Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

نموذج الفئران 6-هيدروكسي دوبامين لمرض باركنسون

Published: October 27, 2021 doi: 10.3791/62923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

تم استخدام نموذج 6-hydroxydopamine (6-OHDA) لعقود لتعزيز فهم مرض باركنسون. في هذا البروتوكول ، نوضح كيفية إجراء آفات nigrostriatal أحادية الجانب في الفئران عن طريق حقن 6-OHDA في حزمة الدماغ الأمامي الإنسي ، وتقييم العجز الحركي ، والتنبؤ بالآفات باستخدام اختبار الخطوة.

Abstract

الأعراض الحركية لمرض باركنسون (PD) - بطء الحركة ، و akinesia ، والهزة أثناء الراحة - هي عواقب التنكس العصبي للخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء pars compacta (SNc) والعجز الشرطي الدوباميني. وقد استخدمت النماذج الحيوانية على نطاق واسع لمحاكاة علم الأمراض البشرية في المختبر. القوارض هي النماذج الحيوانية الأكثر استخداما ل PD بسبب سهولة التعامل معها وصيانتها. علاوة على ذلك ، فإن التشريح والآليات الجزيئية والخلوية والدوائية ل PD متشابهة في القوارض والبشر. إن ضخ السم العصبي ، 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA) ، في حزمة الدماغ الأمامي الإنسي (MFB) من الفئران يعيد إنتاج التدمير الشديد للخلايا العصبية الدوبامينية ويحاكي أعراض PD. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء الحقن المجهري من جانب واحد ل 6-OHDA في MFB في نموذج الفئران من PD ويظهر العجز الحركي الناجم عن 6-OHDA والآفات الدوبامينية المتوقعة من خلال اختبار الخطوة. يسبب 6-OHDA ضعفا كبيرا في عدد الخطوات التي يتم تنفيذها باستخدام الطرف الأمامي المقابل للطرف.

Introduction

الخصائص العصبية المرضية الرئيسية ل PD هي التنكس العصبي التدريجي المزمن للخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء pars compacta (SNc) ووجود أجسام ليوي التي تحتوي على بروتين α-synuclein 1. بينما تقوم الخلايا العصبية الدوبامينية SNc بإسقاط محاورها العصبية في المخطط من خلال المسار nigrostriatal ، يؤدي التنكس العصبي للخلايا العصبية في SNc إلى عجز الدوبامين في المخطط 2. يؤدي غياب الدوبامين في المخطط إلى اختلال التوازن في أنشطة مسارات التحكم الحركي المباشرة وغير المباشرة ، المسؤولة عن الأعراض الحركية الرئيسية ل PD: akinesia (الحركة البطيئة) ، بطء الحركة (صعوبة في بدء الحركات) ، تصلب العضلات ، والهزة عند الراحة3،4،5.

نظرا لأن الآليات الجزيئية والفسيولوجية المشاركة في ظهور مرض باركنسون لا تزال غير مفهومة تماما ، فإن العلاجات الرئيسية المتاحة حاليا تسعى إلى تخفيف الأعراض الحركية من خلال العلاجات الدوائية والتحفيز العميق للدماغ 6,7 والعلاجات الوراثية8 وزرع الخلايا9. لذلك ، يعد البحث قبل السريري أمرا أساسيا لتوضيح الآليات المشاركة في ظهور مرض باركنسون واكتشاف منهجيات جديدة للتشخيص المبكر والعلاجات الجديدة لمنع أو إيقاف انحطاط الخلايا العصبية المتأثرة ب PD10.

وقد استخدمت النماذج الحيوانية على نطاق واسع لمحاكاة علم الأمراض البشرية في المختبر، مما ساهم في تقدم الطب والعلوم11،12،13،14. ومع ذلك ، من الضروري التأكيد على أن الاختيار الصحيح للنموذج الحيواني أمر أساسي لنجاح الدراسة. لذلك ، يجب التحقق من صحة النموذج الحيواني في ثلاثة جوانب رئيسية: أ) صلاحية الوجه ، حيث يجب أن يكون للنموذج الحيواني خصائص علم الأمراض البشري. ب) الصلاحية البناءة ، حيث يجب أن يكون للنموذج الحيواني أساس نظري متين ؛ ج) الصلاحية التنبؤية ، حيث يجب أن تستجيب النماذج الحيوانية للعلاجات بطريقة مماثلة للعلاج السريري.

حاليا ، يتم استخدام العديد من الحيوانات كنماذج حيوانية ل PD. وتشمل المجموعات الرئيسية الثدييات، مثل القوارض والرئيسيات والخنازير الصغيرة والكلاب والقطط، ومجموعات أخرى مثل ذبابة الفاكهة وأسماك الزرد. القوارض هي النموذج الحيواني الأكثر كلاسيكية ل PD والأكثر استخداما بسبب سهولة التعامل معها وصيانتها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن آليات التشريح والآليات الجزيئية والخلوية والدوائية ل PD متشابهة في القوارض والبشر15.

قامت مراجعة نشرها كين وزملاؤه في عام 2019 بتحليل منهجيات النموذج الحيواني الرئيسية المستخدمة في PD في 2000s ووجدت أن النموذج الحيواني الأكثر استخداما ينطوي على السموم العصبية مثل 6-hydroxydopamine (6-OHDA) و 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP). تسبب كل من السموم العصبية خلل تنظيم الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الدوبامينية في المسار الزنجي ، مما يؤدي إلى موت الخلايا16. وهناك نموذج آخر يستخدم على نطاق واسع ينطوي على التلاعب الجيني من خلال طفرة في جينات محددة تشارك في ظهور مرض باركنسوندريا، مما يسبب خلل تنظيم الميتوكوندريا17. تستخدم نماذج السموم العصبية بشكل شائع لتقييم ومقارنة العلاجات ، في حين تستخدم النماذج الجينية لدراسة تطوير العلاجات الوقائية و PD15 مجهول السبب.

تم اكتشاف السم العصبي MPTP ليسبب باركنسون في منتصف 1980s بعد أن استخدم سبعة مرضى المادة وأظهرت أعراض PD شديدة. بالإضافة إلى الأعراض ، استجاب المرضى للعلاج باستخدام L-DOPA ، مما جعل الباحثين يربطون الجزيء مباشرة ب PD. بعد نشر الحالة في عام 1986 ، بدأ العديد من الباحثين في استخدام MPTP في أبحاث PD قبل السريرية 18. وجد الباحثون أنه كونه جزيئا محبة للدهون ، يمكن ل MPTP عبور الحاجز الدموي الدماغي (BBB) وتحويله إلى MPP + 19. تتراكم هذه المادة السامة داخل الخلايا العصبية وتسبب أضرارا للمجمع 1 من السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى وفاة الخلايا العصبية الدوبامينية20.

تم استخدام نموذج السموم العصبية 6-OHDA لأول مرة للحث على انحطاط الخلايا العصبية أحادية الأمين في المسار nigrostriatal في عام 196821. يستخدم نموذج 6-OHDA بشكل شائع للتسبب في التنكس العصبي في المسار nigrostriatal لأنه تناظري الدوبامين وسام للخلايا المحتوية على الكاتيكولامين. بعد دخول 6-OHDA إلى الدماغ ، قد يتم تناوله بواسطة ناقل الدوبامين (DAT) في الخلايا العصبية الدوبامينية ، مما يؤدي إلى انحطاط المسار nigrostriatal22. نظرا لأن 6-OHDA لا يخترق BBB ، فيجب إعطاؤه مباشرة من خلال الحقن المجسمة داخل المخ 23. غالبا ما يتم الجمع بين مثبط امتصاص النورادرينالين والحقن المجهري 6-OHDA للحفاظ على ألياف النورادرينالية وتوفير تنكس أكثر انتقائية للخلايا العصبية الدوبامينية24.

بعد أن يأخذ DAT 6-OHDA ، سوف يتراكم في سيتوسول الخلايا العصبية ، مما ينتج عنه أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ويؤدي إلى موت الخلايا 15. وكثيرا ما تستخدم ثلاثة نماذج مختلفة من الآفات من 6-OHDA: أ) الآفات إلى SNc25,26; ب) آفات في المخطط 27،28 ؛ ج) الآفات إلى MFB29,30. الآفات الناجمة في المخطط تؤدي إلى تنكس بطيء ورجعي للخلايا العصبية الدوبامينية في SNpc. وعلى النقيض من ذلك، تؤدي الآفات الناجمة في SNpc وMFB إلى انحطاط سريع وكامل للخلايا العصبية، مما يؤدي إلى أعراض باركنسون أكثر تقدما31.

الحقن الأحادي أو الثنائي ل 6-OHDA يمكن أن يسبب التنكس العصبي في الخلايا العصبية الدوبامينية. 6-OHDA لا يسبب دائما أضرارا جسيمة للخلايا العصبية. في بعض الأحيان ، يؤدي الحقن إلى تلف جزئي ، والذي يستخدم أيضا لمحاكاة المراحل المبكرة من PD32. يستخدم الحقن من جانب واحد بشكل أكثر شيوعا بسبب قدرة النموذج على تقييم العجز الحركي للحيوان والتنبؤ بفقدان الخلايا من خلال اختبارات مثل الدوران الناجم عن الأمفيتامين / الأبومورفين واختبار الخطوة29. تستخدم الحقن الثنائية بشكل أكبر لتقييم الذاكرة المكانية والإدراك33.

اختبار الدوران الناجم عن الأمفيتامين/الأبومورفين هو اختبار سلوكي يستخدم عادة للتنبؤ بفقدان الخلايا في المسار الزنجي. يتم تعريفه على أنه عملية تؤدي فيها الإدارة المتكررة لناهضات الدوبامين إلى تكثيف السلوك الدوراني في الحيوانات المصابة ب 6-OHDA34. يتكون السلوك الدوراني من تحديد مقدار الدوران الجانبي الناجم عن الأمفيتامين أو المنعطفات المعاكسة التي يسببها الأبومورفين في القوارض المصابة من جانب واحد. تم انتقاد السلوك الدوراني الناجم عن المخدرات لأن الدوران لا يتوافق مع أعراض PD لدى البشر ويمكن أن يتأثر بمتغيرات مثل التسامح والتوعية و "التحضير"35.

التمهيد هو واحد من أهم العوامل في هذه الاختبارات السلوكية. تم الإبلاغ عن بعض الحالات التي أدت فيها جرعة واحدة من L-DOPA إلى فشل في السلوكيات الدورانية36. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عامل حاسم آخر يتصل بالتطبيق المشترك للاختبار الناجم عن الأمفيتامين والاختبار الناجم عن الأبومورفين للاستخدام المتوازي وهو أنهما يقيسان نقاط نهاية مختلفة بسبب آليات العمل المختلفة، مما يعكس تعطيل آليات ومسارات مختلفة للتشوير. وعلاوة على ذلك، فإن الاختبار الناجم عن الأمفيتامين أكثر دقة لقياس الآفات النجمية فوق 50-60 في المائة، في حين أن الاختبار الناجم عن الأبوكومورفين أكثر دقة بالنسبة للآفات التي تزيد عن 80 في المائة 37.

ظهر اختبار الخطوة كاختبار سلوكي يشير إلى العجز المرتبط بتنكس الخلايا العصبية الدوبامينية والآثار العلاجية. وهو يتيح تحليل akinesia الناجمة عن آفة 6-OHDA في الخلايا العصبية الدوبامين دون إجراء يسببه الدواء. وعلاوة على ذلك، فإن الاختبار راسخ وشائع الاستخدام منذ عام 1995، عندما وصفه أولسون وآخرون لأول مرة(35). في عام 1999 ، قام Chang et al.38 أيضا بتحليل ومقارنة أداء الفئران في اختبار الخطوة مع مستوى التنكس الناجم عن 6-OHDA ووجدوا أن الحيوانات التي كان أداؤها أسوأ في اختبار الخطوة كان لديها أيضا انحطاط أكثر أهمية من الخلايا العصبية الدوبامينية.

اختبار التخطي هو طريقة ممتازة للتنبؤ بالضرر النغروي الحاد للدوبامين في الفئران المصابة ب 6-OHDA. تشير الأدلة إلى أن العجز الحركي يظهر في الطرف الأمامي المقابل لضخ 6-OHDA أثناء اختبار الخطوة عندما تكون درجة فقدان الدوبامين في SNc >90٪ 39. تصف هذه الورقة البروتوكولات والمنهجيات والمواد المستخدمة لإجراء الجراحة المجسمة للضخ الأحادي الجانب ل 6-OHDA في MFB من الفئران وكيفية التنبؤ بآفات الدوبامين التي يسببها السم من خلال اختبار الخطوة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات المبادئ الأخلاقية للمجلس الوطني لمراقبة التجارب على الحيوانات (CONCEA) وقانون أروكا (القانون 11.794/2008) ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات المحلية (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5).

