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Neuroscience

El modelo de rata 6-hidroxidopamina de la enfermedad de Parkinson

Published: October 27, 2021 doi: 10.3791/62923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

El modelo de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) se ha utilizado durante décadas para avanzar en la comprensión de la enfermedad de Parkinson. En este protocolo, demostramos cómo realizar lesiones nigrostriatales unilaterales en la rata inyectando 6-OHDA en el haz medial del cerebro anterior, evaluar los déficits motores y predecir lesiones utilizando la prueba de paso.

Abstract

Los síntomas motores de la enfermedad de Parkinson (EP) -bradicinesia, acinesia y temblor en reposo- son consecuencias de la neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta (SNc) y el déficit estriatal dopaminérgico. Los modelos animales se han utilizado ampliamente para simular la patología humana en el laboratorio. Los roedores son los modelos animales más utilizados para la EP debido a su facilidad de manejo y mantenimiento. Además, la anatomía y los mecanismos moleculares, celulares y farmacológicos de la EP son similares en roedores y humanos. La infusión de la neurotoxina, 6-hidroxidopamina (6-OHDA), en un haz medial del cerebro anterior (MFB) de ratas reproduce la destrucción severa de las neuronas dopaminérgicas y simula los síntomas de la EP. Este protocolo demuestra cómo realizar la microinyección unilateral de 6-OHDA en el MFB en un modelo de rata de EP y muestra los déficits motores inducidos por 6-OHDA y las lesiones dopaminérgicas predichas a través de la prueba de paso. El 6-OHDA causa un deterioro significativo en el número de pasos realizados con la extremidad anterior contralateral.

Introduction

Las principales características neuropatológicas de la EP son la neurodegeneración progresiva crónica de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta (SNc) y la presencia de cuerpos de Lewy que contienen proteína α-sinucleína1. A medida que las neuronas dopaminérgicas SNc proyectan sus axones en el cuerpo estriado a través de la vía nigrostriatal, la neurodegeneración de neuronas en SNc da como resultado un déficit dopaminérgico en el cuerpo estriado2. La ausencia de dopamina en el cuerpo estriado provoca un desequilibrio en las actividades de las vías de control motor directo e indirecto, responsable de los principales síntomas motores de la EP: acinesia (movimiento lento), bradicinesia (dificultad para iniciar movimientos), rigidez muscular y temblor en reposo3,4,5.

Como los mecanismos moleculares y fisiológicos implicados en la aparición de la EP aún no se comprenden del todo, los principales tratamientos actualmente disponibles buscan aliviar los síntomas motores a través de farmacoterapias, estimulación cerebral profunda6,7, terapias genéticas8 y trasplante celular9. Por ello, la investigación preclínica es fundamental para dilucidar los mecanismos implicados en la aparición de la EP y descubrir nuevas metodologías para el diagnóstico precoz y nuevas terapias para prevenir o detener la degeneración de las neuronas afectadas por la PD10.

Los modelos animales se han utilizado ampliamente para simular la patología humana en el laboratorio, contribuyendo al avance de la medicina y la ciencia11,12,13,14. Sin embargo, es fundamental destacar que la correcta elección del modelo animal es fundamental para el éxito del estudio. Por lo tanto, el modelo animal debe ser validado en tres aspectos principales: i) validez facial, en la que el modelo animal debe tener las características de patología humana; ii) validez constructiva, en la que el modelo animal debe tener una base teórica sólida; y iii) validez predictiva, en la que los modelos animales deben responder a los tratamientos de manera similar al tratamiento clínico.

Actualmente, varios animales se utilizan como modelos animales para la EP. Los grupos principales incluyen mamíferos, como roedores, primates, minipigs, perros y gatos, y otros grupos como drosophila y pez cebra. Los roedores son el modelo animal más clásico para la EP y el más utilizado debido a su facilidad de manejo y mantenimiento. Además, la anatomía y los mecanismos moleculares, celulares y farmacológicos de la EP son similares en roedores y humanos15.

Una revisión publicada por Kin y sus colegas en 2019 analizó las principales metodologías de modelos animales utilizadas para la EP en la década de 2000 y encontró que el modelo animal más utilizado involucraba neurotoxinas como 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP). Ambas neurotoxinas causan desregulación mitocondrial en las neuronas dopaminérgicas en la vía nigrostriatal, lo que lleva a la muerte celular16. Otro modelo ampliamente utilizado consiste en la manipulación genética a través de la mutación en genes específicos implicados en la aparición de la EP, provocando la desregulación mitocondrial17. Los modelos de neurotoxinas se utilizan comúnmente para evaluar y comparar terapias, mientras que los modelos genéticos se utilizan para estudiar el desarrollo de terapias preventivas y PD15 idiopáticas.

Se descubrió que la neurotoxina MPTP causa parkinsonismo a mediados de la década de 1980 después de que siete pacientes usaron la sustancia y exhibieron síntomas graves de EP. Además de los síntomas, los pacientes respondieron al tratamiento con L-DOPA, lo que hizo que los investigadores vincularan la molécula directamente a la EP. Después de que el caso fue publicado en 1986, varios investigadores comenzaron a utilizar MPTP en la investigación preclínica de LA EP18. Los investigadores han descubierto que al ser una molécula lipofílica, MPTP puede cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) y convertirse en MPP + 19. Esta sustancia tóxica se acumula en el interior de las neuronas y causa daños en el complejo 1 de la cadena respiratoria mitocondrial, provocando la muerte de las neuronas dopaminérgicas20.

El modelo de neurotoxina 6-OHDA se utilizó por primera vez para inducir la degeneración de las neuronas monoamina de la vía nigrostriatal en 196821. El modelo 6-OHDA se usa comúnmente para causar neurodegeneración en la vía nigrostriatal, ya que es un análogo de la dopamina y tóxico para las células que contienen catecolaminas. Después de que el 6-OHDA ingresa al cerebro, puede ser absorbido por el transportador de dopamina (DAT) en las neuronas dopaminérgicas, lo que lleva a la degeneración de la vía nigrostriatal22. Debido a que el 6-OHDA no penetra en el BBB, debe administrarse directamente a través de la inyección estereotáxica intracerebral23. Un inhibidor de la recaptación de noradrenalina a menudo se combina con microinyección 6-OHDA para preservar las fibras noradrenérgicas y proporcionar una degeneración más selectiva de las neuronas dopaminérgicas24.

Después de que daT absorba 6-OHDA, se acumulará en el citosol de las neuronas, produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS) y llevando a la muerte celular15. Se utilizan con frecuencia tres modelos diferentes de lesiones de 6-OHDA: i) lesiones al SNc25,26; ii) lesiones en el cuerpo estriado27,28; iii) lesiones en el MFB29,30. Las lesiones causadas en el cuerpo estriado dan lugar a una degeneración lenta y retrógrada de las neuronas dopaminérgicas en SNpc. Por el contrario, las lesiones causadas en SNpc y MFB dan lugar a una degeneración rápida y total de las neuronas, dando lugar a síntomas parkinsonianos más avanzados31.

La inyección unilateral o bilateral de 6-OHDA puede causar neurodegeneración en las neuronas dopaminérgicas. 6-OHDA no siempre causa daño severo a las neuronas; a veces, la inyección resulta en daño parcial, que también se utiliza para simular las primeras etapas de PD32. La inyección unilateral se utiliza más comúnmente debido a la capacidad del modelo para evaluar los déficits motores del animal y predecir la pérdida celular a través de pruebas como la rotación inducida por anfetamina/apomorfina y la prueba de paso29. Las inyecciones bilaterales son las más utilizadas para evaluar la memoria espacial y el reconocimiento33.

La prueba de rotación inducida por anfetamina/apomorfina es una prueba de comportamiento comúnmente utilizada para predecir la pérdida celular en la vía nigrostriatal. Se define como un proceso en el que la administración repetida de agonistas dopaminérgicos conduce a una intensificación del comportamiento rotacional en animales lesionados por 6-OHDA34. El comportamiento rotacional consiste en cuantificar la rotación ipsilateral inducida por anfetaminas o los giros contralaterales inducidos por apomorfina en roedores lesionados unilateralmente. El comportamiento rotacional inducido por fármacos ha sido criticado porque la rotación no corresponde a los síntomas de la EP en humanos y puede verse afectada por variables como la tolerancia, la sensibilización y el "cebado"35.

El cebado es uno de los factores más críticos en estas pruebas de comportamiento. Se han reportado algunos casos en los que una sola dosis de L-DOPA condujo a un fracaso en los comportamientos rotacionales36. Además, otro factor crítico relacionado con la aplicación combinada de la prueba inducida por anfetamina y la prueba inducida por apomorfina para uso paralelo es que miden diferentes puntos finales debido a diferentes mecanismos de acción, lo que refleja la inactivación de diferentes mecanismos y vías de señalización. Además, la prueba inducida por anfetamina es más precisa para medir lesiones nigrostriatales por encima del 50-60%, mientras que la prueba inducida por apomorfina es más precisa para lesiones superiores al 80%37.

La prueba escalonada ha surgido como una prueba de comportamiento que indica déficits relacionados con la degeneración de las neuronas dopaminérgicas y los efectos terapéuticos. Permite el análisis de la acinesia causada por una lesión 6-OHDA en neuronas dopaminérgicas sin un procedimiento inducido por fármacos. Además, la prueba está bien establecida y se ha utilizado comúnmente desde 1995, cuando fue descrita por primera vez por Olsson et al.35. En 1999, Chang et al.38 también analizaron y compararon el rendimiento de las ratas en la prueba de paso con el nivel de degeneración causada por 6-OHDA y encontraron que los animales que se desempeñaron peor en la prueba de paso también tuvieron una degeneración más significativa de las neuronas dopaminérgicas.

La prueba de paso es un método excelente para predecir el daño nigrostriatal dopaminérgico severo en ratas lesionadas por 6-OHDA. La evidencia sugiere que los déficits motores aparecen en la extremidad anterior contralateral de la infusión de 6-OHDA durante la prueba de paso cuando el grado de pérdida dopaminérgica en SNc es >90%39. Este artículo describe los protocolos, metodologías y materiales utilizados para realizar la cirugía estereotáxica para la infusión unilateral de 6-OHDA en el MFB de ratas y cómo predecir las lesiones dopaminérgicas causadas por la toxina a través de la prueba de paso.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales siguieron los principios éticos del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA) y la Ley Arouca (Ley 11.794/2008) y fueron aprobados por el comité de ética local (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5).

1. Preparación de medicamentos

  1. Anestesia con ketamina/xilazina
    NOTA: La dosis de ketamina utilizada es de 70 mg/kg, y la dosis de xilazina es de 10 mg/kg.
    1. Para preparar 1 ml de anestésico con ketamina 100 mg/ml de solución y xilazina 20 mg/ml de solución, combine 0,35 ml de solución de ketamina, 0,25 ml de solución de xilazina y 0,4 ml de solución salina estéril al 0,9%. Administrar la solución anestésica a un volumen final de 2 ml/kg.
      NOTA: La ketamina junto con la xilazina puede producir sedación durante 60-80 min. Si el animal todavía tiene reflejos (por ejemplo, cabeceo de patas traseras y / o reflejo parpadeante), administre un 10% adicional de la dosis individual.
  2. Imipramina
    NOTA: La dosis individual de imipramina utilizada es de 20 mg/kg.
    1. Para preparar 1 ml de solución de imipramina 20 mg/ml, combine 20 mg de imipramina y 1 ml de solución salina estéril al 0,9%. Administrar la solución de imipramina a un volumen final de 1 ml/kg.
  3. Meloxicam
    NOTA: La dosis individual de meloxicam utilizada es de 1 mg/kg.
    1. Para preparar 1 ml de meloxicam 1 mg/ml de solución, combine 0,05 ml de meloxicam al 2% y 0,95 ml de solución salina estéril al 0,9%. Administrar la solución de meloxicam a un volumen final de 1 ml/kg una vez al día durante dos días.
  4. Ácido ascórbico 0.1%
    1. Para preparar 1 ml de ácido ascórbico al 0,1%, combine 1 mg de ácido ascórbico y 1 ml de solución salina estéril al 0,9%.
  5. 6-hidroxidopamina (6-OHDA)
    NOTA: 6-OHDA es una neurotoxina utilizada para destruir selectivamente las neuronas dopaminérgicas y noradrenérgicas en el cerebro. Evite el contacto directo con la piel y las membranas mucosas de los ojos, la nariz y la boca. Cuando manipule 6-OHDA, use guantes dobles de nitrilo, bata de laboratorio, bata desechable, protección ocular y máscara quirúrgica o protector facial. El volumen total de infusión de la toxina es de 4 μL/animal, y la cantidad individual es de 10 μg de 6-OHDA/animal.
    1. Para preparar 1 ml de 6-OHDA a una concentración final de 2,5 mg/ml, mezcle 2,5 mg de 6-OHDA y 1 ml de solución salina al 0,9% que contenga ácido ascórbico al 0,1% (descrito anteriormente).
      NOTA: El 6-OHDA es sensible a la luz y se degrada más rápido cuando se expone a la luz brillante. Debe manipularse y almacenarse adecuadamente en un entorno protegido de la luz. Si el color de la solución es rojizo, deséchelo.
  6. Clorhidrato de lidocaína (2%)
    1. Prepare una solución de lidocaína al 2% para su aplicación local al animal.
      NOTA: La dosis máxima que se puede aplicar es de 7 mg/kg.
  7. Suspensión polibiótica
    NOTA: La suspensión polibiótica con estreptomicinas y penicilinas (ver la Tabla de Materiales) debe prepararse en el momento de la aplicación con todo el volumen de diluyente, cuya ampolla acompaña al vial con el polvo.
    1. Retire el disco metálico del tapón de goma. Desinfecte el tapón de goma con alcohol.
    2. Usando una jeringa con una aguja de 23 G, inyecte el diluyente en el vial. Retire la aguja y agite el vial vigorosamente hasta que la suspensión esté completamente homogeneizada. Inyecte un poco de aire en el vial y retire el volumen de suspensión deseado.
    3. Administre una inyección intramuscular profunda, tirando del émbolo antes de inyectar el medicamento para asegurarse de que no se alcance ningún vaso sanguíneo.
      NOTA: El volumen final de suspensión a aplicar es de 0,5 mL/kg.

2. Preparación de materiales

NOTA: Siempre siga las instrucciones proporcionadas con la hoja de datos de seguridad del material al manipular productos químicos.

  1. Aparato estereotáxico
    1. Coloque el dispositivo estereotáxico en un banco estable y limpio con la iluminación adecuada para realizar la cirugía. Desinfectar el aparato con etanol al 70%.
    2. Compruebe si la oreja y las barras incisivas del dispositivo están correctamente alineadas. Coloque una manta térmica donde se colocará al animal durante la cirugía para mantenerse caliente durante el procedimiento. Controle la temperatura del animal con una sonda rectal precisa.
      NOTA: La manta térmica debe estar a 37.5 °C para que el animal mantenga una temperatura corporal de 37 °C corporal.
  2. Sistema de microinfusión
    1. Llene (70-80%) una jeringa Hamilton (50 μL o según lo desee) unida a una microtubing de polietileno de grado médico y una aguja con agua destilada doble (ddH2O) y verifique si hay fugas a través del sistema.
    2. Tire del aire a través del sistema para que una sola burbuja de aire separe el ddH2O en la jeringa de la solución 6-OHDA en el microtubo.
      NOTA: Este procedimiento evita contaminar la jeringa Hamilton con 6-OHDA y permite el uso de varias ratas en el mismo día experimental.
    3. Coloque la jeringa Hamilton en la bomba de infusión de modo que esté firmemente unida y el émbolo de la jeringa esté paralelo al marco que se moverá para empujarla. Ajuste la bomba de infusión a una velocidad de 0,5 μL/min para que la aplicación total de 4 μL de 6-OHDA dure 8 min. Pruebe el sistema de infusión confirmando que no hay fugas y que la infusión se produce de acuerdo con el tiempo y el volumen previamente establecidos.
    4. Conecte la aguja de infusión conectada al microtubo al aparato en el extremo del brazo estereotáxico y verifique que la aguja esté colocada en un ángulo de 180 ° con respecto a la superficie. Asegúrese de que la aguja esté recta y no doblada.
      NOTA: Revise todos los procedimientos descritos cuidadosamente porque si alguno de los elementos en el sistema de infusión no funciona correctamente, puede poner en peligro el éxito de la cirugía.
  3. Sutura
    1. Use una sutura estéril de nylon no absorbible con una aguja de círculo de 3/8 para suturar la incisión después de la cirugía.
  4. Sitio de recuperación postquirúrgica
    1. Coloque una caja de alojamiento limpia y esterilizada donde los animales puedan ser monitoreados hasta que se recuperen por completo (sensibles al tacto y la manipulación). Coloque una manta térmica en la caja para la termorregulación.
      NOTA: Como la termorregulación es importante, incluya una fuente de calor suplementaria para mantener la temperatura corporal si es necesario.

3. Procedimiento quirúrgico

NOTA: En este protocolo, las ratas Sprague-Dawley macho adultas (200-250 g) se mantuvieron bajo condiciones controladas de temperatura (22 ± 2 °C), intercambio de aire (15-20 intercambios/hora) y ciclos luz-oscuridad (12 h/12 h), agrupadas en cajas con 3 o 4 animales, con libre acceso a alimentos y agua.

  1. Pesar a los animales para controlar los cambios de peso en los días posteriores a la cirugía. Calcular la dosis de los fármacos a administrar.
  2. Administrar imipramina por vía intraperitoneal 30 min antes de la cirugía (~10-15 min antes de administrar anestesia), utilizando una aguja de 27 G y una jeringa de 1 ml.
    NOTA: La imipramina bloqueará el transportador de noradrenalina (NAT) y evitará la captación de 6-OHDA por las neuronas noradrenérgicas, haciendo que la lesión sea más selectiva para las neuronas dopaminérgicas40.
  3. Después de 10-15 min de la administración de imipramina, administrar la anestesia intraperitoneal de ketamina/xilazina con una aguja de 27 G y una jeringa de 1 ml. Espere hasta que el animal esté completamente anestesiado. Verifique que el animal esté bajo anestesia profunda cuando el animal no responda al pellizco de la pata trasera y no muestre un reflejo de parpadeo.
  4. Afeitar el pelaje de la rata en la región de la cabeza donde se producirá la incisión.
  5. Coloque a la rata en el aparato estereotáxico.
    1. Coloque la cabeza sobre la barra incisiva y fije la barra 3,3 mm por debajo de la línea interaural.
    2. Coloque las barras de la oreja, de un lado a la vez. Coloque la barra incisiva y las barras de la oreja de modo que la parte superior del cráneo esté recta y paralela a la superficie.
    3. Ajuste la abrazadera nasal y pruebe que la cabeza esté firme y no se mueva hacia ninguno de los lados.
  6. Aplique ungüento oftálmico estéril en los ojos de la rata para evitar que las córneas se sequen.
  7. Aplique povidona yodada en el área a incisa para desinfectar el sitio.
  8. Aplicar lidocaína local para la analgesia de la región de la incisión; no excedan de 7 mg/kg.
  9. Administrar el meloxicam por vía subcutánea utilizando una aguja de 27 G y una jeringa de 1 ml.
    NOTA: Meloxicam es un analgésico antiinflamatorio no esteroideo que ayudará al animal a recuperarse después de la cirugía.
  10. Administrar la suspensión polibiótica por vía intramuscular utilizando una aguja de 23 G y una jeringa de 1 ml.
    NOTA: La suspensión polibiótica se administra como tratamiento profiláctico para evitar posibles infecciones bacterianas en la recuperación postquirúrgica.
  11. Verifique que el animal esté en un estado de anestesia profunda verificando los reflejos de parpadeo o los reflejos de las extremidades posteriores pellizcando la pata trasera con pinzas.
  12. Con un bisturí, haga una incisión de ~ 1.5 cm en la región donde ocurrirá la microinyección.
    NOTA: Se aplican técnicas estériles desde este punto hasta el cierre de la herida.
  13. Limpie la región del cráneo con hisopos de algodón y bastoncillos de algodón hasta que se puedan ver el Bregma y lambda. Marque el Bregma y el Lambda con una pluma fina esterilizada.
  14. Compruebe que las coordenadas dorsal-ventral (DV) de Bregma y Lambda son similares. Si son diferentes, reajuste la rata en el aparato estereotáxico ya que la cabeza de la rata no está colocada correctamente.
  15. Anote las coordenadas anteroposterior (AP) y mediolateral (ML) del Bregma.
  16. Muévase a las coordenadas AP y ML del MFB derecho de acuerdo con 41: AP: -4.3 mm, ML: 1.6 mm de Bregma.
  17. Marque la región de la trepanación con una pluma fina esterilizada.
  18. Con un taladro esterilizado, perfore lentamente el cráneo del animal, teniendo cuidado de no dañar la duramadre.
  19. Coloque la aguja de microinyección en la duramadre y observe las coordenadas DV. Tome una aguja delgada y rompa suavemente la duramadre. Inserte la aguja en la coordenada DV (ventral de 8,3 mm) de la MFB, donde tendrá lugar la microinyección.
  20. Opere la bomba de microinyección para liberar la solución 6-OHDA en el MFB. Cuando termine la microinyección, revise la jeringa de Hamilton para ver si se han inyectado 4 μL de 6-OHDA.
    NOTA: La microinyección debe durar 8 min.
  21. Después de la administración del 6-OHDA, espere 10 minutos antes de retirar la aguja para evitar el reflujo del medicamento. Retire la aguja de microinyección lentamente del cerebro del animal.
  22. Desinfecte la región de la incisión nuevamente con povidona yodada.
  23. Sutura el área de la incisión con ~ 3-4 nudos quirúrgicos.
    NOTA: El nudo no debe ser demasiado fuerte o demasiado suelto.
  24. Retire la rata del aparato estereotáxico y colóquela en una caja limpia para su recuperación en la manta térmica hasta que el animal se haya recuperado completamente de la anestesia. Observe al animal cada 15 minutos hasta que esté completamente despierto de la anestesia.

4. Procedimientos postoperatorios

  1. Controle el peso de los animales durante los próximos cuatro días después de la cirugía. Trátelos con meloxicam por vía subcutánea una vez al día durante dos días después de la cirugía, ajustando la dosis para el peso de cada día.
    NOTA: Todos los animales deben ser evaluados por la necesidad de analgésicos en el tercer día después de la cirugía.
  2. Revise las incisiones diariamente durante al menos cuatro días para asegurarse de que no estén infectadas. Busque calor, hinchazón, dolor, secreción y enrojecimiento hasta que las incisiones sanen.
  3. Verifique el apetito y el consumo de agua monitoreando el peso corporal del animal. Dé alimento húmedo para alentar a los animales a comer. Observe la condición general del cuerpo, la actitud y la movilidad diariamente durante al menos cuatro días después de la cirugía. Retire las suturas 7-10 días después de la cirugía.
    NOTA: Los animales deben ser sacrificados si se alcanzan los criterios de valoración definidos en los procedimientos éticos.

5. Prueba de paso

  1. Adiestramiento
    NOTA: Los animales deben ser entrenados durante tres días antes de la prueba. De acuerdo con el protocolo que se describe a continuación, el entrenamiento debe ocurrir dos veces al día, una vez por la mañana y una vez por la tarde, o con un intervalo de al menos 2 h entre sesiones. Realice un seguimiento de la hora con un temporizador.
    1. Día 1
      1. En la primera sesión, maneje a la rata sosteniéndola con guantes durante ~ 1-2 minutos para permitir que la rata se familiarice con el manejador / experimentador.
      2. En la segunda sesión, alterne entre sostener la rata durante 20 s y colocarla en la mesa de protocolo durante 20 s. Repita este paso de entrenamiento durante 3 minutos para familiarizar a la rata con la configuración experimental para la prueba de paso.
    2. Día 2
      1. En la primera sesión, coloque ambas patas delanteras de la rata en la mesa de protocolo sosteniendo sus patas traseras y traseras con una mano. Incline la rata hacia abajo de cabeza en un ángulo de 45 ° con respecto a la superficie plana de la mesa de protocolo. Muévete horizontalmente sobre la mesa de extremo a extremo, permitiendo que la rata pise la mesa con ambas patas (cubre 90 cm en 4 s). Sostenga a la rata con guantes durante 10 s, permitiéndole descansar; repita este patrón durante 3 min.
      2. En la segunda sesión, coloque una pata delantera de la rata en la mesa de protocolo sosteniendo la otra pata delantera hacia atrás con una mano y sostenga la espalda y las patas traseras de la rata con la otra mano (ver paso 5.1.2.1). Muévase horizontalmente sobre la mesa de extremo a extremo en 4 s, permitiendo que la rata pise con su pata libre. Sostenga a la rata con guantes durante 10 s, dejándola descansar, y repita con otra pata delantera, seguida del período de descanso. Repite este patrón, alternando entre las dos patas delanteras, y descansa durante 3 min.
      3. Repita el paso de entrenamiento 3 veces durante 1 minuto cada una.
    3. Día 3
      1. En la primera sesión, siga el procedimiento descrito en el paso 5.1.2.2 para una pata anterior. Repita con otra pata delantera, seguido del período de descanso. Repite este patrón, alternando entre las dos patas delanteras, y descansa durante 3 min.
      2. En la segunda sesión, siga el procedimiento descrito en el paso 5.1.2.2.
  2. Prueba
    NOTA: La prueba de paso se realiza antes de la cirugía, 2 y 4 semanas después de la cirugía estereotáxica, para evaluar la acinesia de la extremidad anterior contralateral y la posible lesión causada por 6-OHDA.
    1. Sostenga a la rata en un ángulo de 45 ° con respecto a la superficie, inmovilizando sus extremidades posteriores y permitiendo que solo una de las extremidades anteriores descanse en la plataforma, como se explicó anteriormente, para el día 3 de entrenamiento.
    2. Arrastre la rata hacia adelante a una distancia de 90 cm en 4 s, con la pata derecha o izquierda apoyada en la superficie.
    3. Tome notas y cuantifique el número de pasos de ajuste de derecha tomados con cada pata en cada dirección.

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Representative Results

Evaluación de la lesión dopaminérgica
La prueba escalonada permite la evaluación de la acinesia del miembro anterior contralateral a la lesión y la selección de animales con una posible lesión de la vía nigrostriatal inducida por infusión de 6-OHDA (Figura 1). La comparación de la realización de la prueba de paso de extremidad anterior contralateral antes de la cirugía y 2 semanas y 4 semanas después de la cirugía reveló interacción (F2,74 = 93,63; p < 0,0001; ANOVA de medidas repetidas bidireccionales) entre el tiempo (pre, 2 y 4 semanas después de la cirugía) y el tratamiento (operado simuladamente y 6-OHDA-lesionado). La prueba post-hoc de Bonferroni mostró una disminución significativa en el número de pasos contralaterales a la lesión en animales que recibieron 6-OHDA en el MFB derecho en comparación con los animales operados simuladamente en la segunda y cuarta semana después de la cirugía (p < 0,0001) (Figura 1). Los resultados fueron consistentes con los de estudios previos35.

Es importante tener en cuenta que cuando la lesión dopaminérgica no está completa, los resultados de la prueba escalonada no alcanzarán el grado de éxito de los resultados presentados en este estudio. Un estudio publicado previamente realizó la prueba de paso e inmunohistoquímica de tirosina hidroxilasa (TH) con animales con una lesión dopaminérgica parcial después de realizar una cirugía de microinyección de 6-OHDA siguiendo el mismo protocolo utilizado en este estudio. Su hallazgo de un déficit parcial en la prueba de paso (4-8 pasos) es el resultado de una lesión dopaminérgica parcial de ~60% de las neuronas39.

Figure 1
Figura 1: Evaluación de la prueba de paso contralateral antes y después de la cirugía para la infusión unilateral de 6-OHDA o vehículo en el MFB derecho. Los datos muestran que los animales que recibieron 6-OHDA tuvieron una disminución significativa en el número de pasos con la extremidad anterior contralateral a la lesión en la segunda y cuarta semana después de la cirugía (****p < 0.0001 vs. postcirugía simulada; ANOVA de medidas repetidas bidireccionales, Bonferroni post-hoc). Los datos expresados como media ± error estándar de la media. Vehicle es una solución salina al 0,9% que contiene ácido ascórbico al 0,1%. Los resultados se basan en 14 animales en el grupo simulado y 25 animales en el grupo 6-OHDA. Abreviaturas: P = precirugía. 2 = dos semanas después de la cirugía. 4 = cuatro semanas después de la cirugía; 6-OHDA = 6-hidroxidopamina; MFB = haz medial del cerebro anterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La comparación de la realización de la prueba de paso de extremidad anterior ipsilateral antes de la cirugía y 2 semanas y 4 semanas después de la cirugía no reveló ninguna interacción (F2,74 = 0,4492; p = 0,6399; ANOVA de medidas repetidas bidireccionales) entre el tiempo (pre, 2 y 4 semanas después de la cirugía) y el tratamiento (operado simuladamente y 6-OHDA-lesionado). La prueba post-hoc de Bonferroni no mostró ninguna diferencia significativa en el número de pasos ipsilaterales a la lesión en animales que recibieron 6-OHDA en el MFB derecho en comparación con los animales simulados (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Evaluación de la prueba de paso ipsilateral antes y después de la cirugía para la infusión unilateral de 6-OHDA o vehículo en el MFB derecho. Los datos muestran que los animales que recibieron 6-OHDA no disminuyeron significativamente el número de pasos con la extremidad anterior ipsilateral a la lesión en la segunda y cuarta semana después de la cirugía (p > 0,05 vs. postcirugía simulada; ANOVA de medidas repetidas bidireccionales, Bonferroni post-hoc). Los datos expresados como media ± error estándar de la media. Vehicle es una solución salina al 0,9% que contiene ácido ascórbico al 0,1%. Los resultados se basan en 14 animales en el grupo simulado y 25 animales en el grupo 6-OHDA. Abreviaturas: P = precirugía. 2 = dos semanas después de la cirugía. 4 = cuatro semanas después de la cirugía; 6-OHDA = 6-hidroxidopamina; MFB = haz medial del cerebro anterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Consistente con estudios previos en animales lesionados por 6-OHDA42, el análisis histológico (Figura 3) que compara la TH del cuerpo estriado de ambos hemisferios permite una evaluación fiable del déficit de DA en el cuerpo estriado. Por lo tanto, este protocolo conductual se puede utilizar en combinación con métodos inmunohistoquímicos en estudios que involucran modelos experimentales de EP.

Figure 3
Figura 3: Imágenes representativas del etiquetado TH en el modelo experimental 6-OHDA de EP, incluyendo estriado anterior y sustancia negra compacta. La imagen panorámica demuestra la extensión de la lesión, y los zooms insertados representan la inervación y los cuerpos celulares inmunoteñidos. (A) Imagen de la sección coronal estriatal que muestra una lesión parcial inducida por 6-OHDA en el hemisferio derecho. (B) Imagen de la sustancia negra y la sección coronal del área tegmental ventral del mismo animal que también muestra la extensión de la lesión. (C) Imagen de la sección coronal estriatal que muestra una lesión inducida completa por 6-OHDA en el hemisferio derecho. (D) Imagen de la sustancia negra y la sección coronal del área tegmental ventral del mismo animal que también muestra la extensión de la lesión. Barra de escala = 1,3 mm en vista panorámica y 65 μm en zooms insertados. Abreviaturas: 6-OHDA = 6-hidroxidopamina; TH = tirosina hidroxilasa; PD = enfermedad de Parkinson; NL = no lesionado; L = lesionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este trabajo se describe un protocolo para la realización de cirugía para la microinfusión unilateral de 6-OHDA en el MFB, capaz de causar lesiones robustas en las neuronas de la vía nigrostriatal y generar acinesia en el animal. También se describe el protocolo para realizar la prueba de paso, una prueba fácilmente aplicable y no invasiva que se puede utilizar para demostrar el éxito de las lesiones y evaluar la acinesia de las extremidades anteriores. Como se presenta en los resultados representativos, los animales que recibieron 6-OHDA mostraron una reducción en el número de pasos de ajuste contralateral a la lesión, lo que significa que los animales lesionados con 6-OHDA exhiben una fuerte acinesia a partir de las 2 semanas posteriores a la cirugía de infusión. La acinesia, el foco de varios tratamientos para la enfermedad, es uno de los principales síntomas motores de la EP. El desarrollo de acinesia en un modelo animal es significativo para los estudios preclínicos de EP. Además, estos resultados se asemejan a los reportados por Chang et al.37, quienes confirmaron que los animales que presentaban un menor número de pasos tenían un mayor porcentaje de muerte neuronal dopaminérgica por inmunohistoquímica. Por lo tanto, los animales que presentaron un menor número de pasos de ajuste contralateral tienen más probabilidades de tener una lesión dopaminérgica.

La evaluación del éxito de la cirugía y de las lesiones también puede confirmarse mediante otras pruebas de comportamiento como la rotación inducida por anfetamina/apomorfina43, la prueba de balanceo corporal elevado (EBST), la prueba de corredor, la prueba de cilindro, las técnicas de marcado tisular como la inmunohistoquímica TH, o incluso la cuantificación de la dopamina en el cuerpo estriado por HPLC42. Otras metodologías difieren en la dosis inyectada de 6-OHDA y el intervalo de tiempo posterior a la cirugía para la evaluación del comportamiento. Una revisión reciente43 resume los artículos más recientes que utilizan esta metodología y la diferencia en la dosis, las pruebas de comportamiento y el intervalo postquirúrgico entre ellos. El modelo de EP inducido por 6-OHDA no imita todos los procesos patológicos relacionados con la enfermedad, como la acumulación de cuerpos de Lewy, sino que simula la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la vía estriatal-nigral. Esto permite el estudio de nuevas terapias para los síntomas de la enfermedad, lo que podría conducir a una mejora en la calidad de vida de los pacientes afectados por esta enfermedad.

A pesar de ser el modelo más utilizado, el modelo 6-OHDA tiene sus limitaciones como todos los modelos PD actuales. El modelo tiene la desventaja de no representar completamente los mecanismos moleculares involucrados en la patología de la enfermedad, como la acumulación de proteínas alfa-sinucleína y la formación de cuerpos de Lewy. El modelo simula la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal, correspondiente a una etapa tardía de la enfermedad y que conduce a la aparición de síntomas motores solamente. Esto lo hace inadecuado para estudiar su desarrollo natural15,32. El modelo 6-OHDA descrito en este artículo generalmente se caracteriza por bajas tasas de mortalidad. La recuperación postquirúrgica es crucial para prevenir altas tasas de mortalidad debido a la unión de un procedimiento invasivo y la lesión neurodegenerativa44. Es posible reducir la mortalidad teniendo especial cuidado durante el período de recuperación postquirúrgica con suplementación nutricional, rehidratación y control de temperatura externa45. Se ha demostrado que la combinación de estas medidas reduce o incluso elimina drásticamente la tasa de mortalidad30,46. Una causa común de muerte es la inserción de la aguja en la coordenada incorrecta en el cerebro. Es crucial verificar cuidadosamente las coordenadas durante este delicado procedimiento quirúrgico. Esto evitará el daño a otras estructuras cerebrales (por ejemplo, el hipotálamo) por la aguja, lo que puede afectar las acciones de alimentación y bebida del animal, lo que lleva a la desnutrición y la deshidratación47.

Finalmente, es esencial destacar que aunque el protocolo de anestesia ketamina-xilazina está bien establecido y se utiliza en experimentos con roedores48, algunas evidencias sugieren que la combinación de estos anestésicos puede ser insuficiente para un período prolongado de cirugía. Además, la sensibilidad a la ketamina-xilazina puede variar según las diferentes cepas de ratones y ratas49,50. Una alternativa puede ser inducir la anestesia por inhalación de isoflurano. Un estudio demostró una pérdida más rápida del reflejo de enderezamiento con anestesia inducida por isoflurano que con ketamina-xilazina. Además, el 60% de las ratas anestesiadas con ketamina-xilazina presentaron reflejos consecutivos de pellizco del dedo del pie durante el procedimiento quirúrgico, incluso con la suplementación de dosis. Por el contrario, los animales anestesiados con isoflurano presentaron casos aislados de reflejos de pellizco de la cola que desaparecieron tras el ajuste de volumen51.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP, beca 2017/00003-0). Agradecemos a la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES). Agradecemos al Dr. Anthony R. West, al Dr. Heinz Steiner y al Dr. Kuei Y. Tseng por su apoyo y tutoría.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OHDA Sigma Aldrich H4381 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel
_6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid Sigma Aldrich 795437 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid=
Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD
RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09
_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO
6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL Hamilton 80539 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine Alfa Aeser J63723 https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump Insight EFF-311 https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino) Ourofino https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic Zoetis https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus Insight EFF-331 https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN

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Neurociencia Número 176
El modelo de rata 6-hidroxidopamina de la enfermedad de Parkinson
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Guimarães, R. P., Ribeiro, D. L., dos Santos, K. B., Godoy, L. D., Corrêa, M. R., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62923, doi:10.3791/62923 (2021).

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