמת הבמה של IPSIlateral ו-2 שבועות ו-4 שבועות לאחר הניתוח לא חשפה שום אינטראקציה (F2,74 = 0.4492; p = 0.6399; דו-כיווני חוזר על עצמו- צעדים חוזרים ונשנים ANOVA) בין הזמן (לפני, 2, ו -4 שבועות לאחר הניתוח) לבין הטיפול (ניתוח מזויף ו 6-OHDA-נגע). הבדיקה שלאחר ההוק של בונפרוני לא הראתה הבדל משמעותי במספר הצעדים של הנגיעה בבעלי חיים שקיבלו 6-OHDA ב-MFB הנכון בהשוואה לבעלי חיים מזויפים (איור 2).

Figure 2
איור 2: הערכה של מבחן צעדים ipsilateral pre-and posturgery עבור עירוי חד-צדדי של 6-OHDA או רכב לתוך MFB הנכון. הנתונים מראים כי בעלי חיים המקבלים 6-OHDA לא הפחיתו באופן משמעותי את מספר הצעדים עם ipsilateral הקדמי הקדמי לנגע בשבוע השני והרביעי לאחר הניתוח (p > 0.05 לעומת פוסט-כירורגיה מזויפת; דו כיוונים חוזרים ונשנים ANOVA, Bonferroni post-hoc). נתונים המבוטאים כממוצע ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע. הרכב הוא תמיסת מלח 0.9% המכילה 0.1% חומצה אסקורבית. התוצאות מבוססות על 14 בעלי חיים בקבוצת המזויפים ו-25 בעלי חיים בקבוצת 6-OHDA. קיצורים: P = presurgery. 2 = שבועיים לאחר הניתוח. 4 = ארבעה שבועות לאחר הניתוח; 6-OHDA = 6-הידרוקסידופאמין; MFB = חבילת מוח קדמית מדיאלית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בהתאם למחקרים קודמים על בעלי חיים עם נגע של 6-OHDA42, ניתוח היסטולוגי (איור 3) המשווה TH של הסטריאטום של שתי ההמיספרות מאפשר הערכה אמינה של הגירעון DA בסטריאטום. לכן, פרוטוקול התנהגותי זה יכול לשמש בשילוב עם שיטות אימונוהיסטוכימיות במחקרים מעורבים מודלים ניסיוניים של PD.

Figure 3
איור 3: תמונות מייצגות של תיוג TH במודל הניסויי של 6-OHDA של PD, כולל סטריאטום קדמי וסובסטנציה ניגרה קומפקטה. התמונה הפנורמית מדגימה את ההרחבה של הנגע, וזום inset מתאר גופים פנימיים e תאים חיסוניים. (A) תמונה של סעיף קורונה striatal מראה פציעה חלקית הנגרמת על ידי 6-OHDA בחצי הכדור הימני. (B) תמונה של סובסטנציה ניגרה ואזור טגמנטלי גחון סעיף קורונל מאותו בעל חיים גם מראה את הרחבת הנגע. (ג) תמונה של סעיף קורונל striatal מראה פציעה המושרה לחלוטין על ידי 6-OHDA בחצי הכדור הימני. (D) תמונה של סובסטנציה ניגרה ואזור טגמנטלי גחוני סעיף קורונל מאותה חיה גם מראה את הרחבת הנגע. סרגל קנה מידה = 1.3 מ"מ בתצוגה פנורמית ו 65 מיקרומטר בזום כניסה. קיצורים: 6-OHDA = 6-הידרוקסידופאמין; TH = טירוזין הידרוקסילאז; PD = מחלת פרקינסון; NL = ללא נגע; L = נגע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול לביצוע ניתוח למיקרו-עירום חד-צדדי של 6-OHDA ב- MFB, המסוגל לגרום לנגעים חזקים בתאי העצב של המסלול הניגרוסטריאטלי וליצור אקנזיה בחיה. כמו כן מתואר הפרוטוקול לביצוע מבחן הצעד, מבחן ישים בקלות ולא פולשני שניתן להשתמש בו כדי להוכיח את הצלחת הנגעים ולהעריך את אקנה קדמי. כפי שהוצג בתוצאות הייצוגיות, בעלי חיים המקבלים 6-OHDA הראו ירידה במספר צעדי ההתאמה בניגוד לפציעה, מה שאומר שבעלי חיים פצועי 6-OHDA מפגינים אקנזיה חזקה משבועיים לאחר ניתוח עירוי. Akinesia - המוקד של מספר טיפולים למחלה - הוא אחד הסימפטומים המוטוריים העיקריים של PD. התפתחות האקנזיה במודל של בעלי חיים היא משמעותית למחקרים פרה-קליניים של PD. יתר על כן, תוצאות אלה דומות לאלה שדווחו על ידי צ'אנג ואח '37, אשר אישר כי בעלי חיים המציגים מספר נמוך יותר של צעדים היה אחוז גבוה יותר של מוות נוירון דופאמין על ידי אימונוהיסטוכימיה. לכן, בעלי חיים שהציגו מספר נמוך יותר של צעדי הסתגלות קונטרה-לטרליים נוטים יותר לפגיעה דופאמין.