1. إعداد الأدوية

  1. التخدير مع الكيتامين / زيلازين
    ملاحظة: جرعة الكيتامين المستخدمة هي 70 ملغم / كغم ، وجرعة الزيلازين هي 10 ملغ / كغ.
    1. لإعداد 1 مل من المخدر باستخدام محلول الكيتامين 100 ملغم / مل ومحلول زيلازين 20 ملغ / مل ، اجمع بين 0.35 مل من محلول الكيتامين ، و 0.25 مل من محلول زيلازين ، و 0.4 مل من محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪. إدارة محلول التخدير في حجم نهائي من 2 مل / كجم.
      ملاحظة: الكيتامين جنبا إلى جنب مع xylazine يمكن أن تنتج التخدير لمدة 60-80 دقيقة. إذا كان الحيوان لا يزال لديه ردود فعل (على سبيل المثال ، الساق الخلفية و / أو رد الفعل الوامض) ، فقم بإعطاء 10٪ إضافية من الجرعة الفردية.
  2. إيميبرامين
    ملاحظة: الجرعة الفردية من الإيميبرامين المستخدمة هي 20 مغ/كغ.
    1. لتحضير 1 مل من محلول إيميبرامين 20 مجم / مل ، اجمع بين 20 مجم من الإيميبرامين و 1 مل من محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪. إدارة محلول الإيميبرامين عند حجم نهائي قدره 1 مل / كجم.
  3. ميلوكسيكام
    ملاحظة: الجرعة الفردية من الميلوكسيكام المستخدمة هي 1 مغ/كغ.
    1. لإعداد 1 مل من محلول ميلوكسيكام 1 ملغم / مل ، اجمع 0.05 مل من ميلوكسيكام 2٪ و 0.95 مل من محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪. إدارة محلول ميلوكسيكام في حجم نهائي من 1 مل / كغ مرة واحدة في اليوم لمدة يومين.
  4. حمض الأسكوربيك 0.1٪
    1. لإعداد 1 مل من حمض الأسكوربيك 0.1 ٪ ، الجمع بين 1 ملغ من حمض الأسكوربيك و 1 مل من محلول ملحي معقم 0.9 ٪.
  5. 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA)
    ملاحظة: 6-OHDA هو سم عصبي يستخدم لتدمير الخلايا العصبية الدوبامينية والنورادرينالية بشكل انتقائي في الدماغ. تجنب التلامس المباشر مع الجلد والأغشية المخاطية للعينين والأنف والفم. عند التعامل مع 6-OHDA ، ارتد قفازات النتريل المزدوجة ، ومعطف المختبر ، وثوب يمكن التخلص منه ، وحماية العين ، والقناع الجراحي أو درع الوجه. إجمالي حجم التسريب للسم هو 4 ميكرولتر / ، والكمية الفردية هي 10 ميكروغرام من 6-OHDA /.
    1. لتحضير 1 مل من 6-OHDA بتركيز نهائي قدره 2.5 ملغ / مل ، امزج 2.5 ملغ من 6-OHDA و 1 مل من محلول ملحي بنسبة 0.9 ٪ يحتوي على 0.1 ٪ من حمض الأسكوربيك (الموصوف أعلاه).
      ملاحظة: 6-OHDA حساس للضوء ويتحلل بشكل أسرع عند تعرضه للضوء الساطع. يجب التعامل معها بشكل صحيح وتخزينها في بيئة محمية من الضوء. إذا كان لون المحلول محمرا ، فتجاهله.
  6. ليدوكائين هيدروكلوريد (2٪)
    1. إعداد محلول يدوكائين 2 ٪ للتطبيق المحلي على الحيوان.
      ملاحظة: الجرعة القصوى التي يمكن تطبيقها هي 7 ملغم/كغ.
  7. تعليق بولي مضاد حيوي
    ملاحظة: يجب تحضير تعليق المضادات الحيوية المتعددة مع الستربتومايسين والبنسلين (انظر جدول المواد) في وقت التطبيق مع كامل حجم المخفف ، الذي ترافق أمبولته القارورة مع المسحوق.
    1. قم بإزالة القرص المعدني الموجود على السدادة المطاطية. تطهير سدادة المطاط مع الكحول.
    2. باستخدام حقنة بإبرة 23 جم ، حقن المخفف في القارورة. قم بإزالة الإبرة وهز القارورة بقوة حتى يصبح التعليق متجانسا تماما. حقن القليل من الهواء في القارورة وسحب الحجم المطلوب من التعليق.
    3. إدارة حقن عضلي عميق ، وسحب المكبس قبل حقن الدواء لضمان عدم الوصول إلى الأوعية الدموية.
      ملاحظة: الحجم النهائي للتعليق الذي سيتم تطبيقه هو 0.5 ملليلتر/كجم.

2. إعداد المواد

ملاحظة: اتبع دائما التعليمات المرفقة مع ورقة بيانات سلامة المواد عند التعامل مع المواد الكيميائية.

  1. جهاز تاكسي مجسم.
    1. ضع الجهاز المجسمة على مقعد مستقر ونظيف مع إضاءة مناسبة لإجراء الجراحة. تطهير الجهاز مع 70 ٪ من الإيثانول.
    2. تحقق مما إذا كانت قضبان الأذن والقواطع الخاصة بالجهاز محاذاة بشكل صحيح. ضع بطانية حرارية حيث سيتم وضع الحيوان أثناء الجراحة للبقاء دافئا أثناء العملية. مراقبة درجة حرارة الحيوان مع مسبار مستقيمي دقيق.
      ملاحظة: يجب أن تكون البطانية الحرارية عند 37.5 درجة مئوية بحيث يحافظ الحيوان على درجة حرارة الجسم 37 درجة مئوية.
  2. نظام التسريب الدقيق
    1. املأ (70-80٪) حقنة هاميلتون (50 ميكرولتر أو حسب الرغبة) متصلة بأنابيب دقيقة من البولي إيثيلين من الدرجة الطبية وإبرة بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) وتحقق من عدم وجود تسربات من خلال النظام.
    2. اسحب الهواء عبر النظام بحيث تفصل فقاعة هواء واحدة ddH2O في المحقنة عن محلول 6-OHDA في الأنبوب الدقيق.
      ملاحظة: يتجنب هذا الإجراء تلويث حقنة هاميلتون ب 6-OHDA ويسمح باستخدام العديد من الفئران في نفس اليوم التجريبي.
    3. ضع حقنة هاميلتون على مضخة التسريب بحيث يتم تثبيتها بإحكام ويكون مكبس المحقنة موازيا للإطار الذي سيتحرك لدفعه. اضبط مضخة التسريب على سرعة 0.5 ميكرولتر / دقيقة بحيث يستمر التطبيق الكلي ل 4 ميكرولتر من 6-OHDA لمدة 8 دقائق. اختبر نظام التسريب عن طريق التأكد من عدم وجود تسربات وأن التسريب يحدث وفقا للوقت والحجم المحددين مسبقا.
    4. قم بتوصيل إبرة التسريب المتصلة بالأنبوب الدقيق بالجهاز في نهاية الذراع المجسمة وتحقق من وضع الإبرة بزاوية 180 درجة على السطح. تأكد من أن الإبرة مستقيمة وغير منحنية.
      ملاحظة: تحقق من جميع الإجراءات الموصوفة بعناية لأنه إذا لم يعمل أي من العناصر الموجودة في نظام التسريب بشكل صحيح ، فقد يعرض نجاح الجراحة للخطر.
  3. خياطه
    1. استخدم خياطة نايلون معقمة غير قابلة للامتصاص بإبرة دائرة 3/8 لخياطة الشق بعد الجراحة.
  4. موقع التعافي بعد الجراحة
    1. ضع صندوقا سكنيا نظيفا ومعقما حيث يمكن مراقبة الحيوانات حتى يتم استردادها بالكامل (تستجيب للمس والتلاعب). ضع بطانية حرارية في الصندوق للتنظيم الحراري.
      ملاحظة: نظرا لأهمية التنظيم الحراري، قم بتضمين مصدر حرارة تكميلي للحفاظ على درجة حرارة الجسم إذا لزم الأمر.

