Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

6-гидроксидофаминовая крысиная модель болезни Паркинсона

14K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62923

⸱

27 октября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo

В этой статье

Краткое содержание

Модель 6-гидроксидотамина (6-OHDA) использовалась в течение десятилетий для продвижения понимания болезни Паркинсона. В этом протоколе мы демонстрируем, как выполнять односторонние нигростриатальные поражения у крыс путем введения 6-OHDA в медиальный пучок переднего мозга, оценивать двигательный дефицит и прогнозировать поражения с помощью степпинг-теста.

Аннотация

Двигательные симптомы болезни Паркинсона (БП) — брадикинезия, акинезия и тремор в состоянии покоя — являются последствиями нейродегенерации дофаминергических нейронов в черной субстанции pars compacta (SNc) и дофаминергического стриатального дефицита. Животные модели широко используются для моделирования патологии человека в лаборатории. Грызуны являются наиболее используемыми животными моделями для PD из-за их простоты обращения и обслуживания. Более того, анатомия и молекулярные, клеточные и фармакологические механизмы БП схожи у грызунов и человека. Инфузия нейротоксина, 6-гидроксидофамина (6-OHDA), в медиальный пучок переднего мозга (MFB) крыс воспроизводит тяжелое разрушение дофаминергических нейронов и имитирует симптомы БП. Этот протокол демонстрирует, как выполнить одностороннюю микроинъекцию 6-OHDA в MFB на крысиной модели PD и показывает двигательный дефицит, индуцированный 6-OHDA и прогнозируемыми дофаминергическими поражениями через ступенчатый тест. 6-OHDA вызывает значительное ухудшение количества шагов, выполняемых с контралатеральной передней конечностью.

Введение

Основными нейропатологическими характеристиками БП являются хроническая прогрессирующая нейродегенерация дофаминергических нейронов в черной субстанции pars compacta (SNc) и наличие телец Леви, содержащих α-синуклеиновый белок1. Поскольку дофаминергические нейроны SNc проецируют свои аксоны в полосатое тело через нигростриатальный путь, нейродегенерация нейронов в SNc приводит к дофаминергическому дефициту в полосатом теле2. Отсутствие дофамина в полосатом теле вызывает дисбаланс в деятельности прямых и непрямых двигательных контрольных путей, что отвечает за основные двигательные симптомы БП: акинезию (медленное движение), брадикинезию (затруднение стартовых движений), жесткость мышц, тремор в состоянии покоя3,4,5.

Поскольку молекулярные и физиологические механизмы, участвующие в возникновении БП, все еще не полностью поняты, в настоящее время доступные основные методы лечения направлены на облегчение двигательных симптомов с помощью фармакотерапии, глубокой стимуляции мозга6,7, генетической терапии8 и трансплантации клеток9. Таким образом, доклинические исследования имеют основополагающее значение для выяснения механизмов, участвующих в возникновении БП, и открытия новых методологий ранней диагностики и новых методов лечения для предотвращения или остановки дегенерации нейронов, пораженных PD10.

Животные модели широко использовались для моделирования патологии человека в лаборатории, способствуя развитию медицины и науки11,12,13,14. Тем не менее, важно подчеркнуть, что правильный выбор животной модели имеет основополагающее значение для успеха исследования. Поэтому животная модель должна быть валидирована в трех основных аспектах: i) валидность лица, при которой животная модель должна обладать характеристиками патологии человека; ii) конструктивная обоснованность, при которой животная модель должна иметь прочную теоретическую основу; и iii) прогностическая валидность, при которой животные модели должны реагировать на лечение аналогично клиническому лечению.

В настоящее время несколько животных используются в качестве животных моделей для БП. Основные группы включают млекопитающих, таких как грызуны, приматы, минипиги, собаки и кошки, а также другие группы, такие как дрозофилы и рыбки данио. Грызуны являются наиболее классической моделью животных для БП и наиболее используемой из-за их простоты обращения и обслуживания. Кроме того, анатомия и молекулярные, клеточные и фармакологические механизмы БП схожи у грызунов и человека15.

В обзоре, опубликованном Кином и его коллегами в 2019 году, были проанализированы основные методологии моделирования животных, используемые для БП в 2000-х годах, и было обнаружено, что наиболее используемая животная модель включала нейротоксины, такие как 6-гидроксидофамин (6-OHDA) и 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP). Оба нейротоксина вызывают митохондриальную дисрегуляцию в дофаминергических нейронах в нигростриатальном пути, что приводит к гибели клеток16. Другая широко используемая модель включает генетические манипуляции посредством мутации в определенных генах, участвующих в возникновении БП, вызывая митохондриальную дисрегуляцию17. Модели нейротоксинов обычно используются для оценки и сравнения терапевтических средств, тогда как генетические модели используются для изучения разработки профилактической терапии и идиопатического PD15.

Нейротоксин MPTP был обнаружен вызывающим паркинсонизм в середине 1980-х годов после того, как семь пациентов использовали вещество и проявляли тяжелые симптомы БП. В дополнение к симптомам, пациенты ответили на лечение L-DOPA, что заставило исследователей связать молекулу непосредственно с БП. После того, как случай был опубликован в 1986 году, несколько исследователей начали использовать MPTP в доклинических исследованиях PD18. Исследователи обнаружили, что, будучи липофильной молекулой, MPTP может пересекать гематоэнцефалический барьер (BBB) и преобразовываться в MPP + 19. Это токсичное вещество накапливается внутри нейронов и вызывает повреждение комплекса 1 митохондриальной дыхательной цепи, что приводит к гибели дофаминергических нейронов20.

Модель нейротоксина 6-OHDA была впервые использована для индуцирования дегенерации моноаминовых нейронов нигростриатального пути в 196821 году. Модель 6-OHDA обычно используется для вызова нейродегенерации в нигростриатальном пути, поскольку она является аналогом дофамина и токсична для клеток, содержащих катехоламин. После того, как 6-OHDA попадает в мозг, он может быть поглощен транспортером дофамина (DAT) в дофаминергических нейронах, что приводит к дегенерации нигростриатального пути22. Поскольку 6-OHDA не проникает в ГЭБ, его необходимо вводить непосредственно через внутримозговую стереотаксическую инъекцию23. Ингибитор обратного захвата норадреналина часто сочетают с микроинъекцией 6-OHDA для сохранения норадренергических волокон и обеспечения более селективной дегенерации дофаминергических нейронов24.

После того, как DAT поглощает 6-OHDA, он будет накапливаться в цитозоле нейронов, производя активные формы кислорода (АФК) и приводя к гибели клеток15. Часто используются три различные модели поражений 6-OHDA: i) поражения SNc25,26; ii) поражения полосатого тела27,28; iii) поражения MFB29,30. Поражения, вызванные в полосатом теле, приводят к медленной и ретроградной дегенерации дофаминергических нейронов в SNpc. Напротив, поражения, вызванные SNpc и MFB, приводят к быстрой и полной дегенерации нейронов, что приводит к более продвинутым симптомам паркинсонизма31.

Односторонняя или двусторонняя инъекция 6-OHDA может вызвать нейродегенерацию в дофаминергических нейронах. 6-OHDA не всегда вызывает серьезные повреждения нейронов; иногда инъекция приводит к частичному повреждению, которое также используется для моделирования ранних стадий PD32. Односторонняя инъекция чаще используется из-за способности модели оценивать двигательный дефицит животного и прогнозировать потерю клеток с помощью таких тестов, как вращение, вызванное амфетамином / апоморфином, и ступенчатый тест29. Двусторонние инъекции чаще всего используются для оценки пространственной памяти и распознавания33.

Тест вращения, индуцированный амфетамином / апоморфином, является поведенческим тестом, обычно используемым для прогнозирования потери клеток в нигростриатальном пути. Он определяется как процесс, при котором повторное введение агонистов дофамина приводит к интенсификации ротационного поведения у 6-OHDA-пораженных животных34. Ротационное поведение состоит из количественной оценки индуцированного амфетамином ипсилатерального вращения или контралатеральных поворотов, вызванных апоморфином, у односторонне пораженных грызунов. Вызванное наркотиками ротационное поведение подверглось критике, потому что ротация не соответствует симптомам БП у людей и может зависеть от таких переменных, как толерантность, сенсибилизация и «прайминг»35.

Прайминг является одним из наиболее важных факторов в этих поведенческих тестах. Сообщалось о некоторых случаях, когда однократная доза L-DOPA приводила к сбою в ротационном поведении36. Кроме того, еще одним критическим фактором, связанным с комбинированным применением теста, индуцированного амфетамином, и теста, индуцированного апоморфином, для параллельного использования является то, что они измеряют различные конечные точки из-за различных механизмов действия, отражающих инактивацию различных сигнальных механизмов и путей. Кроме того, тест, индуцированный амфетамином, более точен для измерения нигростриатальных поражений выше 50-60%, тогда как тест, индуцированный апоморфином, более точен для поражений выше 80% 37.

