帕金森病的6-羟基多巴胺大鼠模型

摘要

6-羟基多巴胺（6-OHDA）模型已被使用数十年，以促进对帕金森病的理解。在本方案中，我们演示如何通过在内侧前脑束注射6-OHDA，在大鼠中建立单侧黑质纹状体损伤，评估运动功能缺陷，并利用步态测试预测损伤程度。

摘要

帕金森病（PD）的运动症状——运动迟缓、运动减少和静止性震颤——是由于黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元发生神经退行性变以及纹状体多巴胺缺乏所致。动物模型已被广泛用于在实验室中模拟人类病理过程。啮齿类动物是研究帕金森病最常用的动物模型，因其易于操作和饲养。此外，帕金森病在啮齿类动物与人类中的解剖结构以及分子、细胞和药理学机制具有相似性。将神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA）注入大鼠内侧前脑束（MFB），可导致多巴胺能神经元严重破坏，并模拟帕金森病的症状。本实验方案演示了如何在帕金森病大鼠模型中进行MFB单侧微量注射6-OHDA，并通过步态测试展示6-OHDA诱导的运动功能障碍及预测的多巴胺能损伤。6-OHDA会导致对侧前肢行走步数显著减少。

引言

帕金森病（PD）的主要神经病理学特征是黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元的慢性进行性变性，以及含有α-突触核蛋白的路易小体的存在¹。由于SNc的多巴胺能神经元通过黑质纹状体通路将其轴突投射至纹状体，SNc神经元的变性导致纹状体中多巴胺能功能缺陷²。纹状体中多巴胺的缺失引起直接和间接运动控制通路活动的失衡，这是PD主要运动症状的原因：运动减少（动作缓慢）、运动迟缓（启动运动困难）、肌肉僵硬以及静止性震颤^3,4,5。

由于帕金森病（PD）发病所涉及的分子和生理机制尚未完全阐明，目前主要的治疗方法旨在通过药物治疗、深部脑刺激^6,7、基因治疗⁸和细胞移植⁹来缓解运动症状。因此，临床前研究对于阐明PD发病机制、发现早期诊断的新方法以及开发能够预防或阻止受累神经元退变的新疗法至关重要¹⁰。

动物模....

方案

所有涉及动物的实验程序均遵循国家动物实验控制委员会（CONCEA）的伦理原则和Arouca法案（第11.794/2008号法律），并经当地伦理委员会（CEUA-FFCLRP/USP（18.5.35.59.5））批准。

1. 药物的制备

1. 氯胺酮/赛拉嗪麻醉
   注意：所用氯胺酮剂量为 70 mg/kg，赛拉嗪剂量为 10 mg/kg。
   1. 配制 1 mL 麻醉剂时，使用浓度为 100 mg/mL 的氯胺酮溶液和浓度为 20 mg/mL 的赛拉嗪溶液，取 0.35 mL 氯胺酮溶液、0.25 mL 赛拉嗪溶液以及 0.4 mL 0.9% 无菌生理盐水溶液混合。以最终给药体积 2 mL/kg 进行注射。
      注意：氯胺酮联合赛拉嗪可产生持续 60–80 分钟的镇静作用。若动物仍存在反射（例如后肢屈曲和/或眨眼反射），可追加单次剂量的 10%。
2. 丙咪嗪
   注意：所用丙咪嗪的单次剂量为 20 mg/kg。
   1. 配制 1 mL 浓度为 20 mg/mL 的丙咪嗪溶液时，将 20 mg 丙咪嗪与 1 mL 0.9% 无菌生理盐水溶液混合。以最终给药体积 1 mL/kg 进行注射。
3. 美洛昔康
   注意：所用美洛昔康的单次剂量为 1 mg/kg。
   ....

结果

多巴胺能损伤评估
步进测试可用于评估损伤对侧前肢的运动减少症，并筛选出可能因6-OHDA灌注导致黑质纹状体通路损伤的动物图1). 对术前及术后2周和4周对侧前肢步态测试表现的比较显示存在交互作用（F_2,74 = 93.63；p < 0.0001；时间（术前、术后2周和4周）与处理方式（假手术组和6-OHDA损毁组）之间的双向重复测量方差分析。Bonferroni法 事后 检测显示，与假手术组动物相比，右侧内侧前脑束注射6-OHDA的动物在术后第二周和第四周时，病变对侧步数显著减少（p < 0.05）。 < 0.0001) (图1。结果与以往研究的结果一致³⁵.

需要注意的是，当多巴胺能损伤不完全时，步态测试的结果将无法达到本研究中所展示结果的成功程度。先前已发表的一项研究对动物进行6-OHDA微量注射手术后造成部分多巴胺能损.......

讨论

本文介绍了一种在内侧前脑束（MFB）中进行单侧微量注射6-OHDA以实施手术的实验方案，该方法可有效损毁黑质纹状体通路中的神经元，并在动物体内诱导运动不能（akinesia）。同时描述了步态测试（stepping test）的操作流程，该测试简便易行、无创，可用于验证损毁效果并评估动物前肢的运动不能情况。如代表性结果所示，接受6-OHDA注射的动物在损伤对侧的调节步数显著减少，表明在注射手术两周后，6-OHDA损伤动物已表现出明显的运动不能。运动不能作为帕金森病（PD）多种治疗手段的主要靶点，是该病的主要运动症状之一。在动物模型中成功诱导运动不能对于帕金森病的临床前研究具有重要意义。此外，本实验结果与Chang等³⁷报道的结果相似，后者通过免疫组织化学证实，调节步数较少的动物其多巴胺能神经元死亡比例更高。因此，对侧调节步数减少的动物更可能存在多巴胺能神经损伤。

手术成功与否及病灶情况还可通过其他行为学测试进行验证，例如安非他明/阿扑吗啡诱导的旋转实验⁴³、抬高体位摆动测试（EBST）、走.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-羟基多巴胺（6-OHDA）	Sigma Aldrich	H4381	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt®ion=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1
70% 乙醇
抗坏血酸	Sigma Aldrich	795437	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt®ion=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB
棉
钻孔或攻丝工具
纱布
50 µL Hamilton 注射器	Hamilton	80539	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
丙咪嗪	Alfa Aeser	J63723	https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
输液泵	Insight	EFF-311	https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
氯胺酮（Dopalen）	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
脱毛机
美洛昔康（Maxicam 2%  Ourofino）	Ourofino		https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
金属废弃物容器
纸巾
五联抗生素	Zoetis		https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
塑料废弃物垃圾桶
多联抗生素	Pentabiotic (Wealth)
聚维酮碘
手术刀及刀片
剪刀
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立体定位仪	Insight	EFF-331	https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
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棉签
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计时器
镊子
赛拉嗪（Anasedan）	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN