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Neuroscience

Il modello di ratto 6-idrossidopamina della malattia di Parkinson

Published: October 27, 2021 doi: 10.3791/62923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

Il modello 6-idrossidopamina (6-OHDA) è stato utilizzato per decenni per far progredire la comprensione della malattia di Parkinson. In questo protocollo, dimostriamo come eseguire lesioni nigrostriatali unilaterali nel ratto iniettando 6-OHDA nel fascio proencefalico mediale, valutare i deficit motori e prevedere le lesioni utilizzando il test di stepping.

Abstract

I sintomi motori della malattia di Parkinson (PD) - bradicinesia, acinesia e tremore a riposo - sono conseguenze della neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNc) e nel deficit striatale dopaminergico. I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per simulare la patologia umana in laboratorio. I roditori sono i modelli animali più utilizzati per pd grazie alla loro facilità di manipolazione e manutenzione. Inoltre, l'anatomia e i meccanismi molecolari, cellulari e farmacologici del PD sono simili nei roditori e negli esseri umani. L'infusione della neurotossina, 6-idrossidopamina (6-OHDA), in un fascio proencefalico mediale (MFB) di ratti riproduce la grave distruzione dei neuroni dopaminergici e simula i sintomi del PD. Questo protocollo dimostra come eseguire la microiniezione unilaterale di 6-OHDA nell'MFB in un modello di RATto di PD e mostra i deficit motori indotti da 6-OHDA e le lesioni dopaminergiche previste attraverso il test di stepping. Il 6-OHDA causa una significativa compromissione del numero di passaggi eseguiti con l'arto anteriore controlaterale.

Introduction

Le principali caratteristiche neuropatologiche del PD sono la neurodegenerazione cronica progressiva dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNc) e la presenza di corpi di Lewy contenenti α-sinucleina1. Poiché i neuroni dopaminergici SNc proiettano i loro assoni nello striato attraverso la via nigrostriatale, la neurodegenerazione dei neuroni in SNc provoca un deficit dopaminergico nello striato2. L'assenza di dopamina nello striato provoca uno squilibrio nelle attività delle vie di controllo motorio dirette e indirette, che è responsabile dei principali sintomi motori del PD: acinesia (movimento lento), bradicinesia (difficoltà nei movimenti iniziali), rigidità muscolare e tremore a riposo3,4,5.

Poiché i meccanismi molecolari e fisiologici coinvolti nell'insorgenza del PD non sono ancora completamente compresi, i principali trattamenti attualmente disponibili cercano di alleviare i sintomi motori attraverso farmacoterapie, stimolazione cerebrale profonda6,7, terapie genetiche8 e trapianto di cellule9. Pertanto, la ricerca preclinica è fondamentale per chiarire i meccanismi coinvolti nell'insorgenza della PD e scoprire nuove metodologie per la diagnosi precoce e nuove terapie per prevenire o fermare la degenerazione dei neuroni affetti da PD10.

I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per simulare la patologia umana in laboratorio, contribuendo al progresso della medicina e della scienza11,12,13,14. Tuttavia, è essenziale sottolineare che la scelta corretta del modello animale è fondamentale per il successo dello studio. Pertanto, il modello animale deve essere validato in tre aspetti principali: i) validità facciale, in cui il modello animale deve avere le caratteristiche della patologia umana; ii) validità costruttiva, in cui il modello animale deve avere una solida base teorica; e iii) validità predittiva, in cui i modelli animali devono rispondere ai trattamenti in modo simile al trattamento clinico.

Attualmente, diversi animali sono usati come modelli animali per PD. I gruppi principali includono mammiferi, come roditori, primati, minipig, cani e gatti e altri gruppi come drosophila e zebrafish. I roditori sono il modello animale più classico per PD e il più utilizzato per la loro facilità di manipolazione e manutenzione. Inoltre, l'anatomia e i meccanismi molecolari, cellulari e farmacologici del PD sono simili nei roditori e negli esseri umani15.

Una revisione pubblicata da Kin e colleghi nel 2019 ha analizzato le principali metodologie di modelli animali utilizzate per il PD negli anni 2000 e ha scoperto che il modello animale più utilizzato coinvolgeva neurotossine come la 6-idrossidopamina (6-OHDA) e l'1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP). Entrambe le neurotossine causano disregolazione mitocondriale nei neuroni dopaminergici nella via nigrostriatale, portando alla morte cellulare16. Un altro modello ampiamente utilizzato prevede la manipolazione genetica attraverso la mutazione in geni specifici coinvolti nell'insorgenza della PD, causando la disregolazione mitocondriale17. I modelli di neurotossina sono comunemente usati per valutare e confrontare le terapie, mentre i modelli genetici sono usati per studiare lo sviluppo di terapie preventive e PD15 idiopatiche.

La neurotossina MPTP è stata scoperta per causare parkinsonismo a metà degli anni 1980 dopo che sette pazienti hanno usato la sostanza e hanno mostrato gravi sintomi di PD. Oltre ai sintomi, i pazienti hanno risposto al trattamento con L-DOPA, che ha fatto sì che i ricercatori collegassero la molecola direttamente al PD. Dopo che il caso è stato pubblicato nel 1986, diversi ricercatori hanno iniziato a utilizzare MPTP nella ricerca preclinica sul PD18. I ricercatori hanno scoperto che essendo una molecola lipofila, MPTP può attraversare la barriera emato-encefalica (BBB) ed essere convertito in MPP + 19. Questa sostanza tossica si accumula all'interno dei neuroni e provoca danni al complesso 1 della catena respiratoria mitocondriale, portando alla morte dei neuroni dopaminergici20.

Il modello di neurotossina 6-OHDA è stato utilizzato per la prima volta per indurre la degenerazione dei neuroni monoamminici della via nigrostriatale nel 196821. Il modello 6-OHDA è comunemente usato per causare neurodegenerazione nella via nigrostriatale in quanto è un analogo della dopamina e tossico per le cellule contenenti catecolamine. Dopo che il 6-OHDA entra nel cervello, può essere assorbito dal trasportatore della dopamina (DAT) nei neuroni dopaminergici, portando alla degenerazione della via nigrostriatale22. Poiché il 6-OHDA non penetra nella BBB, deve essere somministrato direttamente attraverso l'iniezione stereotassica intracerebrale23. Un inibitore della ricaptazione della noradrenalina è spesso combinato con la microiniezione 6-OHDA per preservare le fibre noradrenergiche e fornire una degenerazione più selettiva dei neuroni dopaminergici24.

Dopo che il DAT assume 6-OHDA, si accumulerà nel citosol dei neuroni, producendo specie reattive dell'ossigeno (ROS) e portando alla morte cellulare15. Vengono frequentemente utilizzati tre diversi modelli di lesioni di 6-OHDA: i) lesioni alla SNc25,26; ii) lesioni allo striato27,28; iii) lesioni al MFB29,30. Le lesioni causate nello striato provocano una degenerazione lenta e retrograda dei neuroni dopaminergici in SNpc. Al contrario, le lesioni causate in SNpc e MFB provocano una degenerazione rapida e totale dei neuroni, portando a sintomi parkinsoniani più avanzati31.

L'iniezione unilaterale o bilaterale di 6-OHDA può causare neurodegenerazione nei neuroni dopaminergici. 6-OHDA non sempre causa gravi danni ai neuroni; a volte, l'iniezione provoca danni parziali, che viene anche utilizzato per simulare le prime fasi di PD32. L'iniezione unilaterale è più comunemente usata a causa della capacità del modello di valutare i deficit motori dell'animale e prevedere la perdita cellulare attraverso test come la rotazione indotta da anfetamine / apomorfina e il test di stepping29. Le iniezioni bilaterali sono più utilizzate per valutare la memoria spaziale e il riconoscimento33.

Il test di rotazione indotto da anfetamine / apomorfina è un test comportamentale comunemente usato per prevedere la perdita cellulare nella via nigrostriatale. È definito come un processo in cui la somministrazione ripetuta di agonisti della dopamina porta ad un'intensificazione del comportamento rotazionale in animali 6-OHDA-lesionati34. Il comportamento rotazionale consiste nel quantificare la rotazione ipsilaterale indotta dalle anfetamine o le svolte controlaterali indotte dall'apomorfina nei roditori unilateralmente lesionati. Il comportamento rotazionale indotto da farmaci è stato criticato perché la rotazione non corrisponde ai sintomi del PD negli esseri umani e può essere influenzata da variabili come tolleranza, sensibilizzazione e "priming"35.

L'adescamento è uno dei fattori più critici in questi test comportamentali. Sono stati riportati alcuni casi in cui una singola dose di L-DOPA ha portato a un fallimento nei comportamenti rotazionali36. Inoltre, un altro fattore critico correlato all'applicazione combinata del test indotto dalle anfetamine e del test indotto dall'apomorfina per uso parallelo è che misurano diversi endpoint a causa di diversi meccanismi d'azione, riflettendo l'inattivazione di diversi meccanismi e percorsi di segnalazione. Inoltre, il test indotto dalle anfetamine è più accurato per misurare le lesioni nigrostriatali superiori al 50-60%, mentre il test indotto dall'apomorfina è più accurato per le lesioni superiori all'80%37.

Il test di passo è emerso come un test comportamentale che indica deficit legati alla degenerazione neuronale dopaminergica e agli effetti terapeutici. Consente l'analisi dell'acinesia causata da una lesione 6-OHDA nei neuroni dopaminergici senza una procedura indotta da farmaci. Inoltre, il test è stato ben consolidato e comunemente usato dal 1995, quando è stato descritto per la prima volta da Olsson et al.35. Nel 1999, Chang et al.38 hanno anche analizzato e confrontato le prestazioni dei ratti nel test di stepping con il livello di degenerazione causato da 6-OHDA e hanno scoperto che gli animali che hanno ottenuto risultati peggiori nel test di stepping avevano anche una degenerazione più significativa dei neuroni dopaminergici.

Il test di stepping è un metodo eccellente per prevedere un grave danno nigrostriatale dopaminergico nei ratti 6-OHDA-lesionati. L'evidenza suggerisce che i deficit motori compaiono nell'arto anteriore controlaterale dell'infusione di 6-OHDA durante il test di stepping quando il grado di perdita dopaminergica in SNc è >90%39. Questo documento descrive i protocolli, le metodologie e i materiali utilizzati per eseguire la chirurgia stereotassica per l'infusione unilaterale di 6-OHDA nell'MFB dei ratti e come prevedere le lesioni dopaminergiche causate dalla tossina attraverso il test di stepping.

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali hanno seguito i principi etici del Consiglio nazionale per il controllo della sperimentazione animale (CONCEA) e la legge Arouca (legge 11.794/2008) e sono state approvate dal comitato etico locale (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5).

1. Preparazione di farmaci

  1. Anestesia con ketamina/xilazina
    NOTA: La dose di ketamina utilizzata è di 70 mg/kg e la dose di xilazina è di 10 mg/kg.
    1. Per preparare 1 mL di anestetico utilizzando soluzione di ketamina 100 mg/mL e soluzione di xilazina 20 mg/mL, combinare 0,35 mL di soluzione di ketamina, 0,25 mL di soluzione di xilazina e 0,4 mL di soluzione salina sterile allo 0,9%. Somministrare la soluzione anestetica ad un volume finale di 2 ml/kg.
      NOTA: La ketamina insieme alla xilazina può produrre sedazione per 60-80 minuti. Se l'animale ha ancora riflessi (ad esempio, beccheggio della zampa posteriore e/o riflesso lampeggiante), somministrare un ulteriore 10% della dose individuale.
  2. Imipramina
    NOTA: La dose individuale di imipramina utilizzata è di 20 mg/kg.
    1. Per preparare 1 mL di soluzione di imipramina 20 mg/mL, combinare 20 mg di imipramina e 1 mL di soluzione salina sterile allo 0,9%. Somministrare la soluzione di imipramina ad un volume finale di 1 ml/kg.
  3. Meloxicam
    NOTA: La dose individuale di meloxicam utilizzata è di 1 mg/kg.
    1. Per preparare 1 mL di soluzione di meloxicam 1 mg/mL, combinare 0,05 mL di meloxicam al 2% e 0,95 mL di soluzione salina sterile allo 0,9%. Somministrare la soluzione di meloxicam ad un volume finale di 1 ml/kg una volta al giorno per due giorni.
  4. Acido ascorbico 0,1%
    1. Per preparare 1 mL di acido ascorbico allo 0,1%, combinare 1 mg di acido ascorbico e 1 mL di soluzione salina sterile allo 0,9%.
  5. 6-idrossidopamina (6-OHDA)
    NOTA: 6-OHDA è una neurotossina utilizzata per distruggere selettivamente i neuroni dopaminergici e noradrenergici nel cervello. Evitare il contatto diretto con la pelle e le mucose degli occhi, del naso e della bocca. Quando si maneggia 6-OHDA, indossare doppi guanti in nitrile, camice da laboratorio, camice monouso, protezione per gli occhi e maschera chirurgica o visiera. Il volume totale di infusione della tossina è di 4 μL/animale e la quantità individuale è di 10 μg di 6-OHDA/animale.
    1. Per preparare 1 mL di 6-OHDA ad una concentrazione finale di 2,5 mg/mL, mescolare 2,5 mg di 6-OHDA e 1 mL di soluzione salina allo 0,9% contenente acido ascorbico allo 0,1% (descritto sopra).
      NOTA: 6-OHDA è sensibile alla luce e si degrada più velocemente se esposto a luce intensa. Deve essere opportunamente maneggiato e conservato in un ambiente protetto dalla luce. Se il colore della soluzione è rossastro, scartarlo.
  6. Lidocaina cloridrato (2%)
    1. Preparare la soluzione di lidocaina al 2% per l'applicazione locale all'animale.
      NOTA: La dose massima che può essere applicata è di 7 mg/kg.
  7. Sospensione poli-antibiotica
    NOTA: La sospensione poli-antibiotica con streptomicine e penicilline (vedi Tabella dei Materiali) deve essere preparata al momento dell'applicazione con l'intero volume di diluente, la cui fiala accompagna il flaconcino con la polvere.
    1. Rimuovere il disco metallico sul tappo di gomma. Disinfettare il tappo di gomma con alcool.
    2. Utilizzando una siringa con un ago da 23 G, iniettare il diluente nel flaconcino. Rimuovere l'ago e agitare vigorosamente il flaconcino fino a quando la sospensione non sarà completamente omogeneizzata. Iniettare un po' d'aria nel flaconcino e prelevare il volume desiderato di sospensione.
    3. Somministrare un'iniezione intramuscolare profonda, tirando lo stantuffo prima di iniettare il farmaco per assicurarsi che non venga raggiunto alcun vaso sanguigno.
      NOTA: il volume finale della sospensione da applicare è di 0,5 ml/kg.

2. Preparazione dei materiali

NOTA: seguire sempre le istruzioni fornite con la scheda di dati di sicurezza del materiale durante la manipolazione di sostanze chimiche.

  1. Apparecchi stereotassici
    1. Posizionare il dispositivo stereotassico su una panca stabile e pulita con un'illuminazione adeguata per eseguire l'intervento chirurgico. Disinfettare l'apparecchio con il 70% di etanolo.
    2. Controllare se le barre auricolari e incisive del dispositivo sono allineate correttamente. Posizionare una coperta termica in cui l'animale verrà posizionato durante l'intervento chirurgico per rimanere al caldo durante la procedura. Monitora la temperatura dell'animale con una sonda rettale accurata.
      NOTA: La coperta termica deve essere a 37,5 °C in modo che l'animale mantenga una temperatura corporea di 37 °C corporea.
  2. Sistema di microinfusione
    1. Riempire (70-80%) una siringa Hamilton (50 μL o come desiderato) attaccata a un microtubing in polietilene di grado medico e un ago con acqua doppia distillata (ddH2O) e verificare la presenza di perdite attraverso il sistema.
    2. Aspirare l'aria attraverso il sistema in modo che una singola bolla d'aria separi il ddH2O nella siringa dalla soluzione 6-OHDA nel microtubo.
      NOTA: Questa procedura evita di contaminare la siringa hamilton con 6-OHDA e consente l'uso di più ratti nello stesso giorno sperimentale.
    3. Posizionare la siringa Hamilton sulla pompa di infusione in modo che sia saldamente fissata e che lo stantuffo della siringa sia parallelo al telaio che si muoverà per spingerlo. Impostare la pompa di infusione a una velocità di 0,5 μL/min in modo che l'applicazione totale di 4 μL di 6-OHDA duri per 8 min. Testare il sistema di infusione confermando che non ci sono perdite e che l'infusione avviene in base al tempo e al volume precedentemente impostati.
    4. Fissare l'ago per infusione attaccato al microtubo all'apparecchio all'estremità del braccio stereotassico e controllare che l'ago sia posizionato con un angolo di 180° rispetto alla superficie. Assicurarsi che l'ago sia dritto e non piegato.
      NOTA: Controllare attentamente tutte le procedure descritte perché se uno qualsiasi degli elementi nel sistema di infusione non funziona correttamente, potrebbe compromettere il successo dell'intervento chirurgico.
  3. Sutura
    1. Utilizzare una sutura sterile in nylon non assorbibile con un ago a 3/8 cerchi per suturare l'incisione dopo l'intervento chirurgico.
  4. Sito di recupero postchirurgico
    1. Posizionare una scatola di alloggiamento pulita e sterilizzata in cui gli animali possono essere monitorati fino a completo recupero (reattivo al tatto e alla manipolazione). Metti una coperta termica nella scatola per la termoregolazione.
      NOTA: poiché la termoregolazione è importante, includere una fonte di calore supplementare per mantenere la temperatura corporea, se necessario.

3. Procedura chirurgica

NOTA: In questo protocollo, i ratti maschi adulti Sprague-Dawley (200-250 g) sono stati tenuti in condizioni controllate di temperatura (22 ± 2 °C), ricambio d'aria (15-20 scambi/ora) e cicli luce-buio (12 h/12 h), raggruppati in scatole con 3 o 4 animali, con libero accesso a cibo e acqua.

  1. Pesare gli animali per monitorare le variazioni di peso nei giorni successivi all'intervento. Calcolare la dose di farmaci da somministrare.
  2. Somministrare imipramina per via intraperitoneale 30 minuti prima dell'intervento chirurgico (~ 10-15 minuti prima di somministrare l'anestesia), utilizzando un ago da 27 G e una siringa da 1 mL.
    NOTA: L'imipramina bloccherà il trasportatore della noradrenalina (NAT) e impedirà l'assorbimento di 6-OHDA da parte dei neuroni noradrenergici, rendendo la lesione più selettiva per i neuroni dopaminergici40.
  3. Dopo 10-15 minuti dalla somministrazione di imipramina, somministrare l'anestesia intraperitoneale ketamina/xilazina utilizzando un ago da 27 G e una siringa da 1 mL. Attendere che l'animale sia completamente anestetizzato. Verificare che l'animale sia in anestesia profonda quando l'animale non risponde al pizzicamento della zampa posteriore e non mostra un riflesso lampeggiante.
  4. Radere la pelliccia del ratto nella regione della testa in cui si verificherà l'incisione.
  5. Posizionare il ratto nell'apparato stereotassico.
    1. Posizionare la testa sopra la barra incisiva e fissare la barra 3,3 mm sotto la linea interaurale.
    2. Posizionare le barre auricolari, un lato alla volta. Posizionare la barra incisiva e le barre auricolari in modo che la parte superiore del cranio sia diritta e parallela alla superficie.
    3. Regolare il morsetto del naso e verificare che la testa sia ferma e non si muova su entrambi i lati.
  6. Applicare un unguento oftalmico sterile agli occhi del ratto per evitare che le cornee si secchino.
  7. Applicare povidone-iodio sulla zona da incidere per disinfettare il sito.
  8. Applicare lidocaina locale per l'analgesia della regione di incisione; non superare i 7 mg/kg.
  9. Somministrare il meloxicam per via sottocutanea utilizzando un ago da 27 G e una siringa da 1 mL.
    NOTA: Meloxicam è un analgesico antinfiammatorio non steroideo che aiuterà l'animale a recuperare dopo l'intervento chirurgico.
  10. Somministrare la sospensione poli-antibiotica per via intramuscolare utilizzando un ago da 23 G e una siringa da 1 mL.
    NOTA: La sospensione poli-antibiotica viene somministrata come trattamento profilattico per evitare possibili infezioni batteriche nel recupero post-operatorio.
  11. Controllare che l'animale sia in uno stato di anestesia profonda controllando i riflessi lampeggianti o i riflessi degli arti posteriori pizzicando la zampa posteriore con una pinzetta.
  12. Con un bisturi, fare un'incisione di ~ 1,5 cm nella regione in cui si verificherà la microiniezione.
    NOTA: da questo punto vengono applicate tecniche sterili fino alla chiusura della ferita.
  13. Pulire la regione del cranio con tamponi di cotone e cotton fioc fino a quando bregma e Lambda possono essere visti. Contrassegna il Bregma e il Lambda con una penna fine sterilizzata.
  14. Verificare che le coordinate dorsale-ventrali (DV) di Bregma e Lambda siano simili. Se sono diversi, riadattare il ratto nell'apparato stereotassico poiché la testa del ratto non è posizionata correttamente.
  15. Annotare le coordinate anteroposteriore (AP) e mediolaterale (ML) del Bregma.
  16. Passare alle coordinate AP e ML dell'MFB destro secondo 41: AP: -4,3 mm, ML: 1,6 mm da Bregma.
  17. Segna la regione della trapanazione con una penna fine sterilizzata.
  18. Con un trapano sterilizzato, perforare lentamente il cranio dell'animale, facendo attenzione a non ferire la dura madre.
  19. Posizionare l'ago di microiniezione sulla dura madre e annotare le coordinate DV. Prendi un ago sottile e rompi delicatamente la dura madre. Inserire l'ago nella coordinata DV (8,3 mm ventrale) dell'MFB, dove avverrà la microiniezione.
  20. Azionare la pompa di microiniezione per rilasciare la soluzione 6-OHDA nell'MFB. Al termine della microiniezione, controllare la siringa Hamilton per vedere se sono stati iniettati 4 μL di 6-OHDA.
    NOTA: La microiniezione dovrebbe durare 8 minuti.
  21. Dopo la somministrazione del 6-OHDA, attendere 10 minuti prima di rimuovere l'ago per evitare il riflusso del farmaco. Rimuovere lentamente l'ago per microiniezione dal cervello dell'animale.
  22. Disinfettare nuovamente la regione di incisione con povidone-iodio.
  23. Suturare l'area dell'incisione con ~ 3-4 nodi chirurgici.
    NOTA: Il nodo non deve essere troppo forte o troppo allentato.
  24. Rimuovere il ratto dall'apparato stereotassico e metterlo in una scatola pulita per il recupero sulla coperta termica fino a quando l'animale non si è completamente ripreso dall'anestesia. Osservare l'animale ogni 15 minuti fino a quando non è completamente sveglio dall'anestesia.

4. Procedure postoperatorie

  1. Monitorare il peso degli animali nei prossimi quattro giorni dopo l'intervento chirurgico. Trattarli con meloxicam per via sottocutanea una volta al giorno per due giorni dopo l'intervento chirurgico, regolando la dose per il peso di ogni giorno.
    NOTA: Tutti gli animali devono essere valutati per la necessità di analgesici il terzo giorno dopo l'intervento chirurgico.
  2. Controllare le incisioni ogni giorno per almeno quattro giorni per assicurarsi che non siano infette. Cerca calore, gonfiore, dolore, secrezione e arrossamento fino a quando le incisioni non guariscono.
  3. Controlla l'appetito e il consumo di acqua monitorando il peso corporeo dell'animale. Dare mangime umido per incoraggiare gli animali a mangiare. Osservare le condizioni generali del corpo, l'atteggiamento e la mobilità ogni giorno per almeno quattro giorni dopo l'intervento chirurgico. Rimuovere le suture 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
    NOTA: gli animali dovrebbero essere sottoposti a eutanasia se vengono raggiunti gli endpoint definiti nelle procedure etiche.

5. Test di stepping

  1. Formazione
    NOTA: Gli animali devono essere addestrati per tre giorni prima del test. Secondo il protocollo descritto di seguito, l'allenamento dovrebbe avvenire due volte al giorno, una volta al mattino e una volta al pomeriggio, o con un intervallo di almeno 2 ore tra le sessioni. Tieni traccia del tempo utilizzando un timer.
    1. Giorno 1
      1. Nella prima sessione, maneggiare il ratto tenendolo in guanti per ~ 1-2 minuti per consentire al ratto di familiarizzare con il conduttore / sperimentatore.
      2. Nella seconda sessione, alternare tra tenere il ratto per 20 s e metterlo sul tavolo del protocollo per 20 s. Ripeti questa fase di allenamento per 3 minuti per familiarizzare il ratto con la configurazione sperimentale per il test di stepping.
    2. Giorno 2
      1. Nella prima sessione, posizionare entrambe le zampe anteriori del ratto sul tavolo del protocollo tenendo le zampe posteriori e la schiena con una mano. Inclinare il ratto verso il basso a testa in giù con un angolo di 45° rispetto alla superficie piana della tabella di protocollo. Muoviti orizzontalmente sul tavolo da un capo all'altro, permettendo al topo di calpestare il tavolo con entrambe le zampe (coprire 90 cm in 4 s). Tenere il topo in guanti per 10 s, permettendogli di riposare; ripetere questo schema per 3 minuti.
      2. Nella seconda sessione, posizionare una zampa anteriore del ratto sul tavolo del protocollo tenendo indietro l'altra zampa anteriore con una mano e tenere la schiena e le zampe posteriori del ratto con l'altra mano (vedere il punto 5.1.2.1). Muoviti orizzontalmente sul tavolo da un capo all'altro in 4 s, permettendo al topo di camminare con la sua zampa libera. Tenere il topo in guanti per 10 s, lasciandolo riposare, e ripetere con un'altra zampa anteriore, seguita dal periodo di riposo. Ripeti questo schema, alternando tra le due zampe anteriori e riposa per 3 minuti.
      3. Ripeti la fase di allenamento 3 volte per 1 minuto ciascuna.
    3. Giorno 3
      1. Nella prima sessione, seguire la procedura descritta nel passaggio 5.1.2.2 per una zampa anteriore. Ripetere con un'altra zampa anteriore, seguita dal periodo di riposo. Ripeti questo schema, alternando tra le due zampe anteriori e riposa per 3 minuti.
      2. Nella seconda sessione, seguire la procedura descritta al punto 5.1.2.2.
  2. Test
    NOTA: Il test di stepping viene eseguito prima dell'intervento chirurgico, 2 e 4 settimane dopo l'intervento stereotassico, per valutare l'acinesia dell'arto anteriore controlaterale e la possibile lesione causata da 6-OHDA.
    1. Tenere il ratto ad un angolo di 45° rispetto alla superficie, immobilizzando gli arti posteriori e permettendo a uno solo degli arti anteriori di appoggiarsi sulla piattaforma, come spiegato sopra, per il giorno 3 di allenamento.
    2. Trascina il topo in avanti su una distanza di 90 cm in 4 s, con la zampa destra o sinistra appoggiata sulla superficie.
    3. Prendi appunti e quantifica il numero di passi di regolazione del dritto fatti con ogni zampa in ogni direzione.

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Representative Results

Valutazione della lesione dopaminergica
Il test di stepping consente la valutazione dell'acinesia dell'arto anteriore controlaterale alla lesione e la selezione di animali con una possibile lesione della via nigrostriatale indotta dall'infusione di 6-OHDA (Figura 1). Il confronto delle prestazioni del test di stepping dell'arto anteriore controlaterale pre-chirurgia e 2 settimane e 4 settimane dopo l'intervento ha rivelato un'interazione (F2,74 = 93,63; p < 0,0001; misure ripetute bidirezionali ANOVA) tra il tempo (pre, 2 e 4 settimane dopo l'intervento chirurgico) e il trattamento (operato con sham e 6-OHDA-lesionato). Il test post-hoc di Bonferroni ha mostrato una significativa diminuzione del numero di passaggi controlaterali alla lesione negli animali che ricevono 6-OHDA nel MFB destro rispetto agli animali sottoposti a chirurgia simulata alla seconda e quarta settimana dopo l'intervento chirurgico (p < 0,0001) (Figura 1). I risultati sono stati coerenti con quelli di studi precedenti35.

È importante notare che quando la lesione dopaminergica non è completa, i risultati del test di stepping non raggiungeranno il grado di successo dei risultati presentati in questo studio. Uno studio precedentemente pubblicato ha eseguito il test di stepping e l'immunoistochimica della tirosina idrossilasi (TH) con animali con una lesione dopaminergica parziale dopo aver eseguito un intervento chirurgico per microiniezione di 6-OHDA seguendo lo stesso protocollo utilizzato in questo studio. La loro scoperta di un deficit parziale nel test di stepping (4-8 passi) è il risultato di una lesione dopaminergica parziale di ~ 60% dei neuroni39.

Figure 1
Figura 1: Valutazione del test di stepping controlaterale pre e post-operatorio per infusione unilaterale di 6-OHDA o veicolo nel giusto MFB. I dati mostrano che gli animali trattati con 6-OHDA hanno avuto una significativa diminuzione del numero di passaggi con l'arto anteriore controlaterale alla lesione alla seconda e quarta settimana dopo l'intervento (****p < 0,0001 vs. sham post-chirurgia; misure ripetute bidirezionali ANOVA, Bonferroni post-hoc). I dati espressi come media ± errore standard della media. Il veicolo è una soluzione salina allo 0,9% contenente acido ascorbico allo 0,1%. I risultati si basano su 14 animali nel gruppo sham e 25 animali nel gruppo 6-OHDA. Abbreviazioni: P = prechirurgia. 2 = due settimane dopo l'intervento chirurgico. 4 = quattro settimane dopo l'intervento chirurgico; 6-OHDA = 6-idrossidopamina; MFB = fascio proencefalico mediale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il confronto delle prestazioni del test di stepping dell'arto anteriore ipsilaterale pre-operatorio e 2 settimane e 4 settimane dopo l'intervento chirurgico non ha rivelato alcuna interazione (F2,74 = 0,4492; p = 0,6399; misure ripetute bidirezionali ANOVA) tra il tempo (pre, 2 e 4 settimane dopo l'intervento chirurgico) e il trattamento (operato in modo fittizio e 6-OHDA-lesionato). Il test post-hoc di Bonferroni non ha mostrato alcuna differenza significativa nel numero di passi ipsilaterali alla lesione negli animali che ricevono 6-OHDA nel giusto MFB rispetto agli animali finti (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Valutazione del test di stepping ipsilaterale pre e post-operatorio per infusione unilaterale di 6-OHDA o veicolo nel giusto MFB. I dati mostrano che gli animali trattati con 6-OHDA non hanno diminuito significativamente il numero di passaggi con l'arto anteriore anteriore ipsilaterale alla lesione alla seconda e quarta settimana dopo l'intervento chirurgico (p > 0,05 vs. post-chirurgia fittizia; misure ripetute bidirezionali ANOVA, Bonferroni post-hoc). I dati espressi come media ± errore standard della media. Il veicolo è una soluzione salina allo 0,9% contenente acido ascorbico allo 0,1%. I risultati si basano su 14 animali nel gruppo sham e 25 animali nel gruppo 6-OHDA. Abbreviazioni: P = prechirurgia. 2 = due settimane dopo l'intervento chirurgico. 4 = quattro settimane dopo l'intervento chirurgico; 6-OHDA = 6-idrossidopamina; MFB = fascio proencefalico mediale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Coerentemente con studi precedenti su animali 6-OHDA-lesionati42, l'analisi istologica (Figura 3) che confronta il TH dello striato di entrambi gli emisferi consente una valutazione affidabile del deficit di DA nello striato. Pertanto, questo protocollo comportamentale può essere utilizzato in combinazione con metodi immunoistochimici in studi che coinvolgono modelli sperimentali di PD.

Figure 3
Figura 3: Immagini rappresentative dell'etichettatura TH nel modello sperimentale 6-OHDA di PD, inclusi striato anteriore e substantia nigra compacta. L'immagine panoramica mostra l'estensione della lesione e gli zoom incorporati raffigurano l'innervazione e i corpi cellulari immunocolorati. (A) Immagine della sezione coronale striatale che mostra una lesione parziale indotta da 6-OHDA nell'emisfero destro. (B) Immagine della sezione coronale della substantia nigra e dell'area tegmentale ventrale dello stesso animale che mostra anche l'estensione della lesione. (C) Immagine della sezione coronale striatale che mostra una lesione indotta completa da 6-OHDA nell'emisfero destro. (D) Immagine della sezione coronale della substantia nigra e dell'area tegmentale ventrale dello stesso animale che mostra anche l'estensione della lesione. Barra della scala = 1,3 mm nella vista panoramica e 65 μm negli zoom integrati. Abbreviazioni: 6-OHDA = 6-idrossidopamina; TH = tirosina idrossilasi; PD = morbo di Parkinson; NL = non lesionato; L = lesionato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo documento descrive un protocollo per l'esecuzione di interventi chirurgici per microinfusione unilaterale di 6-OHDA nel MFB, in grado di causare lesioni robuste nei neuroni della via nigrostriatale e generare acinesia nell'animale. Viene inoltre descritto il protocollo per l'esecuzione del test di stepping, un test facilmente applicabile e non invasivo che può essere utilizzato per dimostrare il successo delle lesioni e valutare l'acinesia degli arti anteriori. Come presentato nei risultati rappresentativi, gli animali trattati con 6-OHDA hanno mostrato una riduzione del numero di passaggi di regolazione controlaterale alla lesione, il che significa che gli animali feriti da 6-OHDA mostrano una forte acinesia da 2 settimane dopo l'intervento chirurgico di infusione. L'acinesia, il fulcro di diversi trattamenti per la malattia, è uno dei principali sintomi motori del PD. Lo sviluppo dell'acinesia in un modello animale è significativo per gli studi preclinici del PD. Inoltre, questi risultati assomigliano a quelli riportati da Chang et al.37, che hanno confermato che gli animali che presentavano un numero inferiore di passi avevano una percentuale più alta di morte neuronale dopaminergica per immunoistochimica. Pertanto, gli animali che hanno presentato un numero inferiore di passaggi di regolazione controlaterale hanno maggiori probabilità di avere una lesione dopaminergica.

La valutazione del successo dell'intervento chirurgico e delle lesioni può anche essere confermata da altri test comportamentali come la rotazione indotta da anfetamine / apomorfina43, il test di oscillazione corporea elevata (EBST), il test del corridoio, il test del cilindro, le tecniche di etichettatura dei tessuti come l'immunoistochimica TH o persino la quantificazione della dopamina nello striato mediante HPLC42. Altre metodologie differiscono nella dose iniettata di 6-OHDA e nell'intervallo di tempo post-operatorio per la valutazione comportamentale. Una recente revisione43 riassume gli articoli più recenti che utilizzano questa metodologia e la differenza di dose, test comportamentali e intervallo post-operatorio tra di loro. Il modello di PD indotto da 6-OHDA non imita tutti i processi patologici legati alla malattia, come l'accumulo di corpi di Lewy, ma simula la morte dei neuroni dopaminergici della via striato-nigrale. Ciò consente lo studio di nuove terapie per i sintomi della malattia, che potrebbero portare ad un miglioramento della qualità della vita dei pazienti affetti da questa malattia.

Nonostante sia il modello più utilizzato, il modello 6-OHDA ha i suoi limiti come tutti gli attuali modelli PD. Il modello ha lo svantaggio di non rappresentare pienamente i meccanismi molecolari coinvolti nella patologia della malattia, come l'accumulo di proteine alfa-sinucleina e la formazione di corpi di Lewy. Il modello simula la morte dei neuroni dopaminergici della via nigrostriatale, corrispondente a una fase avanzata della malattia e che porta all'insorgenza dei soli sintomi motori. Questo lo rende inadatto allo studio del suo sviluppo naturale15,32. Il modello 6-OHDA descritto in questo articolo è solitamente caratterizzato da bassi tassi di mortalità. Il recupero post-operatorio è fondamentale per prevenire alti tassi di mortalità dovuti all'unione di una procedura invasiva e della lesione neurodegenerativa44. È possibile ridurre la mortalità prestando particolare attenzione durante il periodo di recupero post-operatorio con l'integrazione nutrizionale, la reidratazione e il controllo della temperatura esterna45. La combinazione di tali misure ha dimostrato di ridurre o addirittura eliminare drasticamente il tasso di mortalità30,46. Una causa comune di morte è l'inserimento dell'ago alla coordinata sbagliata nel cervello. È fondamentale controllare attentamente le coordinate durante questa delicata procedura chirurgica. Ciò eviterà danni ad altre strutture cerebrali (ad esempio, l'ipotalamo) da parte dell'ago, che può compromettere le azioni alimentari e di consumo dell'animale, portando a malnutrizione e disidratazione47.

Infine, è essenziale sottolineare che, sebbene il protocollo di anestesia ketamina-xilazina sia ben consolidato e utilizzato negli esperimenti sui roditori48, alcune prove suggeriscono che la combinazione di questi anestetici può essere insufficiente per un lungo periodo di intervento chirurgico. Inoltre, la sensibilità alla ketamina-xilazina può variare a seconda dei diversi ceppi di topi e ratti49,50. Un'alternativa può essere quella di indurre l'anestesia per inalazione di isoflurano. Uno studio ha dimostrato una perdita più rapida del riflesso di raddrizzamento con anestesia indotta da isoflurano rispetto alla ketamina-xilazina. Inoltre, il 60% dei ratti anestetizzati con ketamina-xilazina ha presentato riflessi consecutivi di pizzicamento del dito del piede durante la procedura chirurgica, anche con l'integrazione della dose. Al contrario, gli animali anestetizzati con isoflurano presentavano casi isolati di riflessi di pizzico della coda che scomparivano dopo l'aggiustamento del volume51.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione di ricerca di San Paolo (FAPESP, sovvenzione 2017/00003-0). Siamo grati per il Coordinamento per il miglioramento del personale dell'istruzione superiore (CAPES). Ringraziamo il Dr. Anthony R. West, il Dr. Heinz Steiner e il Dr. Kuei Y. Tseng per il supporto e il mentoring.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OHDA Sigma Aldrich H4381 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel
_6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid Sigma Aldrich 795437 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid=
Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD
RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09
_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO
6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL Hamilton 80539 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine Alfa Aeser J63723 https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump Insight EFF-311 https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino) Ourofino https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic Zoetis https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus Insight EFF-331 https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN

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Neuroscienze Numero 176
Il modello di ratto 6-idrossidopamina della malattia di Parkinson
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Guimarães, R. P., Ribeiro, D. L., dos Santos, K. B., Godoy, L. D., Corrêa, M. R., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62923, doi:10.3791/62923 (2021).

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