Степпинг-тест появился как поведенческий тест, который указывает на дефицит, связанный с дегенерацией дофаминергических нейронов и терапевтическими эффектами. Это позволяет анализировать акинезию, вызванную поражением 6-OHDA в дофаминергических нейронах без процедуры, вызванной лекарственными средствами. Кроме того, тест был хорошо известен и широко используется с 1995 года, когда он был впервые описан Olsson et al.35. В 1999 году Chang et al.38 также проанализировали и сравнили производительность крыс в ступенчатом тесте с уровнем дегенерации, вызванной 6-OHDA, и обнаружили, что животные, которые показали худшие результаты в ступенчатом тесте, также имели более значительную дегенерацию дофаминергических нейронов.

Степпинг-тест является отличным методом для прогнозирования тяжелого дофаминергического нигростриатального повреждения у крыс с поражением 6 OHDA. Данные свидетельствуют о том, что двигательный дефицит появляется в контралатеральной передней части инфузии 6-OHDA во время степпинг-теста, когда степень дофаминергической потери в SNc составляет >90%39. В этой статье описываются протоколы, методологии и материалы, используемые для выполнения стереотаксической хирургии для односторонней инфузии 6-OHDA в MFB крыс, и как предсказать дофаминергические поражения, вызванные токсином, с помощью ступенчатого теста.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с участием животных соответствовали этическим принципам Национального совета по контролю за экспериментами на животных (CONCEA) и Закону Аруки (Закон 11.794/2008) и были одобрены местным комитетом по этике (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5).

1. Приготовление лекарственных препаратов

  1. Анестезия кетамином/ксилазином
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доза используемого кетамина составляет 70 мг/кг, а доза ксилазина – 10 мг/кг.
    1. Для приготовления 1 мл анестетика с использованием раствора кетамина 100 мг/мл и раствора ксилазина 20 мг/мл соединяют 0,35 мл раствора кетамина, 0,25 мл раствора ксилазина и 0,4 мл 0,9% стерильного физиологического раствора. Вводят раствор анестетика в конечном объеме 2 мл/кг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кетамин вместе с ксилазином может производить седацию в течение 60-80 мин. Если у животного все еще есть рефлексы (например, качка задней ноги и / или рефлекс моргания), введите дополнительно 10% от индивидуальной дозы.
  2. Имипрамин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальная доза используемого имипрамина составляет 20 мг/кг.
    1. Для приготовления 1 мл раствора имипрамина 20 мг/мл соедините 20 мг имипрамина и 1 мл 0,9% стерильного физиологического раствора. Вводят раствор имипрамина в конечном объеме 1 мл/кг.
  3. Мелоксикам
    ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальная доза используемого мелоксикама составляет 1 мг/кг.
    1. Для приготовления 1 мл мелоксикама 1 мг/мл раствора соединяют 0,05 мл мелоксикама 2% и 0,95 мл 0,9% стерильного физиологического раствора. Вводят раствор мелоксикама в конечном объеме 1 мл/кг один раз в день в течение двух дней.
  4. Аскорбиновая кислота 0,1%
    1. Для приготовления 1 мл 0,1% аскорбиновой кислоты смешайте 1 мг аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,9% стерильного физиологического раствора.
  5. 6-гидроксидофамин (6-OHDA)
    ПРИМЕЧАНИЕ: 6-OHDA является нейротоксином, используемым для селективного разрушения дофаминергических и норадренергических нейронов в головном мозге. Избегайте прямого контакта с кожей и слизистыми оболочками глаз, носа и рта. При работе с 6-OHDA надевайте двойные нитриловые перчатки, лабораторное пальто, одноразовый халат, защиту глаз и хирургическую маску или лицевой щиток. Общий объем инфузии токсина составляет 4 мкл / животное, а индивидуальное количество составляет 10 мкг 6-OHDA / животное.
    1. Для приготовления 1 мл 6-OHDA в конечной концентрации 2,5 мг/мл смешивают 2,5 мг 6-OHDA и 1 мл 0,9% физиологического раствора, содержащего 0,1% аскорбиновой кислоты (описано выше).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 6-OHDA светочувствительна и разлагается быстрее при воздействии яркого света. Он должен быть правильно обработан и храниться в среде, защищенной от света. Если цвет раствора красноватый, выбросьте его.
  6. Лидокаина гидрохлорид (2%)
    1. Готовят 2% раствор лидокаина для местного применения животному.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная доза, которая может быть применена, составляет 7 мг/кг.
  7. Полиантиотическая суспензия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полиантиотическая суспензия со стрептомицинами и пенициллинами (см. Таблицу материалов) должна быть приготовлена в момент применения со всем объемом разбавителя, ампула которого сопровождает флакон с порошком.
    1. Снимите металлический диск на резиновой пробке. Продезинфицируйте резиновую пробку спиртом.
    2. С помощью шприца с иглой 23 г вводят разбавитель во флакон. Извлеките иглу и энергично встряхните флакон до тех пор, пока суспензия полностью не гомогенизируется. Введите немного воздуха во флакон и выведите нужный объем суспензии.
    3. Введите глубокую внутримышечную инъекцию, потянув плунжер перед инъекцией препарата, чтобы убедиться, что кровеносный сосуд не достигнут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем применяемой суспензии составляет 0,5 мл/кг.

2. Подготовка материалов

ПРИМЕЧАНИЕ: При обращении с химическими веществами всегда следуйте инструкциям, прилагаемым к паспорту безопасности материала.

  1. Стереотаксические аппараты
    1. Поместите стереотаксическое устройство на устойчивую и чистую скамейку с надлежащим освещением для выполнения операции. Продезинфицируйте аппарат 70% этанолом.
    2. Проверьте, правильно ли выровнены ушные и резцовые стержни устройства. Поместите термоодеяло, куда животное будет помещено во время операции, чтобы оставаться в тепле во время процедуры. Контролируйте температуру животного с помощью точного ректального зонда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Термоодеяло должно быть при температуре 37,5 °C, чтобы животное поддерживало температуру тела 37 °C.
  2. Микроинфузионная система
    1. Заполните (70-80%) шприц Гамильтона (50 мкл или по желанию), прикрепленный к медицинской полиэтиленовой микротюбинке и игле, двойной дистиллированной водой (ddH2O) и проверьте утечки через систему.
    2. Протяните воздух через систему так, чтобы один воздушный пузырь отделял ddH2O в шприце от раствора 6-OHDA в микротрубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура позволяет избежать загрязнения шприца Гамильтона 6-OHDA и позволяет использовать несколько крыс в один и тот же экспериментальный день.
    3. Расположите шприц Гамильтона на инфузионном насосе так, чтобы он был прочно прикреплен, а плунжер шприца был параллельен раме, которая будет двигаться, чтобы толкнуть его. Установите инфузионный насос на скорость 0,5 мкл/мин таким образом, чтобы общее применение 4 мкл 6-OHDA продолжалось в течение 8 мин. Протестируйте инфузионную систему, подтвердив, что нет утечек и что инфузия происходит в соответствии с ранее установленным временем и объемом.
    4. Прикрепите иглу инфузии, прикрепленную к микротрубке, к аппарату на конце стереотаксического плеча и проверьте, что игла расположена под углом 180° к поверхности. Убедитесь, что игла прямая и не изогнута.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно проверьте все описанные процедуры, потому что, если какой-либо из элементов в инфузионной системе не работает правильно, это может поставить под угрозу успех операции.
  3. Шов
    1. Используйте стерильный нейлоновый нерассасывающийся шов с круглой иглой 3/8 для зашивания разреза после операции.
  4. Место послеоперационного восстановления
    1. Поместите чистую и стерилизованную коробку, где животные могут контролироваться до полного восстановления (реагируя на прикосновения и манипуляции). Положите термоодеяло в коробку для терморегуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку терморегуляция важна, включите дополнительный источник тепла для поддержания температуры тела, если это необходимо.

3. Хирургическая процедура

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе взрослые самцы крыс Sprague-Dawley (200-250 г) содержались в контролируемых условиях температуры (22 ± 2 °C), воздухообмена (15-20 обменов в час) и светло-темных циклов (12 ч /12 ч), сгруппированных в ящики с 3 или 4 животными, со свободным доступом к пище и воде.

  1. Взвешивайте животных, чтобы контролировать изменения веса в дни после операции. Рассчитайте дозу препаратов, подлежащих введению.
  2. Вводят имипрамин внутрибрюшинно за 30 мин до операции (~10-15 мин перед введением анестезии), используя иглу 27 г и шприц 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имипрамин блокирует транспортер норадреналина (NAT) и предотвращает поглощение 6-OHDA норадренергическими нейронами, делая поражение более селективным к дофаминергическим нейронам40.
  3. После 10-15 мин введения имипрамина вводят внутрибрюшинную кетамин/ксилазиновую анестезию с помощью иглы 27 г и шприца 1 мл. Подождите, пока животное полностью обезболивается. Убедитесь, что животное находится под глубокой анестезией, когда животное не реагирует на защемление задней ноги и не проявляет рефлекс моргания.
  4. Побрейте шерсть крысы в области головы, где будет происходить разрез.
  5. Поместите крысу в стереотаксический аппарат.
    1. Расположите головку над резцовым стержнем и закрепите планку на 3,3 мм ниже межуровневой линии.
    2. Расположите ушные вкладыши по одной стороне за раз. Расположите резцовый стержень и ушные вкладыши так, чтобы верхняя часть черепа была прямой и параллельной поверхности.
    3. Отрегулируйте носовой зажим и проверьте, что голова твердая и не двигается ни в одну сторону.
  6. Нанесите стерильную офтальмологическую мазь на глаза крысы, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
  7. Нанесите повидон-йод на область, подлежащую надрезу, для дезинфекции участка.
  8. Применяют местный лидокаин для обезболивания области разреза; не превышают 7 мг/кг.
  9. Вводят мелоксикам подкожно, используя иглу 27 г и шприц 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мелоксикам является нестероидным противовоспалительным анальгетиком, который поможет животному восстановиться после операции.
  10. Вводят полиантиотическую суспензию внутримышечно, используя иглу 23 г и шприц 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полиантиотическая суспензия вводится в качестве профилактического лечения, чтобы избежать возможных бактериальных инфекций при послеоперационном восстановлении.
  11. Проверьте, что животное находится в состоянии глубокой анестезии, проверив рефлексы моргания или рефлексы задних конечностей, зажав заднюю лапу пинцетом.
  12. Скальпелем сделайте разрез ~1,5 см в той области, где произойдет микроинъекция.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные методы применяются с этой точки до закрытия раны.
  13. Очистите область черепа ватными тампонами и ватными палочками, пока не будут видны Брегма и Лямбда. Отметьте Брегму и Лямбду стерилизованной тонкой ручкой.
  14. Убедитесь, что координаты дорсально-вентральной (DV) Брегмы и Лямбды схожи. Если они разные, перенастройте крысу в стереотаксическом аппарате, так как голова крысы неправильно расположена.
  15. Запишите переднезадние (AP) и медиолатеральные (ML) координаты Брегмы.
  16. Двигайтесь к координатам AP и ML правого MFB согласно 41: AP: -4,3 мм, ML: 1,6 мм от Bregma.
  17. Отметьте область трепанации стерилизованной тонкой ручкой.
  18. С помощью стерилизованного сверла медленно проткните череп животного, следя за тем, чтобы не травмировать твердую мозговую оболочку.
  19. Поместите микроинъекционную иглу на твердой мозговой оболочке и запишите координаты DV. Возьмите тонкую иглу и аккуратно разорвите твердую мозговую оболочку. Вставьте иглу в координату DV (8,3 мм вентральной) MFB, где будет происходить микроинъекция.
  20. Используйте микроинъекционный насос для высвобождения раствора 6-OHDA в MFB. Когда микроинъекция будет завершена, проверьте шприц Гамильтона, чтобы увидеть, было ли введено 4 мкл 6-OHDA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроинъекция должна длиться 8 мин.
  21. После введения 6-OHDA подождите 10 мин, прежде чем удалять иглу, чтобы избежать обратного потока препарата. Медленно удалите иглу микроинъекции из мозга животного.
  22. Снова продезинфицируйте область разреза повидоном-йодом.
  23. Зашить область разреза ~3-4 хирургическими узлами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Узел не должен быть слишком прочным или слишком свободным.
  24. Извлеките крысу из стереотаксического аппарата и поместите ее в чистую коробку для восстановления на тепловом одеяле до тех пор, пока животное полностью не оправится от анестезии. Наблюдайте за животным каждые 15 минут, пока оно полностью не проснется от анестезии.

4. Послеоперационные процедуры

  1. Следите за весом животных в течение следующих четырех дней после операции. Лечить их мелоксикамом подкожно один раз в день в течение двух дней после операции, корректируя дозу для веса каждого дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные должны быть оценены на предмет необходимости анальгетиков на третий день после операции.
  2. Проверяйте разрезы ежедневно в течение как минимум четырех дней, чтобы убедиться, что они не инфицированы. Ищите тепло, отек, боль, выделения и покраснения, пока разрезы не заживут.
  3. Проверьте аппетит и потребление воды, контролируя массу тела животного. Давайте влажный корм, чтобы побудить животных есть. Ежедневно наблюдайте за общим состоянием тела, отношением и подвижностью в течение как минимум четырех дней после операции. Снимают швы через 7-10 дней после операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные должны быть усыплены, если достигнуты конечные точки, определенные в этических процедурах.

5. Степпинг-тест

  1. Тренировка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные должны быть обучены в течение трех дней до теста. Согласно описанному ниже протоколу, тренировки должны происходить два раза в день, один раз утром и один раз во второй половине дня, или с интервалом не менее 2 ч между занятиями. Отслеживайте время с помощью таймера.
    1. День 1
      1. В первом сеансе обработайте крысу, держа ее в перчатках в течение ~ 1-2 минут, чтобы крыса могла ознакомиться с дрессировщиком / экспериментатором.
      2. Во втором сеансе чередуйте удержание крысы в течение 20 с и помещение ее на протокольный стол в течение 20 с. Повторите этот шаг обучения в течение 3 минут, чтобы ознакомить крысу с экспериментальной установкой для теста на шаг.
    2. День 2
      1. В первом сеансе поместите обе передние лапы крысы на протокольный стол, держа задние лапы и спину одной рукой. Наклоните крысу вниз головой вперед под углом 45° к плоской поверхности протокольного стола. Перемещайтесь горизонтально по столу из конца в конец, позволяя крысе ступить на стол обеими лапами (накройте 90 см за 4 с). Держите крысу в перчатках в течение 10 с, давая ей отдохнуть; повторяйте эту схему в течение 3 минут.
      2. Во втором сеансе положите одну передний лапу крысы на протокольный стол, держа другую заднюю лапу одной рукой, а другой рукой держите спину крысы и задние лапы (см. шаг 5.1.2.1). Перемещайтесь горизонтально по столу из конца в конец за 4 с, позволяя крысе шагнуть свободной лапой. Подержите крысу в перчатках в течение 10 с, дав ей отдохнуть, и повторите с другой передней лапой, после чего последует период покоя. Повторите эту схему, чередуя две передние лапы, и отдохните в течение 3 минут.
      3. Повторите тренировочный шаг 3 раза по 1 мин каждый.
    3. День 3
      1. На первом сеансе следуйте процедуре, описанной в шаге 5.1.2.2 для одной передней лапы. Повторите с другой передней лапой, после чего следует период покоя. Повторите эту схему, чередуя две передние лапы, и отдохните в течение 3 минут.
      2. На второй сессии следуйте процедуре, описанной в шаге 5.1.2.2.
  2. Тест
    ПРИМЕЧАНИЕ: Степпинг-тест проводится перед операцией, через 2 и 4 недели после стереотаксической хирургии, для оценки акинезии контралатеральной передней конечности и возможной травмы, вызванной 6-OHDA.
    1. Держите крысу под углом 45° к поверхности, обездвиживая ее задние конечности и позволяя только одной из передних конечностей отдыхать на платформе, как объяснялось выше, на 3 день тренировки.
    2. Перетащите крысу вперед на расстояние 90 см за 4 с, при этом правая или левая лапа покоится на поверхности.
    3. Делайте заметки и количественно оценивайте количество шагов по корректировке форхенда, сделанных каждой лапой в каждом направлении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оценка дофаминергических поражений
Ступенчатый тест позволяет оценить акинезию передней конечности, противопоказанную к поражению, и выбрать животных с возможным поражением нигростриатального пути, индуцированного инфузией 6-OHDA (рисунок 1). Сравнение эффективности контралатерального предоперационного теста передней конечности и предоперационной терапии через 2 недели и 4 недели после операции выявило взаимодействие (F2,74 = 93,63; p < 0,0001; двустороннее ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе описан протокол выполнения операции по односторонней микроинфузии 6-OHDA в MFB, способной вызывать устойчивые поражения в нейронах нигростриатального пути и генерировать акинезию у животного. Также описан протокол для выполнения степпинг-теста, легко применимого и неинвазивного теста, который может быть использован для доказательства успешности поражений и оценки акинезии передней конечности. Как представлено в репрезентативных результатах, животные, получавшие 6-OHDA, показали снижение количества коррект...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Сан-Паулу (FAPESP, грант 2017/00003-0). Мы благодарны за Координацию по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES). Мы благодарим д-ра Энтони Р. Уэста, д-ра Хайнца Штайнера и д-ра Куэй Й. Ценга за поддержку и наставничество.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-OHDASigma AldrichH4381https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt®ion=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel
_6-ohda-_-srpRecs3-1
70% спирт
Аскорбиновая кислотаSigma Aldrich795437https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt®ion=BR&gclid=
Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD
RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09
_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO
6yicaAot6EALw_wcB
Ватная
дрель или метчик
Марлевый
шприц Hamilton 50 мклHamilton80539https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
ИмипраминAlfa AeserJ63723https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Инфузионный насосInsightEFF-311https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Кетамин (Допален)Cevahttps://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Аппарат для трихотомии
Мелоксикам ( Максикам 2%  Ourofino)Ourofinohttps://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Металлические бумажные
PentabioticZoetishttps://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Мусорное ведро
Пентабиотик (Богатство)
Повидон-йод
Скальпель и лезвия
Ножницы
Скребок
Стереотаксический аппаратInsightEFF-331https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Стерильный физиологический раствор
Тампоны
Температурный зонд
Таймер Пинцет
Ксилазин (Анаседан)Cevahttps://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN
полотенца для утилизации для пластиковых отходов Poly-antibiotic

Ссылки

  1. Gibb, W. R., Lees, A. J. The relevance of the Lewy body to the pathogenesis of idiopathic Parkinson's disease. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 51 (6), 745-752 (1988).
  2. Albin, R. L., Young, A. B., Penney, J. B. The functional anatomy of basal ganglia disorders. Trends in Neurosciences. 12 (10), 366-375 (1989).
  3. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology & Medicine. 62, 132-144 (2013).
  4. Obeso, J. A., et al. Functional organization of the basal ganglia: therapeutic implications for Parkinson's disease. Movement Disorders. 23, Suppl 3 548-559 (2008).
  5. Tysnes, O. -B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. Journal of Neural Transmission. 124 (8), 901-905 (2017).
  6. Karachi, C., et al. Clinical and anatomical predictors for freezing of gait and falls after subthalamic deep brain stimulation in Parkinson's disease patients. Parkinsonism & Related Disorders. 62, 91-97 (2019).
  7. Sudhakar, V., Richardson, R. M. Gene therapy for Parkinson's disease. Progress in Neurological Surgery. 33, 253-264 (2018).
  8. Baizabal-Carvallo, J. F., et al. Combined pallidal and subthalamic nucleus deep brain stimulation in secondary dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 19 (5), 566-568 (2013).
  9. Morizane, A. Cell therapy for Parkinson's disease with induced pluripotent stem cells. Clinical Neurology. 59 (3), 119-124 (2019).
  10. Jankovic, J., Tan, E. K. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 91 (8), 795-808 (2020).
  11. Cenci, M. A., Whishaw, I. Q., Schallert, T. Animal models of neurological deficits: how relevant is the rat. Nature Reviws. Neuroscience. 3 (7), 574-579 (2002).
  12. Tronci, E., Francardo, V. Animal models of l-DOPA-induced dyskinesia: the 6-OHDA-lesioned rat and mouse. Journal of Neural Transmission. 125 (8), 1137-1144 (2018).
  13. Lane, E., Dunnett, S. Animal models of Parkinson's disease and L-dopa induced dyskinesia: How close are we to the clinic. Psychopharmacology. 199 (3), 303-312 (2008).
  14. Meredith, G. E., Sonsalla, P. K., Chesselet, M. -F. Animal models of Parkinson's disease progression. Acta Neuropathologica. 115 (4), 385-398 (2008).
  15. Kin, K., Yasuhara, T., Kameda, M., Date, I. Animal models for Parkinson's disease research: trends in the 2000s. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5402(2019).
  16. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell and Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
  17. Smith, G. A., Isacson, O., Dunnett, S. B. The search for genetic mouse models of prodromal Parkinson's disease. Experimental Neurology. 237 (2), 267-273 (2012).
  18. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219 (4587), 979-980 (1983).
  19. Langston, J. W., Irwin, I., Langston, E. B., Forno, L. S. 1-Methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+): identification of a metabolite of MPTP, a toxin selective to the substantia nigra. Neuroscience Letters. 48 (1), 87-92 (1984).
  20. Ramsay, R. R., Salach, J. I., Singer, T. P. Uptake of the neurotoxin 1-methyl-4-phenylpyridine (MPP+) by mitochondria and its relation to the inhibition of the mitochondrial oxidation of NAD+-linked substrates by MPP+. Biochemical and Biophysical Research Communications. 134 (2), 743-748 (1986).
  21. Ungerstedt, U. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. European Journal of Pharmacology. 5 (1), 107-110 (1968).
  22. Blandini, F., Armentero, M. -T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
  23. McDowell, K., Chesselet, M. -F. Animal models of the non-motor features of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 46 (3), 597-606 (2012).
  24. Luthman, J., Fredriksson, A., Sundström, E., Jonsson, G., Archer, T. Selective lesion of central dopamine or noradrenaline neuron systems in the neonatal rat: motor behavior and monoamine alterations at adult stage. Behavioural Brain Research. 33 (3), 267-277 (1989).
  25. Casarrubea, M., et al. Effects of Substantia Nigra pars compacta lesion on the behavioral sequencing in the 6-OHDA model of Parkinson's disease. Behavioural Brain Research. 362, 28-35 (2019).
  26. Wang, R., Shao, M. L-DOPA-elicited abnormal involuntary movements in the rats damaged severely in substantia nigra by 6-hydroxydopamine. Annals of Palliative Medicine. 9 (3), 947-956 (2020).
  27. Hernandez-Baltazar, D., Mendoza-Garrido, M. E., Martinez-Fong, D. Activation of GSK-3β and caspase-3 occurs in Nigral dopamine neurons during the development of apoptosis activated by a striatal injection of 6-hydroxydopamine. PLoS One. 8 (8), 70951(2013).