3. الإجراء الجراحي

ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم الاحتفاظ بذكور فئران سبراغ داولي البالغة (200-250 جم) تحت ظروف درجة حرارة خاضعة للرقابة (22 ± 2 درجة مئوية)، وتبادل الهواء (15-20 تبادلا/ساعة)، ودورات الضوء والظلام (12 ساعة/12 ساعة)، مجمعة في صناديق بها 3 أو 4 حيوانات، مع حرية الوصول إلى الطعام والماء.

  1. وزن الحيوانات لمراقبة تغيرات الوزن في الأيام التالية للجراحة. حساب جرعة الأدوية التي سيتم إعطاؤها.
  2. إدارة إيميبرامين داخل الصفاق قبل 30 دقيقة من الجراحة (~ 10-15 دقيقة قبل إعطاء التخدير) ، وذلك باستخدام إبرة 27 غرام وحقنة 1 مل.
    ملاحظة: سوف يمنع الإيميبرامين ناقل النورادرينالين (NAT) ويمنع امتصاص 6-OHDA بواسطة الخلايا العصبية النورادرينالية ، مما يجعل الآفة أكثر انتقائية للخلايا العصبية الدوبامينية40.
  3. بعد 10-15 دقيقة من إعطاء الإيميبرامين ، قم بإدارة الكيتامين داخل الصفاق / تخدير زيلازين باستخدام إبرة 27 جم ومحقنة 1 مل. انتظر حتى يتم تخدير الحيوان بالكامل. تحقق من أن الحيوان تحت التخدير العميق عندما لا يستجيب الحيوان لمعسر الساق الخلفية ولا يظهر رد فعل وميض.
  4. حلق فرو الفئران في منطقة الرأس حيث سيحدث الشق.
  5. ضع الفئران في الجهاز المجسم.
    1. ضع الرأس فوق شريط القاطعة وقم بإصلاح الشريط على بعد 3.3 مم أسفل الخط بين الأذنين.
    2. ضع قضبان الأذن ، جانب واحد في كل مرة. ضع قضيب القاطعة وقضبان الأذن بحيث يكون الجزء العلوي من الجمجمة مستقيما وموازيا للسطح.
    3. اضبط مشبك الأنف واختبر أن الرأس ثابت ولا يتحرك إلى أي من الجانبين.
  6. ضع مرهم عيون معقم على عيون الفئران لمنع القرنيات من الجفاف.
  7. ضع البوفيدون اليود على المنطقة المراد شقها لتطهير الموقع.
  8. تطبيق يدوكائين المحلية لتسكين منطقة شق. لا تتجاوز 7 مغ/كغ.
  9. إدارة الميلوكسيكام تحت الجلد باستخدام إبرة 27 غرام ومحقنة 1 مل.
    ملاحظة: ميلوكسيكام هو مسكن مضاد للالتهابات غير الستيرويدية من شأنه أن يساعد الحيوان على التعافي بعد الجراحة.
  10. إدارة تعليق المضادات الحيوية المتعددة في العضل باستخدام إبرة 23 غرام ومحقنة 1 مل.
    ملاحظة: يتم إعطاء تعليق المضادات الحيوية المتعددة كعلاج وقائي لتجنب الالتهابات البكتيرية المحتملة في مرحلة التعافي بعد الجراحة.
  11. تحقق من أن الحيوان في حالة تخدير عميق عن طريق التحقق من وجود ردود فعل وميض أو ردود فعل الأطراف الخلفية عن طريق قرص المخلب الخلفي مع ملاقط.
  12. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق يبلغ ~ 1.5 سم في المنطقة التي سيحدث فيها الحقن المجهري.
    ملاحظة: يتم تطبيق تقنيات معقمة من هذه النقطة حتى إغلاق الجرح.
  13. نظف منطقة الجمجمة بمسحات القطن وبراعم القطن حتى يمكن رؤية Bregma و Lambda. ضع علامة على Bregma و Lambda بقلم ناعم معقم.
  14. تحقق من أن الإحداثيات الظهرية البطنية (DV) لبريغما ولامدا متشابهة. إذا كانت مختلفة ، فأعد ضبط الفئران في الجهاز المجسمة حيث لا يتم وضع رأس الفئران بشكل صحيح.
  15. دون الإحداثيات الأمامية الخلفية (AP) والمتوسطة، للبريغما.
  16. انتقل إلى إحداثيات AP و ML الخاصة ب MFB الأيمن وفقا ل 41: AP: -4.3 مم ، ML: 1.6 مم من Bregma.
  17. ضع علامة على منطقة التنقيب بقلم ناعم معقم.
  18. باستخدام مثقاب معقم ، اخترق جمجمة الحيوان ببطء ، مع الحرص على عدم إصابة الأم الجافية.
  19. ضع إبرة الحقن المجهري على الأم الجافية ولاحظ إحداثيات DV. خذ إبرة رقيقة وقم بتمزيق الأم الجافية بلطف. أدخل الإبرة في إحداثيات DV (8.3 مم بطنية) من MFB ، حيث سيتم الحقن المجهري.
  20. قم بتشغيل مضخة الحقن المجهري لإطلاق محلول 6-OHDA في MFB. عند الانتهاء من الحقن المجهري ، تحقق من حقنة هاميلتون لمعرفة ما إذا كان قد تم حقن 4 ميكرولتر من 6-OHDA.
    ملاحظة: يجب أن يستمر الحقن المجهري لمدة 8 دقائق.
  21. بعد إعطاء 6-OHDA ، انتظر لمدة 10 دقائق قبل إزالة الإبرة لتجنب التدفق العكسي للدواء. إزالة إبرة الحقن المجهري ببطء من دماغ الحيوان.
  22. تطهير منطقة الشق مرة أخرى مع البوفيدون اليود.
  23. خياطة منطقة الشق مع ~ 3-4 عقدة جراحية.
    ملاحظة: يجب ألا تكون العقدة قوية جدا أو فضفاضة جدا.
  24. قم بإزالة الفئران من جهاز التاكسي المجسمة ووضعها في صندوق نظيف للتعافي على البطانية الحرارية حتى يتعافى الحيوان تماما من التخدير. راقب الحيوان كل 15 دقيقة حتى يستيقظ تماما من التخدير.

4. إجراءات ما بعد الجراحة

  1. راقب وزن الحيوانات خلال الأيام الأربعة التالية بعد الجراحة. عالجهم بالميلوكسيكام تحت الجلد مرة واحدة في اليوم لمدة يومين بعد الجراحة ، مع ضبط الجرعة لوزن كل يوم.
    ملاحظة: يجب تقييم جميع الحيوانات للحاجة إلى المسكنات في اليوم الثالث بعد الجراحة.
  2. تحقق من الشقوق يوميا لمدة أربعة أيام على الأقل للتأكد من عدم إصابتها. ابحث عن الحرارة والتورم والألم والإفرازات والاحمرار حتى تلتئم الشقوق.
  3. تحقق من الشهية واستهلاك المياه من خلال مراقبة وزن جسم الحيوان. إعطاء الأعلاف الرطبة لتشجيع الحيوانات على تناول الطعام. راقب حالة الجسم العامة وموقفه وحركته يوميا لمدة أربعة أيام على الأقل بعد الجراحة. إزالة الغرز بعد 7-10 أيام من الجراحة.
    ملاحظة: يجب قتل الحيوانات الرحيم إذا تم الوصول إلى نقاط النهاية المحددة في الإجراءات الأخلاقية.

5. اختبار التدرج

  1. تدريب
    ملاحظة: يجب تدريب الحيوانات لمدة ثلاثة أيام قبل الاختبار. وفقا للبروتوكول الموضح أدناه ، يجب أن يحدث التدريب مرتين في اليوم ، مرة واحدة في الصباح ومرة واحدة في فترة ما بعد الظهر ، أو مع فاصل زمني لا يقل عن 2 ساعة بين الجلسات. تتبع الوقت باستخدام جهاز توقيت.
    1. اليوم 1
      1. في الجلسة الأولى ، تعامل مع الفئران عن طريق الاحتفاظ بها في قفازات لمدة 1-2 دقيقة تقريبا للسماح للفئران بالتعرف على المعالج / المجرب.
      2. في الدورة الثانية ، بالتناوب بين عقد الفئران لمدة 20 ثانية ووضعها على جدول البروتوكول لمدة 20 ثانية. كرر هذه الخطوة التدريبية لمدة 3 دقائق لتعريف الفئران بالإعداد التجريبي لاختبار الخطوة.
    2. اليوم 2
      1. في الجلسة الأولى ، ضع كلا من الكفوف الأمامية للفئران على طاولة البروتوكول عن طريق عقد الكفوف الخلفية والظهر بيد واحدة. قم بإمالة الفئران لأسفل رأسا على عقب بزاوية 45 درجة إلى السطح المستوي لطاولة البروتوكول. تحرك أفقيا على الطاولة من النهاية إلى النهاية ، مما يسمح للفئران بالخطوة على الطاولة بكلا الكفوف (تغطية 90 سم في 4 ثوان). عقد الفئران في قفازات لمدة 10 ثوان ، مما يسمح لها بالراحة ؛ كرر هذا النمط لمدة 3 دقائق.
      2. في الجلسة الثانية ، ضع مخلبا أماميا واحدا من الفئران على طاولة البروتوكول عن طريق إمساك مقدمة أخرى بيد واحدة وأمسك ظهر الفئران ومخالبها الخلفية باليد الأخرى (انظر الخطوة 5.1.2.1). تحرك أفقيا على الطاولة من النهاية إلى النهاية في 4 ثوان ، مما يسمح للفئران بخطوتها بمخلبها الحر. امسك الفئران في قفازات لمدة 10 ثوان ، مما يسمح لها بالراحة ، وكرر ذلك مع forepaw آخر ، تليها فترة الراحة. كرر هذا النمط ، بالتناوب بين المخالب الأمامية ، واسترح لمدة 3 دقائق.
      3. كرر خطوة التدريب 3 مرات لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
    3. اليوم 3
      1. في الجلسة الأولى، اتبع الإجراء الموضح في الخطوة 5.1.2.2 لمقدمة واحدة. كرر مع forepaw آخر ، تليها فترة الراحة. كرر هذا النمط ، بالتناوب بين المخالب الأمامية ، واسترح لمدة 3 دقائق.
      2. في الجلسة الثانية، اتبع الإجراء الموضح في الخطوة 5.1.2.2.
  2. اختبر
    ملاحظة: يتم إجراء اختبار الخطوة قبل الجراحة ، بعد 2 و 4 أسابيع من الجراحة المجسمة ، لتقييم أكينيزيا الطرف الأمامي المقابل والإصابة المحتملة الناجمة عن 6-OHDA.
    1. امسك الفئران بزاوية 45 درجة على السطح ، مما أدى إلى شل حركة أطرافه الخلفية والسماح لطرف واحد فقط من الأطراف الأمامية بالراحة على المنصة ، كما هو موضح أعلاه ، لليوم 3 من التدريب.
    2. اسحب الفئران إلى الأمام على مسافة 90 سم في 4 ثوان ، مع وضع المخلب الأيمن أو الأيسر على السطح.
    3. تدوين الملاحظات وتحديد عدد خطوات الضبط الأمامي المتخذة مع كل مخلب في كل اتجاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقييم آفة الدوبامين
يتيح اختبار التخطي تقييم أكينيزيا الطرف الأمامي المقابل للآفة واختيار الحيوانات ذات الآفة المحتملة للمسار الزنجي البري الناجم عن ضخ 6-OHDA (الشكل 1). كشفت المقارنة بين أداء اختبار خطوة الطرف الأمامي المقابل قبل الجراحة وأسبوعين و 4 أسابيع بعد الجراحة عن تفاعل (F2,74 = 93.63 ؛ p < 0.0001 ؛ مقاييس متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA) بين الوقت (قبل الجراحة ، 2 ، و 4 أسابيع بعد الجراحة) والعلاج (تشغيل صوري و 6-OHDA-آف). أظهر اختبار بونفيروني اللاحق انخفاضا كبيرا في عدد الخطوات المقابلة للآفة في الحيوانات التي تتلقى 6-OHDA في MFB الأيمن مقارنة بالحيوانات التي تديرها الشام في الأسبوع الثاني والرابع بعد الجراحة (p < 0.0001) (الشكل 1). وكانت النتائج متسقة مع نتائج الدراسات السابقة35.

من المهم ملاحظة أنه عندما لا تكتمل آفة الدوبامين ، فإن نتائج اختبار الخطوة لن تصل إلى درجة نجاح النتائج المقدمة في هذه الدراسة. أجرت دراسة منشورة سابقا اختبار التخطي والكيمياء النسيجية المناعية لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) مع الحيوانات المصابة بآفة الدوبامين الجزئية بعد إجراء عملية جراحية للحقن المجهري ل 6-OHDA باتباع نفس البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة. إن اكتشافهم لعجز جزئي في اختبار الخطوة (4-8 خطوات) هو نتيجة لآفة دوبامين جزئية تبلغ ~ 60٪ من الخلايا العصبية39.

Figure 1
الشكل 1: تقييم اختبار الخطوات المضاد قبل وبعد الجراحة للتسريب الأحادي الجانب ل 6-OHDA أو السيارة في MFB الأيمن. تشير البيانات إلى أن الحيوانات التي تتلقى 6-OHDA كان لديها انخفاض كبير في عدد الخطوات مع الطرف الأمامي الأمامي المقابل للآفة في الأسبوعين الثاني والرابع بعد الجراحة (****p < 0.0001 مقابل صورية بعد الجراحة ؛ مقاييس متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA ، Bonferroni post-hoc). البيانات المعبر عنها كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط. السيارة عبارة عن محلول ملحي بنسبة 0.9٪ يحتوي على 0.1٪ من حمض الأسكوربيك. تستند النتائج إلى 14 حيوانا في مجموعة صورية و 25 حيوانا في مجموعة 6-OHDA. الاختصارات: P = ما قبل الجراحة. 2 = أسبوعين بعد الجراحة. 4 = أربعة أسابيع بعد الجراحة; 6-OHDA = 6-هيدروكسي دوبامين ؛ MFB = حزمة الدماغ الأمامي الإنسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لم تكشف المقارنة بين أداء اختبار خطوة الطرف الأمامي الجانبي قبل الجراحة وأسبوعين و 4 أسابيع بعد الجراحة عن أي تفاعل (F2,74 = 0.4492 ؛ p = 0.6399 ؛ مقاييس متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA) بين الوقت (قبل الجراحة و 2 و 4 أسابيع بعدها) والعلاج (تشغيل صوري و 6-OHDA-آف). لم يظهر اختبار بونفيروني اللاحق أي فرق كبير في عدد الخطوات الجانبية للآفة في الحيوانات التي تتلقى 6-OHDA في MFB الأيمن مقارنة بالحيوانات الوهمية (الشكل 2).

Figure 2
الشكل 2: تقييم اختبار التخطي الجانبي قبل وبعد الجراحة للضخ الأحادي الجانب ل 6-OHDA أو السيارة في MFB الأيمن. تشير البيانات إلى أن الحيوانات التي تتلقى 6-OHDA لم تقلل بشكل كبير من عدد الخطوات مع الطرف الأمامي الأمامي إلى الآفة في الأسبوعين الثاني والرابع بعد الجراحة (p > 0.05 مقابل صورية بعد الجراحة ؛ مقاييس متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA ، Bonferroni post-hoc). البيانات المعبر عنها كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط. السيارة عبارة عن محلول ملحي بنسبة 0.9٪ يحتوي على 0.1٪ من حمض الأسكوربيك. تستند النتائج إلى 14 حيوانا في مجموعة صورية و 25 حيوانا في مجموعة 6-OHDA. الاختصارات: P = ما قبل الجراحة. 2 = أسبوعين بعد الجراحة. 4 = أربعة أسابيع بعد الجراحة; 6-OHDA = 6-هيدروكسي دوبامين ؛ MFB = حزمة الدماغ الأمامي الإنسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

واتساقا مع الدراسات السابقة التي أجريت على الحيوانات المصابة ب 6 آفات OHDA42، يسمح التحليل النسيجي (الشكل 3) الذي يقارن بين TH من المخطط في نصفي الكرة الأرضية بإجراء تقييم موثوق به لعجز DA في المخطط. لذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول السلوكي بالاقتران مع الطرق الكيميائية النسيجية المناعية في الدراسات التي تنطوي على نماذج تجريبية من PD.

Figure 3
الشكل 3: صور تمثيلية لوضع العلامات على TH في النموذج التجريبي 6-OHDA ل PD ، بما في ذلك المخطط الأمامي والمادة السوداء المدمجة. توضح الصورة البانورامية امتداد الآفة ، وتصور التكبيرات الداخلية التعصيب e أجسام الخلايا الملطخة بالمناعة. (أ) صورة للقسم الإكليلي المستقيمي تظهر إصابة جزئية ناجمة عن 6-OHDA في نصف الكرة الأيمن. (ب) صورة للمادة السوداء والقسم الإكليلي للمنطقة التاجية البطنية من نفس الحيوان تظهر أيضا امتداد الآفة. (ج) صورة للقسم الإكليلي المستقيمي تظهر إصابة كاملة ناجمة عن 6-OHDA في نصف الكرة الأيمن. (د) صورة للمادة السوداء والقسم الإكليلي للمنطقة التاجية البطنية من نفس الحيوان تظهر أيضا امتداد الآفة. شريط المقياس = 1.3 مم في العرض البانورامي و65 ميكرومتر في التكبير/التصغير الداخلي. الاختصارات: 6-OHDA = 6-هيدروكسي دوبامين; TH = هيدروكسيلاز التيروزين. PD = مرض باركنسون; NL = غير آفة ؛ L = مصابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصف هذه الورقة بروتوكولا لإجراء عملية جراحية للتسريب المجهري من جانب واحد من 6-OHDA في MFB ، قادر على التسبب في آفات قوية في الخلايا العصبية في المسار nigrostriatal وتوليد akinesia في الحيوان. كما تم وصف بروتوكول إجراء اختبار الخطوة، وهو اختبار سهل التطبيق وغير جراحي يمكن استخدامه لإثبات نجاح الآفات وتقييم حالة الحقن الأمامية. كما هو موضح في النتائج التمثيلية ، أظهرت الحيوانات التي تتلقى 6-OHDA انخفاضا في عدد خطوات ضبط المقابل للإصابة ، مما يعني أن الحيوانات المصابة ب 6-OHDA تظهر أكينيزيا قوية من 2 أسابيع بعد جراحة التسريب. Akinesia - محور العديد من العلاجات للمرض - هي واحدة من الأعراض الحركية الرئيسية لمرض باركنسون. يعد تطوير akinesia في نموذج حيواني أمرا مهما للدراسات قبل السريرية ل PD. علاوة على ذلك ، تشبه هذه النتائج تلك التي أبلغ عنها تشانغ وآخرون 37 ، الذين أكدوا أن الحيوانات التي تقدم عددا أقل من الخطوات لديها نسبة أعلى من موت الخلايا العصبية الدوبامينية بواسطة الكيمياء النسيجية المناعية. لذلك ، فإن الحيوانات التي قدمت عددا أقل من خطوات التعديل المعاكسة هي أكثر عرضة للإصابة بالدوبامين.

يمكن أيضا تأكيد تقييم نجاح الجراحة والآفات من خلال اختبارات سلوكية أخرى مثل الدوران الناجم عن الأمفيتامين / الأبومورفين 43 ، أو اختبار تأرجح الجسم المرتفع (EBST) ، أو اختبار الممر ، أو اختبار الأسطوانة ، أو تقنيات وضع العلامات على الأنسجة مثل الكيمياء النسيجية المناعية TH ، أو حتى تحديد كمية الدوبامين في المخطط بواسطة HPLC42. تختلف المنهجيات الأخرى في الجرعة المحقونة من 6-OHDA والفاصل الزمني بعد الجراحة للتقييم السلوكي. تلخص مراجعة حديثة43 أحدث المقالات باستخدام هذه المنهجية والفرق في الجرعة والاختبارات السلوكية والفاصل الزمني بعد الجراحة بينهما. لا يحاكي نموذج PD الناجم عن 6-OHDA جميع العمليات المرضية المتعلقة بالمرض ، مثل تراكم أجسام ليوي ، ولكنه يحاكي موت الخلايا العصبية الدوبامينية في المسار المخطط النيجيري. وهذا يمكن من دراسة علاجات جديدة لأعراض المرض ، والتي يمكن أن تؤدي إلى تحسن في نوعية حياة المرضى المصابين بهذا المرض.

على الرغم من كونه النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع ، إلا أن نموذج 6-OHDA له حدوده مثل جميع نماذج PD الحالية. النموذج له عيب في عدم تمثيل الآليات الجزيئية المشاركة في أمراض المرض بشكل كامل ، مثل تراكم بروتينات ألفا سينوكلين وتشكيل أجسام ليوي. يحاكي النموذج موت الخلايا العصبية الدوبامينية في المسار nigrostriatal ، المقابلة لمرحلة متأخرة من المرض وتؤدي إلى ظهور الأعراض الحركية فقط. هذا يجعلها غير مناسبة لدراسة تطورها الطبيعي15,32. عادة ما يتميز نموذج 6-OHDA الموصوف في هذه المقالة بانخفاض معدلات الوفيات. يعد التعافي بعد الجراحة أمرا بالغ الأهمية لمنع ارتفاع معدلات الوفيات بسبب اتحاد الإجراء الغازي والآفة التنكسية العصبية44. من الممكن تقليل الوفيات عن طريق توخي مزيد من الحذر خلال فترة التعافي بعد الجراحة من خلال المكملات الغذائية والإماهة والتحكم الخارجي في درجة الحرارة45. وقد ثبت أن الجمع بين هذه التدابير يقلل أو حتى يلغي معدل الوفيات بشكل كبير30,46. السبب الشائع للوفاة هو إدخال الإبرة عند الإحداثيات الخاطئة في الدماغ. من الأهمية بمكان التحقق بعناية من الإحداثيات أثناء هذا الإجراء الجراحي الدقيق. سيؤدي ذلك إلى تجنب تلف هياكل الدماغ الأخرى (مثل منطقة ما تحت المهاد) بواسطة الإبرة، والتي يمكن أن تضعف إجراءات الأكل والشرب للحيوان، مما يؤدي إلى سوء التغذية والجفاف47.

وأخيرا، من الضروري تسليط الضوء على أنه على الرغم من أن بروتوكول تخدير الكيتامين-زيلازين راسخ ويستخدم في تجارب القوارض(48)، إلا أن بعض الأدلة تشير إلى أن الجمع بين هذين التخديرين قد لا يكون كافيا لفترة طويلة من الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تختلف حساسية الكيتامين-زيلازين وفقا لسلالات مختلفة من الفئران والجرذان49,50. قد يكون البديل هو الحث على التخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران. أظهرت إحدى الدراسات فقدانا أسرع لمنعكس التصحيح مع التخدير الناجم عن الأيزوفلوران مقارنة بالكيتامين-زيلازين. علاوة على ذلك ، قدم 60٪ من الفئران المخدرة بالكيتامين-زيلازين ردود فعل متتالية لقرصة إصبع القدم أثناء العملية الجراحية ، حتى مع مكملات الجرعة. وعلى النقيض من ذلك، قدمت الحيوانات المخدرة بالأيسوفلوران حالات معزولة من ردود الفعل على قرصة الذيل التي اختفت بعد تعديل الحجم51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ساو باولو للأبحاث (FAPESP ، منحة 2017/00003-0). نحن ممتنون لتنسيق تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES). نشكر الدكتور أنتوني ر. ويست والدكتور هاينز شتاينر والدكتور كوي ي. تسنغ على الدعم والتوجيه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OHDA Sigma Aldrich H4381 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel
_6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid Sigma Aldrich 795437 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid=
Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD
RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09
_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO
6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL Hamilton 80539 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine Alfa Aeser J63723 https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump Insight EFF-311 https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino) Ourofino https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic Zoetis https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus Insight EFF-331 https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibb, W. R., Lees, A. J. The relevance of the Lewy body to the pathogenesis of idiopathic Parkinson's disease. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 51 (6), 745-752 (1988).
  2. Albin, R. L., Young, A. B., Penney, J. B. The functional anatomy of basal ganglia disorders. Trends in Neurosciences. 12 (10), 366-375 (1989).
  3. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology & Medicine. 62, 132-144 (2013).
  4. Obeso, J. A., et al. Functional organization of the basal ganglia: therapeutic implications for Parkinson's disease. Movement Disorders. 23, Suppl 3 548-559 (2008).
  5. Tysnes, O. -B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. Journal of Neural Transmission. 124 (8), 901-905 (2017).
  6. Karachi, C., et al. Clinical and anatomical predictors for freezing of gait and falls after subthalamic deep brain stimulation in Parkinson's disease patients. Parkinsonism & Related Disorders. 62, 91-97 (2019).
  7. Sudhakar, V., Richardson, R. M. Gene therapy for Parkinson's disease. Progress in Neurological Surgery. 33, 253-264 (2018).
  8. Baizabal-Carvallo, J. F., et al. Combined pallidal and subthalamic nucleus deep brain stimulation in secondary dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 19 (5), 566-568 (2013).
  9. Morizane, A. Cell therapy for Parkinson's disease with induced pluripotent stem cells. Clinical Neurology. 59 (3), 119-124 (2019).
  10. Jankovic, J., Tan, E. K. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 91 (8), 795-808 (2020).
  11. Cenci, M. A., Whishaw, I. Q., Schallert, T. Animal models of neurological deficits: how relevant is the rat. Nature Reviws. Neuroscience. 3 (7), 574-579 (2002).
  12. Tronci, E., Francardo, V. Animal models of l-DOPA-induced dyskinesia: the 6-OHDA-lesioned rat and mouse. Journal of Neural Transmission. 125 (8), 1137-1144 (2018).
  13. Lane, E., Dunnett, S. Animal models of Parkinson's disease and L-dopa induced dyskinesia: How close are we to the clinic. Psychopharmacology. 199 (3), 303-312 (2008).
  14. Meredith, G. E., Sonsalla, P. K., Chesselet, M. -F. Animal models of Parkinson's disease progression. Acta Neuropathologica. 115 (4), 385-398 (2008).
  15. Kin, K., Yasuhara, T., Kameda, M., Date, I. Animal models for Parkinson's disease research: trends in the 2000s. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5402 (2019).
  16. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell and Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
  17. Smith, G. A., Isacson, O., Dunnett, S. B. The search for genetic mouse models of prodromal Parkinson's disease. Experimental Neurology. 237 (2), 267-273 (2012).
  18. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219 (4587), 979-980 (1983).
  19. Langston, J. W., Irwin, I., Langston, E. B., Forno, L. S. 1-Methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+): identification of a metabolite of MPTP, a toxin selective to the substantia nigra. Neuroscience Letters. 48 (1), 87-92 (1984).
  20. Ramsay, R. R., Salach, J. I., Singer, T. P. Uptake of the neurotoxin 1-methyl-4-phenylpyridine (MPP+) by mitochondria and its relation to the inhibition of the mitochondrial oxidation of NAD+-linked substrates by MPP+. Biochemical and Biophysical Research Communications. 134 (2), 743-748 (1986).
  21. Ungerstedt, U. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. European Journal of Pharmacology. 5 (1), 107-110 (1968).
  22. Blandini, F., Armentero, M. -T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
  23. McDowell, K., Chesselet, M. -F. Animal models of the non-motor features of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 46 (3), 597-606 (2012).
  24. Luthman, J., Fredriksson, A., Sundström, E., Jonsson, G., Archer, T. Selective lesion of central dopamine or noradrenaline neuron systems in the neonatal rat: motor behavior and monoamine alterations at adult stage. Behavioural Brain Research. 33 (3), 267-277 (1989).
  25. Casarrubea, M., et al. Effects of Substantia Nigra pars compacta lesion on the behavioral sequencing in the 6-OHDA model of Parkinson's disease. Behavioural Brain Research. 362, 28-35 (2019).
  26. Wang, R., Shao, M. L-DOPA-elicited abnormal involuntary movements in the rats damaged severely in substantia nigra by 6-hydroxydopamine. Annals of Palliative Medicine. 9 (3), 947-956 (2020).
  27. Hernandez-Baltazar, D., Mendoza-Garrido, M. E., Martinez-Fong, D. Activation of GSK-3β and caspase-3 occurs in Nigral dopamine neurons during the development of apoptosis activated by a striatal injection of 6-hydroxydopamine. PLoS One. 8 (8), 70951 (2013).
  28. Bagga, V., Dunnett, S. B., Fricker, R. A. The 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease - Terminal striatal lesions provide a superior measure of neuronal loss and replacement than median forebrain bundle lesions. Behavioural Brain Research. 288, 107-117 (2015).
  29. Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behavioural Brain Research. 162 (1), 1-10 (2005).
  30. Boix, J., Padel, T., Paul, G. A partial lesion model of Parkinson's disease in mice - Characterization of a 6-OHDA-induced medial forebrain bundle lesion. Behavioural Brain Research. 284, 196-206 (2015).
  31. Blesa, J., Phani, S., Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Classic and new animal models of Parkinson's disease. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 845618 (2012).
  32. Breit, S., et al. Effects of 6-hydroxydopamine-induced severe or partial lesion of the nigrostriatal pathway on the neuronal activity of pallido-subthalamic network in the rat. Experimental Neurology. 205 (1), 36-47 (2007).
  33. More, S. V., Kumar, H., Cho, D. -Y., Yun, Y. -S., Choi, D. -K. Toxin-induced experimental models of learning and memory impairment. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1447 (2016).
  34. Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. The unilateral 6-hydroxydopamine lesion model in behavioral brain research. Analysis of functional deficits, recovery and treatments. Progress in Neurobiology. 50 (2-3), 275-331 (1996).
  35. Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Björklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15 (5), 3863-3875 (1995).
  36. Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The 'motor complication syndrome' in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with l-DOPA: Relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
  37. Björklund, A., Dunnett, S. B. The amphetamine induced rotation test: A re-assessment of its use as a tool to monitor motor impairment and functional recovery in rodent models of Parkinson's disease. Journal of Parkinson's Disease. 9 (1), 17-29 (2019).
  38. Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease: studies on medial forebrain bundle and striatal lesions. Neuroscience. 88 (2), 617-628 (1999).
  39. Jayasinghe, V. R., Flores-Barrera, E., West, A. R., Tseng, K. Y. Frequency-dependent corticostriatal disinhibition resulting from chronic dopamine depletion: role of local striatal cGMP and GABA-AR signaling. Cerebral Cortex. 27 (1), 625-634 (2017).
  40. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
  41. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2006).
  42. Padovan-Neto, F. E., et al. Selective regulation of 5-HT1B serotonin receptor expression in the striatum by dopamine depletion and repeated L-DOPA treatment: relationship to L-DOPA-induced dyskinesias. Molecular Neurobiology. 57 (2), 736-751 (2020).
  43. Prasad, E. M., Hung, S. -Y. Behavioral tests in neurotoxin-induced aAnimal models of Parkinson's disease. Antioxidants. 9 (10), Basel, Switzerland. 1007 (2020).
  44. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: Relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 16 (1), 110-123 (2004).
  45. Masini, D., et al. A guide to the generation of a 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease for the study of non-motor symptoms. Biomedicines. 9 (6), 598 (2021).
  46. Francardo, V., et al. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 42 (3), 327-340 (2011).
  47. Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
  48. Fish, R., Danneman, P., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , Academic Press. (2008).
  49. Buitrago, S., Martin, T. E., Tetens-Woodring, J., Belicha-Villanueva, A., Wilding, G. E. Safety and efficacy of various combinations of injectable anesthetics in BALB/c mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 47 (1), 11-17 (2008).
  50. Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 50 (3), 344-348 (2011).
  51. Jiron, J. M., et al. Comparison of isoflurane, ketamine-dexmedetomidine, and ketamine-xylazine for general anesthesia during oral procedures in rice rats (Oryzomys palustris). Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 58 (1), 40-49 (2019).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 176 ،
نموذج الفئران 6-هيدروكسي دوبامين لمرض باركنسون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guimarães, R. P., Ribeiro, D.… More

Guimarães, R. P., Ribeiro, D. L., dos Santos, K. B., Godoy, L. D., Corrêa, M. R., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62923, doi:10.3791/62923 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter