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Neuroscience

O Modelo de Rato de 6-hidroxidopamina da Doença de Parkinson

Published: October 27, 2021 doi: 10.3791/62923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

O modelo 6-hidroxidopamina (6-OHDA) tem sido usado há décadas para avançar no entendimento da Doença de Parkinson. Neste protocolo, demonstramos como realizar lesões nigrostriais unilaterais no rato injetando 6-OHDA no feixe de cérebro medial, avaliando déficits motores e prevendo lesões usando o teste de piscimento.

Abstract

Sintomas motores da doença de Parkinson (DP)-bradykinesia, akinesia e tremor no repouso - são consequências da neurodegeneração de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNc) e déficit estriatal dopaminérgico. Modelos animais têm sido amplamente utilizados para simular patologia humana em laboratório. Roedores são os modelos animais mais usados para DP devido à sua facilidade de manuseio e manutenção. Além disso, a anatomia e os mecanismos moleculares, celulares e farmacológicos da DP são semelhantes em roedores e humanos. A infusão da neurotoxina, 6-hidroxidopamina (6-OHDA), em um feixe de cérebro medial (MFB) de ratos reproduz a destruição severa de neurônios dopaminérgicos e simula sintomas de DP. Este protocolo demonstra como realizar a microinjeção unilateral de 6-OHDA no MFB em um modelo de rato de DP e mostra os déficits motores induzidos por 6-OHDA e lesões dopaminérgicas previstas através do teste de passo. O 6-OHDA causa prejuízo significativo no número de etapas realizadas com o membro dianteiro contralateral.

Introduction

As principais características neuropatológicas da DP são a neurodegeneração progressiva crônica de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNc) e a presença de corpos de Lewy contendo proteína α-sinucleína1. À medida que os neurônios dopaminérgicos projetam seus axônios no estriado através da via nigrostriatal, a neurodegeneração dos neurônios na SNc resulta em um déficit dopaminérgico no estriado2. A ausência de dopamina no estriado causa desequilíbrio nas atividades das vias de controle motor direto e indireto, responsável pelos principais sintomas motores da DP: akinesia (movimento lento), bradiquinesia (dificuldade em iniciar movimentos), rigidez muscular e tremor no repouso3,4,5.

Como os mecanismos moleculares e fisiológicos envolvidos no início da DP ainda não são totalmente compreendidos, os tratamentos principais disponíveis atualmente buscam aliviar os sintomas motores através de farmacoterapias, estimulação cerebral profunda6,7, terapias genéticas8 e transplante de células9. Portanto, a pesquisa pré-clínica é fundamental para elucidar os mecanismos envolvidos no surgimento da DP e descobrir novas metodologias para o diagnóstico precoce e novas terapias para prevenir ou parar a degeneração dos neurônios afetados pelo PD10.

Modelos animais têm sido amplamente utilizados para simular a patologia humana em laboratório, contribuindo para o avanço da medicina e da ciência11,12,13,14. No entanto, é essencial ressaltar que a escolha correta do modelo animal é fundamental para o sucesso do estudo. Portanto, o modelo animal deve ser validado em três aspectos principais: i) validade facial, na qual o modelo animal deve ter as características da patologia humana; ii) validade construtiva, na qual o modelo animal deve ter uma base teórica sólida; e iii) validade preditiva, na qual os modelos animais devem responder aos tratamentos de forma semelhante ao tratamento clínico.

Atualmente, vários animais são usados como modelos animais para DP. Os principais grupos incluem mamíferos, como roedores, primatas, miniporcos, cães e gatos, e outros grupos como drosophila e zebrafish. Roedores são o modelo animal mais clássico para DP e o mais usado devido à sua facilidade de manuseio e manutenção. Além disso, a anatomia e os mecanismos moleculares, celulares e farmacológicos da DP são semelhantes em roedores e humanos15.

Uma revisão publicada por Kin e colegas em 2019 analisou as principais metodologias de modelo animal utilizadas para DP nos anos 2000 e descobriu que o modelo animal mais utilizado envolvia neurotoxinas como 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahydropydineri (MPTP). Ambas as neurotoxinas causam a desregulação mitocondrial em neurônios dopaminérgicos na via nigrostriatal, levando à morte celular16. Outro modelo amplamente utilizado envolve a manipulação genética através da mutação em genes específicos envolvidos no início da DP, causando a desregulação mitocondrial17. Modelos de neurotoxinas são comumente utilizados para avaliar e comparar terapêuticas, enquanto modelos genéticos são usados para estudar o desenvolvimento de terapias preventivas e PD15 idiopático.

A neurotoxina MPTP foi descoberta para causar parkinsonismo em meados da década de 1980 depois que sete pacientes usaram a substância e apresentaram sintomas graves de DP. Além dos sintomas, os pacientes responderam ao tratamento com L-DOPA, o que fez com que os pesquisadores ligassem a molécula diretamente à DP. Após a publicação do caso, em 1986, vários pesquisadores começaram a usar MPTP em pesquisas pré-clínicas de PD18. Pesquisadores descobriram que sendo uma molécula lipofílica, o MPTP pode atravessar a barreira hemencefálica (BBB) e ser convertido em MPP+19. Esta substância tóxica se acumula dentro dos neurônios e causa danos ao complexo 1 da cadeia respiratória mitocondrial, levando à morte de neurônios dopaminérgicos20.

O modelo de neurotoxina 6-OHDA foi usado pela primeira vez para induzir a degeneração de neurônios monoaminas da via nigrostriatal em 196821. O modelo 6-OHDA é comumente usado para causar neurodegeneração na via nigrostriatal, pois é um análogo de dopamina e tóxico para células contendo catecolamina. Depois que 6-OHDA entra no cérebro, ele pode ser tomado pelo transportador de dopamina (DAT) em neurônios dopaminérgicos, levando à degeneração da via nigrostriatal22. Como o 6-OHDA não penetra no BBB, deve ser administrado diretamente através da injeção estereotaxal intracerebral23. Um inibidor de recaptação de noradrenalina é frequentemente combinado com microinjeção 6-OHDA para preservar fibras noradrenérgicas e fornecer uma degeneração mais seletiva de neurônios dopaminérgicos24.

Após o DAT assumir o 6-OHDA, ele se acumulará no citosol dos neurônios, produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS) e levando à morte celular15. Três modelos diferentes de lesões de 6-OHDA são frequentemente utilizados: i) lesões ao SNc25,26; ii) lesões ao estriado27,28; iii) lesões ao MFB29,30. Lesões causadas no estriado resultam em uma lenta e retrógrada degeneração de neurônios dopaminérgicos no SNpc. Em contraste, lesões causadas no SNpc e MFB resultam em degeneração rápida e total dos neurônios, levando a sintomas parkinsonianos mais avançados31.

A injeção unilateral ou bilateral de 6-OHDA pode causar neurodegeneração em neurônios dopaminérgicos. 6-OHDA nem sempre causa danos graves aos neurônios; às vezes, a injeção resulta em danos parciais, que também é usado para simular os estágios iniciais do PD32. A injeção unilateral é mais comumente usada devido à capacidade do modelo de avaliar os déficits motores do animal e prever a perda celular através de testes como a rotação induzida pela anfetamina/apomorfina e o teste de pisada29. As injeções bilaterais são mais utilizadas para avaliar a memória espacial e o reconhecimento33.

O teste de rotação induzido pela anfetamina/apomorfina é um teste comportamental comumente usado para prever a perda celular na via nigrostriatal. É definido como um processo no qual a administração repetida de agonistas de dopamina leva a uma intensificação do comportamento rotacional em animais 6-OHDA-lesionados34. O comportamento rotacional consiste em quantificar a rotação ipsilateral induzida pela anfetamina ou as voltas contralaterais induzidas pela apomorfina em roedores unilateralmente lesados. O comportamento rotacional induzido por drogas tem sido criticado porque a rotação não corresponde aos sintomas da DP em humanos e pode ser afetada por variáveis como tolerância, sensibilização e "priming"35.

O escorraça é um dos fatores mais críticos nesses testes comportamentais. Alguns casos foram relatados em que uma única dose de L-DOPA levou a uma falha nos comportamentos rotacionais36. Além disso, outro fator crítico relacionado à aplicação combinada do teste induzido pela anfetamina e do teste induzido pela apomorfina para uso paralelo é que eles medem diferentes pontos finais devido a diferentes mecanismos de ação, refletindo a inativação de diferentes mecanismos de sinalização e caminhos. Além disso, o teste induzido pela anfetamina é mais preciso para medir lesões nigrostriais acima de 50-60%, enquanto o teste induzido pela apomorfina é mais preciso para lesões acima de 80%37.

O teste de pisada surgiu como um teste comportamental que indica déficits relacionados à degeneração do neurônio dopaminérgico e efeitos terapêuticos. Permite a análise da akinesia causada por uma lesão 6-OHDA em neurônios dopaminérgicos sem um procedimento induzido por drogas. Além disso, o teste tem sido bem estabelecido e comumente utilizado desde 1995, quando foi descrito pela primeira vez por Olsson et al.35. Em 1999, Chang et al.38 também analisaram e compararam o desempenho dos ratos no teste de pisada com o nível de degeneração causado pelo 6-OHDA e descobriram que os animais que tiveram pior desempenho no teste de pisada também tiveram uma degeneração mais significativa dos neurônios dopaminérgicos.

O teste de pisada é um excelente método para prever danos nigrostriais dopaminérgicos graves em ratos com lesões de 6 OHDA. Evidências sugerem que os déficits motores aparecem no membro dianteiro contralateral da infusão 6-OHDA durante o teste de pisada quando o grau de perda dopaminérgica em SNc é >90%39. Este artigo descreve os protocolos, metodologias e materiais utilizados para realizar cirurgia estereotaxica para a infusão unilateral de 6-OHDA no MFB de ratos e como prever as lesões dopaminérgicas causadas pela toxina através do teste de pisada.

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Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais seguiram os princípios éticos do Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA) e da Lei Arouca (Lei 11.794/2008) e foram aprovados pelo Comitê de Ética local (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5).

1. Preparação de drogas

  1. Anestesia com Cetamina/Xilazina
    NOTA: A dose de cetamina utilizada é de 70 mg/kg, e a dose de xilazina é de 10 mg/kg.
    1. Para preparar 1 mL de anestésico utilizando solução de cetamina 100 mg/mL e solução de xilazina de 20 mg/mL, combine 0,35 mL de solução de cetamina, 0,25 mL de solução xilazina e 0,4 mL de solução salina estéril de 0,9%. Administre a solução anestésico a um volume final de 2 mL/kg.
      NOTA: A cetamina junto com a xilazina podem produzir sedação por 60-80 min. Se o animal ainda tiver reflexos (por exemplo, arremesso de perna traseira e/ou reflexo piscando), administre um adicional de 10% da dose individual.
  2. Imipramina
    NOTA: A dose individual de imipramina utilizada é de 20 mg/kg.
    1. Para preparar 1 mL de solução de imipramina 20 mg/mL, combine 20 mg de imipramina e 1 mL de solução salina estéril de 0,9%. Administre a solução de imipramina a um volume final de 1 mL/kg.
  3. Meloxicam
    NOTA: A dose individual de meloxicam utilizada é de 1 mg/kg.
    1. Para preparar 1 mL de solução meloxicam 1 mg/mL, combine 0,05 mL de meloxicam 2% e 0,95 mL de solução salina estéril de 0,9%. Administre a solução meloxicam a um volume final de 1 mL/kg uma vez por dia durante dois dias.
  4. Ácido ascórbico 0,1%
    1. Para preparar 1 mL de ácido ascórbico de 0,1%, combine 1 mg de ácido ascórbico e 1 mL de solução salina estéril de 0,9%.
  5. 6-hidroxidopamina (6-OHDA)
    NOTA: 6-OHDA é uma neurotoxina usada para destruir seletivamente neurônios dopaminérgicos e noradrenérgicos no cérebro. Evite contato direto com a pele e membranas mucosas dos olhos, nariz e boca. Ao manusear 6-OHDA, use luvas duplas de nitrito, jaleco, vestido descartável, proteção ocular e máscara cirúrgica ou escudo facial. O volume total de infusão da toxina é de 4 μL/animal, e a quantidade individual é de 10 μg de 6-OHDA/animal.
    1. Para preparar 1 mL de 6-OHDA em uma concentração final de 2,5 mg/mL, misture 2,5 mgs de 6-OHDA e 1 mL de solução salina de 0,9% contendo ácido ascórbico de 0,1% (descrito acima).
      NOTA: 6-OHDA é sensível à luz e se degrada mais rapidamente quando exposto à luz brilhante. Deve ser manuseado adequadamente e armazenado em um ambiente protegido contra a luz. Se a cor da solução estiver avermelhada, descarte-a.
  6. Cloridrato de lidocaína (2%)
    1. Prepare 2% de solução de lidocaína para aplicação local ao animal.
      NOTA: A dose máxima que pode ser aplicada é de 7 mg/kg.
  7. Suspensão de antibióticos poli-antibióticos
    NOTA: A suspensão poli-antibiótico com estreptomicinas e penicilinas (ver a Tabela de Materiais) deve ser preparada no momento da aplicação com todo o volume de diluente, cuja ampola acompanha o frasco com o pó.
    1. Remova o disco metálico na rolha de borracha. Desinfete a rolha de borracha com álcool.
    2. Usando uma seringa com uma agulha de 23 G, injete o diluído no frasco. Retire a agulha e agite o frasco vigorosamente até que a suspensão esteja totalmente homogeneizada. Injete um pouco de ar no frasco e retire o volume desejado de suspensão.
    3. Administre uma injeção intramuscular profunda, puxando o êmbolo antes de injetar a droga para garantir que nenhum vaso sanguíneo seja atingido.
      NOTA: O volume final de suspensão a ser aplicado é de 0,5 mL/kg.

2. Preparação de materiais

NOTA: Siga sempre as instruções fornecidas com a ficha de dados de segurança do material ao manusear produtos químicos.

  1. Aparelho estereotaxico
    1. Coloque o dispositivo estereotaxic em um banco estável e limpo com iluminação adequada para realizar a cirurgia. Desinfete o aparelho com 70% de etanol.
    2. Verifique se as barras de ouvido e incisivo do dispositivo estão corretamente alinhadas. Coloque uma manta térmica onde o animal será colocado durante a cirurgia para se manter aquecido durante o procedimento. Monitore a temperatura do animal com uma sonda retal precisa.
      NOTA: A manta térmica deve estar a 37,5 °C para que o animal mantenha uma temperatura corporal de 37 °C.
  2. Sistema de microinfusão
    1. Encha (70-80%) uma seringa Hamilton (50 μL ou conforme desejado) presa a uma microtubs de polietileno de grau médico e uma agulha com água dupla destilada (ddH2O) e verifique se há vazamentos através do sistema.
    2. Puxe o ar através do sistema para que uma única bolha de ar separe o ddH2O na seringa da solução 6-OHDA no microtubo.
      NOTA: Este procedimento evita contaminar a seringa Hamilton com 6-OHDA e permite o uso de vários ratos no mesmo dia experimental.
    3. Posicione a seringa Hamilton na bomba de infusão para que ela esteja firmemente presa e o êmbolo da seringa seja paralelo ao quadro que se moverá para empurrá-la. Coloque a bomba de infusão a uma velocidade de 0,5 μL/min para que a aplicação total de 4 μL de 6-OHDA dure por 8 min. Teste o sistema de infusão confirmando que não há vazamentos e que a infusão ocorre de acordo com o tempo e volume previamente definidos.
    4. Conecte a agulha de infusão presa ao microtubo ao aparelho na extremidade do braço estereotaxico e verifique se a agulha está posicionada em um ângulo de 180° à superfície. Certifique-se de que a agulha está reta e não dobrada.
      NOTA: Verifique minuciosamente todos os procedimentos descritos, pois se algum dos itens do sistema de infusão não funcionar corretamente, pode comprometer o sucesso da cirurgia.
  3. Sutura
    1. Use uma sutura estéril de nylon não absorvível com uma agulha de círculo 3/8 para suturar a incisão após a cirurgia.
  4. Site de recuperação pós-cirúrgico
    1. Coloque uma caixa de carcaça limpa e esterilizada onde os animais possam ser monitorados até que estejam totalmente recuperados (respondendo ao toque e manipulação). Coloque um cobertor térmico na caixa para termoregulação.
      NOTA: Como a termoregulação é importante, inclua uma fonte de calor suplementar para manter a temperatura corporal, se necessário.

3. Procedimento cirúrgico

NOTA: Neste protocolo, os ratos adultos sprague-Dawley (200-250 g) foram mantidos sob condições controladas de temperatura (22 ± 2 °C), troca de ar (15-20 trocas/hora) e ciclos claro-escuros (12 h/12 h), agrupados em caixas com 3 ou 4 animais, com acesso gratuito a alimentos e água.

  1. Pesar os animais para monitorar as mudanças de peso nos dias seguintes à cirurgia. Calcule a dose de drogas a serem administradas.
  2. Administre imipramina intraperitoneal 30 min antes da cirurgia (~10-15 min antes de administrar anestesia), usando uma agulha de 27 G e uma seringa de 1 mL.
    NOTA: A imipramina bloqueará o transportador noradrenalina (NAT) e evitará a absorção de 6-OHDA por neurônios noradrenérgicos, tornando a lesão mais seletiva aos neurônios dopaminérgicos40.
  3. Após 10-15 min da administração de imipramina, administre a anestesia intraperitoneal cetamina/xilazina usando uma agulha de 27 G e uma seringa de 1 mL. Espere até que o animal esteja completamente anestesiado. Verifique se o animal está sob anestesia profunda quando o animal não responde ao aperto da perna traseira e não mostra um reflexo de piscar.
  4. Raspe a pele do rato na região da cabeça onde ocorrerá a incisão.
  5. Posicione o rato no aparelho estereotaxo.
    1. Posicione a cabeça sobre a barra incisivo e fixe a barra 3,3 mm abaixo da linha interaural.
    2. Posicione as barras de ouvido, de um lado de cada vez. Posicione a barra incisora e as barras de ouvido para que a parte superior do crânio fique reta e paralela à superfície.
    3. Ajuste o grampo do nariz e teste que a cabeça está firme e não se mova para nenhum dos lados.
  6. Aplique pomada oftalmica estéril nos olhos de rato para evitar que as córneas sequem.
  7. Aplique povidone-iodo na área a ser incisada para desinfetar o local.
  8. Aplicar lidocaína local para analgesia da região de incisão; não exceda 7 mg/kg.
  9. Administre a meloxicam subcutâneamente usando uma agulha de 27 G e uma seringa de 1 mL.
    NOTA: Meloxicam é um analgésico anti-inflamatório não esteroide que ajudará o animal a se recuperar após a cirurgia.
  10. Administre a suspensão de polimobicultura intramuscularmente usando uma agulha de 23 G e uma seringa de 1 mL.
    NOTA: A suspensão do poliabito é administrada como um tratamento profilático para evitar possíveis infecções bacterianas na recuperação pós-cirurgia.
  11. Verifique se o animal está em um estado de anestesia profunda, verificando reflexos de pisca-pisca ou reflexos de membros traseiros, beliscando a pata traseira com pinças.
  12. Com um bisturi, faça uma incisão de ~1,5 cm na região onde ocorrerá a microinjeção.
    NOTA: Técnicas estéreis são aplicadas a partir deste ponto até o fechamento da ferida.
  13. Limpe a região do crânio com cotonetes e brotos de algodão até que a Bregma e a Lambda possam ser vistas. Marque a Bregma e a Lambda com uma caneta fina esterilizada.
  14. Verifique se as coordenadas dorsal-ventral (DV) de Bregma e Lambda são semelhantes. Se forem diferentes, reajuste o rato no aparelho estereotaxico, pois a cabeça do rato não está corretamente posicionada.
  15. Observe as coordenadas anteroposterior (AP) e mediolateral (ML) do Bregma.
  16. Mova-se para as coordenadas AP e ML do MFB direito de acordo com 41: AP: -4,3 mm, ML: 1,6 mm de Bregma.
  17. Marque a região da trepanação com uma caneta fina esterilizada.
  18. Com uma broca esterilizada, fure lentamente o crânio do animal, tomando cuidado para não ferir a dura gêmea.
  19. Posicione a agulha de microinjeção na dura mater e observe as coordenadas dv. Pegue uma agulha fina e rompa suavemente a dura gêmea. Insira a agulha na coordenada DV (ventral de 8,3 mm) do MFB, onde ocorrerá a microinjeção.
  20. Opere a bomba de microinjeção para liberar a solução 6-OHDA no MFB. Quando a microinjeção estiver concluída, verifique a seringa Hamilton para ver se 4 μL de 6-OHDA foi injetado.
    NOTA: A microinjeção deve durar 8 min.
  21. Após a administração do 6-OHDA, espere 10 minutos antes de remover a agulha para evitar o refluxo da droga. Remova a agulha de microinjeção lentamente do cérebro do animal.
  22. Desinfete novamente a região de incisão com povidone-iodo.
  23. Suturar a área de incisão com ~3-4 nós cirúrgicos.
    NOTA: O nó não deve ser muito forte ou muito solto.
  24. Retire o rato do aparelho estereotax e coloque-o em uma caixa limpa para recuperação na manta térmica até que o animal tenha se recuperado totalmente da anestesia. Observe o animal a cada 15 minutos até que esteja totalmente acordado da anestesia.

4. Procedimentos pós-operatórios

  1. Monitore o peso dos animais nos próximos quatro dias após a cirurgia. Trate-os com meloxicam subcutânea uma vez por dia durante dois dias após a cirurgia, ajustando a dose para o peso de cada dia.
    NOTA: Todos os animais devem ser avaliados pela necessidade de analgésicos no terceiro dia após a cirurgia.
  2. Verifique as incisões diariamente por pelo menos quatro dias para garantir que elas não estejam infectadas. Procure calor, inchaço, dor, descarga e vermelhidão até que as incisões se curem.
  3. Verifique o apetite e o consumo de água monitorando o peso corporal do animal. Dê ração molhada para incentivar os animais a comer. Observe a condição geral do corpo, atitude e mobilidade diariamente por pelo menos quatro dias após a cirurgia. Remova as suturas 7-10 dias após a cirurgia.
    NOTA: Os animais devem ser eutanizados se os pontos finais definidos nos procedimentos éticos forem alcançados.

5. Teste de intensificação

  1. Formação
    NOTA: Os animais devem ser treinados por três dias antes do teste. De acordo com o protocolo descrito abaixo, o treinamento deve ocorrer duas vezes ao dia, uma pela manhã e uma vez à tarde, ou com intervalo de pelo menos 2h entre as sessões. Rastreie o tempo usando um temporizador.
    1. Dia 1º
      1. Na primeira sessão, manuseie o rato segurando-o em luvas por ~1-2 min para permitir que o rato se familiarize com o manipulador/experimentador.
      2. Na segunda sessão, alternar entre segurar o rato por 20 s e colocá-lo na mesa de protocolo para 20 s. Repita esta etapa de treinamento por 3 minutos para familiarizar o rato com a configuração experimental para o teste de pisa.
    2. Dia 2.
      1. Na primeira sessão, coloque as duas patas dianteiras do rato na mesa de protocolo segurando suas patas traseiras e para trás com uma mão. Incline o rato para baixo de cabeça em um ângulo de 45° para a superfície plana da tabela de protocolo. Mova-se horizontalmente sobre a mesa de ponta a ponta, permitindo que o rato pise sobre a mesa com ambas as patas (cubra 90 cm em 4 s). Segure o rato em luvas por 10 s, permitindo que ele descanse; repetir este padrão por 3 min.
      2. Na segunda sessão, coloque um previ do rato na mesa de protocolo segurando a outra pata dianteira com uma mão e segure as patas traseiras e traseiras do rato com a outra mão (ver passo 5.1.2.1). Mova-se horizontalmente sobre a mesa de ponta a ponta em 4 s, permitindo que o rato pise com sua pata livre. Segure o rato em luvas por 10 s, permitindo que ele descanse, e repita com outra previda, seguida pelo período de descanso. Repita este padrão, alternando entre as duas previs e descanse por 3 minutos.
      3. Repita o passo de treinamento 3 vezes por 1 min cada.
    3. Dia 3.
      1. Na primeira sessão, siga o procedimento descrito na etapa 5.1.2.2 para uma previ. Repita com outra previ, seguida pelo período de descanso. Repita este padrão, alternando entre as duas previs e descanse por 3 minutos.
      2. Na segunda sessão, siga o procedimento descrito na etapa 5.1.2.2.
  2. Teste
    NOTA: O teste de piscimento é realizado antes da cirurgia, 2 e 4 semanas após a cirurgia estereotaxa, para avaliar a akinesia do membro dianteiro contralateral e a possível lesão causada pelo 6-OHDA.
    1. Segure o rato em um ângulo de 45° à superfície, imobilizando seus membros traseiros e permitindo que apenas um dos membros dianteiros descanse na plataforma, como explicado acima, para o 3º dia de treinamento.
    2. Arraste o rato para a frente a uma distância de 90 cm em 4 s, com a pata direita ou esquerda descansando na superfície.
    3. Tome notas e quantifique o número de passos de ajuste de forehand tomados com cada pata em cada direção.

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Representative Results

Avaliação da lesão dopaminérgica
O teste de piscimento permite a avaliação da akinesia do membro anterior contralateral à lesão e a seleção de animais com possível lesão da via nigrostriatal induzida pela infusão 6-OHDA (Figura 1). A comparação do desempenho do teste de pré-cirurgia do forelimb contralateral e 2 semanas e 4 semanas após a cirurgia revelou interação (F2,74 = 93,63; p < 0,0001; duas formas repetidas ANOVA) entre o tempo (pré, 2 e 4 semanas após a cirurgia) e tratamento (operado por sham e 6-OHDA-lesionado). O teste pós-hoc de Bonferroni mostrou uma diminuição significativa no número de passos contralaterais à lesão em animais que recebem 6-OHDA no MFB direito em comparação com os animais operados por vergonha na segunda e quarta semana após a cirurgia (p < 0,0001) (Figura 1). Os resultados foram consistentes com os de estudos anteriores35.

É importante ressaltar que quando a lesão dopaminérgica não estiver completa, os resultados do teste de pisada não atingirão o grau de sucesso dos resultados apresentados neste estudo. Um estudo publicado anteriormente realizou o teste de intensificação e imunohistoquímica da hidroxilase de tyrosina (TH) com animais com lesão dopaminérgica parcial após a realização de cirurgia para microinjeção de 6-OHDA seguindo o mesmo protocolo utilizado neste estudo. Sua constatação de déficit parcial no teste de pisada (4-8 passos) é o resultado de uma lesão dopaminérgica parcial de ~60% dos neurônios39.

Figure 1
Figura 1: Avaliação do teste de passo contralateral pré e pós-cirurgia para infusão unilateral de 6-OHDA ou veículo no MFB direito. Os dados mostram que os animais que receberam 6-OHDA tiveram uma diminuição significativa no número de passos com o anterior anterior contralateral à lesão na segunda e quarta semanas após a cirurgia (****p < 0,0001 vs. sham pós-cirurgia; duas formas repetidas ANOVA, Bonferroni pós-hoc). Dados expressos como ± erro padrão da média. O veículo é uma solução salina de 0,9% contendo ácido ascórbico de 0,1%. Os resultados são baseados em 14 animais do grupo sham e 25 animais do grupo 6-OHDA. Abreviaturas: P = pré-cirurgia. 2 = duas semanas após a cirurgia. 4 = quatro semanas após a cirurgia; 6-OHDA = 6-hidroxidopamina; MFB = pacote de cérebro medial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A comparação do desempenho do teste de pré-cirurgia do pré-operatório ipsilateral e 2 semanas e 4 semanas após a cirurgia não revelou qualquer interação (F2,74 = 0,4492; p = 0,6399; duas formas repetidas de ANOVA) entre o tempo (pré, 2 e 4 semanas após a cirurgia) e tratamento (operado por sham e 6-OH-lesão). O teste pós-hoc de Bonferroni não mostrou diferença significativa no número de passos ipsilaterais à lesão em animais que receberam 6-OHDA no MFB direito em comparação com animais falsos (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Avaliação do teste de pisada ipsilateral pré e pós-cirurgia para infusão unilateral de 6-OHDA ou veículo no MFB direito. Os dados mostram que os animais que recebem 6-OHDA não diminuíram significativamente o número de passos com o ipsilateral anterior para a lesão na segunda e quarta semanas após a cirurgia (p > 0,05 vs. sham pós-cirurgia; duas formas repetidas ANOVA, Bonferroni pós-hoc). Dados expressos como ± erro padrão da média. O veículo é uma solução salina de 0,9% contendo ácido ascórbico de 0,1%. Os resultados são baseados em 14 animais do grupo sham e 25 animais do grupo 6-OHDA. Abreviaturas: P = pré-cirurgia. 2 = duas semanas após a cirurgia. 4 = quatro semanas após a cirurgia; 6-OHDA = 6-hidroxidopamina; MFB = pacote de cérebro medial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Consistente com estudos anteriores sobre animais 6-OHDA-lesionados42, a análise histológica (Figura 3) comparando TH do estriado de ambos os hemisférios permite uma avaliação confiável do déficit de DA no estriado. Portanto, este protocolo comportamental pode ser usado em combinação com métodos imunohistoquímicos em estudos envolvendo modelos experimentais de DP.

Figure 3
Figura 3: Imagens representativas da rotulagem TH no modelo experimental 6-OHDA de PD, incluindo estriada anterior e substantia nigra compacta. A imagem panorâmica demonstra a extensão da lesão, e os zooms de inset retratam a inervação e corpos celulares imunossuídos. (A) Imagem da seção coronal striatal mostrando uma lesão parcial induzida por 6-OHDA no hemisfério direito. (B) Imagem da seção coronal da área substantia nigra e tegmental ventral do mesmo animal também mostrando a extensão da lesão. (C) Imagem da seção coronal striatal mostrando uma lesão completa induzida por 6-OHDA no hemisfério direito. (D) Imagem da seção coronal da área substantia nigra e tegmental ventral do mesmo animal também mostrando a extensão da lesão. Barra de escala = 1,3 mm em vista panorâmica e 65 μm em zooms de entrada. Abreviaturas: 6-OHDA = 6-hidroxidopamina; TH = hidroxilase de tyrosina; DP = Doença de Parkinson; NL = não lesado; L = lesionado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este artigo descreve um protocolo para a realização de cirurgia para microinfusão unilateral de 6-OHDA no MFB, capaz de causar lesões robustas nos neurônios da via nigrostriatal e gerar akinesia no animal. Também descrito é o protocolo para a realização do teste de pisa, um teste facilmente aplicável e não invasivo que pode ser usado para provar o sucesso das lesões e avaliar a akinesia de membros dianteiros. Como apresentado nos resultados representativos, os animais que receberam 6-OHDA apresentaram redução no número de passos de ajuste contralateral para lesão, o que significa que animais 6-OHDA feridos apresentam forte akinesia a partir de 2 semanas após a cirurgia de infusão. A akinesia - o foco de vários tratamentos para a doença - é um dos principais sintomas motores da DP. O desenvolvimento da akinesia em um modelo animal é significativo para estudos pré-clínicos de DP. Além disso, esses resultados se assemelham aos relatados por Chang et al.37, que confirmaram que os animais que apresentavam menor número de passos apresentaram maior percentual de morte de neurônio dopaminérgico por imunohistoquímica. Portanto, os animais que apresentaram menor número de passos de ajuste contralateral são mais propensos a ter uma lesão dopaminérgica.

A avaliação do sucesso da cirurgia e das lesões também pode ser confirmada por outros testes comportamentais, como a rotação induzida pela anfetamina/apomorfina43, teste de balanço corporal elevado (EBST), teste de corredor, teste de cilindro, técnicas de rotulagem tecidual, como imunohistoquímica TH, ou mesmo quantificação de dopamina no estriado pelo HPLC42. Outras metodologias diferem na dose injetada de 6-OHDA e intervalo de tempo pós-cirurgia para avaliação comportamental. Uma revisão recente43 resume os artigos mais recentes usando essa metodologia e a diferença de dose, teste comportamental e intervalo pós-cirurgia entre eles. O modelo de DP induzido pelo 6-OHDA não imita todos os processos patológicos relacionados à doença, como o acúmulo de corpos de Lewy, mas simula a morte de neurônios dopaminérgicos da via estriatal-nigral. Isso permite o estudo de novas terapias para os sintomas da doença, o que pode levar a uma melhora na qualidade de vida dos pacientes acometidos por essa doença.

Apesar de ser o modelo mais utilizado, o modelo 6-OHDA tem suas limitações como todos os modelos PD atuais. O modelo tem a desvantagem de não representar totalmente os mecanismos moleculares envolvidos na patologia da doença, como o acúmulo de proteínas alfa-sinucleínas e a formação de corpos de Lewy. O modelo simula a morte de neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal, correspondendo a um estágio tardio da doença e levando apenas ao aparecimento de sintomas motores. Isso o torna inadequado para estudar seu desenvolvimento natural15,32. O modelo 6-OHDA descrito neste artigo é geralmente caracterizado por baixas taxas de mortalidade. A recuperação pós-cirurgia é crucial para prevenir altas taxas de mortalidade devido à união de um procedimento invasivo e da lesão neurodegenerativa44. É possível reduzir a mortalidade tomando cuidado extra durante o período de recuperação pós-cirurgia com suplementação nutricional, reidratação e controle externo da temperatura45. A combinação dessas medidas tem sido demonstrada para reduzir ou mesmo eliminar drasticamente a taxa de mortalidade 30,46. Uma causa comum de morte é a inserção da agulha na coordenada errada no cérebro. É crucial verificar cuidadosamente as coordenadas durante este delicado procedimento cirúrgico. Isso evitará danos a outras estruturas cerebrais (por exemplo, o hipotálamo) pela agulha, o que pode prejudicar as ações de alimentação e bebida do animal, levando à desnutrição e desidratação47.

Finalmente, é essencial destacar que, embora o protocolo de anestesia cetamina-xilazina seja bem estabelecido e usado em experimentos com roedores48, algumas evidências sugerem que a combinação desses anestésicos pode ser insuficiente por um longo período de cirurgia. Além disso, a sensibilidade cetamina-xilazina pode variar de acordo com diferentes cepas de camundongos e ratos49,50. Uma alternativa pode ser induzir anestesia por inalação de isoflurane. Um estudo demonstrou perda mais rápida do reflexo de direito com anestesia induzida por isoflurano do que com cetamina-xilazina. Além disso, 60% dos ratos anestesiados com cetamina-xilazina apresentaram reflexos consecutivos de beliscão durante o procedimento cirúrgico, mesmo com suplementação de dose. Em contraste, os animais anestesiados com isoflurano apresentaram casos isolados de reflexos de pinça da cauda que desapareceram após o ajuste de volume51.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgments

Este trabalho contou com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), bolsa 2017/00003-0. Agradecemos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Agradecemos ao Dr. Anthony R. West, Ao Dr. Heinz Steiner e ao Dr. Kuei Y. Tseng pelo apoio e mentoria.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OHDA Sigma Aldrich H4381 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel
_6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid Sigma Aldrich 795437 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid=
Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD
RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09
_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO
6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL Hamilton 80539 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine Alfa Aeser J63723 https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump Insight EFF-311 https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino) Ourofino https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic Zoetis https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus Insight EFF-331 https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN

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Neurociência Edição 176
O Modelo de Rato de 6-hidroxidopamina da Doença de Parkinson
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Guimarães, R. P., Ribeiro, D.… More

Guimarães, R. P., Ribeiro, D. L., dos Santos, K. B., Godoy, L. D., Corrêa, M. R., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62923, doi:10.3791/62923 (2021).

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