  28. Bagga, V., Dunnett, S. B., Fricker, R. A. The 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease - Terminal striatal lesions provide a superior measure of neuronal loss and replacement than median forebrain bundle lesions. Behavioural Brain Research. 288, 107-117 (2015).
  29. Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behavioural Brain Research. 162 (1), 1-10 (2005).
  30. Boix, J., Padel, T., Paul, G. A partial lesion model of Parkinson's disease in mice - Characterization of a 6-OHDA-induced medial forebrain bundle lesion. Behavioural Brain Research. 284, 196-206 (2015).
  31. Blesa, J., Phani, S., Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Classic and new animal models of Parkinson's disease. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 845618(2012).
  32. Breit, S., et al. Effects of 6-hydroxydopamine-induced severe or partial lesion of the nigrostriatal pathway on the neuronal activity of pallido-subthalamic network in the rat. Experimental Neurology. 205 (1), 36-47 (2007).
  33. More, S. V., Kumar, H., Cho, D. -Y., Yun, Y. -S., Choi, D. -K. Toxin-induced experimental models of learning and memory impairment. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1447(2016).
  34. Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. The unilateral 6-hydroxydopamine lesion model in behavioral brain research. Analysis of functional deficits, recovery and treatments. Progress in Neurobiology. 50 (2-3), 275-331 (1996).
  35. Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Björklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15 (5), 3863-3875 (1995).
  36. Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The 'motor complication syndrome' in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with l-DOPA: Relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
  37. Björklund, A., Dunnett, S. B. The amphetamine induced rotation test: A re-assessment of its use as a tool to monitor motor impairment and functional recovery in rodent models of Parkinson's disease. Journal of Parkinson's Disease. 9 (1), 17-29 (2019).
  38. Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease: studies on medial forebrain bundle and striatal lesions. Neuroscience. 88 (2), 617-628 (1999).
  39. Jayasinghe, V. R., Flores-Barrera, E., West, A. R., Tseng, K. Y. Frequency-dependent corticostriatal disinhibition resulting from chronic dopamine depletion: role of local striatal cGMP and GABA-AR signaling. Cerebral Cortex. 27 (1), 625-634 (2017).
  40. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
  41. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2006).
  42. Padovan-Neto, F. E., et al. Selective regulation of 5-HT1B serotonin receptor expression in the striatum by dopamine depletion and repeated L-DOPA treatment: relationship to L-DOPA-induced dyskinesias. Molecular Neurobiology. 57 (2), 736-751 (2020).
  43. Prasad, E. M., Hung, S. -Y. Behavioral tests in neurotoxin-induced aAnimal models of Parkinson's disease. Antioxidants. 9 (10), Basel, Switzerland. 1007(2020).
  44. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: Relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 16 (1), 110-123 (2004).
  45. Masini, D., et al. A guide to the generation of a 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease for the study of non-motor symptoms. Biomedicines. 9 (6), 598(2021).
  46. Francardo, V., et al. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 42 (3), 327-340 (2011).
  47. Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234(2012).
  48. Fish, R., Danneman, P., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , Academic Press. (2008).
  49. Buitrago, S., Martin, T. E., Tetens-Woodring, J., Belicha-Villanueva, A., Wilding, G. E. Safety and efficacy of various combinations of injectable anesthetics in BALB/c mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 47 (1), 11-17 (2008).
  50. Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 50 (3), 344-348 (2011).
  51. Jiron, J. M., et al. Comparison of isoflurane, ketamine-dexmedetomidine, and ketamine-xylazine for general anesthesia during oral procedures in rice rats (Oryzomys palustris). Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 58 (1), 40-49 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель с использованием 6-гидроксидофаминадофаминергические нейронымедиальный пучок переднего мозганигростриарное повреждениедвигательный дефициттест на шаганиеодносторонняя микроинъекциянейродегенерация
6-гидроксидофаминовая крысиная модель болезни Паркинсона
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.