הערכה של ההצלחה של הניתוח ואת הנגעים ניתן לאשר גם על ידי בדיקות התנהגותיות אחרות כגון אמפטמין / אפומורפין המושרה סיבוב43, בדיקת נדנדת גוף גבוהה (EBST), בדיקת מסדרון, בדיקת צילינדר, טכניקות תיוג רקמות כגון אימונוהיסטוכימיה TH, או אפילו כימות של דופמין בסטריאטום על ידי HPLC42. מתודולוגיות אחרות נבדלות במינון המוזרק של 6-OHDA ומרווח זמן לאחר ההדבקה להערכה התנהגותית. סקירה עדכנית43 מסכמת את המאמרים האחרונים באמצעות מתודולוגיה זו ואת ההבדל במינון, בדיקות התנהגותיות, ומרווח לאחר הלידה ביניהם. המודל של PD המושרה על ידי 6-OHDA אינו מחקה את כל התהליכים הפתולוגיים הקשורים למחלה, כגון הצטברות של גופים Lewy, אבל מדמה את מותו של נוירונים דופאמין של המסלול striatal-nigral. זה מאפשר לחקור טיפולים חדשים לסימפטומים של המחלה, אשר יכול להוביל לשיפור באיכות החיים של חולים מושפעים ממחלה זו.

למרות היותו הדגם הנפוץ ביותר, לדגם 6-OHDA יש מגבלות כמו לכל דגמי ה-PD הנוכחיים. למודל יש את החיסרון של אי ייצוג מלא של המנגנונים המולקולריים המעורבים בפתולוגיה של המחלה, כגון הצטברות של חלבוני אלפא-סינוקלאין ויצירת גופי לוי. המודל מדמה את מותו של נוירונים דופאמין של המסלול nigrostriatal, המתאים לשלב מאוחר של המחלה ומוביל להתפרצות של סימפטומים מוטוריים בלבד. זה עושה את זה לא מתאים ללמוד את ההתפתחות הטבעית שלה 15,32. מודל 6-OHDA המתואר במאמר זה מאופיין בדרך כלל בשיעורי תמותה נמוכים. התאוששות לאחר ההחלמה היא חיונית כדי למנוע שיעורי תמותה גבוהים בשל האיחוד של הליך פולשני ואת הנגע הנוירודגנרטיבי 444. ניתן להפחית את התמותה על ידי לקיחת טיפול נוסף במהלך תקופת ההחלמה שלאחר ההחלמה עם תוספי תזונה, rehydration, ובקרת טמפרטורה חיצונית45. השילוב של צעדים כאלה הוכח להפחית או אפילו לחסל את שיעור התמותה באופן דרסטי 30,46. סיבת המוות הנפוצה היא החדרת המחט בקואורדינטות הלא נכונות במוח. חשוב לבדוק בקפידה את הקואורדינטות במהלך הליך כירורגי עדין זה. זה ימנע נזק למבנים מוחיים אחרים (למשל, ההיפותלמוס) על ידי המחט, אשר יכול לפגוע בפעולות האכילה והשתייה של החיה, מה שמוביל לתת תזונה והתייבשות47.

לבסוף, זה חיוני כדי להדגיש כי למרות פרוטוקול הרדמה קטמין-קסילזין מבוסס היטב בשימוש בניסויים מכרסמים48, כמה ראיות עולה כי השילוב של הרדמה אלה עשוי להיות מספיק לתקופה ממושכת של ניתוח. בנוסף, קטמין-קסילזין רגישות עשוי להשתנות בהתאם זנים שונים של עכברים וחולדות49,50. חלופה עשויה להיות כדי לגרום להרדמה על ידי שאיפת איזופלוריין. מחקר אחד הדגים אובדן מהיר יותר של רפלקס התיקון עם הרדמה הנגרמת איזופלוריין מאשר עם קטמין-קסילזין. יתר על כן, 60% מהעכברושים מרדימים עם קטמין-קסילזין הציגו רפלקסים רצופים של צביטת בוהן במהלך ההליך הכירורגי, אפילו עם תוספי מינון. לעומת זאת, בעלי חיים מורדמים עם איזופלוריין הציגו מקרים בודדים של רפלקסים צביטת זנב שנעלמו לאחר התאמת נפח51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP, מענק 2017/00003-0). אנו מודים על התיאום לשיפור אנשי ההשכלה הגבוהה (CAPES). אנו מודים לד"ר אנתוני ר. ווסט, ד"ר היינץ שטיינר וד"ר קואי י. טסנג על התמיכה והחונכות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OHDA Sigma Aldrich H4381 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel
_6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid Sigma Aldrich 795437 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid=
Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD
RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09
_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO
6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL Hamilton 80539 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine Alfa Aeser J63723 https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump Insight EFF-311 https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino) Ourofino https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic Zoetis https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus Insight EFF-331 https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibb, W. R., Lees, A. J. The relevance of the Lewy body to the pathogenesis of idiopathic Parkinson's disease. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 51 (6), 745-752 (1988).
  2. Albin, R. L., Young, A. B., Penney, J. B. The functional anatomy of basal ganglia disorders. Trends in Neurosciences. 12 (10), 366-375 (1989).
  3. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology & Medicine. 62, 132-144 (2013).
  4. Obeso, J. A., et al. Functional organization of the basal ganglia: therapeutic implications for Parkinson's disease. Movement Disorders. 23, Suppl 3 548-559 (2008).
  5. Tysnes, O. -B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. Journal of Neural Transmission. 124 (8), 901-905 (2017).
  6. Karachi, C., et al. Clinical and anatomical predictors for freezing of gait and falls after subthalamic deep brain stimulation in Parkinson's disease patients. Parkinsonism & Related Disorders. 62, 91-97 (2019).
  7. Sudhakar, V., Richardson, R. M. Gene therapy for Parkinson's disease. Progress in Neurological Surgery. 33, 253-264 (2018).
  8. Baizabal-Carvallo, J. F., et al. Combined pallidal and subthalamic nucleus deep brain stimulation in secondary dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 19 (5), 566-568 (2013).
  9. Morizane, A. Cell therapy for Parkinson's disease with induced pluripotent stem cells. Clinical Neurology. 59 (3), 119-124 (2019).
  10. Jankovic, J., Tan, E. K. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 91 (8), 795-808 (2020).
  11. Cenci, M. A., Whishaw, I. Q., Schallert, T. Animal models of neurological deficits: how relevant is the rat. Nature Reviws. Neuroscience. 3 (7), 574-579 (2002).
  12. Tronci, E., Francardo, V. Animal models of l-DOPA-induced dyskinesia: the 6-OHDA-lesioned rat and mouse. Journal of Neural Transmission. 125 (8), 1137-1144 (2018).
  13. Lane, E., Dunnett, S. Animal models of Parkinson's disease and L-dopa induced dyskinesia: How close are we to the clinic. Psychopharmacology. 199 (3), 303-312 (2008).
  14. Meredith, G. E., Sonsalla, P. K., Chesselet, M. -F. Animal models of Parkinson's disease progression. Acta Neuropathologica. 115 (4), 385-398 (2008).
  15. Kin, K., Yasuhara, T., Kameda, M., Date, I. Animal models for Parkinson's disease research: trends in the 2000s. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5402 (2019).
  16. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell and Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
  17. Smith, G. A., Isacson, O., Dunnett, S. B. The search for genetic mouse models of prodromal Parkinson's disease. Experimental Neurology. 237 (2), 267-273 (2012).
  18. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219 (4587), 979-980 (1983).
  19. Langston, J. W., Irwin, I., Langston, E. B., Forno, L. S. 1-Methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+): identification of a metabolite of MPTP, a toxin selective to the substantia nigra. Neuroscience Letters. 48 (1), 87-92 (1984).
  20. Ramsay, R. R., Salach, J. I., Singer, T. P. Uptake of the neurotoxin 1-methyl-4-phenylpyridine (MPP+) by mitochondria and its relation to the inhibition of the mitochondrial oxidation of NAD+-linked substrates by MPP+. Biochemical and Biophysical Research Communications. 134 (2), 743-748 (1986).
  21. Ungerstedt, U. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. European Journal of Pharmacology. 5 (1), 107-110 (1968).
  22. Blandini, F., Armentero, M. -T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
  23. McDowell, K., Chesselet, M. -F. Animal models of the non-motor features of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 46 (3), 597-606 (2012).
  24. Luthman, J., Fredriksson, A., Sundström, E., Jonsson, G., Archer, T. Selective lesion of central dopamine or noradrenaline neuron systems in the neonatal rat: motor behavior and monoamine alterations at adult stage. Behavioural Brain Research. 33 (3), 267-277 (1989).
  25. Casarrubea, M., et al. Effects of Substantia Nigra pars compacta lesion on the behavioral sequencing in the 6-OHDA model of Parkinson's disease. Behavioural Brain Research. 362, 28-35 (2019).
  26. Wang, R., Shao, M. L-DOPA-elicited abnormal involuntary movements in the rats damaged severely in substantia nigra by 6-hydroxydopamine. Annals of Palliative Medicine. 9 (3), 947-956 (2020).
  27. Hernandez-Baltazar, D., Mendoza-Garrido, M. E., Martinez-Fong, D. Activation of GSK-3β and caspase-3 occurs in Nigral dopamine neurons during the development of apoptosis activated by a striatal injection of 6-hydroxydopamine. PLoS One. 8 (8), 70951 (2013).
  28. Bagga, V., Dunnett, S. B., Fricker, R. A. The 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease - Terminal striatal lesions provide a superior measure of neuronal loss and replacement than median forebrain bundle lesions. Behavioural Brain Research. 288, 107-117 (2015).
  29. Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behavioural Brain Research. 162 (1), 1-10 (2005).
  30. Boix, J., Padel, T., Paul, G. A partial lesion model of Parkinson's disease in mice - Characterization of a 6-OHDA-induced medial forebrain bundle lesion. Behavioural Brain Research. 284, 196-206 (2015).
  31. Blesa, J., Phani, S., Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Classic and new animal models of Parkinson's disease. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 845618 (2012).
  32. Breit, S., et al. Effects of 6-hydroxydopamine-induced severe or partial lesion of the nigrostriatal pathway on the neuronal activity of pallido-subthalamic network in the rat. Experimental Neurology. 205 (1), 36-47 (2007).
  33. More, S. V., Kumar, H., Cho, D. -Y., Yun, Y. -S., Choi, D. -K. Toxin-induced experimental models of learning and memory impairment. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1447 (2016).
  34. Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. The unilateral 6-hydroxydopamine lesion model in behavioral brain research. Analysis of functional deficits, recovery and treatments. Progress in Neurobiology. 50 (2-3), 275-331 (1996).
  35. Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Björklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15 (5), 3863-3875 (1995).
  36. Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The 'motor complication syndrome' in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with l-DOPA: Relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
  37. Björklund, A., Dunnett, S. B. The amphetamine induced rotation test: A re-assessment of its use as a tool to monitor motor impairment and functional recovery in rodent models of Parkinson's disease. Journal of Parkinson's Disease. 9 (1), 17-29 (2019).
  38. Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease: studies on medial forebrain bundle and striatal lesions. Neuroscience. 88 (2), 617-628 (1999).
  39. Jayasinghe, V. R., Flores-Barrera, E., West, A. R., Tseng, K. Y. Frequency-dependent corticostriatal disinhibition resulting from chronic dopamine depletion: role of local striatal cGMP and GABA-AR signaling. Cerebral Cortex. 27 (1), 625-634 (2017).
  40. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
  41. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2006).
  42. Padovan-Neto, F. E., et al. Selective regulation of 5-HT1B serotonin receptor expression in the striatum by dopamine depletion and repeated L-DOPA treatment: relationship to L-DOPA-induced dyskinesias. Molecular Neurobiology. 57 (2), 736-751 (2020).
  43. Prasad, E. M., Hung, S. -Y. Behavioral tests in neurotoxin-induced aAnimal models of Parkinson's disease. Antioxidants. 9 (10), Basel, Switzerland. 1007 (2020).
  44. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: Relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 16 (1), 110-123 (2004).
  45. Masini, D., et al. A guide to the generation of a 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease for the study of non-motor symptoms. Biomedicines. 9 (6), 598 (2021).
  46. Francardo, V., et al. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 42 (3), 327-340 (2011).
  47. Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
  48. Fish, R., Danneman, P., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , Academic Press. (2008).
  49. Buitrago, S., Martin, T. E., Tetens-Woodring, J., Belicha-Villanueva, A., Wilding, G. E. Safety and efficacy of various combinations of injectable anesthetics in BALB/c mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 47 (1), 11-17 (2008).
  50. Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 50 (3), 344-348 (2011).
  51. Jiron, J. M., et al. Comparison of isoflurane, ketamine-dexmedetomidine, and ketamine-xylazine for general anesthesia during oral procedures in rice rats (Oryzomys palustris). Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 58 (1), 40-49 (2019).

Tags

מדעי המוח גיליון 176
מודל עכברוש 6-הידרוקסידופמין של מחלת פרקינסון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guimarães, R. P., Ribeiro, D.… More

Guimarães, R. P., Ribeiro, D. L., dos Santos, K. B., Godoy, L. D., Corrêa, M. R., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62923, doi:10.3791/62923 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter